WO2017007006A1 - 精子凍結保存用容器及びその製造方法、精子凍結保存方法並びに体外受精方法 - Google Patents

精子凍結保存用容器及びその製造方法、精子凍結保存方法並びに体外受精方法 Download PDF

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WO2017007006A1
WO2017007006A1 PCT/JP2016/070194 JP2016070194W WO2017007006A1 WO 2017007006 A1 WO2017007006 A1 WO 2017007006A1 JP 2016070194 W JP2016070194 W JP 2016070194W WO 2017007006 A1 WO2017007006 A1 WO 2017007006A1
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WO
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sperm
container
gel
gel shell
cryopreservation
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/070194
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English (en)
French (fr)
Inventor
慎司 境
田谷　正仁
和尚 冨田
美彦 細井
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
学校法人近畿大学
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A61D19/02—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for artificial insemination

Definitions

  • the present invention relates to a sperm cryopreservation container and a method for producing the same, a sperm cryopreservation method, and an in vitro fertilization method.
  • Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Documents 1 to 3 describe containers for cryopreserving sperm.
  • ICSI microinsemination
  • Intracytoplasmic Sperm Injection it was difficult to freeze and store the very few spermatozoa with high efficiency.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and a sperm cryopreservation container capable of effectively performing cryopreservation and recovery of the sperm even when the number of sperm is small and its production
  • Another object is to provide a method, a sperm cryopreservation method, and an in vitro fertilization method.
  • a sperm cryopreservation method for solving the above problems includes the following (a) to (f): (a) a gel shell containing glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains, Providing a container having a liquid core coated with a gel shell; (b) injecting sperm into the liquid core of the container to obtain the container holding the sperm; (c) (D) thawing the container after cryopreservation; (e) decomposing the glycosaminoglycan chain from the gel shell of the container after thawing; And / or an enzyme that decomposes the cellulose chain to decompose at least a part of the gel shell; and (f) the sperm held in the container after the gel shell is decomposed.
  • a sperm cryopreservation method capable of effectively performing cryopreservation and recovery of sperm even when the number of sperm is small.
  • the gel shell may contain hyaluronic acid chains, and the gel shell of the container after thawing may be treated with an enzyme that degrades the hyaluronic acid chains.
  • the in vitro fertilization method for solving the above problems includes the following (a) to (g): (a) a gel shell containing glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains, and the gel Providing a container having a liquid core covered with a shell; (b) injecting sperm into the liquid core of the container to obtain the container holding the sperm; (c) the sperm (D) thawing the container after cryopreservation; (e) decomposing the glycosaminoglycan chain in the gel shell of the container after thawing; Treating with an enzyme and / or an enzyme that degrades the cellulose chain to degrade at least a portion of the gel shell; (f) recovering the sperm retained in the container after the gel shell has been degraded.
  • the in vitro fertilization may be microinsemination.
  • a container for sperm cryopreservation according to an embodiment of the present invention for solving the above-described problem holds a gel shell containing glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains, and sperm coated on the gel shell. And a liquid wick. According to the present invention, it is possible to provide a sperm cryopreservation container capable of effectively performing cryopreservation and recovery of sperm even when the number of sperm is small.
  • the gel shell may contain hyaluronic acid chains.
  • the average diameter of the container may be 10 ⁇ m or more and 3000 ⁇ m or less.
  • the container for sperm cryopreservation may be used in any one of the sperm cryopreservation methods or any one of the in vitro fertilization methods.
  • a method for producing a sperm cryopreservation container according to an embodiment of the present invention for solving the above-described problem is a method for producing a sperm cryopreservation container having a gel shell and a liquid core coated on the gel shell.
  • the gel shell may contain a hyaluronic acid chain.
  • a sperm cryopreservation container and a method for producing the same, a sperm cryopreservation method, and an in vitro fertilization method that can effectively perform cryopreservation and recovery of the sperm even when the number of sperm is small Can be provided.
  • Example 1 which concerns on one Embodiment of this invention, it is explanatory drawing which shows the result of having evaluated the influence which a degradation enzyme has on the survival rate of a sperm.
  • Example 1 which concerns on one Embodiment of this invention, it is explanatory drawing which shows the result of having evaluated the influence which a degradation enzyme exerts on the motility rate of a sperm.
  • Example 2 which concerns on one Embodiment of this invention, it is explanatory drawing which shows the result of having evaluated the collection
  • Example 3 which concerns on one Embodiment of this invention, it is explanatory drawing which shows the result of having examined the recovery method of the sperm from the container for sperm cryopreservation.
  • the sperm cryopreservation method comprises the following (a) to (f): (a) a gel shell containing glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains, and a liquid core coated on the gel shell. (B) Injecting sperm into the liquid core of the container to obtain the container holding the sperm; (c) Freezing and storing the container holding the sperm (D) Thawing the container after cryopreservation; (e) Degrading the gel shell of the container after thawing, degrading the glycosaminoglycan chain and / or the cellulose chain Treating with an enzyme that degrades at least a portion of the gel shell; and (f) recovering the sperm retained in the container after degradation of the gel shell.
  • the in vitro fertilization method has the following (a) to (g): cocoon (a) a gel shell containing glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains, and a liquid core coated on the gel shell. Preparing a container; (b) injecting sperm into the liquid core of the container to obtain the container holding the sperm; (c) cryopreserving the container holding the sperm; (D) thawing the container after cryopreservation; (e) decomposing the glycosaminoglycan chain and / or the cellulose chain from the gel shell of the container after thawing. Treating with an enzyme to degrade at least a portion of the gel shell; (f) recovering the sperm retained in the container after decomposition of the gel shell; and (g) recovered. Perform in vitro fertilization using the sperm And; including.
  • a sperm cryopreservation container (hereinafter referred to as “this container”) holds a gel shell containing glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains, and sperm coated on the gel shell.
  • This container holds a gel shell containing glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains, and sperm coated on the gel shell.
  • a liquid core A sperm cryopreservation container
  • the prepared container is the one that has not yet retained sperm.
  • This container may be prepared in advance by preparing a pre-manufactured container (for example, purchasing and preparing the container if the container is in the market) May be manufactured.
  • FIG. 1A shows a cross section of an example of the container.
  • the container 10 has a spherical shape and includes a gel shell 11 and a liquid core 12 covered with the gel shell 11.
  • the gel shell of this container contains glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains. That is, the gel shell may include a glycosaminoglycan chain, may include a cellulose chain, or may include a glycosaminoglycan chain and a cellulose chain. When the gel shell includes glycosaminoglycan chains, the gel shell may further include cellulose chains. When the gel shell includes cellulose chains, the gel shell may further include glycosaminoglycan chains.
  • glycosaminoglycan chain is a polymer chain of glycosaminoglycan.
  • Glycosaminoglycans are polysaccharides composed of disaccharides composed of amino sugar (galactosamine or glucosamine) and uronic acid (glucuronic acid or iduronic acid) or galactose repeatedly bonded.
  • the glycosaminoglycan is selected from, for example, hyaluronic acid, chondroitin sulfate (one or more selected from the group consisting of chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate B and chondroitin sulfate C), keratan sulfate, heparan sulfate and heparin.
  • hyaluronic acid is particularly preferable. That is, the gel shell particularly preferably contains a hyaluronic acid chain.
  • the cellulose chain is a polymer chain of cellulose.
  • Cellulose is a polysaccharide composed of ⁇ -glucose repeatedly bonded linearly by glycosidic bonds.
  • the cellulose chain may be a cellulose chain contained in a cellulose derivative. That is, in this case, the gel shell includes a cellulose derivative, and the cellulose derivative includes a cellulose chain.
  • a cellulose derivative is a polymer other than cellulose, which is formed by introducing a functional group into a cellulose chain and includes the cellulose chain and the functional group.
  • the cellulose derivative may be one or more selected from the group consisting of, for example, nitrocellulose, acetylcellulose, and cellulose ether (for example, carboxymethylcellulose).
  • the gel shell is composed of a polymer gel containing glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains as described above.
  • the content of glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains in the polymer constituting the gel shell is such that the gel shell can be degraded by a degrading enzyme to the extent that sperm can be recovered in (e) above.
  • it is preferably 30% by weight or more, more preferably 50% by weight or more, and particularly preferably 70% by weight or more.
  • the polymer containing a glycosaminoglycan chain and not containing a cellulose chain is the glycosaminoglycan.
  • the polymer that contains the cellulose chain and does not contain the glycosaminoglycan chain means that the polymer contains 30% by weight or more of the cellulose chain.
  • the polymer containing both the chains means that the glycosaminoglycan chain and the cellulose chain are contained in a total of 30% by weight or more.
  • the gel shell may further contain other components in addition to the glycosaminoglycan chain and / or the cellulose chain.
  • the other components are not particularly limited as long as they do not prevent the formation of the gel shell in the production of the container described later.
  • one or more selected from the group consisting of gelatin, collagen, and polyphenols may be used. Good.
  • the liquid core of this container is composed of liquid.
  • the liquid which comprises a liquid core will not be restricted especially if a sperm can survive in it. That is, the liquid constituting the liquid core is, for example, a liquid having an osmotic pressure and pH suitable for sperm survival, and may further include a nutrient source necessary for sperm movement.
  • This container is used for the sperm cryopreservation method and in vitro fertilization method according to this embodiment. That is, this embodiment includes the use of the container for a sperm cryopreservation method and the use of the container for an in vitro fertilization method. In addition, the present embodiment includes a sperm cryopreservation method using the container and an in vitro fertilization method using the container.
  • the size of the container is not particularly limited as long as it is in a range suitable for use in the sperm cryopreservation method and in vitro fertilization method according to the present embodiment, but is preferably a size similar to an egg cell or a zona pellucida thereof.
  • the average diameter of the container may be 10 ⁇ m or more and 3000 ⁇ m or less, preferably 30 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less, more preferably 50 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less, and 50 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less. It is particularly preferred.
  • the average diameter of the container is the average diameter of the gel shell.
  • the average thickness of the gel shell of the container is not particularly limited as long as it is in a range suitable for use in the sperm cryopreservation method and in vitro fertilization method according to the present embodiment. For example, 0.01 ⁇ m or more and 1400 ⁇ m The thickness may be 1 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less, more preferably 10 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less, and particularly preferably 10 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less.
  • the manufacturing method of the container for sperm cryopreservation (this container) which concerns on this embodiment is a manufacturing method of the container for sperm cryopreservation which has a gel shell and the liquid core coat
  • the gel core formed in (x) above is not particularly limited as long as it does not contain sperm and is composed of a gel that can be dissolved in (z) above. That is, the gel core first prepares a precursor solution that gels under predetermined conditions (for example, one or more selected from the group consisting of temperature, pH, light irradiation and contact with other components), and then It can form by applying the said precursor solution to the said predetermined conditions, and gelatinizing.
  • predetermined conditions for example, one or more selected from the group consisting of temperature, pH, light irradiation and contact with other components
  • the gel core is, for example, one or more selected from the group consisting of gelatin, alginic acid, cellulose, pectin, amylopectin, hyaluronic acid, collagen, keratin or konjac mannan gel, gels of these derivatives and matrigel. It may be configured.
  • Formation of the gel shell according to the above (y) is performed by a crosslinking reaction of a precursor polymer containing a glycosaminoglycan chain and / or a cellulose chain and a crosslinkable functional group. That is, for example, when the gel shell includes a hyaluronic acid chain, the gel shell is formed by a crosslinking reaction of a precursor polymer (hyaluronic acid derivative) including the hyaluronic acid chain and a crosslinkable functional group.
  • the precursor polymer can be obtained by introducing a crosslinkable functional group into a polymer containing a glycosaminoglycan chain and / or a cellulose chain.
  • the precursor polymer containing a glycosaminoglycan chain and a crosslinkable functional group includes, for example, a polymer containing the glycosaminoglycan chain and a compound containing a functional group corresponding to the crosslinkable functional group Is produced by chemically or enzymatically reacting.
  • the precursor polymer containing a cellulose chain and a crosslinkable functional group is obtained by, for example, chemically reacting a polymer containing the cellulose chain and a compound containing a functional group corresponding to the crosslinkable functional group. Generated.
  • the crosslinkable functional group contained in the precursor polymer is not particularly limited as long as it contributes to the formation of the gel shell.
  • a hydroxyl group, amino group, carboxyl group, aldehyde group, thiol group, phenol group, epoxy As at least one selected from the group consisting of a group, acryloyl group, vinyl group, benzophenone group, diazoester group, arylazide group, diazirine group, methacrylate group, allyl group, ethylenically unsaturated group, and hydrazide group Also good.
  • the gel shell formed by the crosslinking reaction of the precursor polymer is composed of a polymer containing a glycosaminoglycan chain and / or a cellulose chain and a crosslinking group.
  • the gel core covered with the gel shell is not decomposed and the gel core is dissolved (for example, temperature change, pH change, light It is carried out by treatment with irradiation and one or more selected from the group consisting of contact with other components (for example, enzymes and / or chelating agents).
  • the gel core when the gel core is composed of a gelatin gel, the gel core is treated with a proteolytic enzyme (for example, trypsin) or heated to a temperature at which the gelatin gel is redissolved.
  • the core can be dissolved.
  • the gel core when the gel core is composed of an alginate gel, the gel core can be dissolved by treating the gel core with a chelating agent (for example, citric acid) and / or an alginate lyase.
  • a chelating agent for example, citric acid
  • the liquid core covered with the gel shell is formed by dissolution of the gel core covered with the gel shell. That is, by sequentially performing the above (x), (y), and (z), this container having a gel shell and a liquid core coated on the gel shell is obtained.
  • the method of injecting sperm into the liquid core of the container is not particularly limited as long as it is a method capable of injecting sperm outside the container into the liquid core through the gel shell, It is preferred to use an injection pipette.
  • FIG. 1B shows an example in which the sperm S is injected into the liquid core 12 of the container 10 using the injection pipette 20. That is, injecting the sperm S into the liquid core 12 first holds the sperm S inside the injection pipette 20, and then uses the tip of the injection pipette 20 holding the sperm S as the gel shell of the container 10. 11 is inserted and then penetrated, and then the sperm S in the injection pipette 20 is discharged into the liquid core 12.
  • the injection pipette is not particularly limited as long as it is a hollow needle-like member capable of holding sperm inside, but those used for in vitro fertilization (for example, microinsemination) are preferably used.
  • An injection pipette having an inner diameter of 4 ⁇ m to 10 ⁇ m is preferably used.
  • the injection pipette is preferably made of glass or transparent resin.
  • the container 10 when using an injection pipette, it is preferable to hold the container 10 by a holding pipette 30 as shown in FIG. 1B. That is, in this case, first, the main container 10 is held at the tip of the holding pipette 30 and then the liquid core of the main container 10 held by the holding pipette 30 using the injection pipette 20 as described above. 12 is injected with sperm S.
  • the holding pipette is not particularly limited as long as it is a hollow rod-like member capable of holding the container at the tip thereof, but those used for in vitro fertilization (for example, microinsemination) are preferably used.
  • a holding pipette having an inner diameter of 15 to 30 ⁇ m is preferably used.
  • the holding pipette is preferably made of glass or transparent resin.
  • the injection of sperm into the liquid core of the container according to the above (b) is preferably performed by the same operation as the operation of injecting sperm into the egg cell in microinsemination.
  • an embryo culturer accustomed to the operation of microinsemination can efficiently and surely inject sperm into this container.
  • the sperm held in the container is naturally a live sperm.
  • the origin of the sperm retained in the container is not particularly limited, and may be human sperm, or sperm of a non-human animal (eg, mouse, rabbit, rat, monkey, cow, horse, sheep or pig). May be.
  • the present invention is particularly useful for cryopreservation of rare sperm and in vitro fertilization using rare sperm after cryopreservation.
  • the present invention relates to human sperm, particularly rare sperm from human patients with oligospermia or azoospermia (eg, sperm collected from semen of male patients with oligospermia, or azoospermia This is useful when using sperm collected from the testes of male patients.
  • the method for cryopreservation according to the above (c) is not particularly limited as long as the sperm retained in the container can be frozen and stored viable after thawing. That is, for example, first put this container holding sperm in a cell cryopreservation container (for example, a commercially available cryopreservation instrument (Cryotop (registered trademark), manufactured by KITAZATO CORPORATION)), then using liquid nitrogen, By maintaining the container at a low temperature suitable for cryopreservation (eg, ⁇ 196 ° C. or lower), the sperm and liquid core in the container are frozen. As a result, as shown in FIG. 1C, the present container 10 including the frozen sperm S and the liquid core 12 is obtained.
  • the time for cryopreservation is not particularly limited, and is appropriately determined according to the time of performing in vitro fertilization using sperm after thawing.
  • the method of thawing according to the above (d) is not particularly limited as long as the sperm cryopreserved in this container can be maintained in a alive state even after thawing. That is, for example, the sperm is thawed by immersing the container after cryopreservation in a solution at a temperature suitable for sperm survival (for example, 37 ° C.). As a result, as shown in FIG. 1D, the container 10 having the liquid core 12 containing the live sperm S and the gel shell 11 covering the liquid core 12 is obtained as before the cryopreservation.
  • the enzyme used for decomposing the gel shell according to (e) above is not particularly limited as long as it decomposes glycosaminoglycan chains and / or cellulose chains contained in the gel shell. That is, when the gel shell includes a hyaluronic acid chain, an enzyme (for example, hyaluronidase) that degrades the hyaluronic acid chain is used. When the gel shell includes a chondroitin sulfate chain, an enzyme (for example, chondroitinase) that degrades the chondroitin acid chain is used. When the gel shell contains keratan sulfate chains, an enzyme (for example, keratanase) that degrades the keratan acid chains is used.
  • the gel shell includes heparan sulfate chains and / or heparin chains
  • an enzyme for example, heparinase
  • an enzyme for example, cellulase
  • decomposes the cellulose chains is used.
  • the gel shell contains a hyaluronic acid chain
  • the gel shell of the container after thawing is converted into an enzyme that decomposes the hyaluronic acid chain (for example, , Hyaluronidase).
  • the decomposition of the gel shell it is possible to recover the sperm retained in the liquid core of the container (for example, the sperm retained in the container using an injection pipette without penetrating the gel shell). At least a part of the gel shell may be decomposed to such an extent that the sperm retained in the container can be recovered or the sperm retained in the container can come out of the container.
  • FIG. 1E shows that the gel shell 11 of the container disappears due to enzymatic decomposition (broken line), and the live sperm S held in the liquid core 12 of the container can be easily recovered.
  • the time required for the enzymatic degradation of the gel shell varies depending on the amount of enzyme used and conditions such as temperature, but is preferably as short as possible, for example, preferably 30 minutes or less, and preferably 10 minutes or less. It is particularly preferred that
  • the sperm collection method according to the above (f) is not particularly limited as long as it is a method capable of collecting live sperm released by enzymatic decomposition of the gel shell in a state suitable for subsequent use.
  • an injection pipette may be used in the collection of sperm.
  • FIG. 1F shows an example of how the sperm S is collected using the injection pipette 20.
  • the in vitro fertilization according to (g) is further performed using the sperm collected in (f) above. That is, in vitro, sperm collected from the container is brought into contact with egg cells collected in advance for use in in vitro fertilization to produce a fertilized egg.
  • FIG. 1G shows an example of microinsemination.
  • microinsemination is performed under the microscope with the tip of the injection pipette 20 holding the sperm S inside the cytoplasm C through the zona pellucida Z of the egg cell E held by the holding pipette 30. It is performed by inserting and releasing sperm S into the cytoplasm C from the injection pipette 20.
  • injection of sperm into the container is performed using an injection pipette
  • the gel shell of the container after thawing is decomposed by enzymatic treatment
  • the sperm state is maintained well by an engineer (for example, an embryo cultivator) accustomed to the operation of the injection pipette.
  • an engineer for example, an embryo cultivator
  • cryopreservation, recovery, and application to in vitro fertilization of the sperm can be performed efficiently and reliably.
  • the effects of an enzyme that degrades glycosaminoglycan chains and an enzyme that degrades cellulose chains on sperm viability and motility were evaluated.
  • a commercially available enzyme was used as the degrading enzyme. That is, hyaluronidase (Irvine) was used as the hyaluronic acid chain degrading enzyme. Cellulase (manufactured by Worthington Biochemical) was used as the cellulose chain degrading enzyme. Also, alginate lyase (manufactured by Sigma) which is an alginate degrading enzyme was used.
  • sperm collected from a human male patient but not used in human in vitro fertilization was used. That is, spermatozoa collected for in vitro fertilization but not used at the medical corporation Sankeikai IVF Namba Clinic (Osaka Prefecture, Japan) were used after obtaining informed consent and obtaining consent.
  • a solution containing 4 ⁇ 10 6 cells / mL sperm and a degrading enzyme 40 IU / mL hyaluronidase, 1 mg / mL cellulase, or 0.2 mg / mL alginate lyase
  • a degrading enzyme 40 IU / mL hyaluronidase, 1 mg / mL cellulase, or 0.2 mg / mL alginate lyase
  • sperm viability was assessed by a hypotonic liquid tail swelling test. That is, 50 ⁇ L of physiological saline containing 4 ⁇ 10 6 cells / mL sperm was dropped into 500 ⁇ L of hypotonic solution (150 mOsm), and incubated at room temperature for 30 minutes. Thereafter, sperm in which tail swelling was confirmed was evaluated as a live sperm. Then, under the microscope, the number of viable spermatozoa contained in 100 spermatozoa was counted, and the number of viable spermatozoa was defined as the sperm viability (%).
  • the sperm motility rate is determined by counting the number of sperm moving in the visual field under a microscope using a McLa chamber (SEFI-MEDICAL INSTRUMENT), The ratio of the number of sperm was calculated as sperm motility rate (%).
  • FIGS. 2A and 2B show the results of evaluating the survival rate and motility rate of sperm, respectively.
  • the viability and motility of spermatozoa in contact with any of hyaluronidase, cellulase and alginate lyase were not significantly different from those of spermatozoa not in contact with the enzyme, and the statistically significant difference was Not observed (Turkey-kramer method). That is, it was confirmed that hyaluronidase, cellulase, and alginate lyase have no effect on sperm that would reduce their survival rate and motility rate.
  • a hyaluronic acid derivative (crosslinkable hyaluronic acid) was produced by chemically introducing a phenol group as a crosslinkable functional group into hyaluronic acid (molecular weight: about 1 million, manufactured by JNC). That is, hyaluronic acid was dissolved in 30 mM 2-Morpholinoethanesulfide acid, monohydrate (MES) buffer (pH 6) to a concentration of 0.1% (w / v), and then tyramine hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was further added. It was dissolved to 0.5% (w / v).
  • MES 2-Morpholinoethanesulfide acid, monohydrate
  • tyramine hydrochloride manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • the obtained solution was further added with water-soluble carbodiimide (manufactured by Peptide Institute) and hydroxysuccinimide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) of 0.47% (w / v) and 0.27% (w / v), respectively. ) And stirred at room temperature for 20 hours. Then, after dialysis in purified water using a dialysis membrane (fractionated molecular weight of 10,000 to 20,000), the solution is freeze-dried to obtain a hyaluronic acid derivative containing a hyaluronic acid chain and a phenol group. Got.
  • a double tube structure was formed by arranging a 26G syringe in a 21G (gauge) syringe.
  • the 26G syringe was placed so that the tip of the 26G syringe was placed in the 21G syringe.
  • a 7.5% (w / v) gelatin solution is flowed into the 26G syringe at a flow rate of 4.5 mL / h, and liquid paraffin is flowed between the 26G syringe and the 21G syringe at a flow rate of 4.2 mL / min.
  • the gelatin solution was allowed to flow into the liquid paraffin from the tip of the 26G syringe.
  • the liquid paraffin containing droplets of the gelatin solution thus obtained was cooled in ice water to form spherical gelatin gel beads (gel core) dispersed in the liquid paraffin.
  • the obtained gelatin gel beads were washed several times with phosphate buffered saline to remove liquid paraffin.
  • HA solution containing 0.8% (w / v) of the hyaluronic acid derivative produced as described above, and 1100 U / mL of horseradish peroxidase (horse radish peroxidase: HRP, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) HA / HRP solution was prepared by mixing the HRP solution to be mixed at a volume ratio of 10: 1 (hyaluronic acid solution: HRP solution).
  • the gelatin gel beads prepared as described above were suspended in the HA / HRP solution to prepare an HA / HRP solution containing the gelatin gel beads at 0.1 mL / mL. Further, 5 mL of hydrogen peroxide (35% (w / v), manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 1 L of liquid paraffin, and the mixture was stirred for 30 minutes using a homogenizer. Then, liquid paraffin containing hydrogen peroxide was prepared by removing undissolved hydrogen peroxide solution by centrifugation.
  • hydrogen peroxide 35% (w / v)
  • a double tube structure was formed by placing a 26G syringe in a 21G syringe. Then, the gelatin gel bead-containing HA / HRP solution is flowed into the 26G syringe at a flow rate of 4.5 mL / h, and hydrogen peroxide-containing liquid paraffin is flowed between the 26G syringe and the 21G syringe at a flow rate of 4.2 mL / min. The gelatin gel beads-containing HA / HRP solution was allowed to flow out into the hydrogen peroxide-containing liquid paraffin from the tip of the 26G syringe. In this way, spherical composite gel beads composed of gelatin gel beads (gel core) and hyaluronic acid gel film (gel shell) covering the gelatin gel beads dispersed in hydrogen peroxide-containing liquid paraffin were formed.
  • the HA / HRP solution layer covering the gelatin gel beads is brought into contact with hydrogen peroxide-containing liquid paraffin so that the HA / HRP solution layer is cross-linked and gelled, and the hyaluronic acid gel film covering the gelatin gel beads is formed. Formed. The resulting composite gel beads were collected by centrifugation.
  • a solution containing the recovered composite gel beads was added to a culture solution (GM501, GYNEMED), and the composite gel beads were selected. That is, of the recovered composite gel beads, only the composite gel beads capable of visually recognizing the gel core of the gelatin gel beads were selectively collected using a thin glass pipette having an outer diameter of about 200 ⁇ m to 300 ⁇ m.
  • a hyaluronic acid capsule composed of a liquid core formed by dissolving gelatin gel beads and a hyaluronic acid gel film covering the liquid core was obtained as a sperm cryopreservation container.
  • the diameter of the HA capsule produced as described above was 219 ⁇ 18 ⁇ m (average diameter ⁇ standard deviation), and the thickness of the hyaluronic acid gel film was 30 ⁇ 7 ⁇ m (average thickness ⁇ standard deviation). .
  • the diameter of the HA capsule and the thickness of the hyaluronic acid gel film were measured by analyzing 100 HA capsule photographs taken with an optical microscope using image analysis software (ImageJ, manufactured by the National Institutes of Health, USA). did.
  • sperm cryopreservation As sperm to be cryopreserved in HA capsules, sperm collected from a human male patient but not used in human in vitro fertilization was used. That is, spermatozoa collected for in vitro fertilization but not used at Medical Corporation Sankeikai IVF Namba Clinic (Osaka, Japan) were used after informed consent was obtained and consent was obtained.
  • NARISIGE micromanipulation system equipped with a holding pipette (KITAZATO), an injection pipette (Sunlight medical), and a phase-contrast microscope used for microinsemination
  • the holding pipette was a glass pipette having an inner diameter of about 15 ⁇ m.
  • the injection pipette was a glass pipette having an inner diameter of about 4 ⁇ m.
  • sperm was injected into the liquid core of the HA capsule. That is, a holding pipette is operated under a phase-contrast microscope, and the HA capsule obtained as described above is placed in the tip of the holding pipette in a culture solution (Irvine) in a petri dish placed on a microscope stage. Retained.
  • a culture solution Irvine
  • the injection pipette was operated under a phase contrast microscope, and three spermatozoa were held inside the injection pipette in the culture solution (Irvine) in the petri dish placed on the microscope stage.
  • the injection pipette was operated under a phase contrast microscope, and three sperm were injected from the injection pipette into the liquid core in the HA capsule held by the holding pipette.
  • the tip of the injection pipette holding the sperm inside is inserted into the hyaluronic acid gel film of the HA capsule and penetrated, and the liquid from the tip of the injection pipette disposed in the liquid core of the HA capsule Sperm was released into the core.
  • an HA capsule holding three sperm was obtained.
  • a hollow capsule composed of a zona pellucida prepared from egg cells that were not fertilized after microinsemination was prepared.
  • egg cells collected from humans but not fertilized in microinsemination are treated with 17 ⁇ g / mL of cytochalasin B (Sigma Aldrich), and then the cytoplasm is removed by aspiration with an injection pipette. It was prepared by.
  • This egg cell was used after obtaining informed consent and consent from an egg cell collected for in vitro fertilization but not used at IVF Namba Clinic (Osaka Prefecture, Japan). did.
  • sperm was injected into the liquid core of the ZP capsule by the same operation as that of the above-mentioned HA capsule, thereby obtaining a total of 11 ZP capsules each holding three sperm.
  • HA capsules and ZP capsules holding sperm were stored frozen. That is, a plurality of droplets of 10 ⁇ L of a frozen solution containing 0.1 M sucrose-20% alternative serum (serum supplement) were formed on a 6 cm diameter cell culture dish. Then, each sperm-containing HA capsule or sperm-containing ZP capsule obtained as described above was suspended in one droplet one by one and incubated at room temperature for 5 minutes.
  • cryopreservation device (Cryotop (registered trademark), manufactured by KITAZATO CORPORATION)
  • a droplet of about 1.0 ⁇ L of the capsule-containing frozen solution after incubation is formed, and the droplet is placed on the liquid nitrogen surface.
  • Incubation was performed for 2 minutes while being exposed to liquid nitrogen vapor at a position 4.5 cm away from the substrate.
  • the cryopreservation instrument after incubation on liquid nitrogen vapor was cryopreserved for 24 hours or more in liquid nitrogen.
  • the frozen HA capsules and ZP capsules were thawed. That is, the cryopreservation instrument taken out from liquid nitrogen was incubated in a culture solution at 37 ° C. for 1 minute to thaw the HA capsule and ZP capsule in the cryopreservation instrument.
  • the capsule recovery rate, sperm recovery rate, and sperm motility rate were evaluated for each of the thawed HA capsules and ZP capsules. That is, for the HA capsule, first, a 10 ⁇ L droplet containing 40 IU / mL hyaluronidase was formed on a 6 cm diameter cell culture dish. Then, the thawed HA capsule was suspended in the droplet, and the droplet was coated with 5 mL of culture mineral oil (KITAZATO). Further, the HA capsule-containing droplets were incubated at 37 ° C. for 10 minutes to decompose the hyaluronic acid gel film (gel shell) of the HA capsules. Thereafter, the sperm retained in the HA capsule was collected using an injection pipette. Then, under the microscope, the number of sperm collected from the HA capsule and the number of sperm moving out of the collected sperm were counted.
  • KITAZATO culture mineral oil
  • the ZP capsule first, a 10 ⁇ L droplet of a culture solution (Irvine) was formed on a 6 cm diameter cell culture dish. Subsequently, the thawed ZP capsule was suspended in the droplet. Thereafter, sperm was sucked and collected from the ZP capsule using an injection pipette. Then, the number of sperm collected from the ZP capsule and the number of sperm moving out of the collected sperm were counted.
  • a culture solution Irvine
  • FIG. 3 shows the results of evaluating the capsule recovery rate, sperm recovery rate, and sperm motility rate for each of the HA capsules and ZP capsules after thawing. As shown in FIG. 3, all 11 capsules were recovered for each of the HA capsule and the ZP capsule.
  • sperm recovery rate was 90.9 ⁇ 15.5%.
  • ZP capsule 32 spermatozoa could be recovered, so that the sperm recovery rate was 97.0 ⁇ 10.0%. There was no statistically significant difference in sperm recovery between HA capsules and ZP capsules (t-test).
  • the sperm motility rate was 15.1 ⁇ 17.4%.
  • the ZP capsule out of the 32 sperm collected, movement of 7 sperm was confirmed, so the sperm motility rate was 21.2 ⁇ 16.8%. There was no statistically significant difference in sperm motility between HA capsules and ZP capsules (t-test).
  • a method for recovering sperm from the HA capsule As a method for recovering sperm from the HA capsule, a method of recovering sperm by decomposing the hyaluronic acid gel membrane of the HA capsule with hyaluronidase, and sperm by suction with an injection pipette without decomposing the hyaluronic acid gel membrane of the HA capsule was compared with the method of recovering. In all cases, the operation of the injection pipette was performed by an embryo culturer who was used to microinsemination.
  • HA capsules were produced in the same manner as in Example 2 described above. As sperm retained in the HA capsule, sperm collected from a human male patient but not used in human in vitro fertilization was used. That is, spermatozoa collected for in vitro fertilization but not used at the medical corporation Sankeikai IVF Namba Clinic (Osaka Prefecture, Japan) were used after obtaining informed consent and obtaining consent.
  • Example 2 3 sperm were injected into each of the 6 HA capsules to obtain 6 HA capsules each holding 3 sperm.
  • the resulting sperm-containing HA capsule was incubated at 37 ° C. for 15 minutes.
  • sperm was collected by enzymatic degradation of the hyaluronic acid gel membrane. That is, 3 ⁇ L of a suspension containing 3 sperm-containing HA capsules and 40 IU / mL hyaluronidase was prepared, and the resulting suspension was incubated at 37 ° C. for 10 minutes, whereby hyaluronic acid of the HA capsule was The gel film was broken down.
  • the ratio (%) of the number of sperm collected in the PVP to the number of sperm retained in the HA capsule was evaluated as a sperm collection rate.
  • the ratio (%) of the number of sperm in which motility was confirmed with respect to the number of sperm collected in PVP was evaluated as the sperm motility rate.
  • sperm was collected by an injection pipette without decomposing the hyaluronic acid gel membrane.
  • an injection pipette (a glass pipette having an inner diameter of about 4 ⁇ m) is inserted into a liquid core through a hyaluronic acid gel film, and the sperm in the liquid core is injected into the liquid core. Aspirated into pipette.
  • the sperm in the injection pipette was released into 10 ⁇ L of polyvinylpyrrolidone (PVP, molecular weight 360,000). And the ratio (%) of the number of the sperm collect
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • FIG. 4 shows the sperm recovery rate and sperm motility rate when sperm was recovered by enzymatic degradation of hyaluronic acid gel membrane and when sperm was recovered by injection pipette without decomposing the hyaluronic acid gel membrane. The evaluation results are shown.
  • motility was confirmed for two sperm out of the collected five sperm, but motility was not confirmed for three sperm, and the sperm motility rate was 40 0.0%.
  • the sperm recovery rate was 88.9% and the sperm motility rate was 100%.
  • the method for recovering sperm retained in the HA capsule is simpler, faster and more reliable than the recovery method using the injection pipette by the enzymatic decomposition of the hyaluronic acid gel membrane of the HA capsule. It was confirmed that it was remarkably superior.
  • a sperm storage container having a gel shell containing cellulose chains was produced. That is, first, similarly to the production of the hyaluronic acid derivative in Example 2 described above, a carboxymethyl cellulose (CMC) (400-800 cps-2%, aqueous solution at 25 ° C., manufactured by Sigma) has a phenol group as a crosslinkable functional group. CMC derivatives (crosslinkable CMC) were produced by chemical introduction. Specifically, CMC and tyramine hydrochloride were dissolved in 50 mM MES buffer (pH 6) to 1% (w / v) and 46 mM, respectively.
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • tyramine hydrochloride were dissolved in 50 mM MES buffer (pH 6) to 1% (w / v) and 46 mM, respectively.
  • a CMC solution containing 1.0% (w / v) of CMC The sperm cryopreservation container is composed of a liquid core formed by dissolving gelatin gel beads (gel core) and a CMC gel film (gel shell) covering the liquid core. CMC capsules were obtained. The average diameter of the CMC capsules thus produced was 156 ⁇ m, and the average thickness of the CMC gel film was 25 ⁇ m.
  • a sperm cryopreservation container composed of a liquid core and an alginate gel film (gel shell) covering the liquid core was manufactured. That is, gelatin gel beads were dispersed in a 0.6% (w / v) sodium alginate solution or a 1.0% (w / v) sodium alginate solution. Next, the gel solution is coated with gelatin gel beads (gel core) and the alginate gel by dropping the resulting solution from a syringe with a 26G syringe needle into a 100 mM calcium chloride aqueous solution using electrostatic force. Spherical composite gel beads composed of a membrane (gel shell) were formed.
  • an injection pipette was passed through the gel shell. It was examined whether it could be inserted into the liquid core. In all cases, the operation of the injection pipette was performed by an embryo culturer who was used to microinsemination.
  • the injection pipette could not penetrate through the gel shell (alginate gel film). That is, the injection pipette pierced in the gel shell of the AG capsule is bent before the tip portion penetrates the gel shell and cannot be used.
  • the injection pipette could be penetrated through the gel shell (CMC gel film) of three CMC capsules out of the five CMC capsules.
  • CMC capsules can also inject sperm into the liquid core using an injection pipette.
  • the HA capsule was able to inject sperm more efficiently and reliably than the CMC capsule.
  • a sperm storage container composed of a liquid core and an agarose gel membrane (gel shell) covering the liquid core was manufactured. That is, first, in the same manner as in the production of the hyaluronic acid derivative in Example 2 above, alginic acid (sodium alginate, I-1G, manufactured by Kimica) was chemically introduced with a phenol group as a crosslinkable functional group to thereby obtain alginic acid. A derivative (crosslinkable alginic acid) was prepared. Specifically, alginic acid and tyramine hydrochloride were dissolved in 50 mM MES buffer (pH 6) so as to be 0.5% (w / v) and 4.5% (w / v), respectively.
  • Example 2 similarly to Example 2 described above, a double tube structure was formed by placing a 26G syringe in a 21G syringe. Then, similarly to Example 2 described above, CF-KRH is allowed to flow through the 26G syringe at a flow rate of 4.5 mL / h, and is prepared in the same manner as Example 2 described above between the 26G syringe and 21G syringe.
  • the hydrogen peroxide and lecithin-containing liquid paraffin obtained by adding 3% (w / w) of lecithin to the hydrogen peroxide-containing liquid paraffin were flowed at a flow rate of 4.2 mL / min, and the CF-KRH was The liquid paraffin was allowed to flow out from the tip of the 26G syringe.
  • spherical alginate gel beads gel core
  • the resulting alginate gel beads were then collected by mixing with CF-KRH and then centrifuging.
  • agarose solution of 40 ° C. was prepared by dispersing agarose (manufactured by Sigma, Low gelling temperature) at 4.0% (w / v) in CF-KRH and dissolving it by heating in a microwave oven. .
  • an agarose solution containing the alginate gel beads was prepared by mixing the alginate gel beads produced as described above and the 40 ° C. agarose solution at a volume ratio of 1:20 (alginate gel beads: agarose solution). .
  • a flow rate of agarose solution containing alginate gel beads in the 26G syringe is 4.5 mL / h.
  • a liquid paraffin containing 3% (w / w) lecithin was allowed to flow between the 26G syringe and the 21G syringe at a flow rate of 4.2 mL / min, and the agarose solution containing the alginate gel beads was added to the 26G syringe. It was made to flow out into the lecithin containing liquid paraffin from the tip of the syringe.
  • the recovered composite gel beads are held in CF-KRH containing 0.2 mg / mL alginate lyase for 1 hour, and the alginate gel beads inside the composite gel beads are decomposed to obtain the sperm cryopreservation container.
  • the agarose capsule comprised from the liquid core produced
  • the diameter of the agarose capsule thus produced was about 150 ⁇ m, and the thickness of the agarose gel membrane was 10 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • agarose capsule-containing CF-KRH was prepared by dispersing about 200 agarose capsules produced as described above in 0.2 mL of CF-KRH.
  • 30 U / mL of a commercially available agarase (Thermostable ⁇ -Agarase, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was added to 0.2 mL of this agarose capsule-containing CF-KRH.
  • CF-KRH containing an agarose capsule and agarase was incubated at 37 ° C. for 5 hours.
  • the agarase used exhibited maximum activity at 50 ° C to 60 ° C, but it was obtained from the manual (http://www.nippongene.com/pdf/manual/man_Thermostable_B_Agarase_ver4.pdf). According to (possible), the activity was about half of the maximum activity even at 37 ° C. Further, the manual described that 6 ⁇ U of agarase is used for 200 mg of agarose gel block, and that the agarose gel block is degraded in 10 minutes at 50 ° C. to 60 ° C.

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Abstract

精子の数が少ない場合であっても、当該精子の凍結保存及び回収を効果的に行うことができる精子凍結保存用容器及びその製造方法、精子凍結保存方法並びに体外受精方法を提供する。本発明の一実施形態に係る精子凍結保存方法は、下記（ａ）～（ｆ）： （ａ）グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻（１１）と、ゲル殻に被覆された液体芯（１２）とを有する容器（１０）を用意すること；、（ｂ）容器の液体芯に精子（Ｓ）を注入して、精子を保持した容器を得ること；、（ｃ）精子を保持した容器を凍結保存すること；、（ｄ）凍結保存後の容器を解凍すること；、（ｅ）解凍後の容器のゲル殻を、グリコサミノグリカン鎖を分解する酵素及び／又はセルロース鎖を分解する酵素で処理して、ゲル殻の少なくとも一部を分解すること；及び（ｆ）ゲル殻の分解後に、容器に保持されていた精子を回収すること；を含む。

Description

精子凍結保存用容器及びその製造方法、精子凍結保存方法並びに体外受精方法
　本発明は、精子凍結保存用容器及びその製造方法、精子凍結保存方法並びに体外受精方法に関する。
　人工授精（ＡＩＨ：Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｈｕｓｂａｎｄ‘ｓ　Ｓｅｍｅｎ）や体外受精（ＩＶＦ：Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）といった生殖補助医療（Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＡＲＴ）では、採卵前に、予め採取された当該精子を凍結保存しておくことがある。この点、特許文献１～４及び非特許文献１～３には、精子を凍結保存するための容器が記載されている。
国際公開第２００８／００４８９０号 国際公開第２０１３／１０７７９７号 米国特許出願公開第２０１０／０１７３２７８号明細書 欧州特許出願公開第０９２２４５１号明細書
第３２回日本授精着床学会総会・学術講演会要旨集第２２８頁（２０１４年） 日本受精着床学会雑誌２７（１）：２４－２８，２０１０ Fertility and Sterility Vol.85, No.1, 208-213, 2006
　しかしながら、従来、高度乏精子症の男性患者の精液又は無精子症の男性患者の精巣から採取され、凍結保存された極少数の精子を使用して、体外受精の一つである顕微授精（ＩＣＳＩ：Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｓｐｅｒｍ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を行う場合、当該極少数の精子を高効率に凍結保存及び回収することは難しかった。
　すなわち、例えば、従来の方法においては、凍結保存用容器への精子の保持や、凍結保存後の容器からの精子の回収等の操作が、顕微授精を行う胚培養士により簡便に行うことができず、又は胚培養士によっても長時間を要するといった問題があった。
　本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、精子の数が少ない場合であっても、当該精子の凍結保存及び回収を効果的に行うことができる精子凍結保存用容器及びその製造方法、精子凍結保存方法並びに体外受精方法を提供することを目的の一つとする。
　上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る精子凍結保存方法は、下記（ａ）～（ｆ）： （ａ）グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻と、前記ゲル殻に被覆された液体芯とを有する容器を用意すること；、（ｂ）前記容器の前記液体芯に精子を注入して、前記精子を保持した前記容器を得ること；、（ｃ）前記精子を保持した前記容器を凍結保存すること；、（ｄ）凍結保存後の前記容器を解凍すること；、（ｅ）解凍後の前記容器の前記ゲル殻を、前記グリコサミノグリカン鎖を分解する酵素及び／又は前記セルロース鎖を分解する酵素で処理して、前記ゲル殻の少なくとも一部を分解すること；及び（ｆ）前記ゲル殻の分解後に、前記容器に保持されていた前記精子を回収すること；を含むことを特徴とする。本発明によれば、精子の数が少ない場合であっても、当該精子の凍結保存及び回収を効果的に行うことができる精子凍結保存方法を提供することができる。
　また、前記精子凍結保存方法において、前記ゲル殻は、ヒアルロン酸鎖を含み、解凍後の前記容器の前記ゲル殻を、前記ヒアルロン酸鎖を分解する酵素で処理することとしてもよい。
　上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る体外受精方法は、下記（ａ）～（ｇ）： （ａ）グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻と、前記ゲル殻に被覆された液体芯とを有する容器を用意すること；、（ｂ）前記容器の前記液体芯に精子を注入して、前記精子を保持した前記容器を得ること；、（ｃ）前記精子を保持した前記容器を凍結保存すること；、（ｄ）凍結保存後の前記容器を解凍すること；、（ｅ）解凍後の前記容器の前記ゲル殻を、前記グリコサミノグリカン鎖を分解する酵素及び／又は前記セルロース鎖を分解する酵素で処理して、前記ゲル殻の少なくとも一部を分解すること；、（ｆ）前記ゲル殻の分解後に、前記容器に保持されていた前記精子を回収すること；及び（ｇ）回収された前記精子を使用して体外受精を行うこと；を含むことを特徴とする。本発明によれば、精子の数が少ない場合であっても、凍結保存後の当該精子を使用した体外受精を効果的に行うことができる体外受精方法を提供することができる。
　また、前記体外受精方法において、前記体外受精は、顕微授精であることとしてもよい。
　上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る精子凍結保存用容器は、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻と、前記ゲル殻に被覆された、精子を保持するための液体芯と、を有することを特徴とする。本発明によれば、精子の数が少ない場合であっても、当該精子の凍結保存及び回収を効果的に行うことができる精子凍結保存用容器を提供することができる。
　また、前記精子凍結保存用容器において、前記ゲル殻は、ヒアルロン酸鎖を含むこととしてもよい。また、前記容器の平均直径は、１０μｍ以上、３０００μｍ以下であることとしてもよい。また、前記精子凍結保存用容器は、前記いずれかの精子凍結保存方法又は前記いずれかの体外受精方法に使用されることとしてもよい。
　上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る精子凍結保存用容器の製造方法は、ゲル殻と、前記ゲル殻に被覆された液体芯と、を有する精子凍結保存用容器の製造方法であって、下記（ｘ）～（ｚ）：（ｘ）精子を含まない、溶解可能なゲル芯を形成すること；、（ｙ）前記ゲル芯を被覆する、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻を形成すること；及び（ｚ）前記ゲル殻に被覆された前記ゲル芯を溶解することにより、精子を含まない前記液体芯を形成すること；を含むことを特徴とする。本発明によれば、精子の数が少ない場合であっても、当該精子の凍結保存及び回収を効果的に行うことができる精子凍結保存用容器の製造方法を提供することができる。
　また、前記精子凍結保存用容器の製造方法において、前記ゲル殻は、ヒアルロン酸鎖を含むこととしてもよい。
　本発明によれば、精子の数が少ない場合であっても、当該精子の凍結保存及び回収を効果的に行うことができる精子凍結保存用容器及びその製造方法、精子凍結保存方法並びに体外受精方法を提供することができる。
本発明の一実施形態に係る精子凍結保存用容器の一例について、その断面を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る精子凍結保存用容器に精子を注入する様子の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る、精子を保持した精子凍結保存用容器を凍結した様子の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る、精子を保持した精子凍結保存用容器を凍結保存後に解凍した様子の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態において、精子凍結保存用容器のゲル殻を酵素分解した様子の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態において、精子凍結保存用容器のゲル殻を酵素分解後、精子を回収する様子の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態において精子凍結保存用容器から回収された精子を使用して顕微授精を行う様子の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例１において、分解酵素が精子の生存率に及ぼす影響を評価した結果を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例１において、分解酵素が精子の運動率に及ぼす影響を評価した結果を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例２において、精子凍結保存用容器の回収率、当該容器からの精子の回収率、及び回収された精子の運動率を評価した結果を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例３において、精子凍結保存用容器からの精子の回収方法について検討した結果を示す説明図である。
　以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は、本実施形態に限られるものではない。
　本実施形態に係る精子凍結保存方法は、下記（ａ）～（ｆ）： （ａ）グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻と、当該ゲル殻に被覆された液体芯とを有する容器を用意すること；、（ｂ）当該容器の当該液体芯に精子を注入して、当該精子を保持した当該容器を得ること；、（ｃ）当該精子を保持した当該容器を凍結保存すること；、（ｄ）凍結保存後の当該容器を解凍すること；、（ｅ）解凍後の当該容器の当該ゲル殻を、当該グリコサミノグリカン鎖を分解する酵素及び／又は当該セルロース鎖を分解する酵素で処理して、当該ゲル殻の少なくとも一部を分解すること；及び（ｆ）当該ゲル殻の分解後に、当該容器に保持されていた当該精子を回収すること；を含む。
　本実施形態に係る体外受精方法は、下記（ａ）～（ｇ）： （ａ）グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻と、当該ゲル殻に被覆された液体芯とを有する容器を用意すること；、（ｂ）当該容器の当該液体芯に精子を注入して、当該精子を保持した当該容器を得ること；、（ｃ）当該精子を保持した当該容器を凍結保存すること；、（ｄ）凍結保存後の当該容器を解凍すること；、（ｅ）解凍後の当該容器の当該ゲル殻を、当該グリコサミノグリカン鎖を分解する酵素及び／又は当該セルロース鎖を分解する酵素で処理して、当該ゲル殻の少なくとも一部を分解すること；、（ｆ）当該ゲル殻の分解後に、当該容器に保持されていた当該精子を回収すること；及び（ｇ）回収された当該精子を使用して体外受精を行うこと；を含む。
　本実施形態に係る精子凍結保存用容器（以下、「本容器」という。）は、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻と、当該ゲル殻に被覆された、精子を保持するための液体芯と、を有する。
　上記（ａ）について、用意される容器は、精子を未だ保持していない本容器である。本容器の用意は、予め製造された本容器を用意すること（例えば、本容器が市場に流通している場合、当該本容器を購入して用意すること）であってもよいし、本容器を製造することであってもよい。
　本容器は、上述のとおり、ゲル殻と液体芯とを有する。図１Ａには、本容器の一例について、その断面を示す。図１Ａに示す例において、本容器１０は、球状であり、ゲル殻１１と、当該ゲル殻１１に被覆される液体芯１２とから構成されている。
　本容器のゲル殻は、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含む。すなわち、ゲル殻は、グリコサミノグリカン鎖を含んでもよいし、セルロース鎖を含んでもよいし、グリコサミノグリカン鎖及びセルロース鎖を含んでもよい。ゲル殻がグリコサミノグリカン鎖を含む場合、当該ゲル殻は、さらにセルロース鎖を含んでもよい。ゲル殻がセルロース鎖を含む場合、当該ゲル殻は、さらにグリコサミノグリカン鎖を含んでもよい。
　グリコサミノグリカン鎖は、グリコサミノグリカンの高分子鎖である。グリコサミノグリカンは、アミノ糖（ガラクトサミン又はグルコサミン）と、ウロン酸（グルクロン酸又はイズロン酸）又はガラクトースと、から構成される二糖が、繰り返し結合して構成される多糖である。
　グリコサミノグリカンは、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｃからなる群より選択される１種以上）、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸及びヘパリンからなる群より選択される１種以上であってもよく、特にヒアルロン酸であることが好ましい。すなわち、ゲル殻は、特に、ヒアルロン酸鎖を含むことが好ましい。
　セルロース鎖は、セルロースの高分子鎖である。セルロースは、β－グルコースが、グリコシド結合により直鎖状に繰り返し結合して構成される多糖である。セルロース鎖は、セルロース誘導体に含まれるセルロース鎖であってもよい。すなわち、この場合、ゲル殻は、セルロース誘導体を含み、当該セルロース誘導体は、セルロース鎖を含む。セルロース誘導体は、セルロース鎖に官能基を導入することにより形成された、セルロース鎖と当該官能基をと含む、セルロース以外の高分子である。具体的に、セルロース誘導体は、例えば、ニトロセルロース、アセチルセルロース及びセルロースエーテル（例えば、カルボキシメチルセルロース）からなる群より選択される１種以上であってもよい。
　ゲル殻は、上述のようなグリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含む高分子のゲルから構成される。ゲル殻を構成する高分子におけるグリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖の含有量は、当該ゲル殻が、上記（ｅ）において精子の回収が可能となる程度に分解酵素によって分解可能に構成される範囲であれば特に限られないが、例えば、３０重量％以上であることが好ましく、５０重量％以上であることがより好ましく、７０重量％以上であることが特に好ましい。
　なお、例えば、高分子が、３０重量％以上のグリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むという場合、グリコサミノグリカン鎖を含み、セルロース鎖を含まない高分子は、当該グリコサミノグリカン鎖を３０重量％以上含むことを意味し、セルロース鎖を含み、グリコサミノグリカン鎖を含まない高分子は、当該セルロース鎖を３０重量％以上含むことを意味し、グリコサミノグリカン鎖及びセルロース鎖の両方を含む高分子は、当該グリコサミノグリカン鎖及びセルロース鎖を合計で３０重量％以上含むことを意味する。
　ゲル殻は、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖に加えて、さらに他の成分を含んでもよい。他の成分は、後述する本容器の製造においてゲル殻の形成を妨げるものでなければ特に限られないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン及びポリフェノール類からなる群より選択される１種以上であってもよい。
　本容器の液体芯は、液体から構成される。液体芯を構成する液体は、その中で精子が生存可能なものであれば特に限られない。すなわち、液体芯を構成する液体は、例えば、精子の生存に適した浸透圧及びｐＨを有する液体であり、さらに精子の運動に必要な栄養源を含む液体であってもよい。
　本容器は、本実施形態に係る精子凍結保存方法及び体外受精方法に使用される。すなわち、本実施形態は、本容器の精子凍結保存方法のための使用、及び本容器の体外受精方法のための使用を含む。また、本実施形態は、本容器を使用した精子凍結保存方法、及び本容器を使用した体外受精方法を含む。
　本容器のサイズは、本実施形態に係る精子凍結保存方法及び体外受精方法における使用に適した範囲であれば特に限られないが、卵細胞又はその透明帯に類似したサイズであることが好ましい。
　すなわち、本容器の平均直径は、１０μｍ以上、３０００μｍ以下であることとしてもよく、３０μｍ以上、２０００μｍ以下であることが好ましく、５０μｍ以上、１０００μｍ以下であることがより好ましく、５０μｍ以上、５００μｍ以下であることが特に好ましい。
　なお、本容器のゲル殻の外表面が、当該本容器の最外表面を構成する場合、当該本容器の平均直径は、当該ゲル殻の平均直径である。また、本容器のゲル殻の平均厚さは、本実施形態に係る精子凍結保存方法及び体外受精方法における使用に適した範囲であれば、特に限られないが、例えば、０．０１μｍ以上、１４００μｍ以下であることとしてもよく、１μｍ以上、１０００μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以上、５００μｍ以下であることがより好ましく、１０μｍ以上、１００μｍ以下であることが特に好ましい。
　ここで、本実施形態に係る精子凍結保存用容器（本容器）の製造方法は、ゲル殻と、当該ゲル殻に被覆された液体芯と、を有する精子凍結保存用容器の製造方法であって、下記（ｘ）～（ｚ）：（ｘ）精子を含まない、溶解可能なゲル芯を形成すること；、（ｙ）当該ゲル芯を被覆する、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻を形成すること；及び（ｚ）当該ゲル殻に被覆された当該ゲル芯を溶解することにより、精子を含まない当該液体芯を形成すること；を含む。
　上記（ｘ）で形成するゲル芯は、精子を含んでおらず、上記（ｚ）において溶解可能なゲルから構成されるものであれば特に限られない。すなわち、ゲル芯は、まず所定の条件（例えば、温度、ｐＨ、光照射及び他の成分との接触からなる群より選択される１種以上）でゲル化する前駆体溶液を調製し、次いで、当該前駆体溶液を当該所定の条件に適用してゲル化することにより形成することができる。具体的に、ゲル芯は、例えば、ゼラチン、アルギン酸、セルロース、ペクチン、アミロペクチン、ヒアルロン酸、コラーゲン、ケラチン又はコンニャクマンナンのゲル、これらの誘導体のゲル及びマトリゲルからなる群より選択される１種以上から構成されることとしてもよい。
　上記（ｙ）に係るゲル殻の形成は、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖と架橋性官能基とを含む前駆体高分子の架橋反応により行われる。すなわち、例えば、ゲル殻がヒアルロン酸鎖を含む場合、当該ゲル殻は、当該ヒアルロン酸鎖と架橋性官能基とを含む前駆体高分子（ヒアルロン酸誘導体）の架橋反応により形成される。
　前駆体高分子は、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含む高分子に架橋性官能基を導入することで得られる。具体的に、グリコサミノグリカン鎖と架橋性官能基とを含む前駆体高分子は、例えば、当該グリコサミノグリカン鎖を含む高分子と、当該架橋性官能基に対応する官能基を含む化合物とを化学的又は酵素的に反応させることにより生成される。また、セルロース鎖と架橋性官能基とを含む前駆体高分子は、例えば、当該セルロース鎖を含む高分子と、当該架橋性官能基に対応する官能基を含む化合物とを化学的に反応させることにより生成される。
　前駆体高分子に含まれる架橋性官能基は、ゲル殻の形成に寄与するものであれば特に限られないが、例えば、ヒドキシ基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、チオール基、フェノール基、エポキシ基、アクリロイル基、ビニル基、ベンゾフェノン基、ジアゾエステル基、アリールアジド基、ジアジリン基、メタクリレート基、アリル基、エチレン性不飽和基及びヒドラジド基からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。
　そして、前駆体高分子の架橋反応により形成されたゲル殻は、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖と、架橋基とを含む高分子から構成される。
　上記（ｚ）に係るゲル芯の溶解は、ゲル殻に被覆されたゲル芯を、当該ゲル殻が分解せず、且つ当該ゲル芯が溶解する条件（例えば、温度の変化、ｐＨの変化、光照射及び他の成分（例えば、酵素及び／又はキレート剤）との接触からなる群より選択される１種以上）で処理することにより行う。
　すなわち、例えば、ゲル芯がゼラチンゲルから構成される場合、当該ゲル芯をタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）で処理することにより、又は当該ゼラチンゲルが再溶解する温度に加熱することにより、当該ゲル芯を溶解することができる。また、例えば、ゲル芯がアルギン酸ゲルから構成される場合、当該ゲル芯をキレート剤（例えば、クエン酸）及び／又はアルギン酸リアーゼで処理することにより、当該ゲル芯を溶解することができる。
　ゲル殻に被覆されたゲル芯の溶解によって、ゲル殻に被覆された液体芯が形成される。すなわち、上記（ｘ）、（ｙ）及び（ｚ）を順次実施することにより、ゲル殻と、当該ゲル殻に被覆された液体芯と、を有する本容器が得られる。
　上記（ｂ）について、本容器の液体芯に精子を注入する方法は、本容器外の精子を、そのゲル殻を介して、当該液体芯に注入できる方法であれば、特に限られないが、インジェクションピペットを使用することが好ましい。
　図１Ｂには、本容器１０の液体芯１２に、インジェクションピペット２０を使用して、精子Ｓを注入する様子の一例を示す。すなわち、液体芯１２への精子Ｓの注入は、まずインジェクションピペット２０の内部に精子Ｓを保持し、次いで、当該精子Ｓを保持している当該インジェクションピペット２０の先端部を本容器１０のゲル殻１１に刺して貫通させ、その後、当該インジェクションピペット２０内の精子Ｓを液体芯１２中に放出することにより行う。
　インジェクションピペットは、その内部に精子を保持可能な中空の針状部材であれば特に限られないが、体外受精（例えば、顕微授精）で使用されるものが好ましく使用される。インジェクションピペットは、その内径が４μｍ～１０μｍであるものが好ましく使用される。インジェクションピペットは、ガラス製又は透明な樹脂製のものが好ましく使用される。
　また、インジェクションピペットを使用する場合、図１Ｂに示すように、本容器１０は、ホールディングピペット３０により保持しておくことが好ましい。すなわち、この場合、まず本容器１０をホールディングピペット３０の先端部に保持し、その後、上述のようにして、インジェクションピペット２０を使用して、当該ホールディングピペット３０に保持された本容器１０の液体芯１２に精子Ｓを注入する。
　ホールディングピペットは、その先端部に本容器を保持可能な中空の棒状部材であれば特に限られないが、体外受精（例えば、顕微授精）で使用されるものが好ましく使用される。ホールディングピペットは、その内径が１５μｍ～３０μｍであるものが好ましく使用される。ホールディングピペットは、ガラス製又は透明な樹脂製のものが好ましく使用される。
　このように、上記（ｂ）に係る本容器の液体芯への精子の注入は、顕微授精において卵細胞に精子を注入する操作と同様の操作で行うことが好ましい。この場合、例えば、顕微授精の操作に慣れた胚培養士によって、本容器への精子の注入を効率よく確実に行うことができる。
　なお、本容器に保持する精子は、当然ながら、生きた精子である。本容器に保持する精子の由来は特に限られず、ヒトの精子であってもよいし、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ又はブタ）の精子であってもよい。
　ただし、本発明は、特に、希少な精子の凍結保存、及び凍結保存後の希少な精子を使用する体外受精において有用である。したがって、本発明は、ヒトの精子、特に、乏精子症又は無精子症のヒト患者に由来する希少な精子（例えば、乏精子症の男性患者の精液から採取された精子、又は無精子症の男性患者の精巣から採取された精子）を使用する場合に有用である。
　上記（ｃ）に係る凍結保存の方法は、本容器に保持された精子を、解凍後も生存可能に凍結して保存できる方法であれば特に限られない。すなわち、例えば、まず細胞凍結保存用容器（例えば、市販の凍結保存器具（Ｃｒｙｏｔｏｐ（登録商標）、ＫＩＴＡＺＡＴＯ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製））に、精子を保持した本容器を入れ、次いで、液体窒素を使用して、当該本容器を凍結保存に適した低温（例えば、－１９６℃以下）に維持することにより、当該本容器内の精子及び液体芯を凍結する。その結果、図１Ｃに示すように、凍結された精子Ｓ及び液体芯１２を含む本容器１０が得られる。凍結保存の時間は、特に限られず、解凍後の精子を使用した体外受精を実施する時期に応じて、適宜決定される。
　上記（ｄ）に係る解凍の方法は、本容器内で凍結保存された精子を、解凍後も生存した状態に維持できる方法であれば特に限られない。すなわち、例えば、凍結保存後の本容器を、精子の生存に適した温度（例えば、３７℃）の溶液中に浸漬することにより、当該精子を解凍する。その結果、図１Ｄに示すように、凍結保存前と同様、生きた精子Ｓを含む液体芯１２と、当該液体芯１２を被覆するゲル殻１１とを有する本容器１０が得られる。
　上記（ｅ）に係るゲル殻の分解に使用する酵素は、当該ゲル殻に含まれるグリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を分解するものであれば、特に限られない。すなわち、ゲル殻がヒアルロン酸鎖を含む場合、当該ヒアルロン酸鎖を分解する酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）を使用する。ゲル殻がコンドロイチン硫酸鎖を含む場合、当該コンドロイチン酸鎖を分解する酵素（例えば、コンドロイチナーゼ）を使用する。ゲル殻がケラタン硫酸鎖を含む場合、当該ケラタン酸鎖を分解する酵素（例えば、ケラタナーゼ）を使用する。ゲル殻がヘパラン硫酸鎖及び／又はヘパリン鎖を含む場合、当該ヘパラン硫酸鎖及び／又はヘパリン鎖を分解する酵素（例えば、ヘパリナーゼ）を使用する。ゲル殻がセルロース鎖を含む場合、当該セルロース鎖を分解する酵素（例えば、セルラーゼ）を使用する。
　ここで、本実施形態に係る精子凍結保存方法及び体外受精方法においては、ゲル殻は、ヒアルロン酸鎖を含み、解凍後の本容器の当該ゲル殻を、当該ヒアルロン酸鎖を分解する酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）で処理することが好ましい。
　この場合、生体適合性に優れたヒアルロン酸鎖と、従来の体外受精でも使用され安全性が確認されているヒアルロニダーゼとを使用することにより、精子の凍結保存及び体外受精において、高い安全性と確実性とを実現することができる。
　ゲル殻の分解においては、本容器の液体芯に保持されていた精子が回収可能となる程度（例えば、インジェクションピペットを当該ゲル殻に貫通させることなく使用して、本容器に保持されていた精子を回収できる程度、又は本容器に保持されていた精子が当該本容器の外に出ていくことができる程度）に、当該ゲル殻の少なくとも一部を分解すればよい。図１Ｅには、本容器のゲル殻１１が酵素分解により消失し（破線）、当該本容器の液体芯１２に保持されていた生きた精子Ｓが、容易に回収可能になった様子を示している。ゲル殻の酵素分解に要する時間は、使用する酵素の量や、温度等の条件によって変わるが、可能な限り短時間であることが好ましく、例えば、３０分以下であることが好ましく、１０分以下であることが特に好ましい。
　上記（ｆ）に係る精子の回収方法は、ゲル殻の酵素分解によって解放された生きた精子を、その後の利用に適した状態で回収できる方法であれば、特に限られない。精子の回収においては、例えば、インジェクションピペットを使用することとしてもよい。図１Ｆには、インジェクションピペット２０を使用して、精子Ｓを回収する様子の一例を示す。インジェクションピペットを使用して精子を回収することにより、その後、当該精子を使用した体外受精（特に、顕微授精）を効率よく行うことができる。
　本実施形態に係る体外受精方法においては、さらに、上記（ｆ）で回収された精子を使用して、上記（ｇ）に係る体外受精を行う。すなわち、生体外において、本容器から回収された精子を、体外受精に使用するために予め採取された卵細胞と接触させ、受精卵を作製する。
　上記（ｇ）に係る体外受精は、顕微授精であることとしてもよい。図１Ｇには、顕微授精の様子の一例を示す。図１Ｇに示す例において、顕微授精は、顕微鏡下で、内部に精子Ｓを保持したインジェクションピペット２０の先端部を、ホールディングピペット３０に保持された卵細胞Ｅの透明帯Ｚを介して細胞質Ｃ内に挿入して、当該インジェクションピペット２０から当該細胞質Ｃ内に精子Ｓを放出することにより行われる。
　本実施形態においては、上述の（ａ）～（ｆ）を順次実施することにより、精子の数が少ない場合であっても、当該精子の凍結保存及び回収を効果的に実施することができる。また、上述の（ａ）～（ｇ）を順次実施することにより、精子の数が少ない場合であっても、当該精子を使用した体外受精を効果的に実施することができる。
　すなわち、特に、上記（ａ）、（ｂ）、（ｅ）及び（ｆ）によって、本容器への精子の保持や、凍結保存後の本容器からの精子の回収を、効率的に、且つ確実に実施することができる。
　具体的に、例えば、上記（ｂ）について、本容器への精子の注入をインジェクションピペットを使用して行い、上記（ｅ）について、解凍後の本容器のゲル殻を酵素処理で分解し、上記（ｆ）で本容器からの精子の回収をインジェクションピペットを使用して行う場合には、当該インジェクションピペットの操作に慣れた技術者（例えば、胚培養士）によって、精子の状態を良好に維持しつつ、当該精子の凍結保存、回収及び体外受精への適用を、効率的に、且つ確実に実施ことができる。
　次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
　グリコサミノグリカン鎖を分解する酵素及びセルロース鎖を分解する酵素が、精子の生存率及び運動率に及ぼす影響を評価した。分解酵素としては、市販のものを使用した。すなわち、ヒアルロン酸鎖分解酵素として、ヒアルロニダーゼ（Ｉｒｖｉｎｅ社製）を使用した。セルロース鎖分解酵素として、セルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を使用した。また、アルギン酸分解酵素であるアルギン酸リアーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）も使用した。
　分解酵素と接触させる精子としては、ヒトの体外受精（ＩＶＦ）において、ヒト男性患者から採取されたが使用されなかった精子を使用した。すなわち、医療法人三慧会　ＩＶＦなんばクリニック（大阪府、日本）において、体外受精のために採取されたが使用されなかった精子を、インフォームドコンセントを行い同意を得た後に使用した。
　具体的に、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの精子と、分解酵素（４０ＩＵ/ｍＬのヒアルロニダーゼ、１ｍｇ／ｍＬのセルラーゼ、又は０．２ｍｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼ）とを含む溶液を調製し、得られた溶液を３７℃で１時間インキュベートすることにより、当該精子と当該分解酵素とを接触させた。また、比較対照として、分解酵素を含まないこと以外は同様にして調製された、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの精子を含有する溶液を３７℃で１時間インキュベートした。
　インキュベート後の各溶液中の精子の生存率及び運動率を評価した。精子の生存性は、低張液尾部膨化試験により評価した。すなわち、低張液（１５０ｍＯｓｍ）５００μＬに、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの精子を含む生理食塩水５０μＬを滴下し、室温で３０分間インキュベートした。その後、尾部の膨化が確認された精子を生存精子と評価した。そして、顕微鏡下で、１００個の精子に含まれる生存精子の数をカウントし、当該生存精子の数を精子生存率（％）とした。精子の運動率は、マクラーチャンバー（ＳＥＦＩ－ＭＥＤＩＣＡＬ　ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ社）を用い、顕微鏡下で、視野内で運動している精子の数をカウントし、当該視野内の全ての精子の数に対する、当該運動している精子の数の割合を、精子運動率（％）として算出した。
　図２Ａ及び図２Ｂには、それぞれ精子の生存率及び運動率を評価した結果を示す。図２Ａ及び図２Ｂに示すように、ヒアルロニダーゼ、セルラーゼ及びアルギン酸リアーゼのいずれと接触した精子の生存率及び運動率も、酵素と接触していない精子のそれらと大差なく、統計的に有意な差は認められなかった（Ｔｕｒｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ法）。すなわち、ヒアルロニダーゼ、セルラーゼ及びアルギン酸リアーゼのいずれも、精子に対して、その生存率及び運動率を低下させるような影響は及ぼさないことが確認された。
［精子凍結保存用容器の製造］
　まずヒアルロン酸（分子量約１００万、ＪＮＣ社製）に、架橋性官能基としてフェノール基を化学的に導入することにより、ヒアルロン酸誘導体（架橋性ヒアルロン酸）を製造した。すなわち、３０ｍＭの２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６）にヒアルロン酸を０．１％（ｗ／ｖ）となるように溶解した後、さらにチラミン塩酸塩（東京化成社製）を０．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解させた。次いで、得られた溶液にさらに、水溶性カルボジイミド（ペプチド研究所製）及びヒドロキシスクシイミド（和光純薬社製）をそれぞれ０．４７％（ｗ／ｖ）及び０．２７％（ｗ／ｖ）となるように添加し、室温で２０時間撹拌した。そして、透析膜（分画分子量１０，０００～２０，０００）を用いた精製水中での透析を行った後に、溶液を凍結真空乾燥することにより、ヒアルロン酸鎖とフェノール基とを含むヒアルロン酸誘導体を得た。
　一方、２１Ｇ（ゲージ）シリンジ内に、２６Ｇシリンジを配置することで、二重管構造を形成した。ここで、２６Ｇシリンジの先端部が、２１Ｇシリンジ内に配置されるよう、当該２６Ｇシリンジを配置した。
　次いで、２６Ｇシリンジ内に７．５％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液を４．５ｍＬ／ｈの流速で流すとともに、当該２６Ｇシリンジと２１Ｇシリンジとの間に流動パラフィンを４．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で流して、当該ゼラチン溶液を、当該２６Ｇシリンジの当該先端部から、当該流動パラフィン中に流出させた。その後、こうして得られた、ゼラチン溶液の液滴を含む流動パラフィンを氷水中で冷却することにより、当該流動パラフィン中に分散された球状のゼラチンゲルビーズ（ゲル芯）を形成した。その後、得られたゼラチンゲルビーズをリン酸緩衝生理食塩水により複数回洗浄し、流動パラフィンを除去した。
　一方、上述のようにして製造したヒアルロン酸誘導体を０．８％（ｗ／ｖ）含有するＨＡ溶液と、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ、和光純薬社製）を１１００Ｕ／ｍＬ含有するＨＲＰ溶液とを体積比１０：１（ヒアルロン酸溶液：ＨＲＰ溶液）で混合することにより、ＨＡ／ＨＲＰ溶液を調製した。
　次いで、ＨＡ／ＨＲＰ溶液に、上述のようにして調製したゼラチンゲルビーズを懸濁して、当該ゼラチンゲルビーズを０．１ｍＬ／ｍＬで含むＨＡ／ＨＲＰ溶液を調製した。また、過酸化水素水（３５％（ｗ／ｖ）、和光純薬社製）５ｍＬを流動パラフィン１Ｌに添加して、ホモジナイザーを用いた３０分間の撹拌を行った。その後、遠心分離により未溶解の過酸化水素水を除去することにより、過酸化水素を含む流動パラフィンを調製した。
　上述のゼラチンゲルビーズの形成と同様に、２１Ｇシリンジ内に、２６Ｇシリンジを配置することで、二重管構造を形成した。そして、２６Ｇシリンジ内にゼラチンゲルビーズ含有ＨＡ／ＨＲＰ溶液を４．５ｍＬ／ｈの流速で流すとともに、当該２６Ｇシリンジと２１Ｇシリンジとの間に過酸化水素含有流動パラフィンを４．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で流して、当該ゼラチンゲルビーズ含有ＨＡ／ＨＲＰ溶液を、当該２６Ｇシリンジの先端から、過酸化水素含有流動パラフィン中に流出させた。こうして、過酸化水素含有流動パラフィン中に分散された、ゼラチンゲルビーズ（ゲル芯）と、当該ゼラチンゲルビーズを被覆するヒアルロン酸ゲル膜（ゲル殻）とから構成される球状の複合ゲルビーズを形成した。
　すなわち、ゼラチンゲルビーズを被覆するＨＡ／ＨＲＰ溶液層を、過酸化水素含有流動パラフィンに接触させることにより、当該ＨＡ／ＨＲＰ溶液層を架橋してゲル化し、当該ゼラチンゲルビーズを被覆するヒアルロン酸ゲル膜を形成した。得られた複合ゲルビーズを遠心分離により回収した。
　次いで、回収された複合ゲルビーズを含む溶液を培養液（ＧＭ５０１、ＧＹＮＥＭＥＤ社）に添加し、当該複合ゲルビーズの選別を行った。すなわち、実体顕微鏡下において、回収された複合ゲルビーズのうち、ゼラチンゲルビーズのゲル芯を視認できる複合ゲルビーズのみを、外径約２００μｍ～３００μｍの細いガラスピペットを用いて、選択的に採取した。
　その後、上述のようにして選別された複合ゲルビーズを０．４％（ｗ／ｖ）トリプシンＥＤＴＡ溶液中、３７℃で２分間保持して、当該複合ゲルビーズ内部のゼラチンゲルビーズを溶解した。こうして、精子凍結保存用容器として、ゼラチンゲルビーズの溶解により形成された液体芯と、当該液体芯を被覆するヒアルロン酸ゲル膜とから構成されるヒアルロン酸カプセル（ＨＡカプセル）を得た。
　上述のようにして製造されたＨＡカプセルの直径は、２１９±１８μｍ（平均直径±標準偏差）であり、ヒアルロン酸ゲル膜の厚さは、３０±７μｍ（平均厚さ±標準偏差）であった。なお、ＨＡカプセルの直径及びヒアルロン酸ゲル膜の厚さは、光学顕微鏡により撮影した１００個のＨＡカプセルの写真を画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ、アメリカ国立衛生研究所製）を用いて解析することにより測定した。
［精子凍結保存］
　ＨＡカプセルで凍結保存する精子としては、ヒトの体外受精において、ヒト男性患者から採取されたが使用されなかった精子を使用した。すなわち、医療法人三慧会　ＩＶＦなんばクリニック（大阪府、日本）において、体外受精のために採取されたが使用されなかった精子を、インフォームドコンセントを行い同意を得た後に使用した。
　一方、顕微授精に使用される、ホールディングピペット（ＫＩＴＡＺＡＴＯ社）、インジェクションピペット（Ｓｕｎｌｉｇｈｔ　ｍｅｄｉｃａｌ社）、及び位相差顕微鏡を備えたマイクロマニピュレーションシステム（ＮＡＲＩＳＩＧＥ社）を準備した。ホールディングピペットは、内径約１５μｍのガラス製ピペットであった。インジェクションピペットは、内径約４μｍのガラス製ピペットであった。
　まず、ＨＡカプセルの液体芯に精子を注入した。すなわち、位相差顕微鏡下でホールディングピペットを操作し、顕微鏡ステージ上に置かれたシャーレ内の培養液（Ｉｒｖｉｎｅ社）中において、上述のようにして得られたＨＡカプセルを当該ホールディングピペットの先端部に保持した。
　一方、位相差顕微鏡下でインジェクションピペットを操作し、顕微鏡ステージ上に置かれたシャーレ内の培養液（Ｉｒｖｉｎｅ社）中において、３個の精子を当該インジェクションピペットの内部に保持した。
　そして、位相差顕微鏡下でインジェクションピペットを操作し、ホールディングピペットに保持されたＨＡカプセル内の液体芯中に、当該インジェクションピペットから３個の精子を注入した。
　すなわち、内部に精子を保持したインジェクションピペットの先端部を、ＨＡカプセルのヒアルロン酸ゲル膜に刺し込んで貫通させ、当該ＨＡカプセルの液体芯中に配置された当該インジェクションピペットの先端部から、当該液体芯中に精子を放出した。こうして、３個の精子を保持したＨＡカプセルを得た。
　同様にして、各々が３個の精子を保持したＨＡカプセルを合計で１１個得た。なお、上述したインジェクションピペット及びホールディングピペットを使用したＨＡカプセルへの精子の注入操作は、顕微授精に慣れた胚培養士が行った。
　また、比較対照として、顕微授精後、受精しなかった卵細胞から調製した透明帯から構成される中空のカプセル（ＺＰカプセル）を用意した。このＺＰカプセルは、顕微授精において、ヒトから採取されたが受精しなかった卵細胞を１７μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈｉ社）で処理し、次いで、その細胞質をインジェクションピペットで吸引して除去することにより調製した。なお、この卵細胞としては、医療法人三慧会　ＩＶＦなんばクリニック（大阪府、日本）において、体外受精のために採取されたが使用されなかった卵細胞を、インフォームドコンセントを行い同意を得た後に使用した。そして、上述のＨＡカプセルと同様の操作により、ＺＰカプセルの液体芯に精子を注入することにより、各々が３個の精子を保持したＺＰカプセルを合計で１１個得た。
　次いで、精子を保持したＨＡカプセル及びＺＰカプセルを凍結保存した。すなわち、６ｃｍ径の細胞培養用ディッシュ上に、０．１Ｍスクロース－２０％代替血清（ｓｅｒｕｍ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）含有凍結液１０μＬの液滴を複数形成した。そして、１つの液滴に、上述のようにして得られた精子含有ＨＡカプセル又は精子含有ＺＰカプセルを１つずつ懸濁し、室温で５分間インキュベートした。
　その後、市販の凍結保存器具（Ｃｒｙｏｔｏｐ（登録商標）、ＫＩＴＡＺＡＴＯ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）上に、インキュベート後の上記カプセル含有凍結液約１．０μＬの液滴を形成し、当該液滴を、液体窒素の液面から４．５ｃｍ離れた位置で液体窒素蒸気に曝した状態で２分間インキュベートした。さらに、液体窒素蒸気上でインキュベート後の上記凍結保存器具を、液体窒素中で２４時間以上凍結保存した。
　次いで、凍結保存後のＨＡカプセル及びＺＰカプセルを解凍した。すなわち、液体窒素から取り出した凍結保存器具を、３７℃の培養液中で１分間インキュベートすることにより、当該凍結保存器具内のＨＡカプセル及びＺＰカプセルを解凍した。
　そして、解凍後のＨＡカプセル及びＺＰカプセルのそれぞれについて、カプセル回収率、精子回収率、及び精子運動率を評価した。すなわち、ＨＡカプセルについては、まず、６ｃｍ径の細胞培養用ディッシュ上に、４０ＩＵ/ｍＬのヒアルロニダーゼを含む溶液１０μＬの液滴を形成した。次いで、この液滴中に、解凍後のＨＡカプセルを懸濁し、当該液滴を５ｍＬの培養ミネラルオイル（ＫＩＴＡＺＡＴＯ）で被覆した。さらに、このＨＡカプセル含有液滴を３７℃で１０分間インキュベートすることで、当該ＨＡカプセルのヒアルロン酸ゲル膜（ゲル殻）を分解した。その後、インジェクションピペットを使用して、ＨＡカプセルに保持されていた精子を回収した。そして、顕微鏡下にて、ＨＡカプセルから回収された精子の数、及び回収された精子のうち、運動している精子の数をそれぞれカウントした。
　精子回収率は、次の式により算出した：精子回収率（％）＝（ＨＡカプセルのゲル殻分解後に回収された精子の数／ＨＡカプセルに注入して保持した精子の数）×１００。精子運動率は、次の式により算出した：精子運動率（％）＝ＨＡカプセルから回収され、且つ運動していた精子の数／ＨＡカプセルから回収され精子の数）×１００。
　一方、ＺＰカプセルについては、まず、６ｃｍ径の細胞培養用ディッシュ上に、培養液（Ｉｒｖｉｎｅ社）１０μLの液滴を形成した。次いで、この液滴中に、解凍後のＺＰカプセルを懸濁した。その後、インジェクションピペットを使用して、ＺＰカプセルから精子を吸引して回収した。そして、ＺＰカプセルから回収された精子の数、及び回収された精子のうち、運動している精子の数をそれぞれカウントした。
　精子回収率は、次の式により算出した：精子回収率（％）＝（ＺＰカプセルから回収された精子の数／ＺＰカプセルに注入して保持した精子の数）×１００。精子運動率は、次の式により算出した：精子運動率（％）＝ＺＰカプセルから回収され、且つ運動していた精子の数／ＺＰカプセルから回収され精子の数）×１００。
［結果］
　図３には、解凍後のＨＡカプセル及びＺＰカプセルのそれぞれについて、カプセル回収率、精子回収率、及び精子運動率を評価した結果を示す。図３に示すように、ＨＡカプセル及びＺＰカプセルのそれぞれについて、１１個全てのカプセルを回収できた。
　ＨＡカプセルについて、凍結保存された３３個の精子のうち、３０個の精子を回収できたため、精子回収率は９０．９±１５．５％であった。ＺＰカプセルについて、３２個の精子を回収できたため、精子回収率は９７．０±１０．０％であった。精子回収率について、ＨＡカプセルとＺＰカプセルとについて統計的に有意な差は認められなかった（ｔ－ｔｅｓｔ）。
　ＨＡカプセルについて、回収された３０個の精子のうち、５個の精子の運動が確認されたため、精子運動率は１５．１±１７．４％であった。ＺＰカプセルについて、回収された３２個の精子のうち、７個の精子の運動が確認されたため、精子運動率は２１．２±１６．８％であった。精子運動率について、ＨＡカプセルとＺＰカプセルとについて統計的に有意な差は認められなかった（ｔ－ｔｅｓｔ）。
　なお、いずれのカプセルから回収された精子についても、精子運動率が比較的低い理由の一つとしては、体外受精後の余剰精子を使用したことが考えられた。以上より、ＨＡカプセルを使用することによって、ＺＰカプセルを使用した場合と同等のカプセル回収率、精子回収率、及び精子運動率が得られることが確認された。
　ＨＡカプセルからの精子回収方法として、当該ＨＡカプセルのヒアルロン酸ゲル膜をヒアルロニダーゼで分解して精子を回収する方法と、当該ＨＡカプセルのヒアルロン酸ゲル膜を分解することなく、インジェクションピペットによる吸引によって精子を回収する方法と、を比較した。なお、全ての例において、インジェクションピペットの操作は、顕微授精に慣れた胚培養士が行った。
　上述の実施例２と同様にして、ＨＡカプセルを製造した。ＨＡカプセルで保持する精子としては、ヒトの体外受精において、ヒト男性患者から採取されたが使用されなかった精子を使用した。すなわち、医療法人三慧会　ＩＶＦなんばクリニック（大阪府、日本）において、体外受精のために採取されたが使用されなかった精子を、インフォームドコンセントを行い同意を得た後に使用した。
　そして、上述の実施例２と同様にして、６個のＨＡカプセルのそれぞれに、３個の精子を注入し、各々が３個の精子を保持したＨＡカプセルを６個得た。得られた精子含有ＨＡカプセルを３７℃で１５分間インキュベートした。
　上述のようにして得られた精子含有ＨＡカプセル３個の各々について、ヒアルロン酸ゲル膜の酵素分解による精子の回収を行った。すなわち、精子含有ＨＡカプセル３個と、４０ＩＵ／ｍＬのヒアルロニダーゼとを含む懸濁液３μＬを調製し、得られた当該懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートすることにより、当該ＨＡカプセルのヒアルロン酸ゲル膜を分解した。
　ヒアルロン酸ゲル膜の分解によってＨＡカプセルから解放された精子をインジェクションピペット内に吸引した。次いでインジェクションピペット内の精子を、１０μＬのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、分子量３６万）中に放出した。
　そして、ＨＡカプセルに保持された精子の数に対する、ＰＶＰ中に回収された精子の数の割合（％）を精子回収率として評価した。また、ＰＶＰ中に回収された精子の数に対する、運動性が確認された精子の数の割合（％）を精子運動率として評価した。
　一方、上述のようにして得られた他の精子含有ＨＡカプセル３個の各々について、ヒアルロン酸ゲル膜を分解することなく、インジェクションピペットによる精子の回収を行った。
　すなわち、精子含有ＨＡカプセル３個のそれぞれについて、インジェクションピペット（内径約４μｍのガラス製ピペット）の先端部を、ヒアルロン酸ゲル膜を介して液体芯に刺し込み、当液体芯中の精子を当該インジェクションピペット内に吸引した。
　次いで、インジェクションピペット内の精子を、１０μＬのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、分子量３６万）中に放出した。そして、ＨＡカプセルに保持された精子の数に対する、ＰＶＰ中に回収された精子の数の割合（％）を精子の回収率として評価した。また、ＰＶＰ中に回収された精子の数に対する、運動性が確認された精子の数の割合（％）を精子の運動率として評価した。
［結果］
　図４には、ヒアルロン酸ゲル膜の酵素分解により精子を回収した場合、及び当該ヒアルロン酸ゲル膜を分解することなくインジェクションピペットにより精子を回収した場合のそれぞれについて、精子回収率及び精子運動率を評価した結果を示す。
　図４に示すように、インジェクションピペットによる回収方法においては、ＨＡカプセルに保持された９個の精子のうち、５個の精子が回収されたが、４個の精子は回収することができず、精子回収率は５５．６％であった。
　これは、インジェクションピペットによる回収方法においては、ＨＡカプセルの液体芯を構成する液体の吸引に伴って当該ＨＡカプセルが大きく変形してしまい、回収できない精子があったためであった。
　また、インジェクションピペットによる回収方法において、回収された５個の精子のうち、２個の精子について運動性が確認されたが、３個の精子については運動性が確認されず、精子運動率は４０．０％であった。
　これは、インジェクションピペットによる回収方法においては、ＨＡカプセル内でインジェクションピペットの先端部を操作して、動く精子を適切に吸引することは容易ではなく、その回収に比較的長い時間を要したこと、及び当該インジェクションピペット内に精子を吸引する際に、当該インジェクションピペットとの接触によって当該精子の頭部又は尾部が傷つけられた可能性が考えられた。
　これに対し、ヒアルロン酸ゲル膜の酵素分解による回収方法においては、精子回収率は８８．９％であり、精子運動率は１００％であった。このように、ＨＡカプセルに保持された精子の回収方法としては、インジェクションピペットによる回収方法に比べて、当該ＨＡカプセルのヒアルロン酸ゲル膜の酵素分解による回収方法の方が、簡便、迅速、且つ確実であり、顕著に優れていることが確認された。
　すなわち、本容器のゲル殻を酵素分解して精子を回収する方法によれば、凍結保存後の希少な精子を、その生存及び運動性を良好に維持しつつ、効率的に、且つ確実に回収できることが確認された。
　セルロース鎖を含むゲル殻を有する精子保存用容器を製造した。すなわち、まず上述の実施例２におけるヒアルロン酸誘導体の製造と同様に、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（４００－８００ｃｐｓ－２％　ａｑｕｅｏｕｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｔ　２５℃、Ｓｉｇｍａ社製）に、架橋性官能基としてフェノール基を化学的に導入することにより、ＣＭＣ誘導体（架橋性ＣＭＣ）を製造した。具体的に、ＣＭＣ及びチラミン塩酸塩を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）にそれぞれ１％（ｗ／ｖ）及び４６ｍＭとなるように溶解させた。次いで、得られた溶液に、さらに水溶性カルボジイミド及びヒドロキシスクシイミドをそれぞれ４５．８ｍＭ及び２２．９ｍＭとなるように溶解させ、２５℃にて２４時間撹拌した。そして、透析膜（分画分子量１０，０００～２０，０００）を用いた精製水中での透析を行った後に、溶液を凍結真空乾燥することにより、セルロース鎖とフェノール基とを含むＣＭＣ誘導体を得た。
　次いで、上述の実施例２におけるＨＡカプセルの製造において、ヒアルロン酸誘導体を０．８％（ｗ／ｖ）含有するＨＡ溶液に代えて、ＣＭＣを１．０％（ｗ／ｖ）含有するＣＭＣ溶液を使用したこと以外は同様にして、精子凍結保存用容器として、ゼラチンゲルビーズ（ゲル芯）の溶解により形成された液体芯と、当該液体芯を被覆するＣＭＣゲル膜（ゲル殻）とから構成されるＣＭＣカプセルを得た。こうして製造されたＣＭＣカプセルの平均直径は、１５６μｍであり、ＣＭＣゲル膜の平均厚さは、２５μｍであった。
　また、比較対照として、液体芯と、当該液体芯を被覆するアルギン酸ゲル膜（ゲル殻）とから構成される精子凍結保存用容器を製造した。すなわち、０．６％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム溶液、又は１．０％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム溶液にゼラチンゲルビーズを分散させた。次いで、得られた溶液を２６Ｇの注射針がついた注射器から、静電気力を使用して、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に滴下することにより、ゼラチンゲルビーズ（ゲル芯）と当該ゼラチンゲルビーズを被覆するアルギン酸ゲル膜（ゲル殻）とから構成される球状の複合ゲルビーズを形成した。その後、上述の実施例２と同様にして、複合ゲルビーズ中のゼラチンゲルビーズを選択的に溶解することにより、精子凍結保存用容器として、当該ゼラチンゲルビーズ（ゲル芯）の溶解により形成された液体芯と、当該液体芯を被覆するアルギン酸ゲル膜（ゲル殻）とから構成されるＡＧカプセルを得た。
　そして、上述のようにして製造された５個のＣＭＣカプセル、５個の０．６％ＡＧカプセル、及び５個の１．０％ＡＧカプセルのそれぞれについて、インジェクションピペットを、そのゲル殻を介して液体芯中に刺し込むことができるかどうかを検討した。なお、全ての例において、インジェクションピペットの操作は、顕微授精に慣れた胚培養士が行った。
　その結果、０．６％ＡＧカプセル及び１．０％ＡＧカプセルの全てについて、インジェクションピペットを、そのゲル殻（アルギン酸ゲル膜）に貫通させることができなかった。すなわち、ＡＧカプセルのゲル殻に刺したインジェクションピペットは、その先端部が当該ゲル殻を貫通する前に曲がってしまい、使用することができなくなってしまった。
　これに対し、ＣＭＣカプセルについては、５個のＣＭＣカプセルのうち、３個のＣＭＣカプセルについて、インジェクションピペットをそのゲル殻（ＣＭＣゲル膜）に貫通させることができた。
　以上より、ＣＭＣカプセルもまた、インジェクションピペットを使用して、その液体芯に精子を注入することが可能と考えられた。ただし、上述の実施例２のとおり、ＨＡカプセルの方が、ＣＭＣカプセルに比べて、より効率よく、且つ確実に、精子の注入が可能であった。
[参考例]
　液体芯と、当該液体芯を被覆するアガロースゲル膜（ゲル殻）とから構成される精子保存用容器を製造した。すなわち、まず上述の実施例２におけるヒアルロン酸誘導体の製造と同様に、アルギン酸（アルギン酸ナトリウム、Ｉ－１Ｇ、Ｋｉｍｉｃａ社製）に、架橋性官能基としてフェノール基を化学的に導入することにより、アルギン酸誘導体（架橋性アルギン酸）を製造した。具体的に、アルギン酸及びチラミン塩酸塩を５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）にそれぞれ０．５％（ｗ／ｖ）及び４．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解させた。次いで、得られた溶液に、さらに水溶性カルボジイミド及びヒドロキシスクシイミドをそれぞれ２５．２ｍＭ及び１２．６ｍＭとなるように溶解させ、２５℃で２０時間撹拌した。そして、透析膜（分画分子量１０，０００～２０，０００）を用いた精製水中での透析を行った後に、溶液を凍結真空乾燥することにより、アルギン酸鎖とフェノール基とを含むアルギン酸誘導体を得た。次いで、得られたアルギン酸誘導体０．６（ｗ／ｖ）と、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ１００Ｕ／ｍＬとを含み、カルシウムを含まないＫｒｅｂｓ　Ｒｉｎｇｅｒ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ＣＦ－ＫＲＨ、ｐＨ７．４）を調製した。
　一方、上述の実施例２と同様に、２１Ｇシリンジ内に、２６Ｇシリンジを配置することで、二重管構造を形成した。そして、上述の実施例２と同様に、２６Ｇシリンジ内にＣＦ－ＫＲＨを４．５ｍＬ／ｈの流速で流すとともに、当該２６Ｇシリンジと２１Ｇシリンジとの間に、上述の実施例２と同様に調製した過酸化水素含有流動パラフィンにさらにレシチンを３％（ｗ／ｗ）添加して得られた過酸化水素及びレシチン含有流動パラフィンを４．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で流して、当該ＣＦ－ＫＲＨを、当該２６Ｇシリンジの当該先端部から、当該流動パラフィン中に流出させた。こうして、流動パラフィン中に分散された球状のアルギン酸ゲルビーズ（ゲル芯）を形成した。その後、得られたアルギン酸ゲルビーズをＣＦ－ＫＲＨと混合し、次いで遠心分離することにより回収した。
　また、ＣＦ－ＫＲＨにアガロース（Ｓｉｇｍａ社製、Ｌｏｗ　ｇｅｌｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を４．０％（ｗ/ｖ）で分散させ、電子レンジで加温して溶解させることにより、４０℃のアガロース溶液を調製した。
　次いで、上述のようにして製造したアルギン酸ゲルビーズと、上記４０℃のアガロース溶液とを体積比１：２０（アルギン酸ゲルビーズ：アガロース溶液）にて混合することにより、当該アルギン酸ゲルビーズを含むアガロース溶液を調製した。
　そして、上述の実施例２と同様に、２１Ｇシリンジ内に、２６Ｇシリンジを配置することで形成された二重管構造において、当該２６Ｇシリンジ内にアルギン酸ゲルビーズ含有アガロース溶液を４．５ｍＬ／ｈの流速で流すとともに、当該２６Ｇシリンジと２１Ｇシリンジとの間に３％（ｗ/ｗ）のレシチンを含有する流動パラフィンを４．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で流して、当該アルギン酸ゲルビーズ含有アガロース溶液を、当該２６Ｇシリンジの先端から、レシチン含有流動パラフィン中に流出させた。そして、得られたエマルションを冷却することにより、レシチン含有流動パラフィン中に分散された、アルギン酸ゲルビーズ（ゲル芯）と、当該アルギン酸ゲルビーズを被覆するアガロースゲル膜（ゲル殻）とから構成される球状の複合ゲルビーズを形成した。得られた複合ゲルビーズを遠心分離により回収した。
　その後、回収された複合ゲルビーズを、０．２ｍｇ/ｍＬのアルギン酸リアーゼを含むＣＦ－ＫＲＨで１時間保持して、当該複合ゲルビーズ内部のアルギン酸ゲルビーズを分解することにより、精子凍結保存用容器として、当該アルギン酸ゲルビーズの分解により生成された液体芯と、当該液体芯を被覆するアガロースゲル膜（ゲル殻）とから構成されるアガロースカプセルを得た。こうして製造されたアガロースカプセルの直径は、約１５０μｍであり、アガロースゲル膜の厚さは、１０μｍ～３０μｍであった。
　次に、アガロースカプセルをアガラーゼと接触させた。すなわち、上述のようにして製造された約２００個のアガロースカプセルを、０．２ｍＬのＣＦ－ＫＲＨに分散することにより、アガロースカプセル含有ＣＦ－ＫＲＨを調製した。次いで、このアガロースカプセル含有ＣＦ－ＫＲＨ０．２ｍＬに、市販のアガラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　β－Ａｇａｒａｓｅ、株式会社ニッポンジーン製）を３０Ｕ／ｍＬ添加した。そして、アガロースカプセルとアガラーゼとを含むＣＦ－ＫＲＨを３７℃で５時間インキュベートした。
　しかしながら、５時間のインキュベート後においても、アガロースカプセルには何らの変化も見られなかった。すなわち、アガロースカプセルは、アガラーゼによって分解されなかった。
　なお、使用されたアガラーゼは、５０℃～６０℃で最大活性を示すものであったが、そのマニュアル（ウェブサイト（http://www.nippongene.com/pdf/manual/man_Thermostable_B_Agarase_ver4.pdf）で入手可能）によれば、３７℃でも当該最大活性の約半分の活性を示すものであった。また、上記マニュアルでは、２００ｍｇのアガロースゲルブロックに対して、６μＵのアガラーゼを使用し、５０℃～６０℃にて１０分で当該アガロースゲルブロックを分解することが記載されていた。

Claims (10)

  1. 　下記（ａ）～（ｆ）：
    （ａ）グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻と、前記ゲル殻に被覆された液体芯とを有する容器を用意すること；、
    （ｂ）前記容器の前記液体芯に精子を注入して、前記精子を保持した前記容器を得ること；、
    （ｃ）前記精子を保持した前記容器を凍結保存すること；、
    （ｄ）凍結保存後の前記容器を解凍すること；、
    （ｅ）解凍後の前記容器の前記ゲル殻を、前記グリコサミノグリカン鎖を分解する酵素及び／又は前記セルロース鎖を分解する酵素で処理して、前記ゲル殻の少なくとも一部を分解すること；及び
    （ｆ）前記ゲル殻の分解後に、前記容器に保持されていた前記精子を回収すること；
    　を含む
    　ことを特徴とする精子凍結保存方法。
  2. 　前記ゲル殻は、ヒアルロン酸鎖を含み、
    　解凍後の前記容器の前記ゲル殻を、前記ヒアルロン酸鎖を分解する酵素で処理する
    　ことを特徴とする請求項１に記載の精子凍結保存方法。
  3. 　下記（ａ）～（ｇ）：
    （ａ）グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻と、前記ゲル殻に被覆された液体芯とを有する容器を用意すること；、
    （ｂ）前記容器の前記液体芯に精子を注入して、前記精子を保持した前記容器を得ること；、
    （ｃ）前記精子を保持した前記容器を凍結保存すること；、
    （ｄ）凍結保存後の前記容器を解凍すること；、
    （ｅ）解凍後の前記容器の前記ゲル殻を、前記グリコサミノグリカン鎖を分解する酵素及び／又は前記セルロース鎖を分解する酵素で処理して、前記ゲル殻の少なくとも一部を分解すること；、
    （ｆ）前記ゲル殻の分解後に、前記容器に保持されていた前記精子を回収すること；及び
    （ｇ）回収された前記精子を使用して体外受精を行うこと；
    　を含む
    　ことを特徴とする体外受精方法。
  4. 　前記体外受精は、顕微授精である
    　ことを特徴とする請求項３に記載の体外受精方法。 
  5. 　グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻と、
    　前記ゲル殻に被覆された、精子を保持するための液体芯と、
    　を有する
    　ことを特徴とする精子凍結保存用容器。
  6. 　前記ゲル殻は、ヒアルロン酸鎖を含む
    　ことを特徴とする請求項５に記載の精子凍結保存用容器。
  7. 　前記容器の平均直径は、１０μｍ以上、３０００μｍ以下である
    　ことを特徴とする請求項５又は６に記載の精子凍結保存用容器。
  8. 　請求項１乃至４のいずれかに記載の方法に使用される
    　ことを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載の精子凍結保存用容器。
  9. 　ゲル殻と、前記ゲル殻に被覆された液体芯と、を有する精子凍結保存用容器の製造方法であって、
    　下記（ｘ）～（ｚ）：
    （ｘ）精子を含まない、溶解可能なゲル芯を形成すること；、
    （ｙ）前記ゲル芯を被覆する、グリコサミノグリカン鎖及び／又はセルロース鎖を含むゲル殻を形成すること；及び
    （ｚ）前記ゲル殻に被覆された前記ゲル芯を溶解することにより、精子を含まない前記液体芯を形成すること；
    　を含む
    　ことを特徴とする精子凍結保存用容器の製造方法。
  10. 　前記ゲル殻は、ヒアルロン酸鎖を含む
    　ことを特徴とする請求項９に記載の精子凍結保存用容器の製造方法。
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