DE2417859C2

DE2417859C2 - Verfahren zur Herstellung von einfachen oder gemischten Heparinsalzen und diese enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2417859C2
Application number: DE2417859A
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Marmomme Amyot; Jean Paris Choay; Jean Oissel Goulay
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1973-04-13
Filing date: 1974-04-11
Publication date: 1984-09-20
Also published as: CH597259A5; IT1100950B; JPS5052217A; US4168377A; AU6783674A; CA1042001A; IT7830216A0; NL7405033A; AU504218B2; BE813707A; DE2417859A1; GB1471482A; ES425303A1; AR210456A1

Description

das einen Kiilziumgehalt von 6 Gcw.-% aufweist. Die Analyse dieses Heparinsalz.es zeigt jedoch, daß es noch einen Natriumgehalt von 5,12 Gew.-% besitzt.

Man beobachtet jedoch andererseits, daß in einer zweiten Stufe, insbesondere nachdem ein Kalziumgehalt von 6% erreicht ist, die Bindung des Kalziums nicht mehr quantitativ erfolgt, wenn die Kalziumchloridzugabe fortgesetzt wird. Zum Beispiel ist es zur Erzielung eines Kalziumgehahes von 8,75% notwendig, zu dem Medium 12% Kalzium zuzugeben. Selbst wenn die Zugabe bis zu einer erheblichen Kalziumkonzcniration fortgesetzt wird, gelingt es nicht, das Natrium vollständig auszutauschen.

Somit erscheint dieses Verfahren nicht dazu geeignet zu sein, ein vollständig Natriumionen-freies Heparinkalzium (Kalziumheparinat) herzustellen. Ganz allgemein ist es auch, jedenfaiis bei Einhaltung der bekannten Bedingungen, nicht dazu geeignet, gemischte Salze von Heparin, z. B. von Kalzium und Magnesium, herzustellen, die praktisch vollständig frei von Natriumionen sind, wenn man als Ausgangsmaterial Heparinnatrium verwendet.

Die andere stark verallgemeinerte Form der vorstehend angegebenen Verfahrensweise könnte im Prinzip diese Nachteile vermeiden. Die Anwendung des Hcparins in Form der freien Säure führt jedoch zu einer Reihe anderer Nachteile, von denen der gravierendste die Instabilität der Heparinsäure betrifft, gleichgültig welche Verfahrensbedingungen angewandt werden. Der beobachtete Verlust der antikoagulierendcn Wirkung liegt zwischen 20 und 30%, bezogen auf das eingesetzte Heparin.

Weiterhin ist ohne weiteres zu erkennen, daß dieses Verfahren nur sehr schwer, wenn überhaupt, für die Herstellung von gemischten Salzen geeignet ist. deren relative Konzentrationen an verschiedene Melallioncn vorherbestimmten Werten entsprechen.

Die AT-PS 2 22 807 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutisch wirksamen Produkts auf der Basis von Heparin, gemäß dem das Heparin mit Metallhydroxiden oder mit anorganischen Salzen unter Bildung von wasserlöslichen Verbindungen umgesetzt wird. Dabei ist angegeben, daß bei der Umsetzung von Heparin mit Metallhydroxiden oder anorganischen Salzen die Kationen der angewendeten Hydroxide und die Kationen und Anionen der angewendeten metallischen Salze sehr stark an die Polysaccharide gebunden werden.

Die FR-PS 6 853 M offenbart Magncsiumheparinat und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Dabei wird das Magnesiumheparinat dadurch hergestellt, daß man Natriumheparinat insbesondere mit Hilfe eines Kationenaustauschers vollständig von den Natriumionen befreit und die erhaltene Heparinsäure mit einem Magnesiumsalz umsetzt. Dieses Verfahren ist insoweit nachteilig, als die zunächst zu bildende Heparinsäure instabil ist und Aktivitätsverluste zwischen 20 und 30% hingenommen werden müssen.

Die FR-PS 15 38 204 und die US-PS 34 82 014 beschreiben saure Heparinsalze und Verfahren zu ihrer Herstellung unter Verwendung von Ionenaustauscherharze^

Schließlich sind in den Referaten in Chemical Abstracts 62 (1965) 945c und 78 (1973) 52893y die pharmakologischen Eigenschaften von Kalziumheparinat beschrieben, namentlich seine Wirkung auf die Kapillargefäße und Lungenembolien.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt, weitgehend von Natrium befreite Heparinsalzi.· zu schaffen, die in allen Fällen ohne das Risiko des Auftretens von unerwünschten Nebeneffekten eingesetzt wcrden können und die gegebenenfalls frei vorherbestimnibare. relative Gehalte an bestimmten Metallionen aiitweiscn.

Diese Aufgabe wird nun gelöst durch das Verfahren gemäß llauptanspruch. Die Unteransprüche betreffen ίο besonders bevorzugte Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Verfahrens.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Arzneimittel.

welches die in dieser Weise hergestellten einfachen oder gemischten Heparinsalze als Wirkstoffe neben üblichen pharmazeutischen Bindemitteln oder Trägermaterialien enthält.

Vorzugsweise verwendet man als einfaches Ausgangsheparinsalz Heparinnatrium (Natriumheparinat). Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß nach der Reaktion des Heparinnatriums mit Kalziumchlorid die im Verlaufe der anfänglichen Reaktion in Form von Natriumchlorid freigesetzte Natriumionen mit den Kalziumionen konkurrieren und schließlich den Austausch blockieren, trotz der Tatsache, daß die Affinität des Heparins für Kalzium größer ist als für Natrium. Die vorherige Entfernung der Natriumionen gestattet anschließend die Substitution der noch in dem Heparinat enthaltenen Natriumionen durch Kalziumionen.

Es versteht sich, daß bei der Reaktion eines als Ausjo gangsmaterial eingesetzten Salzes, wie Heparinnatrium oder eines Heparinsalzes mit einem anderen Metall, mit einem Metallsalz, das von einem Kalziumsalz verschieden ist, äquivalente Phänomene zum Tragen kommen.

Es hat sich gezeigt, daß, wenn man in der genannten J5 zweiten Stufe eine einzige Abtrennung der freien Metallionen, gefolgt von einer einzigen erneuten Behandlung der das Heparinat enthaltenen Lösung mit einer ausreichenden Menge eines Salzes des substituierenden Metalles ein Heparinat herstellen kann, das einen höheren Gehalt an Ionen des Substitutionsmetalls enthält, als es das Heparinat enthalten würde, das man nach Durchführung einer einzigen ersten Stufe erhalten würde, selbst wenn man eine wesentlich größere Menge des Salzes des Subsiitutionsmctalls, bezogen auf das Ausgangsmaterial eingesetzte einfache Salz, verwenden würde.

Mit anderen Worten besteht das erfindungsgemäße Verfahren, wenn es auf die Herstellung eines einfachen natriumfreien Hcparinsal/.cs, /.. B. das Kalziumsalz, gerichtet ist, in einer ersten Stufe, in der man ein Natriumsalz von Heparin mit einem Salz des Metalls, das Natrium ersetzen soll, insbesondere Kalzium, z. B. Kalziumchlorid, in Berührung bring! und anschließend in einer zweiten Stufe mindestens einen Behandlungszyklus durchführt, der die Abtrennung der freien Metallioncn von dem erhaltenen Heparinat und eine erneute Behandlung des erhaltenen Heparinats mit dem Kalziumsalz umfaßt, bis man eine praktisch vollständige oder totale Befreiung des als Ausgangsmaterial eingesetzten M) Heparinsalzes von Natrium erreicht hat. Die zwischenzeitlich im Verlaufe der genannten Abtrennungsphase durchgeführte Beseitigung der Natriumionen gestattet die Weiterführung der Substitution der Natriumionen.

Es ist festzustellen, daß wenn die Behandlung in der ersten Stufe bereits eine relativ weitgehende Substitution der in dem anfänglich eingesetzten Heparinat enthaltenen Mctallionen durch die Ionen des Substitutionsmetalls bewirkt hat, ein einziger für die zweite Phase des

erfindungsgemäßen Verfahrens charakteristische Bchandlungszyklus dazu ausreichen kann, einen vollständigen Ersatz der in dem Ausgangsheparinat enthaltenen Metallionen zu bewirken.

Beispielsweise ist es möglich, ve. einer Heparinsalzlösung, die 8,75% Kalzium enthält, ausgehend eine praktisch vollständige Befreiung dieses Salzes von Natrium zu bewirken, indem man dieses Heparir.salz nach der Abtrennung der in dem Medium enthaltenen freien Mctallionen mit einer Kalziumchloridmenge in Berührung bringt, die — bezogen auf das Heparinat — 10Gew.-% Kalzium entspricht. Das Heparinat enthält nach Beendigung dieser Behandlung etwa 10,5 Gew.-% Kalzium.

Wenn man eine Lösung des gleichen Hcparinats, das 8,75% Kalzium enthält, mit einer Kalziumchloridmenge in Berührung bringt, die nur 3 Gew.-% Kalzium entspricht, erhält man trotzdem ein Heparinat. das bereits 10,2% Kalzium enthält.

Die in der zweiten Stufe des Verfahrens erforderliche Abtrennung der freigesetzten Ionen kann in irgendeiner, an sich bekannten Weise erfolgen. Vorzugsweise bewirkt man eine Dialyse, insbesondere gegen cimnineralisiertes Wasser, oder man fällt das erhaltene Heparinat in einem Medium aus, in dem die aus den freigesetzten Metallionen gebildeten Salze löslich sind, insbesondere in einem wäßrig-alkoholischen Medium, das vorzugsweise eine Konzentration von 70 Vol-%, gemessen bei 15°C (70° GL) nicht übersteigt.

Wenn man eine Dialyse, insbesondere gegen cntmineralisiertes Wasser, durchführt, muß diese normalerweise während einer Zeitdauer erfolgen, die für eine praktisch vollständige Beseitigung der nach der ersten Behandlung freigesetzten Natriumionen ausreicht. Diese Dialyse kann gegebenenfalls gleichzeitig mit dieser ersten Behandlung erfolgen, wenn man von Anfang an mit einem Überschuß des Kalziumsalzes arbeitet und die freigesetzten Natriumionen in dem Maße, in dem sie freigesetzt werden, von dem Reaktionsmedium abtrennt, so daß man nach dieser ersten Behandlung oder diesem ersten Inberührungbringcn, wenn man vorher bestimmte Mengen, z. N. des Nalriumsalzes, des Hcparins und des Kalziumchlorids, anwendet, eine weitgehendere Entfernung des Natriums aus dem anfänglich eingesetzten Heparin erreicht, als man es erzielen würde, wenn man die gleichen Reagensmengcn einsetzt, jedoch die Dialyse nicht gleichzeitig durchführt.

Die Dialyse kann gegebenenfalls erst in dem Augenblick durchgeführt werden, da eine teilweise Substitution des Natriums durch Kalzium. /.. B. von 6%, erreicht ist, d. h. dem Augenblick, da der Wettstreit der Natriumionen mit den Kalziuniioncn, der die weitere Substitution verhindert, erheblich wird. Zum Beispiel kann man. wenn man ein Heparinsalz. das 8,75% Kalzium enthält, herstellen will, das als Ausgangsmaterial eingesetzte Heparinnatrium mit einer Kalziumchloridmengc in Berührung bringen, die einer Zufuhr von 12% Kalzium entspricht, worauf die Dialyse in dem Augenblick durchgeführt wird, da die an das Heparin gebundene Kalziunimenge 6% erreicht hat, was etwa 15 Std. nach dem Inberührungbringen des Nalriumsalzes von Heparin mit Kalziumchlorid der Fall ist, wobei die Dialyse dann während etwa b Std. durchgeführt wird.

Wenn man die Ausfällungsmcthodc anwendet, wird der erhaltene 1 leparinainiederschlag erneui in desiil-IkTUMii Wasser gelöst und mil Kal/iuinioncn in Berührung gebracht, die inshcioiidere in l'orni von kal/iimti'hlond /tigelülirt werden. In dieser Weise kann man leicht. /. H. auspellend von einer Losung eines gemischten Natrium-Kalzium-Heparinsalzes, das einen Kalziumgchall von 8,75% enthält, und das unter Einhaltung der obigen Bedingungen erhalten wurde, durch einfache Ausfällung des gemischten Hcparinats mit neutralem Äthylalkohol und Wiederauflösen dieses Niederschlags in Wasser und Zuführen einer wäßrigen Lösung, die unter Einsatz einer Kalziumchloridmenge hergestellt wurde, die, bezogen auf das anfänglich eingesetzte Heparin, eine Zuführung von 3% Kalzium bewirkt, ein KaI-ziumsalz von Heparin herstellen, das praktisch frei von Natriumionen ist.

Es versteht sich schließlich von selbst, daß man die beiden Abtrennungsverfahren kombinieren kann, und zunächst eine Dialyse des Mediums durchführt und dann das Heparinat ausfällt, um es von dem Reaktionsmedium abzutrennen, worauf man das ausgefällte Heparinat erneut in Lösung bringt und mit dem das gewünschte substituierende Metall enthaltende Salz in Berührung bringt.

In allen Rillen erhält man somit ohne weiteres ein Kalziumhcparinai. das einen Gehalt an Kalziumionen zwischen 10,3 und 10,6% und einen Natriumgehall von weniger als 0,1% aufweist. Glücklicherweise hat es sich gezeigt, daß das Endprodukt die antikoagulierende Wir-

2S kung de? anfänglich eingesetzten Heparins vollständig beibehalten hat.

Die Verwendung dieses natriumfreien Kalziumheparinals in der Therapie ist dadurch von Vorteil, daß es in sehr konzentrierten Dosierungen durch lokale, insbe-

H) sondere subkutane Injektionen verabreicht werden kann. Es ist ebenfalls möglich, einen maximalen Nutzen aus der starken anlikoaguliercnden Wirkung des Heparins zu ziehen und dennoch die Patienten von den oben bereits kurz angesprochenen Nachteilen zu bewahren.

Hinzu kommt, daß die subkutane Verabreichung einer Lösung mit hoher Konzentration besonders interessant ist, da in dieser Weise die antikoagulierende Wirkung des Heparins verzögen werden kann, wodurch Perfusionen oder wiederholte intravenöse Injektionen vermieden werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet somit in einfacher Weise die Herstellung eines Heparinkalziums, ohne daß es erforderlich ist. die Heparinsäure als Zwischenprodukt herzustellen, wodurch das Risiko eines

4^r) Verlustes der anlikoaguliercnden Aktivität ausgeschlossen wird.

Man kann unter den gleichen Bedingungen auch Hcparinate von Magnesium oder anderen Kationen herstellen, die vollständig von Natrium befreit sind.

ίο Die obigen Ausführungen betrafen insbesondere die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von einfachen Heparinsalzen, die Kationen enthalten, die von den ursprünglich vorhandenen, insbesondere Natrium verschieden sind.

Y> Das Verfahren ist jedoch auch zur Herstellung von gemischten Heparinsalzen geeignet, die die Ionen des genannten Substitutionsmetalls und Ionen eines anderen Metalls in vorher bestimmten Verhältnissen enthalten, wenn man erfindungsgemäß eine dritte Stufe durch-

M) führt, die darin besteht, das nach der genannten zweiten Stufe erhaltene einfache Heparinsalz des Substitutions-,iieialls mit einem Salz des genannten weiteren Metalls in Berührung bringt, wobei man dieses in solcher Menge verwendet, daß sich die gewünschten relativen Verhiili-

(Ii nisse iles genannien Substituiionsmctalls und des gelunntcn davon verschiedenen Metalls in dem als Endprodukt erhaltenen gemischten 1 lcparinsal/. ergeben. Is kann natürlich auch der lall eintreten, daß der

Anteil der Ionen des Substitulionsmctalls, der in dieser Weise im Verlauf der in Betracht gezogenen dritten Phase substituiert werden kann, einerseits unter ähnlichen Bedingungen, wie sie weiter oben hinsichtlich der Behandlung des Natriumsalzes von Heparin mit einem Kalziumsalz, wie Kalziumchlorid, eingeschränkt sein kann. Es versteht sich, daß man in dem Fall, du man die Grenzen des Substitutionsverhältnisses überschreiten will, die mit einer einfachen Behandlung nicht erreicht werden können, auf das oben erwähnte Zweisiufenverfahren zurückgreifen muß.

Man verfügt in dieser Weise über ein sehr geeignetes Verfahren zur Herstellung von gemischten Heparinsalzen mit vorher bestimmten relativen Gehalten von irgendwelchen unterschiedlichen Metallionen, bei dem man als Ausgangsmaterial insbesondere Nairiumheparinat verwendet und über das Zwischenprodukt eines vollständig von Natrium befreiten einfachen Salzes eines der Metalle, das in dem gemischten Salz vorhanden sein soll, das Endprodukt erhält. Zum Beispiel bildet man zur Herstellung eines gemischten Kalzium- und Magnesiumsalzes von Heparin, ausgehend von einem Natriumsalz von Heparin, zunächst das einfache, von Natrium befreite Salz eines dieser Metalle, indem man die beiden ersten Phasen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchführt, wonach man die Metallionen des gebildeten einfachen Heparinsalzes in dem gewünschten Ausmaß substituiert, indem man das letztere in der genannten dritten Stufe mit einer entsprechenden, vorher bestimmten Menge eines Salzes, z. B. eines Chlorids, des anderen Metalls in Berührung bringt, was in den folgenden Beispielen genauer erläutert werden wird.

Zur Bildung der gemischten Salze, die als eine Sorte der Metallionen diejenigen des in der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens als Ausgangsmaterial eingesetzten Heparinsalzes. z. B. Natrium enthalten, dessen Gehalt des anderen Metallion größer ist als der durch einfaches Inberührungbringen der entsprechenden Reagentien erreicht werden kann, z. B. eines gemischten Heparinats mit hohem Kalziumgehalt und geringern Natriurngehait, kann man die Reaktionen der ersten und zweiten Stufe des genannten Verfahrens nicht in der Weise durchführen, daß man ein vollständig von Natrium befreites Kalziumsalz erhält. So kann man insbesondere geringere Mengen der Kalziumsalzc, die entsprechend der gewünschten Endzusammensetzung des gemischten Salzes gesteuert werden, bei dieser ersten und zweiten Stufe verwenden.

Um das gleiche Ziel zu erreichen, kann man natürlich auch zunächst das von Natrium befreite Kalziumsalz herstellen und dann dieses mit einer ausreichenden Menge Natriumchlcrid in Berührung bringen, um einen begrenzten Austausch der Kalziumionen durch die Natriumionen zu bewirken.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestaltet ferner die Herstellung von gemischten, praktisch natriumionenfreien Heparinsalzen, z. B. von Kalzium und Magnesium, ausgehend von einem aus Natriumheparinai bestehenden Ausgangsmaterial.

So kann man aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens gemischte Heparinate herstellen, die vorher bestimmte relative Mengenverhältnisse aufweisen, die besonderen gewünschten Erfordernissen entsprechen, die eine Funktion der Anwendungsform sind, insbesondere im therapeutischen Bereich und die den Bedingungen entsprechen, bei denen derartige Heparinate verabreicht werden.

Im folgenden wird eine allgemeine Ausführungsform der Herstellung eines n;itriumfreien Kalziumsalzes von Heparin beschrieben (wobei es sich versteht, daß man unter äquivalenten Bedingungen natriumfreie Salze anderer Metalle herstellen kann), wobei die verschiedenen Beispiele dazu dienen, die Anpassungsfähigkeit des erfindiingsgemaUen Verfahrens und die verschiedenartigen damit herzustellenden Produkte /ti erläutern.

Allgemeine Verfahrensweise

Im folgenden sei eine allgemeine Ausführiingsform zur Herstellung von Heparinkalzium. das praktisch vollständig frei von Natrium ist, ausgehend von Heparin in Form des Natriumsal/.cs beschrieben.

Man löst das Heparinnatrium in destilliertem Wasser unter Bildung einer Lösung, die 15 000 bis 20 000 U l/ml enthält, d.h. eine Konzentration von 10 bis 12,5% aufweist. Man hält die Temperatur zwischen 10 und 40°C. vorzugsweise bei 25 C. Unter Rühren gibt man zu der Heparinlösung Kalzium in Form von Kalziumchlorid in einer Menge zwischen 10 und 40%, vorzugsweise 12% Kalzium, bezogen auf das Gewicht des eingesetzten Heparins. Man bringt den pH-Wert des Mediums in CaO auf einen Wert von 7.5 und rührt dann während 8 bis 24 Stunden, vorzugsweise während 16 Stunden bei einer Temperatur von 25¹C. Nach Ablauf dieser Zeit führt man während 6 Stunden eine Dialyse durch. Das Dialysat wird aufgefangen und über eine Asbestplatte filtriert.

Das filtrierte Dialysat wird durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert zwischen 4 und 7,5. vorzugsweise 6,5 gebracht. Dann gibt man 1,5 Teile neutralen Ethylalkohol (Konzentration % Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15"C) pro einen Teil des Dialysats zu. Man läßt während 2 bis b Stunden stehen und gewinnt das gebildete Heparinat mit neutralem Alkohol mit einer Konzentration von 99,5 Vol-% Ethylalkohol. gemessen bei 15°C. Dann verreibt und rührt man das Material gleichzeitig. Das nach der Filtration erhaltene gemischte Kalziumheparinat wird in der zur Bildung einer 15 000 bis 20 000 Ul/m! enthaltenden Lösung entsprechenden Wassermenge gelöst. Dann setzt man unter Rühren und bei einer Temperatur von 25⁰C zwischen 3 und 15%, vorzugsweise 10% Kalzium in Form von Kalziumchlorid zu. Man rührt während 8 bis 24 Stunden, vorzugsweise während 12 Stunden, wobei man den pH-Wert durch Zuaabe von Ca(OH): oder 2 η HCI bei 7.3 einstellt.

Nach 12stündigem Rühren verteilt man die Kalziumheparinat-Lösung in Dialyseschläuche und führt die Dialyse bei Raumtemperatur während etwa 6 Stunden gegen pyrogenfreies. entmincralisiertes Wasser durch.

Das erhaltene Dialysal besitzt bei 25°C eine Leitfähigkeit und 10 000 μ S und einen pH-Wert von 7.2. Man

5^r) stellt den pH-Wert durch Zugabe von 2 η Chlorwasserstoffsäurc auf einen Wert von 5.5 ein. gibt 3 %o m-Cresol als Bakteriostatikum zu und filtriert das Dialysat über Asbest. Das Kalziumheparinat wird nach 2stündigem Stehenlassen durch Zugabe von 1.5 Teilen neutra-

bo lern Ethylalkohol, der eine Konzentralion von 96 Vol-% Ethylalkohol. gemessen bei 15" C aufweist, aus der Lösung ausgefällt.

Das Kalziumheparinal wird in 10 Volumen neutralem Elhylalkohol mit einer Konzentration von 99,5 Vol-%

b5 Ethylalkohol, gemessen bei 15" C aufgenommen, verrieben, filtriert und auf einem Büchner-Filter mit neutralem Ethylalkohol (99.5 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15"C) gewaschen. Das in dieser Weise erhaltene, von

Natrium befreite Kalziumheparinat wird anschließend bei 25°C im Vakuum bei 0,13 mbar getrocknet.

In dieser Weise kann man ohne weiteres, ausgehend von einem Codex-Heparin in Form des Nairiumsal/es in der weiter unten angegebenen Zusammensetzung ein Kalziumheparinat herstellen, das eine antikoagulierende Wirkung im Bereich von 160 U l/ml,

einen Kalziumgehalt im Bereich von 10,6% und einen Natriumgehali im Bereich von 0,05% aufweist.

Das in den folgenden Beispielen verwendete Heparin entspricht den folgenden Normen:

Aussehen:	konform	I
5%ige Lösung:	klar
Schwermetalle:	keine
Proteine:	keine
Gesamtsticksioff:	2,2%
Schwefel:	10.7%
Antikoagulierendc Wirkung:	166 Ul/mg
Pyrogcne Substanzen:	pyrogenfrei
	(nach den allge
	meinen Analyse
	verfahrender
	Pharmacopcc
	Francaise
	8. Auflage,
	S. 1615).
Histaminsubstanzen:	keine
Ammoniumgehalt:	<0,1%
Kalzirmgehalt:	<0,1%
Natriumgehalt:	11,5%
Kaliumgehalt:	0,5%
Magnesiumgehalt:	< 0,1 %.
Beispiel i

Kalziumheparinat (Heparinkalzium)

Man löst 100 g Codex-Heparin, das den oben angegebenen Normen entspricht und eine antikoagulicrende Wirkung von 160Ul/mg aufweist, d.h. insgesamt 16 000 000 Ul, in 800 ml destilliertem Wasser. Die Leitfähigkeit beträgt bei 25⁰C 22 000 S, während sich ein pH-Wert von 7 einstellt. Unter Rühren gibt man das Äquivalent von 12 g Kalzium in Form von CaCl₂ · 2 H₂O (MG = 147) d. h. 44 g CaCl₂ ■ 2 H₂O zu. Die Leitfähigkeit beträgt 50 000 S und der pH-Wert 5. Dann setzt man 200 mg CaO zu, um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen und rührt während 16 Stunden, wobei man die Temperatur bei 25"C hält. Nach dem Rühren verteilt man die Lösung in Präzisionsschläuche, die unter der Bezeichnung NOJAX bekannt sind, in Anteilen von jeweils 300 ml/Schlauch und bringt die Schläuche mit 6 Liter entmineralisiertem Wasser in Berührung, dessen Widerstand 1000 kfi/cm beträgt und läßt Wasser während 6 Stunden einwirken. Man erhält 1600 ml eines Dialysats, dessen Leitfähigkeit 20 000 S aufweist und das einen pH-Wert von 7 besitzt

Das Dialysat wird über einen Büchner-Trichter filtriert, der zuvor durch Behandeln mit Eau de Javellc gereinigt, dann mit pyrogenfreicm. entmineralisiertem Wasser gewaschen, ein weiteres Mal mit Wasser, das 3 %(i Phenol enthält, gereinigt und schließlich bis zur Neutralität mil entmineraüsierlcm, pyrogenfreicm Wasser gewaschen wurde. Die nitration erfolgt über eine unter der Bezeichnung EKS 2 bekannte Asbcslschcibc, die zuvor mit einer 5 η HCl-Lösung und dann mit enlmineralisiertcm, pyrogenfreiem Wasser bis zur Neutralität gewaschen wurde.

Die Filtration erfolgt im Verlaufe von 1 Stunde, worauf das Produkt auf der Asbestscheibe mit 250 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen wird. Man vereinigt das Filtrat und die Waschflüssigkeit und erhält 1900 ml einer Flüssigkeit, die man durch Zugabe einiger Tropfen 2 η Chlorwasscrstoffsäure auf einen pH-Wert von 6,5 einstellt, worauf man unter Rühren 2850 ml neutralen Ethylalkohol (Konzentration 96 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15^CC) zugibt. Man läßt während 2 Stunden stehen und nimmt das erhaltene gemischte Kalzium-Natrium-Hcparinai in 1000 ml Ethylalkohol (99,5 Vol-% F.lhylalkohol, gemessen bei 15°C) auf, be-

r> wirkt mit Hilfe eines Ultra-Turax-Rührers ein Verreiben und filtriert unter schwachem Unterdruck bei einem Büchner-Trichter und saugt maximal unter Druck ab. Man nimmt das gemischte Kalzium-Natrium-Heparinat unter Rühren in 800 ml destilliertem Wasser auf. Dann gibt man das Äquivalent von 10 g Kalzium in Form von Kaliumchlorid, d. h. 36.7 g CaCI> ■ 2 H₂O zu, stellt den pH-Wert durch Zugabe von (etwa 100 mg) CaO auf 7,3 und rührt während 16Std. bei Raumtemperatur. Nach dieser Rührzeit dialysiert man die Lösung erneut und während 6 Stunden unter Einhaltung der oben angegebenen Bedingungen. Das Dialysat (15 000 ml) besitzt eine Leitfähigkeit von 10 000 S und einen pH-Wert von 7,2. Man bringt den pH-Wert durch Zugabe von 2 η Chlorwasscrstoffsäure auf einen Wert von 5,5 und gibt dann 4,5 g m-Cresol zu. Man filtriert die Lösung über eine Asbestscheibe (EKS 2), die in der obigen Weise vorbehandelt worden war. Dann versetzt man das mit der Waschflüssigkeit vermischte Filtrat (1700 ml) mit 2550 ml neutralem Ethylalkohol (Konzentration

r, 96 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15⁰C)₁ wobei man von I land rührt. Nach 2stündigem Stehenlassen gewinnt man das Kalziumheparinat in 1000 ml neutralem Ethylalkohol (Konzentration 99.5 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15"C) und zerkleinert es mit einem Ultra-Turax-Rührer in dem Alkohol. Das Kalziumheparinat wird über einen Büchner-Trichter filtriert, abgesaugt, mit 200 ml F.lhylalkohol (99,5 Vol-% Ethylalkohol. gemessen bei 15" C) gewaschen und dann bei einer Temperatur von 45"C im Vakuum (0,13 mbar) getrocknet. Man erhält 102 g Kalziumheparinat mit folgenden Eigenschaften: Antikoagulicrende Wirkung: 155 Ul/mg, d.h. 15 800 00 Ul, was einer Ausbeute von 99% entspricht. Der Kalziumgehalt des wasserfreien Produkts beträgt 10,4% während das wasserfreie Produkt einen Natriumgehalt von 0,05% aufweist.

Beispiel 2 Kalziumheparinat

Man löst 10 000 g Codex-Heparin mit einer Aktivität von 160 Ul/mg, d.h. insgesamt 1 600 000 000 UI. in 80 Ltr. destilliertem Wasser. Die Leitfähigkeit beträgt bei 25"C 22 000 S, während sich ein pH-Wert von 7

bo ergibt. Unter Rühren setzt man das Äquivalent von 12 000 g Kalzium in Form von Kalziumchlorid-dihydrat. d. h. 4400 g CaCb · 2 H>O zu. Die Leitfähigkeit des einen pH-Wert von 2,5 aufweisenden Mediums beträgt 50 000 S. Man bringt den pH-Wert durch Zugabe von

M 20 g Kalziumoxyd auf einen Wert von 7,5 und rührt während 16 Stunden bei 25"C. Nach Beendigung des Rührens verteilt man die Lösung in Nojax-Präzisionsschläuche, wobei man pro Schlauch 300 ml einfüllt. Man

bringt die Schläuche in ein Bad ein, das 600 1 entmincralisiertes, pyrogenfreies Wasser mit einer Leitfähigkeil von lOOOkn/cm enthält und läßt während 6 Stunden einwirken. Das eine Leitfähigkeit von 20 000 S aufweisende Dialysat besitzt ein Volumen von 160 I und zeigt einen pH-Wert von 7.

Das Dialysat wird über einen rostfreien (Inox) Büchner-Trichter filtriert, der durch Behandeln mil Eau dc Javelle gereinigt, mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser gewaschen, erneut mit Wasser, das 3 %o Phenol enthält, gereinigt und schließlich mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser bis zur Neutralität gewaschen wurde. Die Filtration erfolgt unter Verwendung einer Asbestscheibe (EKS 20), die zuvor mit einer 5 η HCI-Lösung behandelt und mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser bis zur Neutralität gewaschen worden war.

Die Filtration erfolgt im Verlaufe von 12 Stunden, worauf man das Produkt auf der Asbeslscheibe mit 25 1 entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser wäscht.

Dann vereinigt man das Filtrat und die Waschflüssigkeit, wobei man 165 I erhält, die man durch Zugabe von 2 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 6 einstellt und unter Rühren mit 277,5 1 neutralem Ethylalkohol (96 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15° C) versetzt. Man läßt während 2 Stunden stehen und gewinnt das erhaltene gemischte Kalzium-Natrium-Heparinat in 100 ml Ethylalkohol (89,5 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15°C) von Hand. Man nimmt das gemischte Kalium-Natrium-Heparinat in 80 I destilliertem Wasser auf und gibt unter Rühren das Äquivalent von 1000 g Kalzium, d. h. 3670 g CaCl₂ · 2 H₂O zu. Man stellt den pH-Wert durch Zugabc von (etwa 1000 mg) Kalziumoxyd auf 7,3 ein und rührt während 16 Stunden bei 25°C Nach Beendigung des Rührvorgangs dialysieri man die Lösung erneut unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben, während 6 Stunden. Das Dialysat (150 1) besitzt eine Leitfähigkeit von 10 000 S und einen pH-Wert von 7,2. Man bringt den pH-Wert durch Zugabe von 2 π Chlorwasserstoffsäurc auf einen Wert von 4.5 und setzt dann 450 g m-Cresol zu. Die Lösung wird über eine in der obigen Weise vorbehandeln Asbeslscheibe (EKS 2) filtriert. Die nach dem Vereinigen des Filtrais mit der Waschflüssigkeit erhaltene Lösung (170 I) wird unter Rühren mit der Hand mit 255 I neutralem Ethylalkohol (Konzentration 96 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15°C) versetzt. Nach zweistündigem Stehenlassen sammelt man das Kalziumheparinat in 1001 neutralem Ethylalkohol (Konzentration 99,5 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15°C) und verreibt es in dem Alkohol unter Verwendung eines Ullra-Turax-Rührers. Dann filtriert man das Kalziumheparinat über einen Büchner-Trichter, saugt es ab, wäscht es mit 200 ml Ethylalkohol (99,5 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15° C) und trocknet es bei 45° C im Vakuum (0,13 mbar). Man erhält 10 300 g Kalziumheparinat mit einer Aktivität von 155UI/mg, d.h. insgesamt 1 600 000 000 Ul. (Ausbeute 100%.)
Kalziumgehalt: 10,4%

Natriumgehalt: 0,04%

Beispiel 3
Herstellung von Magnesiumheparinai

Man löst 100 g Codex-Hcparin, das den obigen Normen entspricht und eine Aktivität von 160 g Ul/mg aufweist, d. h. 16 000 000 Ul in 800 ml destilliertem Wasser und erhalt eine Lösung mil einer Leitfähigkeil bei 25⁰C von 22 000 μ S und einen pH-Wert von 7. Unier Rühren gibt man dann das Äquivalent von 12 g Magnesium, d. h. 100 g MgCb-OH₂O zu. Die Leitfähigkeit beträgt 50 000 μ S, während sich ein pH-Wert von 5 ergibt. Zur Einstellung des pH-Wertes auf 7.5 gibt man 200 mg MgO und rührt wahrend ib Stunden bei 25°C. Nach Beendigung des Rührvotgangs verleih man die Lösung in Nojax-Präzisionssehläuche. wobei man pro Schlauch

ίο 300 ml einführt und bringt die Schläuche mit 6 1 entmineralisiertem Wasser in Berührung, dessen Widerstand 1000 kn/cm aufweist und läßt während 6 Stunden stehen. Man erhält 1600 ml des Dialysats, dessen Leitfähigkeit 20 000 μ S und dessen pH-Wert 7 betragen.

Das Dialysat wird über einen Büchner-Trichter filtriert, der zuvor mit tau de javeiie gereinigt, mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser gewaschen, mit einer Lösung von 3% Phenol in Wasser gereinigi und bis zur Neutralität mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser gewaschen wurde. Die Filtration erfolgt über eine Asbestscheibe (EKS 2), die zuvor mit einer 5 η HCl-Lösung und schließlich bis zur Neutralität mit entmineralisiertem, pyrogenfreiem Wasser gewaschen wurde. Die Filtration erfolgt im Verlaufe von 1 Stunde, wobei man das Produkt auf einer Asbestscheibe mit 200 ml entmineralisiertem Wasser wäscht.

Man vereinigt das Filtrat und die Waschflüssigkeit und erhält 1900 ml einer Flüssigkeit, die man durch Zugabe einiger Tropfen 2 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 6,5 einstellt. Dann gibt man unter Rühren 2850 ml neutralen Ethylalkohol (Konzentration 96 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15°C) zu. Man läßt während 2 Stunden stehen, gewinnt dann das erhaltene gemischte Magncsiuin-Natrium-Heparinat in 1000 ml Ethylalkohol (99,5 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15"C). Dann verreibt man das Produkt leicht mit Hilfe eines Ullra-Turax-Rülirers in dem Alkohol und filtriert unter Anwendung eines schwachen Unterdrucks über einen Büchner-Trichter, worauf man das Produkt maximal unter Druck absaugt.

Man nimmt das gemischte Magnesium-Natrium-Hcparinal in 800 ml destilliertem Wasser auf und gibt unter Rühren das Äquivalent von 20g Magnesium, d.h. 167,5 g Magncsiumchlorid-Hcxahydrat zu, stellt den pH-Wert (mit etwa 200 mg) MgO auf 7,3 und rührt während 16 Stunden bei 25⁰C. Nach Ablauf dieser Rührbehandlung dialysieri man die Lösung erneut während 6 Stunden unter Einhaltung der obigen Bedingungen. Das Dialysai (1500 ml) besitzt eine Leitfähigkeit von 10 000 μ S und einen pH-Wert von 7,2. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von 2 η Chlorwasserstoffsäure auf 5,5 ein und gibt dann 4,5 g m-Cresol zu. Man filtriert die Lösung über eine Asbestscheibe (EKS 2), die in der obigen Weise vorbehandelt worden war.

Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat (1700 ml) wird mit 2550 ml neutralem Ethylalkohol (Konzentration 96 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15°C) versetzt, wobei man mit der Hand rührt. Nach zweistündigem Stehenlassen gewinnt man das Magnesi-

W) umheparinat in 1000 ml neutralem Elhylalkohol (Konzentration 99.5 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15°C) und verreibt es in dem Alkohol mit Hilfe eines Ultra-Turax-Rührcrs. Das Magnesiumheparinat wird über einen Büchner-Trichter filtriert, abgesaugt, mit 200 ml Ethyl-

b^r> alkohol (99.5 Vol-%) gewaschen und dann bei einer Temperatur von 45"C im Vakuum (0,13 mbar) getrocknet.

Man erhall 100 g Magnesiumheparinat mit einer anti-

koagulierenden Aktivität von 158UI/mg, d.h. einer Ausbeute von 98,8%, wobei das Produkt einen Magnesiumgehalt von 5,4% und einen Natriumgehalt von 0,1 %, bezogen auf das wasserfreie Produkt, aufweist.

Beispiel 4

Herstellung eines gemischten

Kalzium-Magnesium-Heparinats,

ausgehend von einem Magnesiumheparinat

Man löst 100 g Magnesiumheparinat mit einer Aktivität von 158 Ul/mg,d. h. insgesamt 15 800 000 Ul, dessen Magnesiumgehalt 1,4% beträgt, bei 25°C in 650 ml destilliertem Wasser. Dann gibt man unter Rühren 22 g Kalziumchloriddihydrat (MG = 147), d.h. das Äquivalent von 6 g Kalzium, zu. Man sicilt den pH-Wert mit einer Spur Kalziumoxyd auf 7,3 ein und rührt während 16 Stunden bei 25°C. Dann führt man während 6 Stunden eine Dialyse der Lösung gegen entmineralisiertes Wasser durch. Man stellt den pH-Wert mit 2 η Chlorwasserstoffsäure auf 5,5 ein und fällt das gemischte KaI-zium-Magnesium-Heparinat durch Zugabe von 1,5 Volumen Ethylalkohol (96 Vol-%) aus. Man läßt während 2 Stunden stehen und nimmt das gemischte Heparinat in Ethylalkohol (99,5 Vol-%) auf, verreibt es in dem Alkohol, filtriert es und trocknet es bei einer Temperatur von 45° C im Vakuum (0,13 mbar).

Man erhält 102 g gemischtes Kalzium-Magncsium-Heparinat mit einer antikoagulierenden Aktivität von 155 UI/mg, d.h. mit einer Ausbeute von 100%.

Gehalt an Ca^{+ +}
Gehaltan Mg⁺ +
Gehalt an Na*

= 5,85%. + - 2,41%. = 0,02%.

Beispiel 5

Herstellung von gemischten

Kalzium-Magnesium-Heparinaten, ausgehend von Magnesiumheparinat

Nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise erhält man ausgehend von dem 5,4% Magnesium enthaltenden Magnesiumheparinat des Beispiels 3 gemischte Kalzium-Magnesium-Hcparinate, die Kalzium, Magnesium und Natrium in den in der folgenden Tabelle 1 angegebenen Mengen enthalten, indem man das einfache Magnesiumheparinat mit den in der linken Spalte der Tabelle angegebenen Mengen Kalzium (das in Form von CaCl: ■ 2 HiO zugeführt wird) in Berührung bringt.

Tabelle 1

Zugefühne Gehalt des gemischten Heparinats an: Ca-Menge % Ca + ⁺ (%) Mg^{+ f} (%) Na *■ (%)

Kal/.iumgchall 10.5% beträgt bei 25°C in 650 ml destilliertem Wasser. Dann gibt man unter Rühren 50 g Magncsiuinchloridhexahydrat (MG = 203,3), d. h. das Äquivalent von 6 g Magnesium zu. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe einer Spur Magnesiumoxid auf 7,3 ein und rührt während 6 Munden. Dann dialysiert man die Lösung während 6 Stunden gegen entmineralisiertes Wasser. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von 2 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 5,5 ein und fällt das gemischte Kalzium-Magnesium-Heparinat durch Zugabe von 1,5 Volumen neutralen Ethylalkohols (Konzentration 96 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15"C) aus. Man läßt während 2 Stunden stehen, nimmt das gemischte Heparinat in neutralem Ethylalkohol (Konzentration 99,5 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15"C), auf, verreibt es in dem Alkohol, filtriert es und trocknet es bei 45⁰C bei einem Vakuum von 0,13 mbar. Man erhält 103 g gemischtes Kalzium-Magnesium-Heparinat mit einer antikoagulierenden Aktivität von 152 UI/mg, was einer Ausbeute von 99,3% entspricht.

Der Gehalt an Ca^{4 +} beträgt 7.6. Der Gehall an Mg⁺ ' beträgt 1,6%. Der Gehalt an Na⁴ ist <0,01ⁿ/o.

Beispiel 7

Herstellung gemischter Kalzium-Magnesium-Hcparinate. ausgehend von Kalziumheparinat mit einem Kalziumgehalt von 10,5%

Nach der in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrensweise erhält man ausgehend von Kalziumheparinat mit einem Kalziumgehalt von 10,5% gemischte Kalzium-Magnesium-Heparinate mit den in der folgenden Tabelle 11 angegebenen Kalzium-, Magnesium- und Natriumgehaltcn. indem man das von Natrium befreite Kalziumheparinat mit wachsenden Magnesiummengen (das in Form von MgCI₂ · 6 H2O zugeführt wird), die in der linken Spalte der Tabelle angegeben sind, in Berührung

40 bringt.

20

25

Tabelle 11

Gehalt des gemischten Heparinats an:

/.ugeführte	Cieh.
Ca -M enge %	Cn '
1	9.15
2	9
3	8,55
4	8.45
5	7,7
6	7,6
12	6.27

2	1.82	4,56	0,05
4	4,00	3,2	0,05
6	5.85	2,41	0.02
8	7,05	1.83	0,02
10	8.18	1.22	0,02
		B c i s ρ i e 16

55

0,81

0.84

!.24

1.54

1.60

2,34

Beispiel 8

0.02 <0.01 <0.01 <0.01 <0,01 <0,01

0.01

Herstellung eines gemischten

Kalzium-Magncsiurn-Heparinais. ausgehend von

Kalziumheparinat mit einem Kalziumgehall von 10,5%

Man löst 100 g Kalziuniheparinai mit einer Aktivität von 158Ul/mg, d.h. insgesamt 15 800 000 U!, dessen

Herstellung eines gemischten Kalzium-Natrium-

Heparinats, ausgehend von einem Kalziumheparinat

mit einem Kalziumgehalt von 10.5%

Man löst bei 25"C 100 g Kalziumheparinat mit einer Aktivität von 158 Ui/mg, d. h. insgesamt 15 800 000 UI, mit einem Kalziumgehalt von 10.5% in 650 ml destilliertem Wasser. Dann setzt man unter Rühren 6 g reines kristallisiertes Natriumchlorid zu, stellt den pH-Wert mit 1 ml 2 η NaOH-Lösung auf 7.3 ein und rührt während 6 Stunden bei 25"C. Dann dialysiert man das Material während 6 Stunden gegen entmincralisiertes Was-

ser, läßt während 6 Stunden stehen, stellt den pH-Wert mit 2 η Chlorwasserstoffsäurc auf 5.5 ein. fällt anschließend das gemischte Kalziuin-Nalrium-Ileparinal durch Zugabe von 1,5 Volumen neutralem !allylalkohol (Konzentration % Vol-% Äthylalkohol, gemessen bei 15"C) aus und läßt während 2 Stunden stehen. Man nimmt das gemischte Heparinat in neutralem Ethylalkohol (Konzentration 99.5 Vol-% Ethylalkohol, gemessen bei 15"C) auf. verreibt es in dem Alkohol, nitriert es und trocknet

es im Vakuum (0,13 mbar) bei 45°C, wobei man 102 g io Arzneimitteln mit großem Wert dar. gemischtes Kalzium-Natrium-Heparinat mit einer Antikoagulieraktivität von 155 Ul/mg, was einer Ausbeute
von 100% entspricht, erhält.

parinsalze durchgeführt wurde, die aus der gleichen IJmfangscharge Heparin bereitet wurden. Die Dosicninjislcclinik entsprach der in »l'harniacopee i-'ranciiise«,8. Auflage. 1965.Seite 5b0 beschriebenen).

Die vollständig von Natrium befreiten Heparinsal/.e, insbesondere die Kalziumsal/c besitzen eine bemerkenswerte antikoagulierende Wirkung, wie aus den folgenden Ergebnissen der pharniakologischen Untersuchungen hervorgeht. Sie stellen somit Wirkstoffe von

Ca⁺+-Gehalt =
Na+-Gehalt =

8%
2.4%

Beispiel 9

15

Herstellung von gemischten Kalzium-Natrium- " Heparinaten, ausgehend von Kalziumhcparinat mit einem Kalziumgehalt von 10.5%

Nach der in Beispiel 7 beschriebenen Verfahrensweise erhält man ausgehend von Kalziumheparinat mit einem Kalziumgehalt von 10,5% durch einfaches Inberührungbringen der Reagentien gemischte Kalzium-Natrium-Heparinate mit entsprechenden Ca⁺*- und Na+-Gehalten bis zu 2,4%. Zur Bereitung der gemisch-

1. Subkutane Injektion an Kaninchen

Man verabreicht drei Kaninchen durch subkutane Injektion 1000 Ul/kg natriumfreies Kalziumheparinat. Jedem Tier werden nach 5 Min, 15 Min, 30 Min. nach der Injektion sowie stündlich während insgesamt 12 Std. Blutproben aus der zentralen Ohrarterie entnommen.

Eine Bestimmung des Heparins und eine Ermittlung der globalen Gerinnbarkeit erlaubt die Feststellung, daß 15 Min. nach der Injektion eine nachweisbare Heparinäinie vorliegt, die die gesamte Gerinnbarkeit des Kaninchens zu beeinflussen in der Lage ist. Diese Heparinämie ist bis zur 8. Stunde wirksam.

2. Intravenöse Injektion an Kaninchen

Man verabreicht an drei, während 24 Stunden nüchtern gehaltenen Kaninchen auf intravenösem Wege (Hauptvene des Ohrs) 300 Ul/kg natriumfreien Kalziumheparinats, d. h. etwa ein Drittel der in der vorherge-

ten Heparinate, deren Natriumgehalt diesen Wert über- 30 henden Untersuchung subkutan verabreichte Heparin-

steigt, ist es bevorzugt, das Inberührungbringen während der Dialyse zu bewirken, insbesondere wenn man Natriumgehalte oberhalb 3% erreichen will.

Tabelle IiI

Zugeführte	Gehalt des gemischten	Nu ' ("/0)
Ca-Menge%	Hcparinntsun:	1
	Ca * ⁴ (%)	1.6
2	9,55	2.4
4	8.55	2.2
b	8	3,2
8	7.68	4
10	7.15
12	6.68

In den beiden rechten Spalten der obigen Tabelle III sind die Kalzium- und Nalriumgehalte der gemischten Heparinate angegeben, die unter diesen Bedingungen durch Inberührungbringen des von Natrium befreiten Kalziumheparinats mit wachsenden Natriummengen erhalten wurden, die in der linken Spalte der obigen Tabelle angegeben sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren führ! nun zu einer Reihe von Vorteilen, die bereits erwähnt wurden. Es sei erneut darauf hingewiesen, daß man mit diesem Verfahren, ausgehend von Natriumsalzen von Heparin einfache Salze anderer Metalle, wie Natrium, gemischte Heparinsalze erhalten kann, die praktisch vollständig und wi Bedingungen erfolgen: sogar vollständig von Natrium befreit sind.

Die praktisch vollständige Entfernung von Natrium a) wird durch eine deutliche Steigerung der antikoagulierenden Aktivität des Heparins begleitet. Es ist festzustellen, daß diese antikoagulierende Wirkung plötzlich ^ um etwa 10% zunimmt, wenn der Kalziumgehalt eines Kalzium-Natrium-Heparinats von 9,5% auf 10% steigt (wobei die Dosierung mit Hilfe der entsprechenden Hcdosis.

Die Blutproben für die biologischen Untersuchungen werden 5 Min, 1 Std., 3 Std, 4 Std. und 5 Std. nach der Injektion entnommen.

Es ist festzustellen, daß bei einer Dosis, die etwa einem Drittel der subkutan verabreichten Dosis, während der nach der Injektion folgenden Minuten und während 1 bis 2 Std. eine erhöhte Hcparinämie hervorgerufen wird, die größer ist als 1.1 Lll/ml. die jedoch nach der 4» 4. Stunde verschwindet.

Das von Natrium befreite Kalziumheparinat ist besonders zur Behandlung aller llyperkoagulabilitais/ustände geeignet, insbesondere denjenigen, die von Kmbolieen, arteriellen-venösen Thrombosen und Myoeard-4^r> infarkten begleitet werden und ganz allgemein zur Behandlung aller Zustände, bei denen eine antikoagulierende Behandlung erforderlich ist und insbesondere zur Behandlung jener Zustände, bei denen hohe Heparinkonzentrationen erwünscht sind, wobei sich in allen die- •m sen Fällen nicht das Risiko lokaler Hämorrhagie stellt.

Die Heparinsalze, insbesondere Kalziumheparinat oder Hcparinkalzium werden vorzugsweise in Form von Lösungen in einer injizierbaren, sterilen Flüssigkeit, die für die ausgewählte Verabreichungsart (Injektion Ti oder Perfusion) geeignet ist, verabreicht. Zum Beispiel stellt glukosehaltigcs Serum ein Vehikel oder Trägermaterial dar, das für die drei oben genannten Verabreichungsarten geeignet ist.

Diese Verabreichungen können unter den folgenden

auf subkutanem Wege

— zur Vorbeugung 500 Ul. zweimal während 24 Std. und dies während 7 bis 10 Tagen,

— zur Heilung in Abhängigkeit von dem Zustand des Patienten. 13 500 bis 20000 Ul. zweimal pro 24 Std. ebenso lang wie es der thrombolylische Zustand des Patienten erfordert;

17 18

b) auf intravenösem Wege

von 20 bis 40 000 UI, die harmonisch auf 44 Stunden verteilt sind, vorzugsweise durch gesteuerte Perfusion;

c) auf intramuskulärem Wege 5 bis 10 000 UI, dreimal pro Woche.

10

15

2¹)

J5

40

A^r>

5^r>

W)

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von einfachen Hcparinsalzen, die von Natrium verschiedene Metallkationen enthalten, oder von gemischten Hcparinsalzen, bei dem man in einer ersten Stufe eine Lösung eines derartigen einfachen Ausgangsheparinsalzes mit einem Überschuß eines Salzes desjenigen Metalls in Berührung bringt, mit dem man das in dem Ausgangsheparinsalz enthaltene Metall ersetzen will, so daß man ein gemischtes Hcparinsalz erhält, bei dem ein Teil des in dem Ausgangsheparinsalz enthaltenen Metalls durch das andere Metall ersetzt ist, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Erreichen des Gleichgewichts das erhaltene gemischte Heparinsalz in einer zweiten Stufe von den in dem Medium enthaltenen freien, nicht an das Heparinsalz gebundenen Metallionen abtrennt und das gemischte Heparinsalz in Lösung erneut mit dem Salz des anderen Metalls in Berührung bringt und gegebenenfalls den Behandlungszyklus der zweiten Stufe wiederholt, bis das erhaltene Heparinsalz praktisch nur noch das Substitionsmctall enthält.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine dritte Stufe durchführt, die darin besteht, das nach der Durchführung der /weiten Stufe erhaltene einfache Heparinat des Substitutionsmetalls mit einem Salz eines anderen Metalls in Berührung zu bringen, um dadurch ein gemischtes Heparinat aus dem Substitutionsmetall und dem weiteren Metall herzustellen.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Abtrennung durch eine Dialyse des nach der Durchführung der ersten Stufe erhaltenen Mediums gegen entmineralisiertes Wasser erfolgt.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Abtrennung durch Ausfällen des Heparinats in einem Medium erfolgt, in dem die aus den freigesetzten Metallionen gebildeten Salze löslich sind, worauf das gefällte Heparinat erneut in Wasser gelöst wird, bevor man es in der genannten zweiten Stufe erneut mit dem das Substitutionsmetall enthaltenden Salz in Berührung bringt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die selektive Ausfällung in einem wäßrig-alkoholischen Medium erfolgt, das vorzugsweise eine Konzentration von nicht mehr als 70 Vol-% (15°C) Ethylalkohol aufweist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dialyse durch eine selektive Ausfällung und eine erneute Auflösung des ausgefällten Heparinats in einem wäßrigen Medium nach dem Verfahren der Ansprüche 4 oder 5 vervollständigt wird.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche I bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als einfaches Ausgangshcparinsal/ Nalriumhcparinat (Mcparin-Natrium) verwendet.

8. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 hergestelltes einfaches Heparinsal/ ;ils Wirkstoff neben üblichen pharmazeutischen Bindemitteln oder Trägermaierialien enthält.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einfachen oder gemischten Heparinsalzen gemäß Oberbegriff des Hauptanspruchs sowie ein das in dieser Weise gebildete Heparinsalz als Wirkstoff enthaltendes Arzneimittel, welches insbesondere als Antikoagulans geeignet ist, da es sämtliche bekannten therapeutischen Eigenschaften von Heparin entfaltet und praktisch frei ist von Sekundäreffekten wie Hautblutungen und Hämalomen, die bis zum heutigen Tag die Verwendung to von Heparin für bestimmte therapeutische Zwecke eingeschränkt haben.

Es ist bekannt, daß die im Handel erhältlichen oder gereinigen Heparine häufig in Form ihrer Natriumsalze zur Verfügung stehen, die im allgemeinen bei der Geis winnung und Reinigung dieses Materials gebildet werden, insbesondere bei der Extraktion aus natürlichen biologischen Medien.

Es ist andererseits bekannt, daß die Verwendung dieser Salze, deren antikoagulierende Wirkung wohlbekannt ist. in der Therapie nicht frei von Nachteilen ist. Da das Heparin für Kalzium eine stärkere Affinität besitzt als für Natrium, wird die Verabreichung von Heparinnatrium oder Natriumhcparinat von einer Bindung von Kalzium begleitet, das aus verschiedenen Geweben des Organismus und insbesondere im lokalen Bereich der Gefäß- und Kapillarwandungen entnommen wird.

Im Fall der subkutanen Verabreichung einer Lösung mit erhöhter Konzentration erfolgt die Chelatbildung des Kalziums überwiegend auf Kosten der kleinen bejo nachbarlcn Kapillaren, deren Permeabilität dadurch vermindert wird, was Hautblutungen und Hämatome zur Folge hat.

Zur Überwindung dieser Schwierigkeiten wurde bereits vorgeschlagen, die Natriumkationen dieser Heparinsalze teilweise zu ersetzen und zwar insbesondere durch Kalzium. Die hierdurch erhaltenen Salze, die bereits einen merklichen Gehalt an Kalziumionen aufweisen, haben sich als für die Therapie viel leichter verwendbar erwiesen. Sie enthalten jedoch merkliche Mengen Natrium, die sich in der Größenordnung von etwa 5 bis 4 Gcw.-% erstrecken. Es wurde ferner festgestellt, daß diese, zwar an Kalzium angereicherten, gemischten Salze dennoch in der Lage sind, gewisse der bereits angesprochenen Sekundärelfekte herbeizuführen, insbesondere bei der Behandlung von akuter, übermäßiger Gerinnbarkeit (Hyperkoagulabilität), wozu lokale, z. B. subkutane Injektionen von Dosierungen mit hoher Heparinkon/.entration erforderlich sind, um eine schnelle und kräftige antikoagulierende Wirkung herbeizuführen.

Die bislang zur Substitution des Natriums durch Kalzium verwendeten Verfahren bestehen im allgemeinen darin, entweder die Natriumsalzc von Heparin direkt mit einem Kalziiimsalz, z. B. Kalziumchlorid, in Berüh^r>5 rung zu bringen, oder das Heparin in freier Form zu isolieren, insbesondere auf einem sauren oder schwachsauren lonenaustauscherharz.

Das direkte Kontaktverfahren gestattet jedoch nur einen beschränkten Ersatz der Natriumionen des eingeho setzten Salzes durch Kalziumionen. Gewiß ist bei einer gegebenen Heparinkon/.entration festzustellen, daß die Zugabe wachsender Kalziumchloridmengen in einer ersten Stufe zu einer quantitativen Bindung der zugegebenen Kiil/.iumioncn an das Heparin führt. Zum Beispiel b^r> erhält man. wenn man zu 100 g Heparin-Natrium 6,5 g Kalzium in Form Kalziumchlorid, insbesondere unter Einhaltung der in den Beispielen angegebenen Bedingungen, zugibt, sehr leicht ein gemischtes Heparinsal/.