DE2616761A1

DE2616761A1 - Verfahren zur gewinnung von urokinase aus einer urokinase enthaltenden loesung

Info

Publication number: DE2616761A1
Application number: DE19762616761
Authority: DE
Inventors: Sumiyama Hiroshi; Masaharu Urakawa
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co ltd
Priority date: 1975-04-18
Filing date: 1976-04-15
Publication date: 1976-10-28
Also published as: DE2616761B2; FR2307818A1; US4025390A; JPS51123885A; FR2307818B1; DE2616761C3; JPS5315155B2; GB1492922A

Description

DR. ING. E. HOFFMANN · DIPL. ING. W. EITLE · DR. HER. NAT. K. HOFFMANN

PATENTANWALT»

D-8000 MÖNCHEN 81 · ARABEUASTRASSE 4 · TELEFON (OBlI] 911087

Case FP-1051 27 969 Wt/My

HITACHI CHEMICAL COMPANY, LTD. Tokyo/ Japan

Verfahren zur Gewinnung von Urokinase aus einer Urokinase

enthaltenden Lösung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Urokinase, bei dem die Lösung, die Urokinase enthält, in Kontakt mit mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Cyanoalkyl-polysaccharid, Cyanoalkyl-modifiziertes-polysaccharid und Cyanoalkyl-polyvinylalkohol zur Adsorption der Urokinase gebracht wird und dann die Urokinase von dem Mittel, worin sie adsorbiert ist, eluiert wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Urokinase aus Urokinase enthaltenden Lösungen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung von Urokinase hoher Reinheit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Urokinase enthaltende Lösung in Kontakt mit mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Cyanoalkyl-polysaccharid, Cyanoalkyl-modifiziertes-polysaccharid und Cyanoalkylpolyvinylalkohol bringt, woran die Urokinase adsorbiert wird, und dann die Urokinase aus dem Material, an dem sie adsorbiert ist, eluiert. Die oben beschriebenen Verbindungen sind neue Adsorptionsmittel für die Gewinnung von Urokinase.

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Urokinase ist ein Plasminogen-Aktivator, der in Spurenmengen im menschlichen Urin vorkommt. Sie ist ein potentes Auflösemittel für Blutpfropfen bzw. Blutgerinnsel, und hochgereinigte Urokinase wurde klinisch für die Behandlung von thromboembolischen Störungen bzw. Zuständen verwendet.

Zur Gewinnung von Urokinase aus einer Urokinase enthaltenden Lösung wie Urin werden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, wie die Ultrafiltration, das Präzipitationsverfahren mit einer Schwermetallverbindung (US-PS 2 961 382), das Adsorptionsverfahren mit Silikagel, mit Ionenaustauschern (US-PS 2 983 647) usw. Diese Verfahren ergeben jedoch keine Urokinase hoher Reinheit in hohen Ausbeuten.

Die Anmelderin hat überraschenderweise gefunden, daß Urokinase selektiv durch -Cyanoalkyl-polysaccharid, Cyanoalkyl-modifiziertes-polysaccharid (die beide im folgenden als CAS abgekürzt werden) oder Cyanoalkyl-polyvinylalkohol (der im folgenden als CAP abgekürzt wird) adsorbiert werden kann.

Erfindungsgemäß wird eine Lösung, die Urokinase enthält, in Kontakt mit CAS oder CAP gebracht, damit die Urokinase adsorbiert wird, und dann wird die adsorbierte Urokinase von dem Adsorptionsmittel eluiert.

In der vorliegenden Erfindung ist eine Urokinase enthaltende Lösung beispielsweise Urin oder eine teilweise gereinigte, unreine Lösung aus Urokinase, wie eine Lösung, die man bei bekannten Reinigungsverfahren, wie oben beschrieben, erhält.

Die Adsorptionsmittel, die erfindungsgemäß für die Gewinnung der Urokinase verwendet werden, sind Cyanoalkylpolysaccharide wie Cyanoalkyl-cellulose, Cyanoalkyl-dextran

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usw., Cyanoalkyl-modifizierte-polysaccharide wie Cyanoalkyldextran, vernetzt mit Epichlorhydrin usw., z.B. Sephadex (Warenzeichen der Aktiebolaget Pharmacia), und Cyanoalkylpolyvinylalkohol. Cyanoalkyl-poIysaccharid oder modifiziertes Polysaccharid oder Cyanoalkyl-polyvinylalkohol leitet sich von Polysaccharid, modifiziertem Polysaccharid bzw. Polyvinylalkohol ab und können in an sich bekannter Weise, z.B. durch Cyanoäthylierung dieser Verbindungen mit Acrylnitril oder Methacrylnitril in Anwesenheit eines Alkalis als Katalysator, hergestellt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten CAS und CAP sind beide wasserunlöslich. Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet eine Cyanoalkylgruppe,eine Cyano-niedrig-alkylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen einschließlich dem Kohlenstoffatom der Cyanogruppe. Beispiele solcher Gruppen sind eine Cyanomethylgruppe (-CH₂CN), eine Cyanoäthy!gruppe (-

eine 2-Cyanopropylgruppe (-CH₂-CH \_CN ) usw.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Urokinase enthaltende Lösung in Kontakt mit CAS oder CAP gebracht, so daß Urokinase selektiv adsorbiert wird. Zu diesem Zeitpunkt wird der pH-Wert der Lösung auf 4,5 bis 7,5, bevorzugt 5,0 bis 6,5, eingestellt. Zur besseren Gewinnung der Urokinase aus Urin ist es bevorzugt,den Urin vorzubehandeln, indem man den pH-Wert auf 7,5 bis 9,5 einstellt und den entstehenden Niederschlag vor der Behandlung des Urins mit CAS oder CAP entfernt.

Zur Eluierung der an dem Adsorptionsmittel adsorbierten Urokinase wird eine wäßrige Lösung eines Alkalis oder einer basischen Verbindung verwendet. Beispiele von Alkalioder basischen Verbindungen sind Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniak. Bevorzugt wird das Adsorptionsmittel einem Elutionsverfahren

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unterworfen, wobei das Elutionsmittel eine wäßrige Lösung mit solchem pH-Wert ist, daß das entstehende Eluat einen pH-Wert zwischen 9 und 11,5 besitzt. Da eine wäßrige Lösung aus Ammoniak Urokinase stabilisiert, ist sie als Eluierungsmittel geeignet. Es ist bevorzugt, sie in einer Konzentration von etwa 4 Gew.% zu verwenden. Nach bekannten Verfahren wird das Eluat neutralisiert, mit Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumchlorid usw. ausgesalzt (oder der isoelektrischen Präzipitation unterworfen), damit Urokinase ausfällt, dialysiert und gefriergetrocknet, wobei man Urokinase in fester Form erhält.

Wie oben beschrieben und wie im folgenden näher erläutert wird, wird erfindungsgemäß ein neues Verfahren geschaffen, mit dem Urokinase in hoher Ausbeute und Reinheit mit einer geringen Menge eines neuen Adsorptionsmittels,

CAS oder CAP, erhalten wird. Die erfindungsgemäßen Adsorptionsmittel können wiederholt verwendet werden, und sie sind somit wirtschaftlich. Die vorliegende Erfindung kann zur Gewinnung von Urokinase nicht nur aus Urin selbst, sondern ebenfalls aus irgendeiner anderen Urokinase enthaltenden Lösung verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Zu 100 1 frischem menschlichem Urin, erhalten von normalen Personen, gibt man eine 40%ige Lösung aus Natriumhydroxid zur Einstellung des pH-Wertes des Urins auf 8,5. Der entstehende Niederschlag wird entfernt und der pH-Wert der überstehenden Lösung wird mit 6n Chlorwasserstoffsäure auf 6,0 eingestellt. Zu der Lösung gibt man 200 g Cyanoäthyl-cellulose. Diese wird erhalten, indem man cyanoäthyliertes Papier in Wasser eintaucht (erhältlich von TOMOEGAWA Paper Manuf.Co., Ltd.), dieses in einer Mischvor-

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richtung vermischt, bis es zu Pulpe zerkleinert wird, ausreichend mit Wasser wäscht und entwässert. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt, und dann wird die Cyanoäthyl-cellulose durch Zentrifugieren abgetrennt. Die so erhaltene Cyanoäthylcellulose wird dann in 3 1 einer 4%igen wäßrigen Ammoniaklösung zur Elution der adsorbierten Urokinase gegeben. Das Eluat wird mit 6n Schwefelsäure neutralisiert und Ammoniumsulfat wird bis zur 60#igen Sättigung" zugegeben. Nach dem Stehen über Nacht bei 4⁰C wird der Niederschlag gesammelt, in destilliertem Wasser gelöst und gegenüber Wasser bei 4°C über Nacht dialysiert. Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 1 χ 10 I.E. Urokinase/l Ausgangsurin insgesamt; dies entspricht einer 90%igen Ausbeute, bezogen auf die Menge an Urokinase in dem Ausgangsurin, berechnet entsprechend dem in der Literatur angegebenen Urokinase-Gehalt, dessen spezifische Aktivität 3000 I.E./mg beträgt. (I.E. ist die Abkürzung für Internationale Einheit.)

Beispiel 2

Der pH-Wert von 100 1 frischem menschlichem Urin, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, wird mit einer 40%igen Lösung aus Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt. Der entstehende Niederschlag wird entfernt, und der pH-Wert der restlichen Lösung wird mit 6n Chlorwasserstoff säure auf 6,0 eingestellt. Anschließend gibt man dazu 200 g Cyanoäthylpolyvinylalkohol, der durch Cyanoäthylierung von Polyvinylalkohol mit Acrylnitril in Anwesenheit von Natriumhydroxid als Katalysator erhalten wird. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt. Der Cyanoäthyl-polyvinylalkohol, der Urokinase adsorbiert, wird gesammelt und in 3 1 einer 4%igen wäßrigen Ammoniaklösung zur Elution der adsorbierten Urokinase gegeben. Das Eluat wird mit 6n Schwefelsäure neutralisiert, und Ammoniumsulfat wird bis zur 60%igen Sättigung zugegeben.Nach dem Stehenlassen über Nacht bei 4°C wird der Niederschlag gesammelt, in 50 ecm destilliertem Wasser gelöst und gegen-

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über Wasser bei 4⁰C über Nacht dialysiert. Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 9,4 χ 10^ I.E. Urokinase/l Ausgangsurin; dies entspricht einer 85%igen Ausbeute; die spezifische Aktivität beträgt 3500 I.E./mg.

Vergleichsbeispiel 1

Der pH-Wert von 2 1 menschlichem Urin, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, wird mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt. Nach Entfernung des entstehenden Niederschlags wird der pH-Wert der restlichen Lösung auf 6,0 eingestellt. Die Lösung wird dann mit 20 ml Silikagel zur Gewinnung der Urokinase behandelt. Das Silikagel wird ausreichend mit Wasser gewaschen, und dann wird die adsorbierte Urokinase eluiert und gewonnen. Die gewonnene Menge an Urokinase beträgt 8,9 x 10¹^ I.E./l Ausgangsurin; dies entspricht einer 80%igen Ausbeute. Die spezifische Aktivität beträgt 1200 I.E./mg.

Vergleichsbeispiel 2

Zu 2 1 menschlichem Urin, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, gibt man 100 ml 50&Lge wäßrige Zinkchloridlösung, und dann wird der entstehende Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt. Zu dem Niederschlag gibt man 200 ml einer 10bigen wäßrigen Lösung aus Natriumphosphat (monobasisch), und das Gemisch wird dann gerührt; man erhält einen Niederschlag aus Zinkphosphat. Das Zinkphosphat wird abfiltriert und das Filtrat wird konzentriert und gefriergetrocknet; man erhält Urokinase in fester Form. Die Menge an gewonnener Urokinase beträgt 1,06 χ 10 I.E./l Ausgangsurin; dies entspricht einer 95%igen Ausbeute. Die spezifische Aktivität beträgt 3,5 I.E./mg.

Aus den obigen Ergebnissen ist erkennbar, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Urokinase

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eine extrem hohe spezifische Aktivität besitzt, verglichen mit der, die man bei den bekannten Verfahren erhält. Die Gewinnung an Urokinase ist ebenfalls sehr hoch.

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Claims

- 8 Patentansprüche

(1 * Verfahren zur Gewinnung von Urokinase, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Urokinase enthaltende Lösung in Kontakt mit mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Cyanoalkyl-polysaccharid, Cyanoalkyl-modifiziertes-polysaccharid und Cyanoalkyl-polyvinylalkohol zur Adsorption der Urokinase bringt und dann die Urokinase aus dem Adsorptionsmittel eluiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Cyanoalkyl-polysaccharid und Cyanoalkyl-modifiziertes-ροIysaccharid Cyanoalkyl-cellulose, Cyanoalkyl-dextran und Cyanoalkyl-dextran, vernetzt mit Epichlorhydrin, verwendet werden,
3· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Cyanoalkylgruppe eine Cyano-niedrig-alkylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen einschließlich des Kohlenstoffatoms der Cyanogruppe ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Cyano-niedrig-alkylgruppe eine Cyanoäthylgruppe ist.
5 · Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption bei einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 7>5 durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert 5,0 bis 6,5 beträgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeich net, daß der Elutionsvorgang unter Verwendung

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einer wäßrigen Alkalilösung als Elutionsmittel mit einem solchen pH-Wert, daß das entstehende Eluat einen pH-Wert von 9 Ms 11,5 besitzt, durchgeführt wird·
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man als Alkalilösung eine ungefähr 4 gew.%ige wäßrige Ammoniaklösung verwendet.

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