CN111034713A

CN111034713A - 一种冻存大体积脂肪组织的方法

Info

Publication number: CN111034713A
Application number: CN201911422015.6A
Authority: CN
Inventors: 孙瑞霞
Original assignee: Guangzhou Baiwosi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Baiwosi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-04-21

Abstract

本发明公开了一种冻存大体积脂肪组织的方法，包括以下步骤：（1）自体血浆的制备；（2）脂肪组织的前处理；（3）脂肪组织的冻存。本发明通过使用配制的脂肪组织冻存液，再辅以自体血浆，以保持冻存的脂肪组织的活性，且冻存后的细胞复苏率高，本发明提供的冻存大体积脂肪组织的方法，既不影响脂肪组织的生物活性，又能最大限度保护脂肪组织中的细胞不受损伤；同时能够一次性储存大量体积的脂肪组织，冻存脂肪组织在复苏后生长状态良好，真正做到“一次吸脂，多次使用”。

Description

一种冻存大体积脂肪组织的方法

技术领域

本发明涉及生物组织细胞保存领域，具体涉及一种冻存大体积脂肪组织的方法。

背景技术

脂肪组织（adipose tissue）是以脂肪细胞为主体的细胞团块．由疏松结缔组织分隔成小叶结构的一种特殊结缔组织。其中，自体脂肪作为一种理想的填充材料，由于其具有来源丰富、取材容易、组织相容性好、无排斥反应、恢复快、不留瘢痕等优点，因此被广泛应用于整形外科领域。但是，自体脂肪移植存在过度吸收问题，临床上常需要进行少量、多次移植才能达到预期的治疗效果；而多次手术操作势必会增加患者的手术风险、身心痛苦、治疗费用以及手术医生的工作量。如果能实现“一次吸脂、多次使用”，则在临床工作中具有重要的应用价值。这就需要对抽取的多余脂肪进行适当的保存。

低温冷冻保存被公认为是组织与器官长期保存的最有效方法之一，其主要是通过低温条件抑制细胞内新陈代谢过程中的化学反应，从而使细胞得以长期保存。虽然低温冷冻能使生物组织长期保存，但也带来了冷冻损伤的问题。因此，需要配以合适的冷冻保护剂进行冷冻保存。

冷冻保护剂是指一类可以保护细胞抵抗低温或超低温对细胞产生的损害的化合物，是保证生物材料免受冷冻和解冻损伤的重要因素。常用的冷冻保护剂可分为两类，一类是渗透性冷冻保护剂，容易透过细胞膜，如丙三醇、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇等；另一类是非渗透性冷冻保护剂，包括蔗糖、葡聚糖和聚乙烯乙二醇（PEG）等。

目前，关于低温冷冻保存脂肪组织的研究较少，主要是关于小体积的脂肪组织冻存方法的研究，尚未有专门的冻存大体积脂肪组织的方法。

发明内容

本发明提供一种冻存大体积脂肪组织的方法，通过使用配制的脂肪组织冻存液，再辅以自体血浆，以保持冻存的脂肪组织的活性，且冻存后的细胞复苏率高。

本发明解决其技术问题采用以下技术方案：

一种冻存大体积脂肪组织的方法，所述冻存大体积脂肪组织的方法包括以下步骤：

（1）自体血浆的制备：用EDTA抗凝采血管采集供者外周血，用体积浓度为70~80%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，将外周血转移分装至40~60mL离心管中，1800~2200rpm转速下离心8~12min，离心结束吸取上层血浆至另一离心管中，然后置于50~60℃水浴中灭活，灭活结束后在2500~3500rpm转速离心8~12min，去除沉淀，得到自体血浆并置于0~6℃保存；

（2）脂肪组织的前处理：采用吸脂术在供者手术部分抽吸脂肪组织于注射器内，保持0~10℃转移至实验室，用体积浓度为70~80%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，静置2~4min，排尽液体；将脂肪组织分装至洁净的200~250mL离心管内，每管体积为80~100mL，加入等体积缓冲液进行洗涤，离心，去除上层液态油脂和下层含有血凝块和条索纤维的缓冲液，重新加入等体积缓冲液反复洗涤2~4次，直至缓冲液澄清，去除洗涤液；

（3）脂肪组织的冻存：将脂肪组织转移至离心管内，每管体积为80~100mL，加入制备好的自体血浆，混匀，然后再加入等体积0~8℃预冷的脂肪组织冻存液，混匀后在0~8℃平衡8~12min，然后转入-25~-15℃冻存25~35min，最后采用无菌棉垫包裹并转移至-90~-70℃冰箱保存。

作为一种优选方案，所述步骤（1）中灭活时间为25~35min。

作为一种优选方案，所述的吸脂术中采用的吸脂针吸孔直径为2~6mm。

作为一种优选方案，所述的缓冲液为生理盐水、PBS中的一种或两种。

作为一种优选方案，所述步骤（2）中离心条件为1200~2000rpm离心3~5min。

作为一种优选方案，所述步骤（3）中自体血浆的加入量占脂肪组织的5~10%。

作为一种优选方案，所述的脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成：5~10份二甲基亚砜、0.5~1份海藻糖、2~6份聚乙烯吡咯烷酮、2~5份血清替代物Ultroser G、80~90份DMEM高糖培养基、0.3~0.7份细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、0.2~0.6份琼脂粉、0.05~0.15份泊洛沙姆188。

作为一种最优选方案，所述的脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成：8份二甲基亚砜、0.8份海藻糖、4份聚乙烯吡咯烷酮、3份血清替代物Ultroser G、83.2份DMEM高糖培养基、0.5份细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、0.4份琼脂粉、0.1份泊洛沙姆188。

作为一种优选方案，所述海藻糖的浓度为0.25~0.50mol/L。

本发明的有益效果：（1）自体血浆来源于供体本身，缺少表面抗原，避免了潜在过敏反应的可能，而且自体血浆中含有血清和多种营养成分，能够提供细胞生长所需的生长因子、激素、维生素和微量矿物元素，在组织冻存过程中对细胞提供一定程度的保护；（2）本发明所述的脂肪组织冻存液通过使用渗透性冷冻保护剂二甲基亚砜，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，通过使用海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮非渗透性冷冻保护剂，可使细胞或组织在冷冻、脱水、高渗透压及有毒试剂等环境中仍然保持生物活性，而且对机体没有任何毒副作用，再通过与血清替代物Ultroser G、细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、琼脂粉、泊洛沙姆188的联用，既保持了冻存的脂肪组织的生物活性，又保证了在使用经洗涤过的冷冻脂肪组织进行移植手术后不会对人体产生毒副作用，且冻存后的细胞复苏率高；（3）本发明提供的冻存大体积脂肪组织的方法，既不影响脂肪组织的生物活性，又能最大限度保护脂肪组织中的细胞不受损伤；同时能够一次性储存大量体积的脂肪组织，冻存脂肪组织在复苏后生长状态良好，真正做到“一次吸脂，多次使用”。

附图说明

图1为冻存前脂肪组织的油红O染色组织学光镜观察照片；

图2冻存3个月复苏后脂肪组织的油红O染色组织学光镜观察照片；

图3为冻存前脂肪组织的P1代细胞生长状态；

图4为冻存3个月后复苏的脂肪组织P1代细胞生长状态；

图5为脂肪组织冻存前后的生长曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

（1）自体血浆的制备：用EDTA抗凝采血管采集供者外周血，用体积浓度为75%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，将外周血转移分装至50mL离心管中，2000rpm转速下离心10min，离心结束吸取上层血浆至另一离心管中，然后置于56℃水浴中灭活，灭活结束后在3000rpm转速离心10min，去除沉淀，得到自体血浆并置于4℃保存；

（2）脂肪组织的前处理：采用吸脂术在供者手术部分抽吸脂肪组织于注射器内，保持5℃转移至实验室，用体积浓度为75%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，静置3min，排尽液体；将脂肪组织分装至洁净的225mL离心管内，每管体积为95mL，加入等体积缓冲液进行洗涤，离心，去除上层液态油脂和下层含有血凝块和条索纤维的缓冲液，重新加入等体积缓冲液反复洗涤3次，直至缓冲液澄清，去除洗涤液；

（3）脂肪组织的冻存：将脂肪组织转移至离心管内，每管体积为95mL，加入制备好的自体血浆，混匀，然后再加入等体积4℃预冷的脂肪组织冻存液，混匀后在4℃平衡10min，然后转入-20℃冻存30min，最后采用无菌棉垫包裹并转移至-80℃冰箱保存。

所述步骤（1）中灭活时间为30min。

所述的吸脂术中采用的吸脂针吸孔直径为4mm。

所述的缓冲液为PBS。

所述步骤（2）中离心条件为1600rpm离心4min。

所述步骤（3）中自体血浆的加入量占脂肪组织的8%。

所述的脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成：8份二甲基亚砜、0.8份海藻糖、4份聚乙烯吡咯烷酮、3份血清替代物Ultroser G、83.2份DMEM高糖培养基、0.5份细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、0.4份琼脂粉、0.1份泊洛沙姆188。

所述海藻糖的浓度为0.40mol/L。

实施例2

实施例2与实施例1不同之处在于，冻存大体积脂肪组织的方法的参数不同，其它都相同。

（1）自体血浆的制备：用EDTA抗凝采血管采集供者外周血，用体积浓度为70%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，将外周血转移分装至60mL离心管中，1800rpm转速下离心12min，离心结束吸取上层血浆至另一离心管中，然后置于50℃水浴中灭活，灭活结束后在3500rpm转速离心8min，去除沉淀，得到自体血浆并置于6℃保存；

（2）脂肪组织的前处理：采用吸脂术在供者手术部分抽吸脂肪组织于注射器内，保持0℃转移至实验室，用体积浓度为80%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，静置2min，排尽液体；将脂肪组织分装至洁净的250mL离心管内，每管体积为80mL，加入等体积缓冲液进行洗涤，离心，去除上层液态油脂和下层含有血凝块和条索纤维的缓冲液，重新加入等体积缓冲液反复洗涤4次，直至缓冲液澄清，去除洗涤液；

（3）脂肪组织的冻存：将脂肪组织转移至离心管内，每管体积为80mL，加入制备好的自体血浆，混匀，然后再加入等体积8℃预冷的脂肪组织冻存液，混匀后在0℃平衡12min，然后转入-25℃冻存35min，最后采用无菌棉垫包裹并转移至-90℃冰箱保存。

所述步骤（1）中灭活时间为35min。

所述的吸脂术中采用的吸脂针吸孔直径为2mm。

所述的缓冲液为PBS。

所述步骤（2）中离心条件为2000rpm离心3min。

实施例3

实施例3与实施例1不同之处在于，冻存大体积脂肪组织的方法的参数不同，其它都相同。

（1）自体血浆的制备：用EDTA抗凝采血管采集供者外周血，用体积浓度为80%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，将外周血转移分装至40mL离心管中，2200rpm转速下离心8min，离心结束吸取上层血浆至另一离心管中，然后置于60℃水浴中灭活，灭活结束后在2500rpm转速离心12min，去除沉淀，得到自体血浆并置于0℃保存；

（2）脂肪组织的前处理：采用吸脂术在供者手术部分抽吸脂肪组织于注射器内，保持10℃转移至实验室，用体积浓度为70%的酒精消毒处理后转移至无菌工作台内，静置4min，排尽液体；将脂肪组织分装至洁净的200mL离心管内，每管体积为100mL，加入等体积缓冲液进行洗涤，离心，去除上层液态油脂和下层含有血凝块和条索纤维的缓冲液，重新加入等体积缓冲液反复洗涤2次，直至缓冲液澄清，去除洗涤液；

（3）脂肪组织的冻存：将脂肪组织转移至离心管内，每管体积为100mL，加入制备好的自体血浆，混匀，然后再加入等体积0℃预冷的脂肪组织冻存液，混匀后在8℃平衡8min，然后转入-15℃冻存25min，最后采用无菌棉垫包裹并转移至-70℃冰箱保存。

所述步骤（1）中灭活时间为25min。

所述的吸脂术中采用的吸脂针吸孔直径为6mm。

所述的缓冲液为PBS。

所述步骤（2）中离心条件为1200rpm离心5min。

实施例4

实施例4与实施例1不同之处在于，自体血浆的加入量不同，其它都相同。

所述自体血浆的加入量占脂肪组织的5%。

实施例5

实施例5与实施例1不同之处在于，脂肪组织冻存液的配比不同，其它都相同。

所述的脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成：5份二甲基亚砜、1份海藻糖、2份聚乙烯吡咯烷酮、5份血清替代物Ultroser G、80份DMEM高糖培养基、0.7份细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、0.2份琼脂粉、0.15份泊洛沙姆188。

实施例6

实施例6与实施例1不同之处在于，脂肪组织冻存液的配比不同，其它都相同。

所述的脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成： 10份二甲基亚砜、0.5份海藻糖、6份聚乙烯吡咯烷酮、2份血清替代物Ultroser G、90份DMEM高糖培养基、0.3份细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、0.6份琼脂粉、0.05份泊洛沙姆188。

对比例1

对比例1与实施例1不同之处在于，对比例1没有加入自体血浆，其它都相同。

对比例2

对比例2与实施例1不同之处在于，对比例2脂肪组织冻存液中不含有二甲基亚砜，其它都相同。

对比例3

对比例3与实施例1不同之处在于，对比例3脂肪组织冻存液中不含有海藻糖其它都相同。

对比例4

对比例4与实施例1不同之处在于，对比例4脂肪组织冻存液中不含有聚乙烯吡咯烷酮，其它都相同。

对比例5

对比例5与实施例1不同之处在于，对比例5脂肪组织冻存液中不含有血清替代物Ultroser G，其它都相同。

对比例6

对比例6与实施例1不同之处在于，对比例6脂肪组织冻存液中不含有琼脂粉，其它都相同。

对比例7

对比例7与实施例1不同之处在于，对比例6脂肪组织冻存液中不含有泊洛沙姆188，其它都相同。

为了进一步证明本发明的效果，提供了以下测试方法：

1.冻存脂肪细胞复苏率。

开启电热恒温水浴锅，并预热至39℃，从-80℃冰箱中取出冻存3个月的实施例1~6、对比例1~7的脂肪组织，快速置于水浴锅中，并经常晃动离心管使脂肪组织快速解冻，复苏，计算活率，结果见表1。

表1 细胞复苏活率

从表1可以看出，本发明所述的冻存大体积脂肪组织的方法冻存后的细胞具有极高的复苏率，对比实施例1~3可知，不同的冻存大体积脂肪组织的方法参数能够影响脂肪组织的复苏率，其中实施例1为最佳参数；对比实施例1与实施例4可知，不同的自体血浆的加入量也能影响脂肪组织的复苏率，其中实施例1为最佳自体血浆加入量；对比实施例1与实施例5、6可知，不同的脂肪组织冻存液的配比能够影响脂肪组织的复苏率，其中实施例1为最佳配比；由上可知，实施例1为最佳实施方式；对比实施例1与对比例1可知，自体血浆的加入与否，能够显著影响脂肪组织的复苏率，对比实施例1与对比例2~7可知，二甲基亚砜、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、血清替代物Ultroser G、细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、琼脂粉、泊洛沙姆188均能显著的影响脂肪组织的复苏率，其中二甲基亚砜影响最大，其它依次为：聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、血清替代物Ultroser G、细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、琼脂粉、泊洛沙姆188。

2. 实施例1冻存前、后脂肪组织复苏后的培养。

开启电热恒温水浴锅，并预热至39℃，从-80℃冰箱中取出冻存3个月的脂肪组织，快速置于水浴锅中，并经常晃动离心管使脂肪组织快速解冻；然后1500rpm离心4min，用酒精棉球将离心管外壁擦拭干净并转移至超净工作台中，移除自体血浆和冻存液，并用等体积生理盐水洗涤1次，去除洗涤液，取少量脂肪组织制作成冰冻切片，然后进行油红O染色观察冻存前、后脂肪组织形态的变化（图1、2），从图1、2中可看出，冻存后脂肪组织仍有大量的脂质被染色，与冻存前脂肪组织比较无明显差异；剩余的脂肪组织加入等体积 37℃预热的0.1%胶原酶I溶液，37℃，70rpm消化1h。加入适量生理盐水终止消化，400g离心10min，去除上层油脂和液体，仅保留底部沉淀；用生理盐水重悬，400g离心10min，用培养液重悬细胞并接种培养，获得脂肪干细胞，在倒置显微镜下观察（图3、图4），从图3、4可看出，冻存复苏后分离得到的脂肪干细胞和冻存前分离得到的脂肪干细胞形态一致，脂肪组织冻存前后的生长曲线如图5所示，从图5可以看出脂肪组织冻存前后的生长状态基本一致。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims

1.一种冻存大体积脂肪组织的方法，其特征在于，所述冻存大体积脂肪组织的方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的冻存大体积脂肪组织的方法，其特征在于，所述步骤（1）中灭活时间为25~35min。

3.根据权利要求1所述的冻存大体积脂肪组织的方法，其特征在于，所述的吸脂术中采用的吸脂针吸孔直径为2~6mm。

4.根据权利要求1所述的冻存大体积脂肪组织的方法，其特征在于，所述的缓冲液为生理盐水、PBS中的一种或两种。

5.根据权利要求1所述的冻存大体积脂肪组织的方法，其特征在于，所述步骤（2）中离心条件为1200~2000rpm离心3~5min。

6.根据权利要求1所述的冻存大体积脂肪组织的方法，其特征在于，所述步骤（3）中自体血浆的加入量占脂肪组织的5~10%。

7.根据权利要求1所述的冻存大体积脂肪组织的方法，其特征在于，所述的脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成：5~10份二甲基亚砜、0.5~1份海藻糖、2~6份聚乙烯吡咯烷酮、2~5份血清替代物Ultroser G、80~90份DMEM高糖培养基、0.3~0.7份细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、0.2~0.6份琼脂粉、0.05~0.15份泊洛沙姆188。

8.根据权利要求7所述的冻存大体积脂肪组织的方法，其特征在于，所述的脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成：8份二甲基亚砜、0.8份海藻糖、4份聚乙烯吡咯烷酮、3份血清替代物Ultroser G、83.2份DMEM高糖培养基、0.5份细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、0.4份琼脂粉、0.1份泊洛沙姆188。

9.根据权利要求7所述的冻存大体积脂肪组织的方法，其特征在于，所述海藻糖的浓度为0.25~0.50mol/L。