DE2604481C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine wäßrige Lösung von Lentinan, die durch einen Gehalt an einem wasserlöslichen Dextran und Glucose stabilisiert ist. Diese Lösung eignet sich als Arzneimittelzubereitung, beispielsweise zur intravenösen Injektion.

Wie aus der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung 484/1974 hervorgeht, hat Lentinan, ein β-(1→3)-Glucan, Antitumorwirksamkeit und hervorragende Wirksamkeit zur Wiederherstellung der Immunantwort, die normalerweise in dem an einem Tumor erkrankten Organismus vermindert ist.

Dieses Lentinan hat jedoch - wie auch andere als Antitumormittel wirksame Polysaccharide wegen ihres hohen Molekulargewichts - eine geringe Löslichkeit in Wasser, nämlich 38 mg/dl. Die wäßrige Lösung von Lentinan neigt daher gewöhnlich zur Ausbildung eines unlöslichen Niederschlags, wenn sie einen oder zwei Tage oder länger stehengelassen wird. Lentinan kann leicht in einer wäßrig alkalischen Lösung gelöst werden; es wird jedoch in der Lösung rasch hydrolysiert und in inaktive Abbauprodukte übergeführt.

Es ist eine bekannte Tatsache, daß die physiologische Aktivität selbst vermindert oder beseitigt werden kann, wenn eine physiologisch aktive Substanz gemeinsam mit anderen Hilfssubstanzen gelöst wird, um die Löslichkeit der aktiven Substanz zu erhöhen. Diese Tatsache konnte durch die Untersuchungen der Anmelderin vor allem dann bestätigt werden, wenn die physiologische Aktivität von Polysacchariden weitgehend von der Makrostruktur der Polysaccharide in der Lösung abhängt. Wenn ein Polysaccharid mit Antitumorwirkung gemeinsam mit einem anderen Mittel in Wasser gelöst wird, so zeigt sich, daß die physiologische Wirksamkeit vieler Polysaccharide aufgrund einer weitgehenden Veränderung der höheren Strukturen bzw. Makrostrukturen der Polysaccharide in der wäßrigen Lösung in Gegenwart der Hilfsstoffe vermindert wird oder verschwindet.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine stabilisierte wäßrige Lösung des physiologisch aktiven Lentinans zur Verfügung zu stellen, in der dieser Polysaccharidwirkstoff in relativ hoher Konzentration gelöst werden kann, ohne daß es beim Stehenlassen zu unerwünschten Abscheidungen kommt.

Es wurde nun gefunden, daß eine wäßrige Lösung, die das physiologisch aktive Lentinan und bestimmte Mengen von einem wasserlöslichen Dextran sowie Glucose enthält, die gewünschte physiologische Aktivität, speziell Antitumoraktivität, nicht verliert und daß diese Aktivität nicht vermindert wird. Eine derartige wäßrige Lösung ist weit stabiler und bildet keine Spuren einer Abscheidung und eignet sich daher sehr gut als Injektionslösung zur intravenösen Injektion in der Humanmedizin. Außerdem wird auf diese Weise die Löslichkeit des Lentinans im wäßrigen Medium stark erhöht.

Die erfindungsgemäße stabilisierte wäßrige Lösung mit Wasser als Medium enthält dabei neben dem Lentinan als physiologisch wirksamer Verbindung noch ein wasserlösliches Dextran in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 g/dl und Glucose in einer Konzentration von 1,0 bis 10 g/dl.

Das in den erfindungsgemäßen Lösungen vorliegende tumorhemmende Lentinan kann aus den Fruchtkörpern von Lentinus edodes Sing extrahiert werden.

Für das wasserlösliche Dextran besteht in Bezug auf das Molekulargewicht keine Beschränkung. Die erfindungsgemäße Lösung enthält im Hinblick auf die stabilisierende Wirkung und die Viskosität der Lösung das Dextran vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 1,0 g/dl.

Um eine isotonische Lösung mit guter Stabilität zu erzielen, enthält die erfindungsgemäße Lösung 1,0 bis 10 g/dl des Monosaccharids Glucose.

Die erfindungsgemäße Lösung kann gebildet werden, indem das wasserlösliche Dextran und die Glucose zu der Lösung des tumorhemmenden Lentinans gegeben werden. Durch Zugabe des wasserlöslichen Dextrans und der Glucose wird eine bemerkenswerte Verbesserung der Stabilität und Löslichkeit erreicht, die auf eine Wechselwirkung zwischen diesen beiden Materialien zurückzuführen ist.

Beispiel

500 g frische Fruchtkörper von Lentinus edodes wurden gewaschen, in einem Waring-Mischer mit etwa 2 l Wasser homogen zerkleinert und die so erhaltene Aufschlämmung wurde unter Rühren 16 Stunden gekocht. Nach dem Entfernen von unlöslichen Materialien durch Zentrifugieren wurde 1 l einer überstehenden Flüssigkeit erhalten, die auf etwa 1/3 ihres ursprünglichen Volumens im Vakuum eingedampft wurde. Das Konzentrat wurde in etwa 400 ml Äthanol gegossen, wobei sich etwa 50 g eines faserigen Niederschlags bildeten. Der Niederschlag wurde mit einem Sieb entfernt, mit Äthanol gewaschen und durch Homogenisieren in einem Waring-Mischer während 5 Minuten in 2 l Wasser dispergiert. Durch weiteres Verdünnen mit 20 l Wasser und Rühren wurde eine klare Lösung erhalten.

Eine 0,2molare Lösung von Cetyltrimethylammoniumhydroxid wurde tropfenweise zugesetzt, bis kein weiterer farbloser Niederschlag mehr gebildet wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen, in Äthanol gewaschen, 5 Minuten bei Raumtemperatur in 1,2 l 20%iger Essigsäure gerührt und erneut in Form eines Niederschlags durch Zentrifugieren isoliert. Das Verfahren wurde unter Verwendung von 1,2 l 50%iger Essigsäure von 0°C wiederholt. Der erhaltene Niederschlag wurde in einer 0,5 n wäßrigen Natriumhydroxidlösung gelöst und die so erhaltene Lösung wurde mit Hilfe der Methode nach Sevage entproteinisiert. Aus der entproteinisierten Lösung wurde reines Lentinan in bekannter Weise ausgefällt, gewaschen und getrocknet.

Das so erhaltene Lentinan wurde mit Hilfe eines Homogenisators in destilliertem Wasser dispergiert und die Dispersion wurde erhitzt, wobei eine gesättigte Lösung erhalten wurde, die in 10 Proben unterteilt wurde. Zu verschiedenen Proben wurden die nachstehend angegebenen Zusätze zugefügt und jede Probe wurde mit destilliertem Wasser auf 100 ml mit einem Gehalt an 0,1 g Lentinan verdünnt, durch ein Milliporenfilter filtriert und auf 100 Glasfläschen verteilt, die dann dicht verschlossen und 30 Minuten in Wasserdampf von 110°C sterilisiert wurden. Die Fläschchen, welche die Bildung eines Niederschlags zeigten, wurden sofort verworfen und die anderen Proben wurden 2 Monate bei 40°C, 25°C bzw. 0°C aufbewahrt.

Probe Nr. 1 enthielt keine Zusätze. 80 Fläschchen wurden sofort nach dem Sterilisieren verworfen, weil sich ein Niederschlag gebildet hatte. Alle verbliebenen Fläschchen, die bei 40°C aufbewahrt worden waren, zeigten einen Niederschlag, 2/3 der bei 25°C aufbewahrten Fläschchen waren ebenso mangelhaft und gleiches gilt für die Hälfte der bei 0°C aufbewahrten Fläschchen.

Probe Nr. 2 enthielt zusätzlich zu Lentinan 5 g/dl Glucose. 70 Fläschchen zeigten einen Niederschlag nach dem Sterilisieren und etwa die Hälfte der anfänglich klaren Lösungen bildeten Niederschläge nach der Aufbewahrung bei jeder der drei gewählten Temperaturen.

Probe Nr. 3 enthielt 0,9 g/dl NaCl als einzigen Zusatz, wodurch eine Ausfällung in allen Fläschchen nach der Sterilisation verursacht wurde.

Die Proben Nr. 4, 5 und 6 enthielten 1 g/dl Dextran 70, 1 g/dl Hydroxyäthylstärke (Molekulargewicht 200 000) bzw. 1 g/dl Natriumsalz der Carboxymethylcellulose als löslichmachende Mittel. Etwa 10 Fläschchen der Probe Nr. 5 und 20 Fläschchen jeder der Proben Nr. 4 und 6 mußten nach der Sterilisation verworfen werden. In den anderen Fläschchen dieser Gruppe wurde durch die Lagerung bei 40°C, 25°C oder 0°C kein Niederschlag gebildet.

Probe Nr. 7 enthielt zusätzlich zu Lentinan 1 g/dl Dextran 70 und 0,9 g/dl NaCl. 10 Fläschchen mußten nach dem Sterilisieren verworfen werden und 10 bis 20% der Fläschchen, welche die erste Bewertung passierten, zeigten Niederschläge nach der Aufbewahrung bei den drei angegebenen Temperaturen.

Die Proben Nr. 8 bis 10 unterschieden sich von den Proben Nr. 4 bis 6 durch den Zusatz von 5 g/dl Glucose als weiterem löslichmachenden Mittel. Es zeigte sich, daß kein Fläschchen nach der Sterilisation einen Niederschlag enthielt und es bildete sich kein Niederschlag während zwei Monate langer Lagerung bei 40°C, 25°C bzw. 0°C.

Die Antitumorwirkung von frisch sterilisierten Proben von Lentinan und von Proben, die zwei Monate bei 40°C aufbewahrt worden waren, wurden unter Verwendung von Gruppen von zehn ICR-JCI-Mäusen geprüft. Die Mäuse erhielten subkutane Injektionen von 3×10⁶ Zellen von Sarcoma 180 in 0,05 ml Ascites-Flüssigkeit in die rechte Leistengegend. 24 Stunden nach der Injektion der Tumorzellen und danach täglich während insgesamt zehn Tagen wurden den Mäusen intraperitoneale Injektionen von Lentinanlösungen entsprechend 1 mg Lentinan pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. Nach 5 Wochen wurden die Tumoren herausgeschält und ausgewogen und die durchschnittliche Inhibierungswirkung wurde in Prozent berechnet im Vergleich mit dem Gewicht von Tumoren, die aus einer Gruppe von unbehandelten Kontrolltieren erhalten wurden. Die Anzahl von vollständigen Regressionen der Tumoren wurde ebenfalls festgehalten.

Die Proben Nr. 3 und Nr. 1 konnten nach der Lagerung nicht mehr geprüft werden, weil keine klaren Lösungen mehr vorlagen. Die Ergebnisse der anderen Proben sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle

Ferner wurde die Toxizität des im Beispiel verwendeten Lentinans gegenüber Mäusen geprüft, wobei dieses den Mäusen durch intraperitoneale Injektion verabreicht wurde. Es zeigte sich, daß die DL₅₀-Werte größer als 4000 mg/kg waren.

Das Molekulargewicht des als Antitumormittel wirksamen Lentinans ist für die Zwecke der Erfindung irrelevant, abgesehen von den für die Antitumorwirkung erforderlichen Grenzwerten und von den Löslichkeitseigenschaften.

Die intraperitoneale Injektion ist zwar die praktisch geeignetste Methode zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Lösungen, es können jedoch auch andere Verabreichungswege gewählt werden. Weitere Tests zeigen an, daß diese intraperitonealen Injektionslösungen auch von anderen Warmblütlern als Laboratoriumstieren gut vertragen werden, wenn sie intravenös injiziert werden.

Claims (1)

1. Stabilisierte wäßrige Lösung von Lentinan, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein wasserlösliches Dextran in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 g/dl und Glucose in einer Konzentration von 1,0 bis 10 g/dl enthält.