JP2022536588A - 細胞の凍結保存のための組成物および方法 - Google Patents
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- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
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Abstract
凍結保存用組成物は、３００ｍＭ以下の組成物中の糖成分の総濃度を有する糖成分、２Ｍ以下の組成物中の糖アルコール成分の総濃度を有する糖アルコール成分、ならびにポリマー成分およびアルブミンの少なくとも１つを含み、但し、凍結保存用組成物が凍結保存量未満のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。細胞を凍結保存する方法は、細胞を凍結保存用組成物に加えること、凍結保存用組成物を凍結すること、凍結した凍結保存用組成物を保存すること、凍結保存用組成物を解凍すること、解凍した凍結保存用組成物から細胞を移すこと、ならびに細胞が生存可能であるために効果的な条件下で細胞を培養することを含む。上記凍結することは、０．１℃／分～５℃／分の速度で冷却することを含み得る。当該方法は、解凍後の洗浄工程なしで実施され得る。
Description
本出願は、細胞を凍結保存するための組成物および方法に関する。
［継続出願のデータ］
本出願は、引用により本明細書に組み込まれる、２０１９年４月３０日に出願された、米国仮特許出願第６２／８４０，６１７号の利益を主張する。
本出願は、引用により本明細書に組み込まれる、２０１９年４月３０日に出願された、米国仮特許出願第６２／８４０，６１７号の利益を主張する。
［政府の資金援助］
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたＥＢ０２３８８０のもと、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたＥＢ０２３８８０のもと、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本出願は、細胞を凍結保存するための組成物および方法に関する。凍結保存用組成物は、３００ｍＭ以下の凍結保存用組成物中の糖成分の総濃度を有する糖成分、２Ｍ以下の凍結保存用組成物中の糖アルコール成分の総濃度を有する糖アルコール成分、ならびに１％～１５％の濃度でのポリマー成分および０．５％～１０％の濃度でのアルブミンの少なくとも１つを含むことができ、但し、凍結保存用組成物は凍結保存量未満のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
糖成分は１ｍＭ～１００ｍＭの濃度で提供され得る。糖成分は、トレハロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、グルコース、デキストラン、メレジトース、ラフィノースラフィノース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、マルトトリウロース、ケストース、セロビオース、キトビオース、ラクツロース、またはそれらの組み合わせを含み得る。
糖アルコール成分は０．２Ｍ～１．２Ｍの濃度で提供され得る。糖アルコール成分は、グリセロール、ソルビトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、イノシトール、キシリトール、マンニトール、アラビトール、リビトール、エリスリトール、スレイトール、ガラクチトール、ピニトール、またはそれらの組み合わせを含み得る。
凍結保存用組成物は、０．１％～２．５％の濃度でイオン成分をさらに含み得る。凍結保存用組成物は、０．１ｍＭ～５０ｍＭの濃度でアミノ酸成分をさらに含み得る。アミノ酸成分は、イソロイシン、クレアチン、またはそれらの組み合わせを含み得る。凍結保存用組成物は第２のアミノ酸成分をさらに含み得る。第２のアミノ酸成分は、１つまたは複数のプロリン、バリン、アラニン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、チロシン、アルギニン、グルタミン、タウリン、ベタイン、エクトイン、ジメチルグリシン、エチルメチルグリシン、ＲＧＤペプチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。
凍結保存用組成物は細胞をさらに含んでもよい。細胞はｉＰＳ細胞であり得る。細胞は、生存可能な回復された凍結保存された細胞であり得る。
細胞を凍結保存する方法は、細胞を凍結保存用組成物に加えること、該組成物を凍結すること、凍結した組成物を０℃未満の温度で保存すること、該組成物を解凍すること、解凍した組成物から細胞を移すこと、および細胞が生存可能であるために効果的な条件下で細胞を培養することを含む。上記組成物の凍結は、０℃／分超から５℃／分までの速度で冷却することを含む。当該方法は、解凍後の洗浄工程なしで実施され得る。本開示の凍結保存方法は、定義された温度で氷核形成を活発に誘導する。
本開示は、細胞を凍結保存するための組成物および方法に関する。特に、本開示は、ＤＭＳＯを使用せずに細胞を凍結保存するための組成物および方法に関する。本開示の組成物は、凍結保存後およびその後の使用前に細胞を洗浄する必要がない方法で細胞を凍結保存するために使用することができる。
本明細書で使用される「実質的に（substantially）」という用語は、「著しく（significantly）」と同じ意味を有し、後に続く用語を少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％で修飾すると理解され得る。本明細書で使用される「実質的ではない（not substantially）」という用語は、「著しくない（not significantly）」と同じ意味を有し、「実質的に」の逆の意味を有する、すなわち、後に続く用語を２５％以下、１０％以下、５％以下、または２％以下で修飾すると理解され得る。
「約」という用語は、本明細書では、当業者によって予期される測定値の通常の変動を含むように数値と組み合わせて使用され、「ほぼ」と同じ意味を有し、記載値の±５％などの典型的な許容誤差をカバーすると理解される。
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの用語は、単一の実体のみを指すことを意図するものではなく、具体的な例が説明のために使用され得る一般的なクラスを含む。
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、「少なくとも１つ」という用語と交換可能に使用される。リストが続く「少なくとも１つ」および「少なくとも１つを含む」という句は、リストにある項目のいずれか１つおよびリストにある２つまたはそれ以上の項目の任意の組み合わせを指す。
本明細書で使用される場合、「または」という用語は、内容が明確に別段の指示をしない限り、「および／または」を含むその通常の意味で一般的に使用される。「および／または」という用語は、リストされた要素の１つもしくはすべてまたはリストされた要素の任意の２つもしくはそれ以上の組み合わせを意味する。
エンドポイントによる数値範囲の列挙には、その範囲内に含まれるすべての数が含まれる（たとえば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含むか、または１０以下は、１０、９．４、７．６、５、４．３、２．９、１．６２、０．３などを含む）。値の範囲が特定の値、「最大」または「少なくとも」である場合、その値は範囲内に含まれる。
「好ましい（preferred）」および「好ましくは（preferably）」という用語は、特定の状況下で特定の恩恵をもたらし得る実施形態に言及する。しかし、同じまたは他の状況下では、他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、特許請求の範囲などの本開示の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
「凍結保存量（cryopreservative amount）」という用語は、本明細書では、細胞などのサンプルの凍結保存を提供するのに十分な量を指すように使用される。「凍結保存量未満のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）」という句は、１４０ｍＭ未満のＤＭＳＯを指し得る。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は再生医療への現在のアプローチの基礎となるものである。たとえば、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、さまざまな体細胞からの再プログラミングから形成することができる多細胞凝集体であり、３つの胚葉すべてに分化される可能性があり、組織工学、疾患モデリング、およびパーソナライズされた薬において大変興味を引き付けられるものである。ｉＰＳ細胞は、分化されて肝臓細胞として機能する肝細胞を形成することができ、肝不全を治療するために肝補助装置または移植可能な肝臓で使用することができる。ｉＰＳ細胞はまた、神経細胞、心臓細胞、およびそうでなければ入手が困難な他の細胞タイプに分化され得る。しかし、そのような治療法の開発は細胞の入手可能性によって制限されている。
臨床的および科学的目的の両方のために、ｉＰＳ細胞の効果的な凍結保存が、凍結されたｉＰＳ細胞の輸送、貯蔵、および他の下流の使用のために必要とされる。しかし、凍結保存されたｉＰＳ細胞は、生存率、機能、または多能性の損失に対して脆弱である。
研究所およびバイオレポジトリでの現在の慣行は、所望の用途に応じて、凝集体または単一細胞のいずれかとしてｉＰＳ細胞を凍結保存することを伴う。ｉＰＳ細胞の凍結保存には、典型的に、ＤＭＳＯを含む溶液またはＤＭＳＯをほとんど含まない溶液という２種類の溶液のうちの１つ、および従来の徐冷またはガラス化という２つの異なる方法のうちの１つを要し得る。ガラス化は典型的に、凍結中の氷の形成を回避するために、高濃度の凍結防止剤を高い冷却速度と組み合わせて使用する。たとえば、サンプルは、専用のストローまたは膜に含まれ、液体窒素に急速に浸漬され得る。段階的冷却では、サンプルは、０℃（氷上）から－２０℃に移され得、その後、正規化されていない時間の間－８０℃に移され得、最終的に－１９６℃で保存され得る。冷凍庫内に細胞を収容し、冷却速度をおよそ１℃／分に減速するように構築されている専用の容器が利用可能である（商標名ＭＲ．ＦＲＯＳＴＹ（商標）およびＣＯＯＬＣＥＬＬ（商標）の下で販売される）。制御された凍結速度を提供する速度制御冷凍庫も利用可能である。従来の徐冷は典型的に、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の溶液および１℃／分の冷却速度を使用することを意味している。ガラス化では高い解凍後の回復率（最大約１００％）が観察されるが、当該方法では、スケーラビリティが低く、汚染のリスクが高いという制限に直面する。
ＤＭＳＯは、細胞に対して毒性であることが知られており、細胞のエピジェネティクスを変更し得る。これは、ｉＰＳ細胞などの再プログラムされている細胞の場合には、細胞の下流での使用に関する懸念につながりかねない。具体的には、ｉＰＳ細胞に関する懸念の１つは遺伝的安定性である。遺伝的安定性に影響を与える要因は、細胞の臨床使用に関する懸念を引き起こす。
凍結保存溶液中でＤＭＳＯを使用することで、ユーザは、溶液の導入後すぐに細胞を冷凍し、解凍後すぐに溶液を洗い流して、冷凍されていない／解凍された細胞のＤＭＳＯへの曝露時間を最小限に抑えることになる。この要件はワークフローに影響を与え、細胞の保存をより困難かつ高価なものにしている。
ｉＰＳ細胞を保存する細胞バンクは細胞生存率の高い変動性を説明している。所与の細胞株の１つのバイアルが比較的高い生存率を示し、同じ細胞株の別のバイアルが非常に低い生存率を示すことは一般的である。結果に変動性があることで、研究および潜在的な細胞治療製品にｉＰＳ細胞を使用することはより費用がかかり困難になる。
多細胞凝集体の凍結保存を改善する試みにもかかわらず、異なる凍結条件からの損傷のメカニズムは十分に理解されていない。単一細胞と同様に、広範な細胞内氷形成（ＩＩＦ）が損傷を与えることが証明されている。低温での高溶質濃度への曝露は、細胞に溶質効果を引き起こしかねず、凍結防止剤の添加または除去は、結果として、浸透圧ストレスに起因する細胞損失をもたらしかねない。しかし、細胞凝集体の凍結応答は単一細胞の凍結応答よりも複雑である。たとえば、ギャップ結合を通した細胞凝集体におけるＩＩＦの広がりは、さまざまな細胞タイプにおいて実験的に観察されている。
解離されたｈｉＰＳＣ（すなわち、単一細胞）の生存を増強するために、Ｒｈｏキナーゼ（「ＲＯＣＫ」）阻害剤（ＲＯＣＫｉ）Ｙ－２７６３２が使用されてきた。ＲＯＣＫ阻害の結果としての非筋細胞ミオシンＩＩＡ（ＮＭＭＩＩＡ）およびアクチンの破壊は、単一のｈｉＰＳＣの生存率および多能性を増加させることが示されている。しかし、ＲＯＣＫｉを追加すると、ｈｉＰＳＣ凝集体の場合に矛盾する影響が生じかねない。ＮＭＭＩＩＡのダウンレギュレーションは、ｈｉＰＳＣ凝集体の細胞接着、細胞間結合、自己複製、および多能性を損なわせることが示されている。
自発的で可変の冷却プロファイルを有するパッシブ冷凍を結果としてもたらす、ＮＡＬＧＥＮＥ（登録商標）ＭＲ．ＦＲＯＳＴ（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）または同等の超低温冷凍庫内の冷凍コンテナを使用する幹細胞研究における一般的な慣行とは異なり、本開示の凍結保存方法は、定義された一貫した冷却プロファイルに従うようにプログラムされている速度制御凍結を使用する。また、定義された冷却速度ではあるが自発的で可変の氷核形成温度を用いる速度制御凍結を使用する、研究所および幹細胞レポジトリにおける既存の慣行とは異なり、本開示の凍結保存方法は、定義された温度で氷核形成を積極的に誘発する。冷却プロファイル（高いサブゼロ温度および核形成温度での冷却速度）は、凍結保存された細胞の質に影響を与える。冷却プロファイルの変動性は、凍結保存された細胞の生存および機能の変動性に寄与する。最適以下の冷却速度および氷核形成温度は、それらが自発的に発生することを可能にされた場合に生じる可能性があり、これは深刻な細胞死および解凍後の培養の失敗につながり、これは既存の慣行下での凍結保存されたｉＰＳ細胞のユーザに共通の経験である。比較すると、本開示の凍結保存方法は、氷核形成温度と冷却プロファイルの冷却速度の両方を定義し、これにより、変動を最小限に抑え、凍結保存された細胞の質を改善する。
使用が容易であり、結果として高い細胞生存率をもたらし、および／またはＲＯＣＫ阻害剤の使用を必要としない凍結保存用組成物および方法が望まれる。
本開示の凍結保存用組成物および方法は、さまざまなタイプの細胞および細胞形成での使用に適している。たとえば、凍結保存用組成物および方法は、懸濁中の解離した単一細胞；たとえば水溶液に懸濁された、無傷の細胞間接着のある解離した細胞の二次元クラスタ；たとえば水溶液に懸濁された、細胞の三次元凝集体；三次元マトリックス（たとえば、ヒドロゲル）に埋め込まれた単一細胞；三次元マトリックス（たとえば、ヒドロゲル）の表面に付着した細胞の二次元単層；二次元マトリックスの表面に付着した細胞の二次元単層；およびオルガノイドを用いて使用され得る。
本開示の凍結保存用組成物および方法は、ｉＰＳ細胞や他のタイプの細胞を凍結保存するのに適している。さまざまな細胞タイプには、たとえば、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、または胚様体；肝細胞または肝臓オルガノイド；ニューロンまたは神経前駆細胞、またはニューロスフェアまたは脳オルガノイド；グリア細胞またはグリア前駆細胞；心筋細胞、心臓前駆細胞、心臓組織、または心臓オルガノイド；内皮細胞または内皮；上皮細胞または上皮；筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋組織、または平滑筋組織；腱細胞または腱組織；骨細胞、軟骨細胞、または骨軟骨前駆細胞；ベータ細胞、膵島組織、または膵臓オルガノイド；脂肪細胞または脂肪組織；角膜細胞または角膜；網膜細胞または網膜組織；小柱網細胞または小柱網組織；腸細胞、腸組織、または腸オルガノイド；腎細胞または腎臓オルガノイド；造血細胞；脈管細胞、リンパ細胞、血管、またはリンパ管；または配偶子が含まれ得る。
細胞、複数の細胞、または組織の凍結保存は、検体の冷却および／または保存を含み得る。検体は、０℃以下、－２０℃以下、－４０℃以下、－９０℃以下、－１５０℃以下、－１９０℃以下、または－１９６℃以下の温度に冷却され得るか、またはその温度で保存され得る。検体は、０℃未満および－１９６℃以上の温度に冷却され得るか、またはその温度で保存され得る。たとえば、検体は、０℃～－１９６℃、０℃～－４０℃、－４０℃～－１９６℃、－４０℃～－９０℃、または－９０℃～－１９６℃の範囲の温度に冷却され得るか、またはその温度で保存され得る。
一実施形態によれば、本開示の方法は、０℃～－４０℃などの比較的高いサブゼロ温度でサンプルを保存するために使用され得る。それゆえ、速度制御冷凍庫を使用する従来の凍結保存方法の最終温度（－９０℃～－１９６℃）とは異なり、いくつかの実施形態では、本開示の凍結方法の最終温度は、－１８℃～－３０℃の間という、一般的な家庭用または研究室用の冷凍庫の温度により近くなり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、速度制御冷凍庫および極低温貯蔵ユニットを含み得る専用の装置、または液体窒素を含み得る専用の材料、または凍結サンプルを凍結モダリティから貯蔵ユニットに移すことを含み得る専用の取り扱い手順の使用を必要としない。数年または数十年といった液体窒素貯蔵の対象とされるサンプル安定性の範囲とは異なり、本開示の方法のいくつかの実施形態は、数日、数週間、または数か月の高いサブゼロ貯蔵におけるサンプル安定性の範囲を対象とし得る。他の実施形態では、本開示の方法は、数年または数十年などの長期貯蔵の安定性を対象とする。
本開示のいくつかの実施形態によれば、凍結保存用組成物は、ＤＭＳＯを含まないか、または実質的に含まない。一実施形態によれば、本開示の凍結保存用組成物は、解凍後に細胞を洗浄することなく使用することができる。さらに一実施形態によれば、本開示の凍結保存用組成物および凍結保存方法は、結果として、解凍された細胞の高い回復率、高い生存率、正常な増殖速度、および正常な核型のうちの１つまたは複数をもたらす。細胞生存は、本開示内で議論されるように、濃度および他のパラメータの特定の範囲内で維持され得る。たとえば、細胞生存は、凍結前の凍結保存用組成物への細胞曝露の時間、冷却速度、氷核形成温度、解凍後の凍結保存用組成物への細胞曝露の時間、またはそれらの任意の組み合わせを変化させながら維持され得る。本開示の凍結保存方法は、凍結、解凍、および培養の複数のサイクルを含み得る。本開示の凍結保存方法は、自動化された細胞培養システムによって実行され得る。
一実施形態によれば、凍結保存用組成物は、少なくとも１つの第１の成分および少なくとも１つの第２の成分を含む。第１の成分は、糖成分、糖アルコール成分、アミノ酸成分、ポリマー成分、タンパク質成分、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の成分は、少なくとも、糖成分および糖アルコール成分を含む。いくつかの実施形態では、第１の成分は、糖成分、糖アルコール成分、アミノ酸成分、ポリマー成分、およびタンパク質成分を含む。アミノ酸成分はさらに、第１のアミノ酸成分と第２のアミノ酸成分に分けられ得る。いくつかの実施形態では、凍結保存用組成物は、第１のアミノ酸成分と第２ノミノ酸成分の両方を含む。いくつかの実施形態では、凍結保存用組成物は、第１の次アミノ酸成分または第２のアミノ酸成分のみを含む。
糖成分は、任意の適切な単糖、二糖、もしくは三糖、またはそれらの組み合わせを含み得る。たとえば、糖成分は、トレハロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、グルコース、デキストラン、メレジトース、ラフィノース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、マルトトリウロース、ケストース、セロビオース、キトビオース、ラクツロース、または糖の組み合わせを含み得る。糖成分は、少なくとも１ｍＭ、たとえば、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、または少なくとも２５０ｍＭなどの濃度を有し得る。糖成分は、５００ｍＭ以下の最大濃度（たとえば、糖の総量で）、たとえば、４００ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１２５ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、または５０ｍＭ以下などの最大濃度で提供され得る。糖成分は、上に挙げられた任意の最小濃度とその最小濃度よりも大きい上に挙げられた任意の最大濃度とによって定義されるエンドポイントを有する範囲内の濃度で提供することもできる。１つよりも多くの糖が凍結保存用組成物中に存在する場合、糖成分の濃度は、凍結保存用組成物中のすべての糖の総濃度を反映している。したがって、いくつかの実施形態では、糖成分は、０．１ｍＭ～２５０ｍＭの濃度、たとえば、１ｍＭ～２５０ｍＭ、１ｍＭ～２００ｍＭ、２ｍＭ～１５０ｍＭ、５～１２０ｍＭ、１０ｍＭ～１００ｍＭ、１５～１００ｍＭ、または２０ｍＭ～８０ｍＭなどの濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、糖成分は、１０ｍＭ～２００ｍＭ、２０～１２０ｍＭ、または３０ｍＭ～８０ｍＭのトレハロース、マルトース、ラクトース、またはそれらの組み合わせを含む。
糖アルコール成分は、任意の適切な糖アルコールまたはそれらの組み合わせを含み得る。たとえば、糖アルコール成分は、グリセロール、ソルビトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、イノシトール、キシリトール、マンニトール、アラビトール、リビトール、エリスリトール、スレイトール、ガラクチトール、ピニトール、または糖アルコールの組み合わせを含むことができる。糖アルコール成分は、少なくとも０．１Ｍの濃度、たとえば、少なくとも０．２Ｍ、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍ、または少なくとも１．０Ｍなどの濃度を有し得る。糖アルコール成分は、２．０Ｍ以下の最大濃度（たとえば、糖アルコールの総量で）、たとえば、１．９Ｍ以下、１．８Ｍ以下、１．７Ｍ以下、１．６Ｍ以下、１．５Ｍ以下、１．４Ｍ以下、１．３Ｍ以下、１．０Ｍ以下、０．９０Ｍ以下、０．８Ｍ以下、０．７Ｍ以下、０．６Ｍ以下、または０．５Ｍ以下などの最大濃度で提供され得る。糖アルコール成分は、上に挙げられた任意の最小濃度とその最小濃度よりも高い上に挙げられた任意の最大濃度とによって定義されるエンドポイントを有する範囲内の濃度で提供することもできる。１つよりも多くの糖アルコールが凍結保存用組成物中に存在する場合、糖アルコール成分の濃度は、凍結保存用組成物中のすべての糖アルコールの総濃度を反映している。したがって、いくつかの実施形態では、糖アルコール成分は、０．１Ｍ～１．２Ｍ、０．２Ｍ～１．２Ｍ、０．２Ｍ～１Ｍ、０．３Ｍ～１Ｍ、０．５Ｍ～１Ｍ、または０．３Ｍ～０．８Ｍの濃度で存在し得る。たとえば、特定の実施形態は、０．２Ｍ～１．０Ｍの濃度でグリセロールを含むことができる。他の特定の実施形態は、０．３Ｍ～０．８Ｍの濃度で代替の糖アルコールを含むことができる。
アミノ酸成分は、任意の適切なアミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。たとえば、アミノ酸成分は、イソロイシン（たとえば、Ｌ－イソロイシン）、プロリン（たとえば、Ｌ－プロリン）、バリン（たとえば、Ｌ－バリン）、アラニン（たとえば、Ｌ－アラニン）、グリシン、アスパラギン（たとえば、Ｌ－アスパラギン）、アスパラギン酸（たとえば、Ｌ－アスパラギン酸）、グルタミン酸（たとえば、Ｌ－グルタミン酸）、セリン（たとえば、Ｌ－セリン）、ヒスチジン（たとえば、Ｌ－ヒスチジン）、システイン（たとえば、Ｌ－システイン）、トリプトファン（たとえば、Ｌ－トリプトファン）、チロシン（たとえば、Ｌ－チロシン）、アルギニン（たとえば、Ｌ－アルギニン）、グルタミン（たとえば、Ｌ－グルタミン）、クレアチン（たとえば、Ｌ－クレアチン）、タウリン（たとえば、Ｌ－タウリン）、ベタイン、エクトイン、ジメチルグリシン、エチルメチルグリシン、ＲＧＤペプチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。アミノ酸のうち、イソロイシンおよびクレアチンは第１のアミノ酸成分と見なされ得る。アミノ酸成分は、少なくとも０．１ｍＭの濃度、たとえば、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、または少なくとも１０ｍＭなどの濃度を有し得る。アミノ酸成分は、１００ｍＭ以下の最大濃度、たとえば、８０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２２．５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１４ｍＭ以下、または１０ｍＭ以下などの最大濃度で提供され得る。アミノ酸成分の濃度は、アミノ酸全体（第１および第２を含む）、または第１のアミノ酸成分のみを指し得る。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸成分は、０ｍＭ～８０ｍＭ、０．１ｍＭ～５０ｍＭ、１ｍＭ～１５ｍＭ、１ｍＭ～１０ｍＭ、または２ｍＭ～１０ｍＭの濃度で存在し得る。たとえば、特定の実施形態は、１ｍＭ～１５ｍＭの濃度でのアミノ酸成分を含むことができる。他の特定の実施形態は、２ｍＭ～１０ｍＭの濃度でのアミノ酸成分を含むことができる。
ポリマー成分は、任意の適切なポリマー成分またはそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態によれば、適切なポリマー成分は、生体適合性ポリマー、親水性または両親媒性ポリマー、非細胞接着分子（「ＣＡＭ」）結合ポリマーである。たとえば、ポリマー成分は、ポロキサマー（たとえば、ポロキサマー１４２、ポロキサマー１８８、ポロキサマー３３１、またはポロキサマー４０７）、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール、ポリグルタミン酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、またはそれらの組み合わせを含み得る。ポリマー成分は、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、または少なくとも５％の濃度を有し得る。ポリマー成分は、１５％以下、１２％以下、１０％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下の最大濃度で提供され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ポリマー成分は、１％～１５％、１％～１２％、２％～１２％、１％～１０％、３％～１０％、または３％～８％の濃度で存在し得る。たとえば、特定の実施形態は、２％～１２％の濃度でポリマー成分を含むことができる。他の特定の実施形態は、３％～８％の濃度でポリマー成分を含むことができる。
タンパク質成分は、任意の適切な血清成分またはそれらの組み合わせを含み得る。たとえば、タンパク質成分はアルブミンを含み得る。タンパク質成分は、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、または少なくとも３％の濃度を有し得る。タンパク質成分は、１０％以下、８％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、または２％以下の最大濃度で提供され得る。したがって、いくつかの実施形態では、タンパク質成分は、０％～１０％、０．５％～１０％、０％～６％、１％～６％、０％～５％、１％～５％、または１．５％～４％の濃度で存在し得る。たとえば、特定の実施形態は、１％～６％の濃度でのタンパク質成分を含むことができる。他の特定の実施形態は、１．５％～４％の濃度でのタンパク質成分を含むことができる。
第２の成分は、塩、無機イオン、ｐＨ平衡剤、およびそれらの組み合わせなどの、１つまたは複数のイオン成分を含み得る。第２のアミノ酸成分はまた第２の成分の１つと見なされ得る。いくつかの実施形態では、第２の成分は、少なくとも塩、無機イオン、ｐＨ平衡剤、および第２のアミノ酸成分を含む。
イオン成分は、任意の適切なイオン性化合物またはそれらの組み合わせを含み得る。たとえば、イオン成分は、Ｃａ+、Ｍｇ2+、Ｎａ+、Ｋ+、Ｃｌ-、ＨＣＯ3-などのイオン、またはそれらの組み合わせを提供する塩、酸、または塩基を含み得る。適切な塩の例としては、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＫＣｌ、ＫＨ2ＰＯ4、ＮａＨＣＯ3、ＮａＣｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4などが挙げられる。イオン成分は、少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、または少なくとも０．７％の濃度を有し得る。イオン成分は、２．５％（ｗ／ｖ）以下、２％以下、１．５％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、または１．０％以下の最大濃度で提供され得る。したがって、いくつかの実施形態では、イオン成分は、０．１％～２．５％の濃度で存在し得る。たとえば、特定の実施形態は、０．２％～２％の濃度でのイオン成分を含むことができる。他の特定の実施形態は、０．３％～１．６％の濃度でのイオン成分を含むことができる。イオン成分の濃度は、モル濃度で表されてもよく、たとえば、５０ｍＭ～３００ｍＭ、７５ｍＭ～２５０ｍＭ、または１００ｍＭ～２００ｍＭの範囲であり得る。
第２のアミノ酸成分は、タンパクを構成するアミノ酸、タンパクを構成しないアミノ酸、アミノ酸誘導体、またはペプチドを含み得る。たとえば、第２のアミノ酸成分は、プロリン（たとえば、Ｌ－プロリン）、バリン（たとえば、Ｌ－バリン）、アラニン（たとえば、Ｌ－アラニン）、グリシン、アスパラギン（たとえば、Ｌ－アスパラギン）、アスパラギン酸（たとえば、Ｌ－アスパラギン酸）、グルタミン酸（たとえば、Ｌ－グルタミン酸）、セリン（たとえば、Ｌ－セリン）、ヒスチジン（たとえば、Ｌ－ヒスチジン）、システイン（たとえば、Ｌ－システイン）、トリプトファン（たとえば、Ｌ－トリプトファン）、チロシン（たとえば、Ｌ－チロシン）、アルギニン（たとえば、Ｌ－アルギニン）、グルタミン（たとえば、Ｌ－グルタミン）、タウリン（たとえば、Ｌ－タウリン）、ベタイン、エクトイン、ジメチルグリシン、エチルメチルグリシン、ＲＧＤペプチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。第２のアミノ酸成分は、個別にまたは全体として、少なくとも０．０５ｍＭの濃度、たとえば、少なくとも０．０８ｍＭ、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．１２ｍＭ、少なくとも０．１５ｍＭ、少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．４ｍＭ、少なくとも０．６ｍＭ、少なくとも０．８ｍＭ、または少なくとも１ｍＭなどの濃度を有し得る。第２のアミノ酸成分は、個別にまたは全体として、１０ｍＭ以下の最大濃度、たとえば、８ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１．５ｍＭ以下、１．３ｍＭ以下、または１．０ｍＭ以下などの最大濃度で提供され得る。したがって、第２のアミノ酸成分は、個別にまたは全体として、０．０５ｍＭ～５ｍＭ、０．０８ｍＭ～３ｍＭ、または０．１ｍＭ～１．５ｍＭの範囲の濃度を有し得る。
概して、凍結保存用組成物は、ＤＭＳＯを含まなくてもよく、または少なくとも実質的にＤＭＳＯを含まなくてもよい。本明細書で使用される場合、「ＤＭＳＯを含まない」とは、微量以下のＤＭＳＯを含み、ＤＭＳＯを完全に含まない可能性がある組成物を指す。本明細書で使用されるように、「少なくとも実質的にＤＭＳＯを含まない」とは、溶液の残りの成分よりも大きな凍結保存を提供しないレベルのＤＭＳＯ、すなわち、溶液の機能性に重要ではない量のＤＭＳＯを含む溶液を指す。典型的な凍結保存溶液は１０％のＤＭＳＯを含む。しかし、本開示のいくつかの実施形態では、組成物中のＤＭＳＯの量は、５％（ｗ／ｖ）未満、２％未満、１％未満、または０．１％未満、または０％である。
したがって、一態様では、本開示は凍結保存用組成物について記載している。概して、凍結保存用組成物は、上記でより詳細に明記されるように、糖成分および糖アルコール成分を含む。いくつかの実施形態では、糖成分の少なくとも一部は、必ずしも細胞膜を貫通しなくてもよく、したがって、細胞の外面に作用する。そのような場合、糖成分はトレハロースを含むことができる。いくつかの実施形態では、凍結保存用組成物は、ポリマー成分、少なくとも１つのアミノ酸、イオン成分、およびアルブミンをさらに含むことができる。概して、凍結保存用組成物は、ＤＭＳＯを含まない凍結保存用組成物の残りの成分よりも多くの凍結保護を提供しない量のＤＭＳＯを有する。例示的な凍結保存用組成物が以下に示される。
いくつかの場合では、凍結保存用組成物は細胞をさらに含む。最初に、細胞は、凍結保存および保存される前に、凍結保存用組成物に添加され得る。他の場合では、細胞は、凍結された凍結保存用組成物の成分として保存されている可能性がある。さらに他の場合では、細胞は、解凍された凍結保存用組成物から回復可能である生存可能な細胞であり得る。本明細書で使用されるように、「生存可能な」細胞は、凍結保護液中で凍結保存され、０℃未満で保存され、その後、解凍され、凍結保護用組成物から移された後、細胞に適した培養条件下で生存可能なままである細胞を含む。一実施形態によれば、細胞は、生存可能なままであるために解凍後に洗浄する必要はない。
本開示はまた、細胞を凍結保存および保存する方法を記載している。細胞は、凍結保存が望まれる任意の生細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞はｉＰＳ細胞などの幹細胞である。概して、当該方法は、上記の凍結保護用組成物の任意の実施形態に細胞を添加すること、凍結保護用組成物を凍結すること、凍結した凍結保護用組成物を０℃未満の温度で保存すること、凍結保護用組成物を解凍すること、解凍した凍結保護用組成物から細胞を移すこと、ならびに細胞が生存可能なままであるために効果的な条件下で細胞を培養することを含む。
いくつかの実施形態では、当該方法は、冷却速度の制御および／または再加温速度の制御を含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、０℃～－３℃、－１℃～－２０℃、－１℃～－１２℃、－１２℃～－２０℃、－６℃～－１２℃、－１℃～－８℃、－１．５℃～－７℃、－２℃～－６℃、－３℃～－６℃、または－３℃～－５℃の温度（「氷核形成温度」と呼ばれる）で凍結保存用組成物中の分子成分の結晶化を開始することを含む。１つの特定の実施形態では、当該方法は、約－４℃の温度での凍結保存用組成物中の分子成分の結晶化を開始することを含む。当該方法は、０℃／分を超える速度、たとえば、０．１℃／分以上、０．２℃／分以上、０．３℃／分以上、０．４℃／分以上、０．５℃／分以上、０．８℃／分以上、１．０℃／分以上、１．２℃／分以上、２℃／分以上、５℃／分以上、または１０℃／分以上などの速度で凍結保護用組成物を細胞と共に冷却することを含み得る。当該方法は、５０℃／分以下、２０℃／分以下、１０℃／分以下、５℃／分以下、３℃／分以下、２．５℃／分以下、２．０℃／分以下、１．８℃／分以下、１．５℃／分以下、１．２℃／分以下、または１．０℃／分以下の速度で凍結保護用組成物を細胞と共に冷却する工程を含み得る。したがって、凍結保護用組成物は細胞と共に、０℃／分超から５℃／分まで、０．３℃／分～３℃／分、０．４０℃／分～２℃／分、０．５℃／分～１．５℃／分、または０．８℃／分～１．２℃／分の速度で冷却され得る。一実施形態では、凍結保護用組成物は細胞と共に、約１℃／分の速度で冷却される。凍結保護用組成物は細胞と共に、約－５℃以下、－１０℃以下、－２０℃以下、－５０℃以下、－７０℃以下、－８０℃以下、－１００℃以下、－１５－℃以下、または－１９０℃以下などの典型的な保存温度まで冷却され得る。上に指定された冷却速度は、温度が約－５℃以下、－１０℃以下、－２０℃以下、－２５℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－６０℃以下になるまで、または最終保存温度に達するまで維持され得る。凍結保護用組成物は細胞と共に、約－５℃以下、－１０℃以下、－２０℃以下、－２５℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、または－６０℃以下の温度に達した後、より速い速度でさらに冷却され得る。
細胞を含む凍結保護用組成物は、２０℃／分以上、４０℃／分以上、または６０℃／分以上の速度で解凍され得る。細胞を含む凍結保護用組成物は、９０℃／分以下、８０℃／分以下、または７０℃／分以下の速度で解凍され得る。
一実施形態によれば、凍結保存および無洗浄解凍のための細胞調製は、完全に自動化された方法で実行することができる。たとえば、細胞調製は、３７℃、湿度８５％、および５％のＣＯ2で、自動化されたインキュベータである、ＦＬＵＥＮＴ（登録商標）７８０ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（テカン グループ社製、メンネドルフ、スイス）、およびＣＹＴＡＴＩＯＮ １（バイオテックインスツルメント社製、ウィヌースキ、ＶＴ））などの自動化された細胞イメージングリーダを使用して実行され得る。
少なくともいくつかの実施形態では、細胞は解凍後に洗浄される必要はない。言い換えれば、細胞は洗浄することなく解凍直後に使用されてもよい。
細胞を保存する凍結保存用組成物の能力を以下のように試験した。
実施例１
細胞株および培養の維持
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株（ｉＰＳ－ＤＦ １９－９－１１Ｔ．Ｈ（ウィセル（WiCell））およびＵＭＮ ＰＣＢＣ１６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１））を使用して、凍結保存方法を開発した。細胞を、ｈＥＳＣ認定のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニング社（Corning, Inc.）製、コーニング、ＮＹ）または組換えヒトビトロネクチン（ペプロテックＵＳ社（PeproTech US）製、ロッキーヒル、ＮＪ）上でＥ８培地（ＴｅＳＲ－Ｅ８、ステムセルテクノロジー社（STEMCELL Technologies Inc.）製、バンクーバー、カナダおよびＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ThermoFisher Scientific）製、ウォルサム、ＭＡ）中で培養し、コロニーが７５～８０％のコンフルエンスに達したら、酵素不含解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製））を使用して凝集体として継代した。
細胞株および培養の維持
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株（ｉＰＳ－ＤＦ １９－９－１１Ｔ．Ｈ（ウィセル（WiCell））およびＵＭＮ ＰＣＢＣ１６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１））を使用して、凍結保存方法を開発した。細胞を、ｈＥＳＣ認定のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニング社（Corning, Inc.）製、コーニング、ＮＹ）または組換えヒトビトロネクチン（ペプロテックＵＳ社（PeproTech US）製、ロッキーヒル、ＮＪ）上でＥ８培地（ＴｅＳＲ－Ｅ８、ステムセルテクノロジー社（STEMCELL Technologies Inc.）製、バンクーバー、カナダおよびＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ThermoFisher Scientific）製、ウォルサム、ＭＡ）中で培養し、コロニーが７５～８０％のコンフルエンスに達したら、酵素不含解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製））を使用して凝集体として継代した。
ＤＭＳＯ不含凍結保存溶液の製剤
基礎溶液は、Ｃａ2+およびＭｇ2+を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋＋）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社（Spectrum Chemical）製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度（２×）の凍結保存溶液は、ＰＢＳ＋＋中に、６０ｍＭのスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、１０％ｖ／ｖのグリセロール（フムコ社（Humco）製、オースチン、ＴＸ）、１５ｍＭのＬ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）、５％ｗ／ｖのＰ１８８および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ社製）を含んだ。１：１の容量比で基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液との混合により、ＰＢＳ＋＋中に、３０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、７．５ｍＭのＬ－イソロイシン、５％ｗ／ｖのＰ１８８、および１倍濃度（１×）のＮＥＡＡを得た。最終組成物は以下を含んだ：
基礎溶液は、Ｃａ2+およびＭｇ2+を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋＋）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社（Spectrum Chemical）製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度（２×）の凍結保存溶液は、ＰＢＳ＋＋中に、６０ｍＭのスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、１０％ｖ／ｖのグリセロール（フムコ社（Humco）製、オースチン、ＴＸ）、１５ｍＭのＬ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）、５％ｗ／ｖのＰ１８８および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ社製）を含んだ。１：１の容量比で基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液との混合により、ＰＢＳ＋＋中に、３０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、７．５ｍＭのＬ－イソロイシン、５％ｗ／ｖのＰ１８８、および１倍濃度（１×）のＮＥＡＡを得た。最終組成物は以下を含んだ：
凍結保存のための細胞調製
細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して解離し、～３×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、凍結前に室温で正確に３０分間インキュベートした。
細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して解離し、～３×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、凍結前に室温で正確に３０分間インキュベートした。
速度制御凍結
細胞のクライオバイアルを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫（Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社（Planer PLC）製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度２０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．－４℃まで－１℃／分
５．１５分間－４℃で保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度が－４℃に達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－１℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
細胞のクライオバイアルを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫（Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社（Planer PLC）製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度２０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．－４℃まで－１℃／分
５．１５分間－４℃で保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度が－４℃に達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－１℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
凍結したクライオバイアルを、ＣＲＹＯＰＯＤキャリア（バイオシジョン社（Biocision, LLC）製、サンラファエル、ＣＡ）に移し、液体窒素中で保存した。
無洗浄解凍
凍結したクライオバイアルを３７℃の水浴で解凍した。クライオバイアルを蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。
凍結したクライオバイアルを３７℃の水浴で解凍した。クライオバイアルを蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。
アポトーシス阻害剤を含むかまたは含まないかいずれかのＥ８培地を、～１ｍｌ／分の流速を使用して細胞凝集体の解凍した懸濁液に添加した。希釈係数２を使用した。これは、細胞の各クライオバイアルを用い、解凍後の細胞培養物の６ウェルプレートの１ウェルを作成したことを意味している。希釈した細胞を、新たにコーティングした培養容器上に播種し、２４時間３７℃のインキュベータで５％のＣＯ2中に静置した。
実験結果
ここで、図１Ａ～１Ｅを参照すると、図１Ａの上部のパネルでは、－５０℃の氷、および－４℃で播種され、さまざまな冷却速度で凍結されたｉＰＳ細胞凝集体のラマンヒートマップが、１℃／分および３℃／分では細胞内の氷がほとんどまたはまったくなく、１０℃／分では大きな量およびサイズの細胞内の氷晶を示した。中央のパネルでは、－５０℃の氷、および－８℃で播種され、さまざまな冷却速度で凍結された細胞凝集体のラマンヒートマップが、すべての凝集体における細胞内氷形成を示し、細胞内氷晶の量およびサイズが冷却速度とともに増加することを示した。下部のパネルでは、さまざまな冷却速度および氷核形成温度で測定されたＡＩＣが、より高い氷核形成温度に対して統計学的に有意なより少量の細胞内氷を示した。ｎ．ｓ．：ｐ≧０．０５；*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。図１Ｂでは、さまざまな冷却速度および氷核形成温度での膜の完全性に基づく解凍後の回復が、－８℃、－６℃、および－４℃での氷核形成の間の統計学的な有意差に加え、凍結保存されたｉＰＳ細胞凝集体と単一細胞との間の類似性を示した。図１Ｃでは、さまざまな冷却速度および氷核形成温度でのエステラーゼ活性に基づく解凍後の再付着が、－８℃、－６℃、および－４℃での氷核形成の間の統計学的に有意な差を示し、凍結保存された単一のｉＰＳ細胞から生存可能な培養物はほとんどまたはまったくなく、ｉＰＳ細胞に対する凍結条件を開発するためのこの測定基準の高い選択性を示した。図１Ｄでは、ヘキスト３３３４２で染色された、継代後または解凍後４、８、１２、および２４時間の培養でのコロニーが示されている。白い矢印は、アポトーシスの兆候である凝縮クロマチンを指している。白い円は、有糸分裂の証拠である、形成された、整列した、または分離した姉妹染色分体を強調している。スケールバー：５０μｍ。図１Ｅでは、ｆ－アクチンに対して染色された、継代後または解凍後４、８、１２、および２４時間の培養でのコロニーが示されている。ハニカム状のパターンは、継代後約８時間および解凍後約１２時間ではっきりと見える。スケールバー：５０μｍ。
ここで、図１Ａ～１Ｅを参照すると、図１Ａの上部のパネルでは、－５０℃の氷、および－４℃で播種され、さまざまな冷却速度で凍結されたｉＰＳ細胞凝集体のラマンヒートマップが、１℃／分および３℃／分では細胞内の氷がほとんどまたはまったくなく、１０℃／分では大きな量およびサイズの細胞内の氷晶を示した。中央のパネルでは、－５０℃の氷、および－８℃で播種され、さまざまな冷却速度で凍結された細胞凝集体のラマンヒートマップが、すべての凝集体における細胞内氷形成を示し、細胞内氷晶の量およびサイズが冷却速度とともに増加することを示した。下部のパネルでは、さまざまな冷却速度および氷核形成温度で測定されたＡＩＣが、より高い氷核形成温度に対して統計学的に有意なより少量の細胞内氷を示した。ｎ．ｓ．：ｐ≧０．０５；*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。図１Ｂでは、さまざまな冷却速度および氷核形成温度での膜の完全性に基づく解凍後の回復が、－８℃、－６℃、および－４℃での氷核形成の間の統計学的な有意差に加え、凍結保存されたｉＰＳ細胞凝集体と単一細胞との間の類似性を示した。図１Ｃでは、さまざまな冷却速度および氷核形成温度でのエステラーゼ活性に基づく解凍後の再付着が、－８℃、－６℃、および－４℃での氷核形成の間の統計学的に有意な差を示し、凍結保存された単一のｉＰＳ細胞から生存可能な培養物はほとんどまたはまったくなく、ｉＰＳ細胞に対する凍結条件を開発するためのこの測定基準の高い選択性を示した。図１Ｄでは、ヘキスト３３３４２で染色された、継代後または解凍後４、８、１２、および２４時間の培養でのコロニーが示されている。白い矢印は、アポトーシスの兆候である凝縮クロマチンを指している。白い円は、有糸分裂の証拠である、形成された、整列した、または分離した姉妹染色分体を強調している。スケールバー：５０μｍ。図１Ｅでは、ｆ－アクチンに対して染色された、継代後または解凍後４、８、１２、および２４時間の培養でのコロニーが示されている。ハニカム状のパターンは、継代後約８時間および解凍後約１２時間ではっきりと見える。スケールバー：５０μｍ。
図１Ａに示されるように、１℃／分の冷却速度と－４℃の氷核形成温度の組み合わせは、細胞内氷形成（ＩＩＦ）を阻害し、これは、細胞膜、細胞小器官、および細胞骨格を氷害から保護する。氷核形成温度が低いと、結果としてＩＩＦの総量が統計学的に有意に大きくなり、冷却速度が速いと、結果としてＩＩＦに統計学的に有意な差は生じなかったたが、質的により大きな氷晶およびより崩壊した細胞凝集体が生じた。図１Ｂに示されるように、その凍結条件は、結果として９８．５％の解凍後の細胞回復をもたらした。最小の細胞死は、ラマン分光法によって観察された最小のＩＩＦと一致していた。より高い冷却速度またはより低い氷核形成温度は、結果として、より乏しい細胞回復をもたらした。様々な条件下で凍結保存用細胞凝集体と同様の量の解凍後の生細胞が得られたにもかかわらず、図１Ｃに見られるように、凍結保存する単一のｉＰＳ細胞は、冷却速度または氷核形成温度に関係なく、Ｒｈｏキナーゼ（「ＲＯＣＫ」）阻害剤なしでは解凍後の培養物を産生することができなかった。しかし、１℃／分または３℃／分の低い冷却速度と－４℃または－６℃の高い氷核形成温度を組み合わせると、凍結保存するｉＰＳ細胞は凝集体として、ＲＯＣＫ阻害剤を使用せずに解凍後の培養物の産生に成功した。また、これらの条件下では、凍結保存された細胞凝集体の解凍後の再付着は、８時間以内の細胞増殖の早期開始（図１Ｄ）および通常のハニカム状のｆ－アクチンネットワークの解凍後の培養における２４時間以内の形成（図１Ｅ）を伴って、新鮮な細胞に匹敵していた。
より大量の細胞アポトーシスおよびその後の増殖の開始にもかかわらず（図１Ｄ）、－４℃での核形成および１℃／分の冷却速度からわずかにオフセットされた凍結条件（すなわち、３℃／分の冷却速度または－６℃の氷核形成）は、最小の氷害（図１Ａ）を伴う生きたｉＰＳ細胞凝集体の確実な保存（図１Ｂ）、解凍後に培養物を産生する能力（図１Ｃ）および正常なｆ－アクチン組織を回復する能力（図１Ｅ）、ならびに検証されるべき正常な増殖および多能性を実証した。氷核形成の手動誘発（図３Ａ）は追加の技術訓練を必要とするが、氷核形成の自動誘発（図３Ｂ）は、労力を必要とせず、液体窒素で冷却されたＣＲＦによって達成可能である。液体窒素を含まないＣＲＦは、冷却速度のその動作範囲によって制限され、急速冷却による自動氷核形成を実施することができないが、サンプル温度を－４℃よりわずかに低く保持し、理論的に氷核形成を誘発することができる。いくつかの場合では、冷却速度（１～３℃／分）は、氷核形成温度（－４～－６℃）と組み合わされてもよく、これは、自発的な氷核形成が－１５℃もの低い温度で生じ得るためである（図３Ｃ）。自発的な氷核形成が生じる一方で、凍結保存は、結果として、解凍後の細胞の生存能力および機能の大幅な喪失、および生存可能な解凍後の培養物の産生の不能をもたらす可能性がある。これは、ＮＡＬＧＥＮＥ（登録商標）ＭＲ．ＦＲＯＳＴＹ（商標）などの凍結容器の主要な問題であり、ｉＰＳ細胞の凍結保存にＣＲＦを使用する正当な理由である。
ここで、図２Ａ～２Ｄを参照すると、図２Ａにおいて、左側では、ｉＰＳ細胞凝集体および氷の組み合わされたラマンヒートマップが、４つのサンプル細胞凝集体すべての周辺から細胞への特定の氷の伝播の他に、１つの凝集体における各細胞の細胞質に由来する大きな氷晶（右上）を示した。右側では、ＡＩＣのボックスチャートは、その統計分布の大きなばらつきを示し、これは大きく変動可能なＩＩＦを示唆している。図２Ｂでは、細胞凝集体を、浸透圧調節物質のみ、Ｐ１８８と共に、またはＰ１８８とＮＥＡＡの両方と共に使用して凍結保存した。凍結保存された細胞の定性および定量分析は、細胞間接触、膜の完全性および生存率の維持に対するＰ１８８およびＮＥＡＡの添加のプラス効果を示した。図２Ｃでは、細胞凝集体を、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ中に浸透圧調節物質、Ｐ１８８、ＮＥＡＡを含む、（Ｂ）からの凍結保存溶液中で処理した。ＲＯＳインデューサでの処理後（第１のカラム）、凍結前の細胞処理後（第２のカラム）および凍結解凍後（第３のカラム）に、ＲＯＳラベルで染色された細胞凝集体の明視野および蛍光画像を取得した。凍結前および解凍後の処理された細胞における酸化ストレスの陰性検出が示され、未処理の染色された陰性対照と比較して統計学的に有意な差は見られなかった。図２Ｄでは、ＦＡＭ－ＦＬＩＣＡで染色された細胞ペレットの明視野および蛍光画像が、アポトーシス細胞集団の存在量を示した。
本組成物は、ｉＰＳ細胞凝集体に関するＩＩＦにおける非常に可変的な結果の発生を低減する（図２Ａ）。これは、少なくとも部分的に、ポロキサマーＰ１８８、およびＮＥＡＡまたはＨＢＳＳ緩衝液の存在に起因し得る。Ｐ１８８およびＮＥＡＡは、ｉＰＳ細胞凝集体の保存および解凍後の培養物の産生を助け得る。Ｐ１８８またはＮＥＡＡなしでｈＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）製剤で凍結された細胞凝集体は、構造的崩壊、ほぼ完全な細胞死を受け、生存可能な解凍後の培養物を産生しなかった（図２Ｂ、左側）。Ｐ１８８の添加により、細胞間接触における細胞凝集体の完全性が改善されたが、ＮＥＡＡなしでは、凍結保存から溶解またはアポトーシスへの間に細胞集団の大部分が失われ、生存可能な解凍後の培養物は産生されなかった（図２Ｂ、中央）。Ｐ１８８とＮＥＡＡの両方が添加された場合、大きな凝集体サイズおよび７３．３％の高い解凍後の回復率の証拠として、凍結保存された細胞凝集体の構造的完全性と生存率の両方が改善された。しかし、緩衝液としてＮｏｒｍｏｓｏｌ Ｒを用いて、ｈＭＳＣから適合されたこの製剤は、解凍後の培養において生存可能なコロニーの収量が非常に低かった（図２Ｂ、右側）。凍結保存細胞において活性酸素種（ＲＯＳ）またはフリーラジカルが検出されなかったため、この低収量は、酸化ストレスによって引き起こされたものではなかった（図２Ｃ）が、ほとんどがＦＡＭ－ＦＬＩＣＡ陽性集団を有する凍結保存細胞のペレットに見られる、解凍後の細胞凝集体における高レベルの初期アポトーシスと関連していた（図２Ｄ）。
Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒを緩衝液としてＰＢＳ＋＋に置き換えた場合、解凍後の再付着は２７％までわずかに上昇したが、アポトーシスは凍結保存された細胞において依然として顕著なものであった。様々なアポトーシス経路のスクリーニングにより、Ｒｈｏキナーゼ媒介内因性アポトーシス、ＦａｓリガンドおよびＴＲＡＩＬＲ２媒介外因性アポトーシスが、凍結保存溶液中での凍結前のインキュベーションの際に細胞中で始まり、それら外因性アポトーシスが凍結解凍に応答してさらに進行したことが示唆された（表１、２）。
ＰＢＳ＋＋を緩衝液としてＨＢＳＳに置き換えた場合、解凍後の再付着は劇的に９６％まで改善した（表３）。さらに、外因性アポトーシスと内因性アポトーシスの両方が縮小された（表４）。保存状態が良くなく且つ高度にアポトーシスを起こした細胞を救済するためにＹ－２７６３２および他のアポトーシス阻害剤を使用するｉＰＳ細胞の凍結保存における一般的な慣行とは対照的に、すべてのアポトーシス阻害剤は、凍結保存された細胞に対して有意な負の効果を示し、解凍後の培養物における細胞増殖を減少させた（表５）。その組成物の凍結保存の結果は、ＤＭＳＯに基づく製剤の結果を上回り、細胞増殖が改善され、アポトーシス阻害剤から独立した。
最終製剤は、アルブミン、スクロース、グリセロール、イソロイシン、Ｐ１８８、ＮＥＡＡおよびＨＢＳＳを含んだ。ＨＢＳＳの組成物は以下の表６に示される。
浸透圧調節物質の予備スクリーニングにおいて、ｉＰＳ細胞が、様々な二糖類で類似した投与量応答を示し、不浸透性糖アルコールよりも細胞透過性に対してより良好な応答を示すことも分かった（表７）。ｉＰＳ細胞凍結保存の同等の結果をもたらすため、代替の二糖分子（たとえば、トレハロース、マルトース、ラクトース）、糖アルコール（たとえば、エチレングリコール）およびアミノ酸（たとえば、クレアチン）が、スクロース、グリセロール、およびイソロイシンに代えて使用され得る。
実施例２
細胞株および培養の維持
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＰＣＢＣＩ６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１）を使用して、凍結保存方法を開発した。細胞を、組換えヒトビトロネクチン（ペプロテックＵＳ社製、ロッキーヒル、ＮＪ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが５５～６５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で０．０２％のエチレンジアミン四酢酸溶液（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）を使用して凝集体として継代した。
細胞株および培養の維持
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＰＣＢＣＩ６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１）を使用して、凍結保存方法を開発した。細胞を、組換えヒトビトロネクチン（ペプロテックＵＳ社製、ロッキーヒル、ＮＪ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが５５～６５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で０．０２％のエチレンジアミン四酢酸溶液（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）を使用して凝集体として継代した。
ＤＭＳＯ不含凍結保存溶液の製剤
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中に、１８０ｍＭのスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、１０％ｖ／ｖのグリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、５％ｗ／ｖのＰ１８８、および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ）を含んだ。１：１の容量比での基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液との混合により、ＨＢＳＳ中に、９０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、５％ｗ／ｖのＰ１８８、および１倍濃度のＮＥＡＡを得た。最終的な組成物は以下を含んだ：
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中に、１８０ｍＭのスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、１０％ｖ／ｖのグリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、５％ｗ／ｖのＰ１８８、および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ）を含んだ。１：１の容量比での基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液との混合により、ＨＢＳＳ中に、９０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、５％ｗ／ｖのＰ１８８、および１倍濃度のＮＥＡＡを得た。最終的な組成物は以下を含んだ：
凍結保存のための細胞調製
細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して解離し、～３×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、室温で正確に３０分間インキュベートした後、凍結させた。
細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して解離し、～３×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、室温で正確に３０分間インキュベートした後、凍結させた。
速度制御凍結
細胞のクライオバイアルを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫（Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．－４℃まで－１℃／分
５．１５分間－４℃で保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度が－４℃に達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－１℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
細胞のクライオバイアルを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫（Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．－４℃まで－１℃／分
５．１５分間－４℃で保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度が－４℃に達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－１℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
凍結したクライオバイアルを、ＣＲＹＯＰＯＤキャリア（バイオシジョン社製、サンラファエル、ＣＡ）に移し、液体窒素に保存した。
無洗浄解凍
凍結したクライオバイアルを、３７℃の水浴またはＴＨＡＷＳＴＡＲ（登録商標）自動解凍システム（Automated Thawing System）（バイオシジョン社製）のいずれかで解凍した。３７℃の水浴を使用する場合、クライオバイアルを、蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。ＴｈａｗＳＴＡＲを使用する場合、サンプルが解凍されたことをデバイスが示した後に、クライオバイアルを２０秒間撹拌した。
凍結したクライオバイアルを、３７℃の水浴またはＴＨＡＷＳＴＡＲ（登録商標）自動解凍システム（Automated Thawing System）（バイオシジョン社製）のいずれかで解凍した。３７℃の水浴を使用する場合、クライオバイアルを、蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。ＴｈａｗＳＴＡＲを使用する場合、サンプルが解凍されたことをデバイスが示した後に、クライオバイアルを２０秒間撹拌した。
アポトーシス阻害剤または他の添加剤を含まないＴｅＳＲ－Ｅ８培地を、－１ｍｌ／分の流速を使用して細胞凝集体の解凍した懸濁液に添加した。希釈係数２を使用した。これは、細胞の各クライオバイアルを用い、解凍後の細胞培養物の６ウェルプレートの１ウェルを作成したことを意味している。希釈した細胞を、新たにコーティングした培養容器上に播種し、２４時間３７℃のインキュベータで５％のＣＯ2中に静置した。
実験結果
ここで、図３Ａ～３Ｃを参照すると、図３Ａにおいて、出現する集団として収束したＤＭＳＯを含まない凍結保存溶液の差分進化アルゴリズム主導の開発を、第６世代で繰り返した。計量としての解凍後の細胞の再付着を、ＤＭＳＯ対照に対して正規化した。ＤＭＳＯ対照の製剤は、ＨＢＳＳ中に１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯおよび５％ｗ／ｖのＰ１８８を含んだ。図３Ｂは、さまざまな濃度のスクロース、グリセロール、およびイソロイシンによる解凍後の細胞再付着の４Ｄプロットを示している。解凍後の細胞再付着に関するこのパラメータ空間のトポグラフィは、非線形であって、単様式ではなく、最適値を含む領域内に密集した等高線を有する複雑なものであったが、最適値からの距離では滑らかであった。図３Ｃでは、差分進化アルゴリズム主導の開発からの最良の１２の製剤の解凍後の再付着率を、１０％のＤＭＳＯ対照と比較して４つの独立した生物学的複製で検証した。複数の製剤（たとえば、製剤＃２－４－２）に対して解凍後の細胞再付着に高い変動が見られた一方で、製剤＃３－５－０に対しては低い変動および高い解凍後の細胞再付着が見られた。
ここで、図３Ａ～３Ｃを参照すると、図３Ａにおいて、出現する集団として収束したＤＭＳＯを含まない凍結保存溶液の差分進化アルゴリズム主導の開発を、第６世代で繰り返した。計量としての解凍後の細胞の再付着を、ＤＭＳＯ対照に対して正規化した。ＤＭＳＯ対照の製剤は、ＨＢＳＳ中に１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯおよび５％ｗ／ｖのＰ１８８を含んだ。図３Ｂは、さまざまな濃度のスクロース、グリセロール、およびイソロイシンによる解凍後の細胞再付着の４Ｄプロットを示している。解凍後の細胞再付着に関するこのパラメータ空間のトポグラフィは、非線形であって、単様式ではなく、最適値を含む領域内に密集した等高線を有する複雑なものであったが、最適値からの距離では滑らかであった。図３Ｃでは、差分進化アルゴリズム主導の開発からの最良の１２の製剤の解凍後の再付着率を、１０％のＤＭＳＯ対照と比較して４つの独立した生物学的複製で検証した。複数の製剤（たとえば、製剤＃２－４－２）に対して解凍後の細胞再付着に高い変動が見られた一方で、製剤＃３－５－０に対しては低い変動および高い解凍後の細胞再付着が見られた。
図４Ａ～４Ｃは、氷核形成温度ＴNUCおよび潜熱ΔＨでラベル付けされた、１℃／分の一定の冷却速度下で氷核形成を誘発する様々な方法で記録された実施例において使用された冷却プロファイルを示している。図面では以下で表される：破線：プログラムされたＣＲＦチャンバ温度；実線：記録されたＣＲＦチャンバ温度（またはクライオバイアル外部温度）；点線：記録されたサンプル温度（またはクライオバイアル内部温度）。図４Ａでは、自発的な氷核形成が－１５℃で発生したが、－４℃での１５分間の保持では発生せず、潜熱の大量放出が大量の望ましくない氷形成を示唆している。図４Ｂでは、ＣＲＦを手動で開き、液体窒素をクライオバイアル上に迅速に噴霧することで、予想通り－４℃での氷核形成の誘発に成功し、潜熱の最小限の放出が氷形成の十分な阻害を示唆している。図４Ｃでは、ＣＲＦチャンバの自動化された急速冷却によって、予想された－４℃をわずかに下回る氷核形成の誘発に成功し、潜熱の最小限の放出が氷形成の十分な阻害を示唆している。
実施例３
細胞株および培養の維持
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＰＣＢＣｌ６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１）を使用して凍結保存方法を開発し、追加の社内および市販のｉＰＳ細胞株（ＵＭＮ ＡＭＤ３－６Ｂ４、ＡＣＳ １０２４（ＡＴＣＣ）、およびｈｉＰＳＣ－ＣＣＮＤ２ＯＥ）を使用して、当該方法を検証した。細胞を、ｈＥＳＣ認定のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニング社製、コーニング、ＮＹ）または組換えヒトビトロネクチン（ペプロテックＵＳ社製、ロッキーヒル、ＮＪ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが６５～７５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で酵素を含まない解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製）を使用して凝集体として継代した。
細胞株および培養の維持
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＰＣＢＣｌ６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１）を使用して凍結保存方法を開発し、追加の社内および市販のｉＰＳ細胞株（ＵＭＮ ＡＭＤ３－６Ｂ４、ＡＣＳ １０２４（ＡＴＣＣ）、およびｈｉＰＳＣ－ＣＣＮＤ２ＯＥ）を使用して、当該方法を検証した。細胞を、ｈＥＳＣ認定のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニング社製、コーニング、ＮＹ）または組換えヒトビトロネクチン（ペプロテックＵＳ社製、ロッキーヒル、ＮＪ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが６５～７５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で酵素を含まない解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製）を使用して凝集体として継代した。
ＤＭＳＯ不含凍結保存溶液の製剤
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中に、１２０ｍＭのスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、１０％ｖ／ｖのグリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、１５ｍＭのＬ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）、５％ｗ／ｖのＰ１８８、４％のアルブミン（ＡＬＢＵＴＥＩＮ（登録商標）、グリフォルス社（Grifols S.A.）製、バルセロナ、スペイン）、および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ社製）を含んだ。１：１の容量比での基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液との混合により、ＨＢＳＳ中に、６０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、７．５ｍＭのＬ－イソロイシン、５％ｗ／ｖのＰ１８８、２％のアルブミン、および１倍濃度のＮＥＡＡを得た。最終的な組成物は以下を含んだ：
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中に、１２０ｍＭのスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、１０％ｖ／ｖのグリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、１５ｍＭのＬ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）、５％ｗ／ｖのＰ１８８、４％のアルブミン（ＡＬＢＵＴＥＩＮ（登録商標）、グリフォルス社（Grifols S.A.）製、バルセロナ、スペイン）、および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ社製）を含んだ。１：１の容量比での基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液との混合により、ＨＢＳＳ中に、６０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、７．５ｍＭのＬ－イソロイシン、５％ｗ／ｖのＰ１８８、２％のアルブミン、および１倍濃度のＮＥＡＡを得た。最終的な組成物は以下を含んだ：
凍結保存のための細胞調製
細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して解離し、～３×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、室温で１時間インキュベートした後、凍結させた。
細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して解離し、～３×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、室温で１時間インキュベートした後、凍結させた。
速度制御凍結
細胞のクライオバイアルを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃または－１２℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫（Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度２０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．ＴNUCまで－１℃／分
５．１５分間ＴNUCで保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度がＴNUCに達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－Ｂ℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
細胞のクライオバイアルを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃または－１２℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫（Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度２０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．ＴNUCまで－１℃／分
５．１５分間ＴNUCで保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度がＴNUCに達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－Ｂ℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
凍結したクライオバイアルを、ＣＲＹＯＰＯＤキャリア（バイオシジョン社製、サンラファエル、ＣＡ）に移し、液体窒素に保存した。
パッシブ冷凍
速度制御凍結の代わりに、断熱された凍結容器ＣｏｏｌＣｅｌｌ（バイオシジョン社製）を使用してパッシブ凍結を実施した。細胞のクライオバイアルを、室温でＣｏｏｌＣｅｌｌ内に入れ、４時間にわたって－８０℃の機械式冷凍庫内で凍結した。サンプル温度を、ＤＩ－２４５ ＵＳＢ熱電対データ取得システム（ＤＡＴＡＱインスツルメンツ社製、アクロン、ＯＨ）を使用して記録した。熱電対を、穴の開いたキャップを介して、実験サンプルと同じ量の細胞と凍結保存溶液が入っている「ダミー」バイアルに挿入した。凍結後、クライオバイアルを、ＣＲＹＯＰＯＤキャリアに移し、液体窒素中に保存した。
速度制御凍結の代わりに、断熱された凍結容器ＣｏｏｌＣｅｌｌ（バイオシジョン社製）を使用してパッシブ凍結を実施した。細胞のクライオバイアルを、室温でＣｏｏｌＣｅｌｌ内に入れ、４時間にわたって－８０℃の機械式冷凍庫内で凍結した。サンプル温度を、ＤＩ－２４５ ＵＳＢ熱電対データ取得システム（ＤＡＴＡＱインスツルメンツ社製、アクロン、ＯＨ）を使用して記録した。熱電対を、穴の開いたキャップを介して、実験サンプルと同じ量の細胞と凍結保存溶液が入っている「ダミー」バイアルに挿入した。凍結後、クライオバイアルを、ＣＲＹＯＰＯＤキャリアに移し、液体窒素中に保存した。
無洗浄解凍
凍結したクライオバイアルを、３７℃の水浴またはＴＨＡＷＳＴＡＲ（登録商標）自動解凍システム（バイオシジョン社製）のいずれかで解凍した。３７℃の水浴を使用する場合、クライオバイアルを、蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。ＴｈａｗＳＴＡＲを使用する場合、サンプルが解凍されたことをデバイスが示した後に、クライオバイアルを２０秒間撹拌した。
凍結したクライオバイアルを、３７℃の水浴またはＴＨＡＷＳＴＡＲ（登録商標）自動解凍システム（バイオシジョン社製）のいずれかで解凍した。３７℃の水浴を使用する場合、クライオバイアルを、蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。ＴｈａｗＳＴＡＲを使用する場合、サンプルが解凍されたことをデバイスが示した後に、クライオバイアルを２０秒間撹拌した。
細胞凝集体の解凍した懸濁液を、遠心分離または他の添加物なしで、－１ｍｌ／分の流速を使用してＥ８培地に移した。希釈係数２～１５を使用した。これは、細胞の各クライオバイアルを用い、解凍後の細胞培養物の６ウェルプレートの１ウェルと１つのＴ７５フラスコを作成したことを意味している。希釈した細胞を、新たにコーティングした培養容器上に播種し、２４時間３７℃のインキュベータで５％のＣＯ2中に静置した。解凍後の培養物を、継代して細胞培養を維持するか、一定方向への分化などの下流のワークフローに直接使用した。図５は、上記の凍結保存ワークフロー全体の説明図を示している。
実験結果
ここで、図６Ａ～６Ｃを参照すると、図６Ａにおいて、出現集団として収束したＤＭＳＯを含まない凍結保存溶液の差分進化アルゴリズム主導の開発を、第７世代で、またはそれぞれ５つの区間に離散化された４つの可変パラメータ、スクロース、グリセロール、イソロイシン、およびアルブミンのパラメータ空間において、８セットの１０サンプル実験後に繰り返した。計量としての解凍後の細胞の再付着を、ＤＭＳＯ対照に対して正規化した。ＤＭＳＯ対照の製剤は、ＨＢＳＳ中に７．５％ｖ／ｖのＤＭＳＯおよび５％ｗ／ｖのＰ１８８を含んだ。ＤＭＳＯを含まない製剤の範囲は、解凍後の細胞再付着でＤＭＳＯ対照を上回った。これらの製剤は、２０～６０ｍＭのスクロース、４～５％ｖ／ｖのグリセロール、０～２２．５ｍＭのイソロイシン、０～２％のアルブミン、５％ｗ／ｖのＰ１８８、１倍濃度のＮＥＡＡおよびＨＢＳＳを含んだ。図６Ｂは、５次元のうちの４次元で示される、ＤＥアルゴリズムが開発中にナビゲートしたパラメータ空間の４Ｄランドスケープを示している。このパラメータ空間のトポロジーは、非線形であって、単様式ではないが、矢印で示されるように最適値を含む領域内の密集した等高線を有する複雑なものであった。図６Ｃは、すべて５次元で示される、ＤＥアルゴリズムによって試験されたすべての製剤の５Ｄバブルチャートを示している。最適値（星）は、レベル２のスクロース、レベル５のグリセロール、レベル１のイソロイシン、レベル４のアルブミンに位置した。
ここで、図６Ａ～６Ｃを参照すると、図６Ａにおいて、出現集団として収束したＤＭＳＯを含まない凍結保存溶液の差分進化アルゴリズム主導の開発を、第７世代で、またはそれぞれ５つの区間に離散化された４つの可変パラメータ、スクロース、グリセロール、イソロイシン、およびアルブミンのパラメータ空間において、８セットの１０サンプル実験後に繰り返した。計量としての解凍後の細胞の再付着を、ＤＭＳＯ対照に対して正規化した。ＤＭＳＯ対照の製剤は、ＨＢＳＳ中に７．５％ｖ／ｖのＤＭＳＯおよび５％ｗ／ｖのＰ１８８を含んだ。ＤＭＳＯを含まない製剤の範囲は、解凍後の細胞再付着でＤＭＳＯ対照を上回った。これらの製剤は、２０～６０ｍＭのスクロース、４～５％ｖ／ｖのグリセロール、０～２２．５ｍＭのイソロイシン、０～２％のアルブミン、５％ｗ／ｖのＰ１８８、１倍濃度のＮＥＡＡおよびＨＢＳＳを含んだ。図６Ｂは、５次元のうちの４次元で示される、ＤＥアルゴリズムが開発中にナビゲートしたパラメータ空間の４Ｄランドスケープを示している。このパラメータ空間のトポロジーは、非線形であって、単様式ではないが、矢印で示されるように最適値を含む領域内の密集した等高線を有する複雑なものであった。図６Ｃは、すべて５次元で示される、ＤＥアルゴリズムによって試験されたすべての製剤の５Ｄバブルチャートを示している。最適値（星）は、レベル２のスクロース、レベル５のグリセロール、レベル１のイソロイシン、レベル４のアルブミンに位置した。
ｉＰＳ細胞凝集体の効果的な凍結保存
ここで、図７Ａを参照すると、凍結保存方法を、３回の凍結解凍サイクルを介してストレス試験した。解凍後の培養物の凍結、解凍、および１継代というタイプＩサイクルを使用して、凍結保存から結果として生じ得る表現型の不安定性を増幅させた。図７Ｂ～７ＥはタイプＩサイクルによるものである。解凍後の培養の凍結、解凍、および３継代のタイプＩＩサイクルを使用して、凍結保存から結果として生じ得る染色体の不安定性を増幅させた。図７ＦはタイプＩＩサイクルによるものである。
ここで、図７Ａを参照すると、凍結保存方法を、３回の凍結解凍サイクルを介してストレス試験した。解凍後の培養物の凍結、解凍、および１継代というタイプＩサイクルを使用して、凍結保存から結果として生じ得る表現型の不安定性を増幅させた。図７Ｂ～７ＥはタイプＩサイクルによるものである。解凍後の培養の凍結、解凍、および３継代のタイプＩＩサイクルを使用して、凍結保存から結果として生じ得る染色体の不安定性を増幅させた。図７ＦはタイプＩＩサイクルによるものである。
図７Ｂでは、凍結保存した細胞凝集体は、新鮮な細胞に匹敵する、その解凍後の再付着によって証明される、培養を再確立する強力な能力を示した。解凍後２４時間で、ＤＭＳＯを含まない凍結保存から培養中に結果として生じた生細胞の量は、新鮮な細胞を継代した場合と統計学的に有意な差はなかった。これは、３回の無洗浄凍結解凍サイクル全体で一貫しており、凍結保存の任意のラウンド後に、解凍後の付着に統計学的に有意な差は見られなかった。図７Ｃでは、凍結保存細胞の解凍後の培養は、Ｃｙｔａｔｉｏｎ １細胞イメージングマルチモードリーダ（ＢｉｏＴｅｋ）を使用した自動化イメージングによって定量化された両方の成長曲線によって示されるコンフルエンスの増加、コロニーの真円度の回復、およびコロニーサイズの増大によって証明されるように、第３ラウンドの解凍後４日間にわたって正常な増殖、コロニーの成長および圧縮を示した。
図７Ｄでは、凍結保存した細胞はまた、凍結解凍ストレス試験において正常な多能性を示した。表面マーカーＴＲＡ－１－６０の発現は、３つのラウンドの凍結保存全体にわたって高かった。９５．８％および９３．７％のＴＲＡ－１－６０陽性集団を、それぞれ、最初の２ラウンドの解凍直後に測定し、これは、ＤＭＳＯを含まない凍結保存方法がポドカリキシン膜タンパク質にほとんど物理機械的損傷を引き起こさなかったことを示唆した。９９．５％のＴＲＡ－１－６０陽性集団を、第３ラウンドの解凍後６日目に７５～８０％のコンフルエント培養で測定し、前の２つの測定値よりもわずかに高く、一貫して保存されたポドカリキシンのみならず、現行のプロトコル下での解凍後培養物の１００％の多能性に向けた効果的な回復を示した。さらに、転写因子ＯＣＴ－４およびＮＡＮＯＧの発現は両方とも凍結保存された細胞において高かった。９９．１％のＯＣＴ－４陽性集団および９７．１％のＮＡＮＯＧ－陽性集団を、第３ラウンドの凍結保存後の継代コンフルエンスで解凍後の培養について測定した。ＴＲＡ－１－６０発現と共に、これは、自発的な分化がほとんどまたはまったくない、高度に多能性であるｉＰＳ細胞培養を表した。第４ラウンドの解凍で、凍結保存された細胞を３つの胚葉すべてに分化し、図７Ｅの蛍光画像によって示されるように、内胚葉マーカーＦＯＸＡ２およびＳＯＸ１７、中胚葉マーカーＮＣＡＭおよびＴ、外胚葉マーカーＰＡＸ６およびＮｅｓｔｉｎの陽性の同時発現を伴った。
図７Ｆでは、第３のタイプＩＩ凍結解凍サイクル後の第３の継代で、凍結保存した細胞の細胞遺伝学的発見は、正常な男性の核型を表した。分析に利用可能な１６個の中期細胞の中に、クローンの数値的または構造的な染色体異常は見つからなかった。上記のすべての発見は、非常に望ましい、効果的なＤＭＳＯを含まない凍結保存方法を実証した。
上記のすべての発見は、非常に望ましい、効果的なＤＭＳＯを含まない凍結保存方法を実証した。
Ｐ１８８、スクロース、グリセロール、イソロイシンおよびアルブミンを含む組成物の使用は、結果として、過冷却に対してはるかに低い感受性を示す多細胞凝集体をもたらす。図８Ａは、この凍結方法の製剤に記載されたＤＭＳＯを含まない組成物が使用される限り、より大きな程度の過冷却下でも解凍後の細胞付着が損なわれなかったことを示しているが、組成物がＤＭＳＯを含まない組成物からわずかに逸脱したとき、またはＤＭＳＯを使用したときには著しく低下した。図８Ｂは、氷核形成が－４℃または－１２℃のどちらで発生したかにかかわらず、解凍後の培養での凍結保存ｉＰＳ細胞の成長が、標準継代後の新鮮なｉＰＳ細胞の成長に匹敵したことを示している。
図８Ｃは、－４℃で手動により誘発された氷核形成を伴う速度制御凍結の過程にわたって記録されたサンプルの内部温度を示している。図８Ｄは、対応するサンプル内部温度に対してプロットされた図８Ｃの一次導関数を示す。図８Ｅは、自発的な氷核形成を伴うＣｏｌｏｌＣｅｌｌにおけるパッシブ凍結の過程にわたって記録されたサンプル内部温度を示している。図８Ｆは、対応するサンプル内部温度に対してプロットされた図８Ｅの一次導関数を示す。凍結保存溶液に関係なく、速度制御凍結の使用が、過冷却および冷却速度に対する細胞の感受性を軽減することによって解凍後の細胞の生存を大幅に改善した一方で、パッシブ凍結の使用は、長期間にわたってより低い冷却速度を伴い、結果として冷却速度に対する細胞の感受性による大幅な細胞の損失をもたらした。
凍結防止剤としてのＰ１８８の作用機構は、その氷形成の阻害および組成物中の他の浸透圧調節物質とのその相乗的相互作用に起因した。図９Ａは、－５０℃で氷に埋め込まれたＰ１８８ミセルの液滴に対する氷晶間の凍結されていないＰ１８８水溶液のチャネルで獲得されたラマンスペクトルを示している。広いＯＨ伸縮ピークの赤色移動（破線の矢印）およびハイドロハライトピークのダウンシフト（星）は、Ｐ１８８ミセルが水格子の水素結合ネットワークを強化し、ハイドロハライト形成を阻害したことを示唆している。Ｐ１８８をグリセロールと混合したとき、ミセルは存在しなかった。図９Ｂは、－５０℃での氷晶間のＰ１８８がある場合とない場合の凍結されていないＤＭＳＯ溶液のラマンスペクトルを示している。２つのスペクトルの差は、Ｐ１８８のシグナルのＤＭＳＯ上への重ね合わせによって説明され得る。Ｐ１８８の添加時に広いＯＨ伸縮ピークの赤色移動がないことは、水素結合ネットワークへの効果がないことを示唆していた。図９Ｃは、－５０℃での氷晶間のＰ１８８がある場合とない場合の凍結されていないＤＭＳＯを含まない溶液のラマンスペクトルを示している。２つのスペクトルの差は、Ｐ１８８の信号のＤＭＳＯを含まない溶液の残りの部分上への重ね合わせによって説明され得る。Ｐ１８８の添加時に広いＯＨ伸縮ピークの赤色移動がないことは、水素結合ネットワークへの効果がないことを示していた。図９Ａ～９Ｃを要約すると、本開示の方法におけるＰ１８８が水素結合を強化するように作用することを示唆している証拠はない。
図９Ｄでは、ＤＭＳＯを含まない溶液中で形成された氷晶のラマンヒートマップは、横方向および軸方向に－５０℃でＰ１８８を使用した場合と使用しない場合のサンプル中の氷形態に明確な違いを示した。図９Ｅでは、ｉＰＳ細胞凝集体を、Ｐ１８８を使用した場合と使用しない場合のＤＭＳＯ溶液中で－５０℃まで凍結した。ラマンヒートマップは、細胞内Ｐ１８８の位置が軽度の細胞内容物の喪失（破線の円）の位置と一致したことを示し、これは、シーラントとしてのＰ１８８の機能を実証し、ラマンヒートマップはまた、Ｐ１８８は氷が細胞内に伝播するのを防ぎ、細胞凝集体の崩壊を防いだこと（矢印）を示した。図９Ｆでは、－５０℃での異なるＤＭＳＯを含まないおよびＤＭＳＯベースの溶液のラマンヒートマップは、Ｐ１８８がスクロース、グリセロール、イソロイシンおよびアルブミンの組成物と共に使用された場合にのみ観察された特有の氷形態を示した。伝播する各氷晶の前面が柔らかくなり、隣接する氷晶間の凍結していない空間の量が増加した。表８は、氷の形成とｉＰＳ細胞の凍結反応に対するＤＭＳＯを含まない組成物と組み合わせたＰ１８８の効果を示している。
表９では、示差走査熱量測定の結果は、Ｐ１８８の存在が、氷形成を（融解温度を著しく低下させることによって）抑圧し、（融解のエンタルピーを著しく低下させることによって）抑制したことを示している。
実施例４
細胞株および培養の維持
加齢性黄斑変性症を有するドナーの結膜に元来由来する人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＡＭＤ３－６Ｂ４を使用して、凍結保存方法を開発した。細胞を、組換えヒトビトロネクチン（ペプロテックＵＳ社製、ロッキーヒル、ＮＪ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが６５～７５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で酵素を含まない解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製）を使用して凝集体として継代した。
細胞株および培養の維持
加齢性黄斑変性症を有するドナーの結膜に元来由来する人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＡＭＤ３－６Ｂ４を使用して、凍結保存方法を開発した。細胞を、組換えヒトビトロネクチン（ペプロテックＵＳ社製、ロッキーヒル、ＮＪ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが６５～７５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で酵素を含まない解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製）を使用して凝集体として継代した。
ＤＭＳＯ不含凍結保存溶液の製剤
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中にさまざまな濃度のトレハロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、グリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、Ｌ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）およびＰ１８８を含んだ。基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液を１：１の容量比で混合することによって、結果として、ＨＢＳＳ中のトレハロース、グリセロール、Ｌ－イソロイシン、およびＰ１８８の希釈溶液が得られた。最終的な組成物は以下を含んだ：
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中にさまざまな濃度のトレハロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、グリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、Ｌ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）およびＰ１８８を含んだ。基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液を１：１の容量比で混合することによって、結果として、ＨＢＳＳ中のトレハロース、グリセロール、Ｌ－イソロイシン、およびＰ１８８の希釈溶液が得られた。最終的な組成物は以下を含んだ：
凍結保存のための細胞調製
細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して解離し、～３×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、室温で１時間インキュベートした後、凍結させた。
細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（商標）を使用して解離し、～３×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、室温で１時間インキュベートした後、凍結させた。
パッシブ冷凍
細胞のクライオバイアルを、２～８℃に予冷した熱伝導性サンプルモジュールＣｏｌｏｒＲａｃ（バイオシジョン社製、サンラファエル、ＣＡ）内に入れ、８０分間にわたって２０℃の機械的冷凍庫内で凍結した。サンプル温度を、ＤＩ－２４５ ＵＳＢ熱電対データ取得システム（ＤＡＴＡＱインスツルメンツ社製、アクロン、ＯＨ）を使用して記録した。熱電対を、穴の開いたキャップを介して、実験サンプルと同じ量の細胞と凍結保存溶液が入っている「ダミー」バイアルに挿入した。凍結したクライオバイアルを－２０℃で保存した。
細胞のクライオバイアルを、２～８℃に予冷した熱伝導性サンプルモジュールＣｏｌｏｒＲａｃ（バイオシジョン社製、サンラファエル、ＣＡ）内に入れ、８０分間にわたって２０℃の機械的冷凍庫内で凍結した。サンプル温度を、ＤＩ－２４５ ＵＳＢ熱電対データ取得システム（ＤＡＴＡＱインスツルメンツ社製、アクロン、ＯＨ）を使用して記録した。熱電対を、穴の開いたキャップを介して、実験サンプルと同じ量の細胞と凍結保存溶液が入っている「ダミー」バイアルに挿入した。凍結したクライオバイアルを－２０℃で保存した。
無洗浄解凍
凍結したクライオバイアルを３７℃の水浴で解凍した。クライオバイアルを、蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。細胞凝集体の解凍した懸濁液を、遠心分離または他の添加物なしで、－１ｍｌ／分の流速を使用してＴｅＳＲ－Ｅ８培地に移した。希釈係数２を使用した。これは、細胞の各クライオバイアルを用い、解凍後の細胞培養の６ウェルプレートの１ウェルを作成したことを意味している。希釈した細胞を、新たにコーティングした培養容器上に播種し、２４時間３７℃のインキュベータで５％のＣＯ2中に静置した。
凍結したクライオバイアルを３７℃の水浴で解凍した。クライオバイアルを、蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。細胞凝集体の解凍した懸濁液を、遠心分離または他の添加物なしで、－１ｍｌ／分の流速を使用してＴｅＳＲ－Ｅ８培地に移した。希釈係数２を使用した。これは、細胞の各クライオバイアルを用い、解凍後の細胞培養の６ウェルプレートの１ウェルを作成したことを意味している。希釈した細胞を、新たにコーティングした培養容器上に播種し、２４時間３７℃のインキュベータで５％のＣＯ2中に静置した。
実験結果
ここで、図１０Ａ～１０Ｂを参照すると、このパッシブ凍結方法の冷却プロファイルを評価した。図１０Ａは、異なる凍結保存製剤の３つの独立した複製からの、互いに大部分が類似した一連の３つの温度プロファイルを経時的に示している。図１０Ｂは、上記と同じ３つの複製からの、再び互いに大部分が類似した温度変化に対応する一連の３つのリアルタイム冷却速度プロファイルを示している。リアルタイム冷却速度は、経時的なサンプル温度の一次導関数であった。言い換えれば、温度プロファイルの勾配は、冷却速度プロファイルのｙ軸値と一致していた。この凍結保存方法によって実証される冷却プロファイルは、以下の４つの段階に分けることができる：サンプルを周囲温度からその凝固点のすぐ上まで急速に冷却する第１の段階、氷核形成と溶融潜熱が冷却速度を低下させる第２の段階、１℃／分に近い冷却速度での継続的な氷成長の第３の段階、およびサンプル温度が－２０℃近くで安定する最終段階。－２０℃の冷凍庫内で熱伝導性サンプルホルダーを使用するパッシブ凍結のこの傾向は、－８０℃の冷凍庫内で断熱容器を使用する他の一般的なパッシブ凍結方法の傾向と似ていた。
ここで、図１０Ａ～１０Ｂを参照すると、このパッシブ凍結方法の冷却プロファイルを評価した。図１０Ａは、異なる凍結保存製剤の３つの独立した複製からの、互いに大部分が類似した一連の３つの温度プロファイルを経時的に示している。図１０Ｂは、上記と同じ３つの複製からの、再び互いに大部分が類似した温度変化に対応する一連の３つのリアルタイム冷却速度プロファイルを示している。リアルタイム冷却速度は、経時的なサンプル温度の一次導関数であった。言い換えれば、温度プロファイルの勾配は、冷却速度プロファイルのｙ軸値と一致していた。この凍結保存方法によって実証される冷却プロファイルは、以下の４つの段階に分けることができる：サンプルを周囲温度からその凝固点のすぐ上まで急速に冷却する第１の段階、氷核形成と溶融潜熱が冷却速度を低下させる第２の段階、１℃／分に近い冷却速度での継続的な氷成長の第３の段階、およびサンプル温度が－２０℃近くで安定する最終段階。－２０℃の冷凍庫内で熱伝導性サンプルホルダーを使用するパッシブ凍結のこの傾向は、－８０℃の冷凍庫内で断熱容器を使用する他の一般的なパッシブ凍結方法の傾向と似ていた。
図１１は、差分進化アルゴリズム主導型の開発実験におけるＤＭＳＯを含まない凍結保存製剤の初期生成の結果を示している。９つのサンプルの１つのセットを、トレハロース、グリセロール、イソロイシン、およびＰ１８８の４つの可変パラメータのパラメータ空間でランダムに生成し、それぞれ４つの区間に離散化した。計量としての解凍後の細胞の再付着を、新鮮な細胞対照に対して正規化した。ＤＭＳＯ対照も使用した。ＤＭＳＯ対照製剤は、ＨＢＳＳ中に７．５％ｖ／ｖのＤＭＳＯおよび５％ｗ／ｖのＰ１８８を含み、実施例３で使用されたＤＭＳＯ対照と同じ製剤であった。９つの新しい製剤のうち８つは、解凍後の細胞再付着においてＤＭＳＯ対照を上回った。これらの製剤は、１３．６～２２．９ｍＭのトレハロース、４１０～６８５ｍＭのグリセロール、３０～５０ｍＭのイソロイシン、１～５％ｗ／ｖのＰ１８８およびＨＢＳＳを含んだ。
ＤＭＳＯ対照製剤は、サンプルを－９０℃以下に冷却して保存する一般的な速度制御凍結およびパッシブ凍結方法では実行可能であったが、サンプルを－１８℃以下および－３０℃以上に冷却して保存する場合には実行不可能であった。これは、細胞が、ＤＭＳＯを含まない凍結保存製剤（たとえば製剤＃４３０）において有意により安定しており、解凍後の培養で再付着して生存する能力を維持した一方で、ＤＭＳＯ対照製剤では安定せず、解凍後の培養で生存する能力を維持しなかったことを示唆している。
実施例５
細胞株および培養の維持
続いて、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＰＣＢＣｌ６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１）のために開発された凍結保存方法を、ｉＰＳ細胞株（ｈｉＰＳＣ－ＣＣＮＤ２ＯＥ）に由来するコミットした心臓前駆細胞（ＣＣＰ）細胞で試験した。ｉＰＳ細胞を、ｈＥＳＣ認定のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニング社製、コーニング、ＮＹ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが７５～８５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で酵素を含まない解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製）を使用して凝集体として継代した。ＣＣＰを、Ｌｉａｎらによって開発された１４日間のＧｉＷｉ心臓分化プロトコルに従って、６日目に１２ウェルプレートにおけるコンフルエントな付着単層として得た。
細胞株および培養の維持
続いて、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＰＣＢＣｌ６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１）のために開発された凍結保存方法を、ｉＰＳ細胞株（ｈｉＰＳＣ－ＣＣＮＤ２ＯＥ）に由来するコミットした心臓前駆細胞（ＣＣＰ）細胞で試験した。ｉＰＳ細胞を、ｈＥＳＣ認定のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニング社製、コーニング、ＮＹ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが７５～８５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で酵素を含まない解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製）を使用して凝集体として継代した。ＣＣＰを、Ｌｉａｎらによって開発された１４日間のＧｉＷｉ心臓分化プロトコルに従って、６日目に１２ウェルプレートにおけるコンフルエントな付着単層として得た。
ＤＭＳＯ不含凍結保存溶液の製剤
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中に、１２０ｍＭのスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、１０％ｖ／ｖのグリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、１５ｍＭのＬ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）、５％ｗ／ｖのＰ１８８、４％のアルブミン（ＡＬＢＵＴＥＩＮ（登録商標）、グリフォルス社製、バルセロナ、スペイン）、および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ社製）を含んだ。１：１の容量比での基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液との混合により、ＨＢＳＳ中に、６０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、７．５ｍＭのＬ－イソロイシン、５％ｗ／ｖのＰ１８８、２％のアルブミン、および１倍濃度のＮＥＡＡを得た。最終的な組成物は以下を含んだ：
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中に、１２０ｍＭのスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、１０％ｖ／ｖのグリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、１５ｍＭのＬ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）、５％ｗ／ｖのＰ１８８、４％のアルブミン（ＡＬＢＵＴＥＩＮ（登録商標）、グリフォルス社製、バルセロナ、スペイン）、および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ社製）を含んだ。１：１の容量比での基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液との混合により、ＨＢＳＳ中に、６０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、７．５ｍＭのＬ－イソロイシン、５％ｗ／ｖのＰ１８８、２％のアルブミン、および１倍濃度のＮＥＡＡを得た。最終的な組成物は以下を含んだ：
凍結保存のための細胞調製
細胞を、１５ｍＭクエン酸ナトリウムを使用して解離し、～２×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、室温で１時間インキュベートした後、凍結させた。
細胞を、１５ｍＭクエン酸ナトリウムを使用して解離し、～２×１０6／ｍｌの細胞濃度で基礎溶液中において遠心分離なしで凝集体として収集した。細胞凝集体の懸濁液を０．５ｍｌ／バイアルでクライオバイアル（Ｎｕｎｃ ＣｒｙｏＴｕｂｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）へと充填した。２倍濃度の凍結保存溶液を０．５ｍｌ／バイアルで細胞に滴下した。細胞を、その後、室温で１時間インキュベートした後、凍結させた。
速度制御凍結
細胞のクライオバイアルを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度２０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．－４℃まで－１℃／分
５．１５分間－４℃で保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度が－４℃に達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－１℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
細胞のクライオバイアルを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度２０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．－４℃まで－１℃／分
５．１５分間－４℃で保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度が－４℃に達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－１℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
凍結したクライオバイアルを、ＣＲＹＯＰＯＤキャリア（バイオシジョン社製、サンラファエル、ＣＡ）に移し、液体窒素に保存した。
無洗浄解凍
凍結したクライオバイアルを３７℃の水浴で解凍した。クライオバイアルを、蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。細胞凝集体の解凍した懸濁液を、遠心分離または他の添加物なしで、－１ｍｌ／分の流速を使用してインスリン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ウォルサム、ＭＡ）を含むＲＰＭＩ Ｂ２７（＋）に移した。希釈係数２を使用した。これは、細胞の各クライオバイアルを用い、解凍後の細胞培養物の１２ウェルプレートの１ウェルを作成したことを意味している。希釈した細胞を、新たにコーティングした培養容器上に播種し、２４時間３７℃のインキュベータで５％のＣＯ2中に静置した。
凍結したクライオバイアルを３７℃の水浴で解凍した。クライオバイアルを、蓋の下に沈め、２．５分間撹拌した。細胞凝集体の解凍した懸濁液を、遠心分離または他の添加物なしで、－１ｍｌ／分の流速を使用してインスリン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ウォルサム、ＭＡ）を含むＲＰＭＩ Ｂ２７（＋）に移した。希釈係数２を使用した。これは、細胞の各クライオバイアルを用い、解凍後の細胞培養物の１２ウェルプレートの１ウェルを作成したことを意味している。希釈した細胞を、新たにコーティングした培養容器上に播種し、２４時間３７℃のインキュベータで５％のＣＯ2中に静置した。
実験結果
ｉＰＳ細胞から分化したＣＣＰ細胞を凍結保存するために一般的に使用される方法とは異なり、本開示の凍結保存方法は、その凍結保護製剤または解凍後の細胞増殖培地においてアポトーシス阻害剤なしで実施され得る。凍結保存または継代培養の目的でＣＣＰを二次元付着培養から解離する一般的な方法は、主に単一細胞の形でＣＣＰを得る、Ａｃｃｕｔａｓｅ（イノベイティブセルテクノロジー社（Innovative Cell Technologies）製、サンディエゴ、ＣＡ）などの酵素試薬を使用する。これらの単一のＣＣＰ細胞は、アポトーシス阻害なしでアポトーシスを受ける。代わりに、酵素を含まないキレート剤であるクエン酸ナトリウムを、本開示の方法で使用して、主に多細胞凝集体の形態でＣＣＰを得た。図１２は、ＨＢＳＳ中で５％のＰ１８８に懸濁されたＣＣＰ凝集体の明視野画像を示している。示された関心領域（ＲＯＩ）の細胞の大部分は、無傷の細胞間接触を伴う多細胞凝集体であった。
ｉＰＳ細胞から分化したＣＣＰ細胞を凍結保存するために一般的に使用される方法とは異なり、本開示の凍結保存方法は、その凍結保護製剤または解凍後の細胞増殖培地においてアポトーシス阻害剤なしで実施され得る。凍結保存または継代培養の目的でＣＣＰを二次元付着培養から解離する一般的な方法は、主に単一細胞の形でＣＣＰを得る、Ａｃｃｕｔａｓｅ（イノベイティブセルテクノロジー社（Innovative Cell Technologies）製、サンディエゴ、ＣＡ）などの酵素試薬を使用する。これらの単一のＣＣＰ細胞は、アポトーシス阻害なしでアポトーシスを受ける。代わりに、酵素を含まないキレート剤であるクエン酸ナトリウムを、本開示の方法で使用して、主に多細胞凝集体の形態でＣＣＰを得た。図１２は、ＨＢＳＳ中で５％のＰ１８８に懸濁されたＣＣＰ凝集体の明視野画像を示している。示された関心領域（ＲＯＩ）の細胞の大部分は、無傷の細胞間接触を伴う多細胞凝集体であった。
従来のＣＣＰの凍結保存および継代培養のアプローチでＣＣＰの全集団を懸濁液に解離することの困難性とは異なり、細胞のパッチまたはスポットが一般に、解離工程後に培養基板上で視覚的に検出され得る場合、この方法は、結果として、解離後にＣＣＰ集団全体の容易な脱離および懸濁をもたらした。図１３は、クエン酸ナトリウム処理前のＣＣＰ細胞のコンフルエントな単層で覆われた培養基板の明視野顕微鏡および携帯電話による画像を示し、培養基板上に細胞がほとんどまたはまったく残っておらず、クエン酸ナトリウム処理およびＰ１８８懸濁後に組織培養容器の底全体が目に見えてきれいであった。
本実施例で使用される凍結保存剤製剤は、結果として、解凍後２４時間での６７．８５％の表面コンフルエンスにおけるＣＣＰ培養物をもたらした。
図１４は、低温ラマン分光法を使用してレンダリングされた、凍結されたＣＣＰ細胞凝集体ならびに氷および凍結防止剤の分布のヒートマップを示している。細胞内氷形成（矢印）および細胞完全性の喪失（破線の円）によって、凍結損傷のメカニズムを特定した。凍結防止剤分子の分配を、細胞内領域におけるよりも細胞外領域における有意に高い濃度から示した。これらのＣＣＰで観察された細胞内氷形成の量は、同じ製剤中のｉＰＳ細胞で観察された量よりもはるかに多かった。
実施例６
細胞株および培養の維持
続いて、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＰＣＢＣ１６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１）のために使用される凍結保存方法を、コンフルエントな付着単層の形態で、ｉＰＳ細胞株（ｈｉＰＳＣ－ＣＣＮＤ２ＯＥ）に由来するコミットした心臓前駆細胞（ＣＣＰ）細胞を保存するように修正した。ｉＰＳ細胞を、ｈＥＳＣ認定のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニング社製、コーニング、ＮＹ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが７５～８５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で酵素を含まない解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製）を使用して凝集体として継代した。Ｌｉａｎらによって開発された１４日間のＧｉＷｉ心臓分化プロトコルを、９６ウェルのマイクロプレートにおいて培養細胞にスケールダウンした。ＣＣＰを６日目に得た。
細胞株および培養の維持
続いて、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株ＵＭＮ ＰＣＢＣ１６ｉＰＳＶ（またはｖＳｈｉＰＳ ９－１）のために使用される凍結保存方法を、コンフルエントな付着単層の形態で、ｉＰＳ細胞株（ｈｉＰＳＣ－ＣＣＮＤ２ＯＥ）に由来するコミットした心臓前駆細胞（ＣＣＰ）細胞を保存するように修正した。ｉＰＳ細胞を、ｈＥＳＣ認定のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（コーニング社製、コーニング、ＮＹ）上でＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製、バンクーバー、カナダ）で培養し、コロニーのコンフルエンスが７５～８５％に達したら、４日ごとに１：８の分割比で酵素を含まない解離試薬ＲｅＬｅＳＲ（ステムセルテクノロジー社製）を使用して凝集体として継代した。Ｌｉａｎらによって開発された１４日間のＧｉＷｉ心臓分化プロトコルを、９６ウェルのマイクロプレートにおいて培養細胞にスケールダウンした。ＣＣＰを６日目に得た。
ＤＭＳＯ不含凍結保存溶液の製剤
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中に、さまざまな濃度のスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、グリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、Ｌ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）、アルブミン（ＡＬＢＵＴＥＩＮ（登録商標）、グリフォルス社製、バルセロナ、スペイン）、５％ｗ／ｖのＰ１８８および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ社製）を含んだ。基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液を１：１の容量比で混合することによって、結果として、ＨＢＳＳ中のスクロース、グリセロール、Ｌ－イソロイシン、Ｐ１８８、アルブミン、およびＮＥＡＡの希釈溶液が得られた。最終的な組成物は以下を含んだ：
基礎溶液は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、およびグルコースを有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製、バーゼル、スイス）中に５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８（Ｐ１８８、スペクトラムケミカル社製、ニューブランズウィック、ＮＪ）を含んだ。２倍濃度の凍結保存溶液は、ＨＢＳＳ中に、さまざまな濃度のスクロース（シグマ－アルドリッチ社製、セントルイス、ＭＯ）、グリセロール（フムコ社製、オースチン、ＴＸ）、Ｌ－イソロイシン（シグマ－アルドリッチ社製）、アルブミン（ＡＬＢＵＴＥＩＮ（登録商標）、グリフォルス社製、バルセロナ、スペイン）、５％ｗ／ｖのＰ１８８および２倍濃度のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ－アルドリッチ社製）を含んだ。基礎溶液と２倍濃度の凍結保存溶液を１：１の容量比で混合することによって、結果として、ＨＢＳＳ中のスクロース、グリセロール、Ｌ－イソロイシン、Ｐ１８８、アルブミン、およびＮＥＡＡの希釈溶液が得られた。最終的な組成物は以下を含んだ：
凍結保存のための細胞調製
インスリンを含まないＲＰＭＩ Ｂ２７（－）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ウォルサム、ＭＡ）を吸引によって除去した。９６ウェルプレートにおいて２５μｌ／ウェルで細胞凝集体のコンフルエントな単層を覆うために、基礎溶液を加えた。２×凍結保存溶液を２５μｌ／ウェルでゆっくりと細胞に導入した。続いて、細胞を１時間室温でインキュベートし、凍結する前に、９６ウェルプレートをシリコーンウェルプレートライナ（ＪＧフィネラン社製、バインランド、ＮＪ）を使用して密封した。
インスリンを含まないＲＰＭＩ Ｂ２７（－）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ウォルサム、ＭＡ）を吸引によって除去した。９６ウェルプレートにおいて２５μｌ／ウェルで細胞凝集体のコンフルエントな単層を覆うために、基礎溶液を加えた。２×凍結保存溶液を２５μｌ／ウェルでゆっくりと細胞に導入した。続いて、細胞を１時間室温でインキュベートし、凍結する前に、９６ウェルプレートをシリコーンウェルプレートライナ（ＪＧフィネラン社製、バインランド、ＮＪ）を使用して密封した。
速度制御凍結
シリコーン密封したプレートを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫（Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度２０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．－４℃まで－１℃／分
５．１５分間－４℃で保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度が－４℃に達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－１℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
シリコーン密封したプレートを、１℃／分の冷却速度Ｂおよび－４℃の播種（または氷核形成）温度ＴNUCを使用して以下に列記される工程に従って速度制御冷凍庫（Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ、プランナー社製、ミドルセックス、英国）を用いて凍結した：
１．開始温度２０℃
２．０℃まで－１０℃／分
３．１０分間０℃で保持して、クライオバイアルの内側と外側の温度を平衡化する
４．－４℃まで－１℃／分
５．１５分間－４℃で保持する
６．工程５の終了に向けてクライオバイアルの内部温度が－４℃に達したときに氷核形成を誘発する
７．－６０℃まで－１℃／分
８．－１００℃まで－１０℃／分
凍結したプレートを、ＣＲＹＯＰＯＤキャリア（バイオシジョン社製、サンラファエル、ＣＡ）に移し、液体窒素の気相に保存した。
無洗浄解凍
凍結したプレートを３７℃の水浴で解凍した。密封したプレートを、プレートの縁の下に沈め、２．５分間撹拌した。シリコンウェルライナを取り外した。インスリンを含むＲＰＭＩ Ｂ２７（＋）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ウォルサム、ＭＡ）を、９６ウェルプレートにおいて２５０μｌ／ウェルで、解凍した細胞の単層にゆっくりと添加した。希釈した細胞培養物を、３７℃のインキュベータで５％のＣＯ2に入れて２４時間静置し、続いて、７日目の細胞として１４日間のＧｉＷｉ心臓分化プロトコルを再開するために使用した。
凍結したプレートを３７℃の水浴で解凍した。密封したプレートを、プレートの縁の下に沈め、２．５分間撹拌した。シリコンウェルライナを取り外した。インスリンを含むＲＰＭＩ Ｂ２７（＋）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、ウォルサム、ＭＡ）を、９６ウェルプレートにおいて２５０μｌ／ウェルで、解凍した細胞の単層にゆっくりと添加した。希釈した細胞培養物を、３７℃のインキュベータで５％のＣＯ2に入れて２４時間静置し、続いて、７日目の細胞として１４日間のＧｉＷｉ心臓分化プロトコルを再開するために使用した。
実験結果
心臓前駆細胞および心筋細胞の凍結保存製剤または他のアッセイのハイスループットスクリーニングのための技術的基盤を確立した。ＧｉＷｉ心臓分化プロトコルを９６ウェルのフォーマットにスケールダウンした。１６日目に、試験した９６ウェルプレートのすべてのウェルにおいて拍動が観察され、分化の成功が実証された。細胞をカルセインＡＭで染色することによって、コンフルエントな単層による細胞収量の広がりを定量化した。９６ウェルプレートのウェルあたりの細胞収量の９５％の信頼区間を、ウェルあたりの平均細胞収量の９７．１７～１０２．８％であると測定し、これは、心臓細胞単層のスケールダウン培養物の生産における高い一貫性および凍結保存製剤の差分進化アルゴリズム主導の開発などの実験において凍結保存細胞単層の解凍後の細胞脱離を定量化するこの構成の適合性を実証している。
心臓前駆細胞および心筋細胞の凍結保存製剤または他のアッセイのハイスループットスクリーニングのための技術的基盤を確立した。ＧｉＷｉ心臓分化プロトコルを９６ウェルのフォーマットにスケールダウンした。１６日目に、試験した９６ウェルプレートのすべてのウェルにおいて拍動が観察され、分化の成功が実証された。細胞をカルセインＡＭで染色することによって、コンフルエントな単層による細胞収量の広がりを定量化した。９６ウェルプレートのウェルあたりの細胞収量の９５％の信頼区間を、ウェルあたりの平均細胞収量の９７．１７～１０２．８％であると測定し、これは、心臓細胞単層のスケールダウン培養物の生産における高い一貫性および凍結保存製剤の差分進化アルゴリズム主導の開発などの実験において凍結保存細胞単層の解凍後の細胞脱離を定量化するこの構成の適合性を実証している。
図１５は、ＣＣＰ単層の凍結保存を発展させるための差分進化アルゴリズム主導の実験におけるＤＭＳＯを含まない製剤の最初の２世代の結果を示している。８個のサンプルの１つのセットを、４つの可変パラメータ、スクロース、グリセロール、イソロイシン、およびアルブミンのパラメータ空間でランダムに生成し、それぞれ５つの区間に離散化した。測定基準としての解凍後の培養コンフルエンスを、コンフルエントな単層の新鮮な細胞対照に対して正規化した。ＤＭＳＯ対照を使用した。ＤＭＳＯ対照製剤は、ＨＢＳＳ中に７．５％ｖ／ｖのＤＭＳＯおよび５％ｗ／ｖのＰ１８８を含み、実施例３で使用されたＤＭＳＯ対照と同じ製剤であった。ＤＭＳＯを含まない対照も使用した。ＤＭＳＯを含まない対照製剤は、ＨＢＳＳ中に６０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、７．５ｍＭのイソロイシン、２％ｗ／ｖのアルブミン、および５％ｗ／ｖのＰ１８８を含み、実施例３におけるｉＰＳ細胞凝集体用に開発されたものと同じ製剤であった。解凍後の細胞生存の世代平均とＤＭＳＯ対照およびＤＭＳＯを含まない対照より優れた実験製剤の数との両方が、世代０から世代１まで改善された。１６の新しい製剤のうち３つが、細胞脱離を最小限に抑え、細胞単層の大部分を解凍後の培養で無傷に保つ点でＤＭＳＯ対照を上回った。これらの製剤は、１００～１２０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、０ｍＭのイソロイシン、０．５～２．５％ｗ／ｖのアルブミン、５％ｗ／ｖのＰ１８８およびＨＢＳＳを含んだ。トレハロースなどの代替の凍結防止剤が使用されてもよい。Ｐ１８８などの追加の凍結防止剤が可変パラメータとして調整されてもよい。
懸濁液中のｉＰＳ細胞凝集体の速度制御凍結のために開発されたＤＭＳＯを含まない対照製剤は、一貫して～１００％の高い解凍後の再付着率をもたらし、結果として、ｉＰＳ細胞から分化した付着性ＣＣＰ単層の速度制御凍結の凍結保存単層において４２．３％の細胞脱離をもたらした。
実施例で使用される実験方法
解凍後の細胞再付着
解凍後に培養を再確立する凍結保存された細胞の能力を、解凍後の細胞再付着の測定基準に基づいて評価した。解凍した細胞を特定の分割比で蒔いた。２４時間後、解凍後の培養物を洗浄し、細胞透過性色素、カルセインＡＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を使用して、エステラーゼ活性を有する生細胞に対して染色した。各サンプルにおける生細胞を、平均蛍光強度に基づいてスキャンモードでＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダ（バイオテック社製）を使用して定量化した。蛍光測定を、ＤＭＳＯベースの対照製剤を使用する同じ細胞密度で継代された新鮮な細胞または同じ凍結前の細胞濃度で凍結保存された細胞のいずれかであった対照に対して正規化し、任意単位での各サンプルに対する解凍後の細胞再付着の値を判定した。
解凍後の細胞再付着
解凍後に培養を再確立する凍結保存された細胞の能力を、解凍後の細胞再付着の測定基準に基づいて評価した。解凍した細胞を特定の分割比で蒔いた。２４時間後、解凍後の培養物を洗浄し、細胞透過性色素、カルセインＡＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を使用して、エステラーゼ活性を有する生細胞に対して染色した。各サンプルにおける生細胞を、平均蛍光強度に基づいてスキャンモードでＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダ（バイオテック社製）を使用して定量化した。蛍光測定を、ＤＭＳＯベースの対照製剤を使用する同じ細胞密度で継代された新鮮な細胞または同じ凍結前の細胞濃度で凍結保存された細胞のいずれかであった対照に対して正規化し、任意単位での各サンプルに対する解凍後の細胞再付着の値を判定した。
解凍後の細胞増殖およびコロニー形成
凍結保存した細胞を１：６の解凍比で蒔いた。ＤＭＳＯを含まない溶液で凍結保存された細胞の解凍後の培養物を、デフォルトのフォーカス方法を使用した明視野およびスキャンモードでの４倍の対物レンズ（ＮＡ ０．１３、オリンパス社製）を備えたＣｙｔａｔｉｏｎ １細胞イメージングマルチモードリーダ（バイオテック社製）を用いて毎日画像化することによって、ラベルフリーで評価した。境界認識を使用するＧｅｎ ５ソフトウェア（バイオテック社製）によって画像を自動的に分析し、コロニーのコンフルエンス、サイズ、および真円度を測定した。
凍結保存した細胞を１：６の解凍比で蒔いた。ＤＭＳＯを含まない溶液で凍結保存された細胞の解凍後の培養物を、デフォルトのフォーカス方法を使用した明視野およびスキャンモードでの４倍の対物レンズ（ＮＡ ０．１３、オリンパス社製）を備えたＣｙｔａｔｉｏｎ １細胞イメージングマルチモードリーダ（バイオテック社製）を用いて毎日画像化することによって、ラベルフリーで評価した。境界認識を使用するＧｅｎ ５ソフトウェア（バイオテック社製）によって画像を自動的に分析し、コロニーのコンフルエンス、サイズ、および真円度を測定した。
凍結保存細胞の品質管理
核型分析を行って、染色体異常を検出した。細胞を、３時間コルセミドで処理し、標準的な細胞遺伝学的プロトコルに従って採取した。この細胞株は１６個の中期細胞のみを産生し、これらを４００バンドレベルの解像度でＧバンディングによって完全に分析した。
核型分析を行って、染色体異常を検出した。細胞を、３時間コルセミドで処理し、標準的な細胞遺伝学的プロトコルに従って採取した。この細胞株は１６個の中期細胞のみを産生し、これらを４００バンドレベルの解像度でＧバンディングによって完全に分析した。
表面多能性マーカー、ＴＲＡ－１－６０の発現を、フローサイトメトリーを使用して特徴付けた。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（イノベイティブセルテクノロジー社製、サンディエゴ、ＣＡ）を使用して培養から単一細胞に分離し、マウス抗ＴＲＡ－１－６０抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗マウス抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を使用して染色した。フローサイトメトリーを、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences）製、サンジョゼ、ＣＡから）で低流量にて実施した。５０，０００の事象を、各サンプルに対して記録し、前方散乱細胞集団および側方散乱細胞集団の他に、陰性の未染色対照を有する蛍光に対してゲートした。
転写因子、ＯＣＴ－４およびＮＡＮＯＧの発現を、免疫蛍光および定量的蛍光顕微鏡法を使用して特徴付けた。細胞培養物を、３．７％のホルムアルデヒド（シグマ－アルドリッチ社製）を使用して固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（シグマ－アルドリッチ社製）を使用して透過処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に対する、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗マウス抗体を有するマウス抗ＯＣＴ－４抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５標識ウサギ抗ヤギ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を有するヤギ抗ＮＡＮＯＧ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）製、ミネアポリス、ＭＮ）を使用して染色した。２０倍の空気対物レンズ（ＮＡ ０．５０、Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ、カールツァイス社（Carl Zeiss）製）およびＳｐｏｔＩｎｓｉｇｈｔ Ｆｉｒｅｗｉｒｅ ２カメラを備えたＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ５０を使用して、画像を取得した。ＯＣＴ－４およびＮＡＮＯＧ陽性細胞を、ＦＩＪＩを使用してバイナリ閾値および粒子分析によって定量化した。
使用説明書に従いＳＴＥＭｄｉｆｆ三血球系分化キット（ステムセルテクノロジーズ社製）を使用して三血球系分化を実施した。３つの胚葉の分化細胞を、内胚葉マーカーである、ＦＯＸＡ２（デベロップメンタル・スタディーズ・ハイブリドーマ・バンク（Developmental Studies Hybridoma Bank）製、アイオワシティー、ＩＡ）およびＳＯＸ１７（ミリポアシグマ社（MilliporeSigma）製、バーリントン、ＭＡ）、中胚葉マーカーである、ＮＣＡＭ（ミリポアシグマ社製）およびＴ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、および外胚葉マーカーである、ＰＡＸ６（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）およびＮｅｓｔｉｎ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）に対して染色した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ １細胞イメージングマルチモードリーダ（バイオテックインスツルメント社製、ウィヌースキ、ＶＴ）を使用して、２０倍の倍率で画像を取得した。
統計
特に他に明記のない限り、平均プラス／マイナス標準誤差をすべての測定に関して報告した。２サンプルの比較のために両側スチューデントのｔ検定を実施し、複数のサンプル間の同時比較のためにボンフェローニ補正を用いる一元配置分散分析の試験を実施して、０．０５に設定された有意水準でのｐ値を得た。帰無仮説を、サンプルのどのペアにも統計学的差異がないこととして定義し、０．０５未満のｐ値を使用して、帰無仮説を棄却し、サンプル間の有意差を判定する決定を下した。
特に他に明記のない限り、平均プラス／マイナス標準誤差をすべての測定に関して報告した。２サンプルの比較のために両側スチューデントのｔ検定を実施し、複数のサンプル間の同時比較のためにボンフェローニ補正を用いる一元配置分散分析の試験を実施して、０．０５に設定された有意水準でのｐ値を得た。帰無仮説を、サンプルのどのペアにも統計学的差異がないこととして定義し、０．０５未満のｐ値を使用して、帰無仮説を棄却し、サンプル間の有意差を判定する決定を下した。
低温ラマン分光法
低温ラマン分光法を、指定された速度制御凍結工程に従って、４段ペルチェ（サーモナミックエレクトロニクス社（Thermonamic Electronics）製）およびシリーズ８００の温度制御装置（アルファオメガインスツルメント社（Alpha Omega Instruments）製）を使用して温度制御の段階で実施した。－５０℃で、ラマンスペクトルデータを、ＵＨＴＳ３００分光計、６００／ｍｍのＤＶ４０１ ＣＣＤ検出器、５３２ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザ、１００×空気対物レンズ（ＮＡ ０．９０、ニコン社製）、および～３００ｎｍの横方向光学分解能を備えるＡｌｐｈａ ３００Ｒ共焦点ラマン顕微鏡（ウィテック社（WITec）製、ウルム、ドイツ）を使用して０．２秒の積分時間で２Ｄスキャンモードで取得した。３１２５ｃｍ1の波数を中心として結晶性Ｏ－Ｈ伸縮のラマン散乱を使用して氷を特徴付け、１６６０ｃｍ1でのアミドＩおよびＣ＝Ｃの伸縮のラマン散乱を使用して細胞を特徴付け、４８５ｃｍ1でのＣＣＯ揺動のラマン散乱を使用してグリセロールを特徴付け、１２８５ｃｍ1でのＣＥＬ捻じれのラマン散乱を使用してＰ１８８を特徴付け、８５０ｃｍ1でのＣＣ伸縮のラマン散乱を使用してすべてのＤＭＳＯを含まないＣＰＡ分子を特徴付け、および６７３ｃｍ1での対称ＣＳ伸縮のラマン散乱を使用してＤＭＳＯを特徴付けた。ラマンスペクトルを、５秒間の積分時間にわたって一定のレーザ出力を使用して各サンプルから取得し、１０回の累積で平均化した。指定された物質のラマンヒートマップを、それぞれ、３ピクセル／μｍでのその特徴的なラマン波数のピーク下の領域からレンダリングし、その分布および相互の空間的関係を視覚化した。
低温ラマン分光法を、指定された速度制御凍結工程に従って、４段ペルチェ（サーモナミックエレクトロニクス社（Thermonamic Electronics）製）およびシリーズ８００の温度制御装置（アルファオメガインスツルメント社（Alpha Omega Instruments）製）を使用して温度制御の段階で実施した。－５０℃で、ラマンスペクトルデータを、ＵＨＴＳ３００分光計、６００／ｍｍのＤＶ４０１ ＣＣＤ検出器、５３２ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザ、１００×空気対物レンズ（ＮＡ ０．９０、ニコン社製）、および～３００ｎｍの横方向光学分解能を備えるＡｌｐｈａ ３００Ｒ共焦点ラマン顕微鏡（ウィテック社（WITec）製、ウルム、ドイツ）を使用して０．２秒の積分時間で２Ｄスキャンモードで取得した。３１２５ｃｍ1の波数を中心として結晶性Ｏ－Ｈ伸縮のラマン散乱を使用して氷を特徴付け、１６６０ｃｍ1でのアミドＩおよびＣ＝Ｃの伸縮のラマン散乱を使用して細胞を特徴付け、４８５ｃｍ1でのＣＣＯ揺動のラマン散乱を使用してグリセロールを特徴付け、１２８５ｃｍ1でのＣＥＬ捻じれのラマン散乱を使用してＰ１８８を特徴付け、８５０ｃｍ1でのＣＣ伸縮のラマン散乱を使用してすべてのＤＭＳＯを含まないＣＰＡ分子を特徴付け、および６７３ｃｍ1での対称ＣＳ伸縮のラマン散乱を使用してＤＭＳＯを特徴付けた。ラマンスペクトルを、５秒間の積分時間にわたって一定のレーザ出力を使用して各サンプルから取得し、１０回の累積で平均化した。指定された物質のラマンヒートマップを、それぞれ、３ピクセル／μｍでのその特徴的なラマン波数のピーク下の領域からレンダリングし、その分布および相互の空間的関係を視覚化した。
緩衝液および添加剤の開発
速度制御凍結プロトコルは、１℃／分の冷却速度および－４℃の氷核形成温度で一定のままであった。浸透圧調節物質（すなわち、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ中の３０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、７．５ｍＭのイソロイシン）の組成物を、開始点として使用された基本的な製剤である、ｈＭＳＣ用に事前に最適化された凍結保存溶液（Pollock K., Algorithm optimization of cryopreservation protocols to improve mesenchymal stem cell functionality. Dissertation, University of Minnesota, 2016を参照。hdl.handle.net/11299/191466で入手可能）から適合させた。
速度制御凍結プロトコルは、１℃／分の冷却速度および－４℃の氷核形成温度で一定のままであった。浸透圧調節物質（すなわち、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ中の３０ｍＭのスクロース、５％ｖ／ｖのグリセロール、７．５ｍＭのイソロイシン）の組成物を、開始点として使用された基本的な製剤である、ｈＭＳＣ用に事前に最適化された凍結保存溶液（Pollock K., Algorithm optimization of cryopreservation protocols to improve mesenchymal stem cell functionality. Dissertation, University of Minnesota, 2016を参照。hdl.handle.net/11299/191466で入手可能）から適合させた。
細胞損傷の異なる形態を特定した。前述のように低温分光法を実施して、－５０℃での細胞内氷形成を特徴付けた。凍結前と解凍後の両方で、細胞を、４５分間３７℃でＨ２ＤＣＦＤＡ（ＲＯＳ検出アッセイキット、バイオビジョン社製）を使用して、ＲＯＳおよびフリーラジカルに対して染色し、免疫蛍光法およびマイクロプレートアッセイによって酸化ストレスを特徴付けた。また、解凍した細胞を、ＦＡＭ－ＦＬＩＣＡ（イムノケミストリーテクノロジーズ社（ImmunoChemistry Technologies, LLC）製、ブルーミングトン、ＭＮ）を使用してカスパーゼ酵素活性に対して染色し、アポトーシスを検出した。解凍後の細胞凝集体のサイズを視覚的に観察した。解凍後の細胞の回復、再付着および増殖を、前述のように測定した。ＰＢＳ＋＋中の１０％のＤＭＳＯを使用して凍結保存された細胞を、対照として使用した。明視野および蛍光画像を、１０倍の空気対物レンズ（ＮＡ ０．３０、Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ、カールツァイス社製）または２０倍の空気対物レンズ（ＮＡ ０．５０、Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ、カールツァイス社製）およびＳｐｏｔ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｆｉｒｅｗｉｒｅ ２のカメラを備えたＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ５０を使用して取得した。マイクロプレートアッセイを、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダ（バイオテック社製）を使用して定量化した。
異なるタイプの添加剤を試験した。５％ｗ／ｖのＰ１８８を、基礎溶液と２×凍結保存溶液の両方に添加して、細胞膜を安定化させた。２×ＮＥＡＡを、２×凍結保存溶液に添加して予め凍結し、細胞エネルギーを節約した。以下の分子を、一般的または特定のアポトーシス経路を標的とするために使用し、凍結前または解凍後のいずれかに所定の作業濃度で添加した：１０μＭのｒｈｏキナーゼ阻害剤（またはＲＯＣＫ阻害剤、Ｙ－２７６３２、ステムセルテクノロジーズ社製）、２０μＭのパンカスパーゼ阻害剤（Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、アペックスバイオテクノロジー社（ApexBio Technology LLC）製、ハウストン、ＴＸ）、１μｇ／ｍｌのＦａｓリガンド阻害剤（組み換えヒトＦａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６－Ｆｃキメラ、バイオレジェンド社（BioLegend）製、サンディエゴ、ＣＡ）、ＴＲＡＩＬ受容体１（組換えヒトＴＮＦＲＳＦ１０Ａ－Ｆｃキメラ、バイオレジェンド社製）、ＴＲＡＩＬ受容体２（組換えヒトＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ－Ｆｃキメラ、バイオレジェンド社製）、およびＴＲＡＩＬ受容体４（組換えヒトＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ－Ｆｃキメラ、バイオレジェンド社製）を標的とする各１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）。
２つの異なるタイプの緩衝液を、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒを置き換えるために試験した。Ｍｇ2+およびＣａ2+を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋＋、組織内）を、基礎溶液と２×凍結保存溶液の両方の一部として、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、ＨＣＯ3-およびグルコースを含むハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ロンザ社製）と比較した。それらは、凍結前および解凍後の細胞処理において周囲の大気条件下で塩のバランスおよび中性ｐＨを維持することを目的としていた。ＨＥＰＥＳを、基礎溶液または凍結保存溶液に対する懸濁液とは見なさず、無洗浄解凍すると、Ｅ８に含まれるＨＥＰＥＳは、５％のＣＯ2条件下で中性ｐＨを維持する役割を果たす。
凍結保存溶液のスクリーニング
異なるタイプの糖（二糖類）および糖アルコール（すべてバイオウルトラ（BioUltra）または医薬グレード、シグマ－アルドリッチ社製）を、細胞再付着への影響に基づいて、細胞毒性の限界について個別に試験した。凍結前の細胞処理を考慮して、３００ｍＭ、１５０ｍＭ、および７５ｍＭの所与の濃度の各分子を使用して、３０分または１時間室温でＨＢＳＳ中に懸濁した細胞凝集体をインキュベートした。その後、最小希釈率２での無洗浄解凍を考慮して、細胞凝集体の各サンプルを、Ｅ８培地を用いて１：１の容量比で混合し、ビトロネクチンでコーティングした培養容器に蒔いた。２４時間後、Ｎｉｋｏｎ ＴＭＳ逆相差顕微鏡下で細胞再付着を定性的に観察した。二糖類は、スクロース、トレハロース、マルトース、およびラクトースを含んだ。糖アルコールは、エチレングリコール、グリセロール（フムコ社製）、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、キシリトール、ミオイノシトール、およびアドニトールを含んだ。
異なるタイプの糖（二糖類）および糖アルコール（すべてバイオウルトラ（BioUltra）または医薬グレード、シグマ－アルドリッチ社製）を、細胞再付着への影響に基づいて、細胞毒性の限界について個別に試験した。凍結前の細胞処理を考慮して、３００ｍＭ、１５０ｍＭ、および７５ｍＭの所与の濃度の各分子を使用して、３０分または１時間室温でＨＢＳＳ中に懸濁した細胞凝集体をインキュベートした。その後、最小希釈率２での無洗浄解凍を考慮して、細胞凝集体の各サンプルを、Ｅ８培地を用いて１：１の容量比で混合し、ビトロネクチンでコーティングした培養容器に蒔いた。２４時間後、Ｎｉｋｏｎ ＴＭＳ逆相差顕微鏡下で細胞再付着を定性的に観察した。二糖類は、スクロース、トレハロース、マルトース、およびラクトースを含んだ。糖アルコールは、エチレングリコール、グリセロール（フムコ社製）、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、キシリトール、ミオイノシトール、およびアドニトールを含んだ。
凍結保存製剤の差分進化アルゴリズム主導型の最適化
基本的な変異戦略（ＤＥ／ｒａｎｄ／ｌ／ｂｉｎ）（Stom and Price, 1997）を用いたＤＥアルゴリズムを使用して、解凍後の再付着率の機能的測定基準に基づいて、ｈｉＰＳＣ用のＤＭＳＯを含まない凍結溶液の組成物を迅速に最適化した。簡潔には、ＤＥアルゴリズムは、確率的直接検索を利用して、パラメータ空間全体にまたがる集団からサンプルパラメータ（つまり、ＤＭＳＯを含まないＣＰＡ分子の濃度）の初期の群（世代０）をランダムに生成する。世代０のサンプルを実験的に試験し、それらの解凍後の再付着率を、アルゴリズムによって、試験対象の世代０の変異したバージョンであったＣＰＡ濃度の次の群（世代１）を出力するために使用した。各世代の累積的に最適なメンバーを緊急集団として保存した。差分進化アルゴリズム主導型の最適化を完了させ、最新世代の出現集団が前世代の出現集団と同じになったときに収束を達成した。ＤＥアルゴリズムのパラメータ空間を、細胞毒性限界によって判定し、複数の区間に離散化した。細胞毒性を、新鮮な細胞対照と比較したそれぞれの分子への１時間の曝露の２４時間後にカルセインＡＭを使用して測定された細胞培養における細胞再付着の減少として定義した。
基本的な変異戦略（ＤＥ／ｒａｎｄ／ｌ／ｂｉｎ）（Stom and Price, 1997）を用いたＤＥアルゴリズムを使用して、解凍後の再付着率の機能的測定基準に基づいて、ｈｉＰＳＣ用のＤＭＳＯを含まない凍結溶液の組成物を迅速に最適化した。簡潔には、ＤＥアルゴリズムは、確率的直接検索を利用して、パラメータ空間全体にまたがる集団からサンプルパラメータ（つまり、ＤＭＳＯを含まないＣＰＡ分子の濃度）の初期の群（世代０）をランダムに生成する。世代０のサンプルを実験的に試験し、それらの解凍後の再付着率を、アルゴリズムによって、試験対象の世代０の変異したバージョンであったＣＰＡ濃度の次の群（世代１）を出力するために使用した。各世代の累積的に最適なメンバーを緊急集団として保存した。差分進化アルゴリズム主導型の最適化を完了させ、最新世代の出現集団が前世代の出現集団と同じになったときに収束を達成した。ＤＥアルゴリズムのパラメータ空間を、細胞毒性限界によって判定し、複数の区間に離散化した。細胞毒性を、新鮮な細胞対照と比較したそれぞれの分子への１時間の曝露の２４時間後にカルセインＡＭを使用して測定された細胞培養における細胞再付着の減少として定義した。
本明細書で引用されるすべての参考文献および公報は、本開示と直接矛盾し得る場合を除いて、それら全体が引用により本開示に明示的に組み込まれる。具体的な実施形態が本明細書で例示および説明されてきたが、様々な代替および／または同等の実装を、本開示の範囲から逸脱することなく、示され説明される具体的な実施形態に置き換えることができることが当業者に理解される。本開示が、本明細書に明記される例示的な実施形態および実施例によって過度に限定されることを意図するものではなく、そのような実施例および実施形態が、本明細書で明記される請求項によってのみ限定されることを意図する本開示の範囲でのみ例として提示されることを理解されたい。
Claims (20)
- 凍結保存用組成物であって、凍結保存用組成物が、
糖成分であって、凍結保存用組成物中の糖成分の総濃度が３００ｍＭ以下である、糖成分と、
糖アルコール成分であって、凍結保存用組成物中の糖アルコール成分の総濃度が２Ｍ以下である、糖アルコール成分と、
１％～１５％の濃度でのポリマー成分および０．５％～１０％の濃度でのアルブミンのうちの少なくとも１つと、
を含み、但し、凍結保存用組成物が凍結保存量未満のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、凍結保存用組成物。 - 前記糖成分が、１ｍＭ～２５０ｍＭ、１０ｍＭ～２００ｍＭ、２０ｍＭ～１２０ｍＭ、２５ｍＭ～１００ｍＭ、または３０ｍＭ～８０ｍＭの濃度で提供される、請求項１記載の凍結保存用組成物。
- 前記糖成分が、トレハロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、グルコース、デキストラン、メレジトース、ラフィノース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、マルトトリウロース、ケストース、セロビオース、キトビオース、ラクツロース、またはそれらの組み合わせ、好ましくは、トレハロース、マルトース、ラクトース、またはそれらの組み合わせ、最も好ましくはトレハロースを含む、請求項１または２に記載の凍結保存用組成物。
- 前記糖成分が、１０ｍＭ～２００ｍＭ、２０ｍＭ～１２０ｍＭ、または３０ｍＭ～８０ｍＭのトレハロース、マルトース、ラクトース、またはそれらの組み合わせ、好ましくは、１０ｍＭ～２００ｍＭ、２０ｍＭ～１２０ｍＭ、または３０ｍＭ～８０ｍＭのトレハロース、最も好ましくは３０ｍＭから８０ｍＭのトレハロースを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- 前記糖アルコール成分が、０．２Ｍ～１．２Ｍ、０．２Ｍ～１Ｍ、または０．３Ｍ～０．８Ｍの濃度で提供される、請求項１～４のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- 前記糖アルコール成分が、グリセロール、ソルビトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、イノシトール、キシリトール、マンニトール、アラビトール、リビトール、エリスリトール、スレイトール、ガラクチトール、ピニトール、またはそれらの組み合わせ、好ましくは、グリセロール、ソルビトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、イノシトール、キシリトール、マンニトール、またはそれらの組み合わせ、最も好ましくはグリセロールを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- ０．４ｍＭ～１ｍＭのグリセロールを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- 少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、または少なくとも５％、かつ１５％以下、１２％以下、１０％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下のポリマー成分、好ましくは１．５％～１０％のポリマー成分、最も好ましくは３％～８％のポリマー成分を含み、好ましくはポリマー成分がポロキサマーを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- ０．５％～８％、好ましくは１％～５％の濃度でのアルブミンを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- 少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、または少なくとも０．７％、かつ２．５％（ｗ／ｖ）以下、２％以下、１．５％以下、１．３％以下、１．２以下％、１．１％以下、または１．０％以下、好ましくは０．２％～２％、より好ましくは０．３％～１．６％の濃度でのイオン成分をさらに含み、イオン成分が、塩、酸、塩基、またはそれらの組み合わせを含み、随意に、塩が、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＫＣｌ、ＫＨ2ＰＯ4、ＮａＨＣＯ3、ＮａＣｌ、およびＮａ2ＨＰＯ4から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- 少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、または少なくとも１０ｍＭ、かつ１００ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０以下ｍＭ、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２２．５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１４ｍＭ以下、または１０ｍＭ以下、好ましくは０．１ｍＭ～５０ｍＭの濃度でのアミノ酸成分をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- 前記アミノ酸成分が、イソロイシン、クレアチン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- １つまたは複数のアミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む第２のアミノ酸成分をさらに含む、請求項１１または１２に記載の凍結保存用組成物。
- 前記第２のアミノ酸成分が、１つまたは複数のプロリン、バリン、アラニン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、チロシン、アルギニン、グルタミン、タウリン、ベタイン、エクトイン、ジメチルグリシン、エチルメチルグリシン、ＲＧＤペプチド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３記載の凍結保存用組成物。
- 細胞をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
- 前記細胞が、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、心臓前駆細胞、心筋細胞、神経前駆細胞、ニューロン、グリア細胞、ベータ細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、腱細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、角膜細胞、網膜細胞、小柱網細胞、腸細胞、腎細胞、造血細胞、配偶子、またはそれらの組み合わせ、好ましくは、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、心臓前駆細胞、心筋細胞、神経前駆細胞、ニューロン、グリア細胞、上皮細胞、内皮細胞、網膜細胞、またはそれらの組み合わせ、最も好ましくはｉＰＳ細胞である、請求項１５記載の凍結保存用組成物。
- 前記細胞が、生存可能な回復された凍結保存細胞である、請求項１５または１６に記載の凍結保存用組成物。
- 細胞を凍結保存する方法であって、
請求項１～１４のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物に細胞を加えること、
該凍結保存用組成物を凍結すること、
前記凍結した凍結保存用組成物を０℃未満の温度で保存すること、
前記凍結保存用組成物を解凍すること、
解凍した前記凍結保存用組成物から前記細胞を移すこと、ならびに
前記細胞が生存可能なままであるために効果的な条件下で前記細胞を培養すること
を含む方法。 - 前記凍結保存用組成物の前記凍結することが、０．１℃／分～５℃／分、好ましくは０．３℃／分～３℃／分、最も好ましくは０．８℃／分～１．２℃／分の速度で冷却することを含む、請求項１８記載の方法。
- 洗浄工程を含まない、請求項１８記載の方法。
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