DE1617930C - Verfahren zur Reinigung roher Präparate des Proteasen-Inhibitors aus Rinderlunge - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung Fällungsmittel aus der Lösung quantitativ zu ent-■oher Lösungen des aus Rinderlunge gewonnenen fernen ist, was mit einem erheblichen Aufwand ver-

^:3roteasen-Inhibitors. bunden ist.

Der Proteasen-Inhibitor aus Rinderlunge wird in Insbesondere bedeutet ein Arbeiten mit Anionen-

ier Humanmedizin zur Therapie von Pankreatitiden 5 austauschern eine starke Belastung, da diese nach dem

iowie als Antifibrinolytikum angewandt. Die Appli- Aufladen durch Lauge mit großen Mengen bidestillier-

■cation erfolgt parenteral. Auch in der klinischen ten Wassers gewaschen werden müssen. Darüber hin-

Oiagnostik und der biochemischen Forschung findet aus sind für den Austauschprozeß verhältnismäßig

ier Inhibitor Verwendung. große Mengen des Austauschers notwendig.

Es ist bekannt, daß besonders Rinderorgane wie io Die Membrandialyse und noch mehr die Filtration

.'.. B. Parotis, Pankreas und Lunge einen Proteasen- über vernetzte Dextrangele sind für eine großtechnische

inhibitor enthalten. Bei diesem Wirkstoff handelt Produktion ungeeignet. Die mit der Durchführung

;s sich um ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht dieser Methoden verbundenen längeren Behandlungs-

von etwa 11600. Der Wirkstoff inhibiert unter zeiten bieten günstige Entwicklungsbedingungen für

anderem Trypsin, Chymotrypsin und das blutdruck- 15 Mikroorganismen, wodurch eine Bildung von Pyro-

,enkende Kreislaufenzym. genen möglich wird. Dadurch wird eine Verwendung

Die deutsche Auslegeschrift 1084 433 beinhaltet der Inhibitorlösung in der Therapie unmöglich gemacht.

;in Verfahren zur Herstellung reiner Lösungen des Mit der Erfindung war beabsichtigt, eine Beseiti-

Inhibitors, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß gung der beschriebenen Mängel herbeizuführen. Es

Jas darin enthaltene Ballasteiweiß mit Sulfosalicyl- so bestand die Aufgabe, nach Adsorbentien zu suchen,

säure ausgefällt und die überschüssige Sulfosalicyl- die die Fähigkeit besitzen, die in der rohen Inhibitor-

iäure durch Behandlung mit Anionen- und Kationen- lösung vorhandenen Begleitproteine und Farbstoffe zu

lustauschern entfernt wird. binden und auf diese Weise eine Reinigung zu bewir-

Es ist weiter aus der deutschen Auslegeschrift ken. Dabei war streng darauf zu achten, daß Wirk-

1. 155 563 ein Verfahren bekannt, das bei Zugabe »5 Stoffverluste durch Adsorption oder Einschluß mini-

von Metaphosphorsäure zur Wirkstofflösung den mal blieben.

Inhibitor ausfällt. Der abgetrennte Niederschlag wird Das zu suchende Verfahren sollte auch großtech-

•Jurch Lösung in Lauge oder Salzlösung zerlegt und nisch leicht durchführbar sein und nur wenige Arbeits-

die Lösung mittels bekannter Methoden, z. B. Be- stufen enthalten.

Handlung mit Ionenaustauschern oder Membran- 30 Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß es möglich

dialyse von Salzen befreit. ist, ein klinisch hochverträgliches, reines Präparat des

Nach der deutschen Auslegeschrift 1 193 200 wird Proteasen-Inhibitors aus Rinderlunge zu erhalten,

der Inhibitor aus seinen Lösungen mit wasserlöslichen wenn in folgender Weise vorgegangen wird:

Salzen der Metaphosphorsäure unter Vermeidung Eine ungereinigte, aus Rinderlunge gewonnene, den

eines Überschusses ausgefällt und der abgetrennte 35 Inhibitor enthaltende wäßrige Lösung mit einer Akti-

Niederschlag durch Auflösen in Ammoniak, Laugen vität von 800 bis 1300 Anti-Trypsin-Einheiten (ATrE)

oder Salzlösung zerlegt. Die resultierende Lösung pro Millimeter und einem pH-Wert von 8,5 bis 9,5

wird nach bekannten Methoden, wie z.B. Behänd- wird mit 3 bis 10%, vorzugsweise 5%, an reinem

lung mit Ionenaustauschern oder Membrandialyse Magnesiumoxyd (MgO) versetzt und 1 bis 16 Stunden,

von Salzen befreit. 40 vorzugsweise 3 Stunden, mechanisch bei Temperaturen

Bekannt ist weiterhin ein Verfahren, wonach man zwischen 10 und 50⁰C, vorzugsweise bei 25°C gerührt,

den Inhibitor aus seinen Lösungen mit Polyphosphor- Das mit Proteinen und Farbstoffen beladene Ma-

säuren oder deren wasserlöslichen Salzen ausfällt gnesiumoxyd wird darauf durch Filtration über eine

und den Niederschlag durch Lösen in Lauge oder Nutsche abgetrennt. Die anfänglich gelblich-bis bräun-

Salzlösungen zerlegt (deutsche Auslegeschrift 1181371). 45 lichgefärbte Inhibitorlösung wird dabei fast farblos.

Die bekannten Verfahren zur Reinigung roher, Die Adsorption von Proteinen dokumentiert sich in

proteinhaltiger Inhibitorlösungen bedienen sich einer- einem Absinken der relativen Extinktionswerte von

seits zur Entfernung dieser störenden Begleitproteine Ausgangslösung und der Lösung nach Magnesium-

der Ausfällung mit Eiw.eißfällungsmitteln wie Sulfo- oxydbehandlung im Ultraviolettgebiet bei 280 μηι.

salicylsäure, Trichloressigsäure und Perchlorsäure. 50 Die Entfernung von Pigmenten kann zusätzlich durch

Dabei muß anschließend das überschüssige Fäl- Messung der Extinktion bei 555 nm verfolgt werden,

lungsmittel quantitativ entfernt werden, falls das Wenn auch das Magnesiumoxyd als Adsorptionsmittel

gewonnene Präparat therapeutische VeΓwendμng fin- bekannt ist, so muß doch seine selektive Adsorptions-

den soll. Dies kann durch Umsetzung mit Anionen- wirkung für Proteine, nicht aber für relativ nieder-

und Kationenaustauschern oder mittels Dialyse durch 55 molekulare Polypeptide wie z. B. den Proteaseninhibi-

semipermeable Membranen bzw. durch Filtration tor als außerordentlich überraschender Effekt bezeich-

über vernetzte Dextrangele geschehen. net werden. Die Oxyde anderer zur Gruppe der Erd-

Andererseits bedienen sich bekannte Verfahren alkalien gehörender Metalle, des Kalziums und des des Prinzips der Ausfällung des Inhibitors aus der Bariums sind nicht wie das Magnesium für die Reini-Lösung, z. B. durch Zusatz von Metaphosphorsäure, 60 gungsprozedur des Proteaseninhibitors geeignet, wenn-Gerbsäure oder Ammoniumsulfat. Auch hierbei gleich sie im Prinzip den gleichen Effekt aufweisen, besteht die Notwendigkeit der vollständigen Abtren- Auch viele andere Adsorbentien, die untersucht wurnung der Fällungsmittel durch Gelfiltration, Dialyse den, bewirkten entweder eine zu hohe Adsorption des oder Behandlung mit Ionenaustauschern. Wirkstoffes oder eine zu geringe Bindung der Ballast-Alle angeführten Veifahren erscheinen in irgend- 65 stoffe.

einer Weise mangelhaft. Sowohl die Verfahren zur Am Magnesiumoxyd werden außer den Ballast-Ausfällung von Ballaststoffen als auch diejenigen zur stoffen nur etwa 10% des eingesetzten Wirkstoffes Fällung des Wirkstoffes haben zur Folge, daß das adsorptiv festgehalten. Nach dem Abtrennen des be-

ladenen MgO über eine Nutsche enthält die Wirkstofflösung noch Spuren von Mg-Ionen, die zwar physiologisch unbedenklich sind, jedoch gegebenenfalls durch Behandlung mit einem Kationenaustauscher vom Typ eines Polymerisationsharzes auf der Basis von Polystyrol mit Divinylbenzol als Vernetzer im Rührverfahren leicht entfernt werden können.

Nach dem Abtrennen des beladenen Austauschers über eine Nutsche wird das erhaltene Filtrat mit dem doppelten bis 6fachen, vorzugsweise 4fachen Volumen an niederen aliphatischen Alkoholen, vorzugsweise Äthanol, oder mit Aceton versetzt. . Dabei ist das Fällungsmittel zweckmäßig auf —5°C vorher abzukühlen und die Mischung zur Vervollständigung der Ausfällung des Wirkstoffes über Nacht in der Kälte aufzubewahren. Es entsteht ein feiner, reinweißer Niedeischlag, der zweckmäßig durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Der Niederschlag wird entweder durch Waschen mit Äthanol bzw. Aceton zu einem Trockenpulver verarbeitet oder in pyrogenfreiem ao Wasser bzw. physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen, wobei er sich ohne Rückstand löst.

Diese Inhibitorlösung mit einem pH-Wert von 2,5 bis 3,5 besitzt eine Aktivität von etwa 2500 ATrE/ml. Die Ausbeute liegt zwischen 80 und 95%. bezogen 2$ auf eingesetztes Material.

Der Reinheitsgrad steigt von 80 bis 140 ATrE/mg in der Ausgangslösung auf 600 bis 1000 ATrE/mg im Endprodukt. Die Inhibitorlösung wird in bekannter Weise sterilfiltriert und kann ohne weiteres therapeutisch verwendet werden.

In der erfindungsgemäß hergestellten Inhibitorlösung lassen sich weder Proteine mittels Sulfosalicylsäure noch Magnesiumionen mit der empfindlichen Titangelb-Reaktion nachweisen.

Die Aktivität des Proteaseninhibitors aus Rinderlunge wird in Anti-Trypsin-Einheiten (ATrE) angegeben. Die Bestimmung erfolgt nach einer von Markw a r d t und Walsmann beschriebenen Methode (F. Markward t, P. Walsmann: Zur quantitativen Bestimmung von Proteaseninhibitoren. Die Pharmazie; 19 [1964], S. 453).

Beispiel

650 ml einer aus Rinderlunge hergestellten Inhibitorlösung mit einer Aktivität von 918 ATrE/ml werden bei einem pH von etwa 8,5 mit 32,5 g Magnesiumoxyd versetzt und 3 Stunden bei 25° C mechanisch gerührt. Nach anschließendem Abtrennen auf einer Nutsche erhält man 580 ml Inhibitorlösung mit 774 ATrE/ml und einem pH von 10,0, wobei die relative Extinktion bei 280 nm von 0,190 auf 0,089 absinkt. Das fast farblose Filtrat wird mit 60 ml Kationenaustauscher Wofatit KPS (Warenzeichen) im Rührverfahrem behandelt, auf der Nutsche abgesaugt und anschließend mit dem 4fachen Volumen konzentrierten Äthanols von — 5°C versetzt. Zum Vervollständigen der entstandenen Fällung wird die Mischung über Nacht in der Kälte aufbewahrt.

Der feine weiße Niederschlag wird abzentrifugiert und in 225 ml pyrogenfreier, physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. ,

Das so erhaltene Inhibitorkonzentrat mit einer relativen UV-Extinktion von 0,056 hat eine Aktivität von 2502 ATrE/ml. Der Reinheitsgrad ist gegenüber der Ausgangslösung von 124,2 ATrE/mg auf 695 ATrE/ mg angestiegen, die Ausbeute beträgt 94,2%.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Reinigung roher Präparate des Proteaseninhibitors aus Rinderlunge, dadurch gekennzeichnet, daß man eine den Inhibitor enthaltende wäßrige Lösung mit einem Reinheitsgrad von 80 bis 140 ATrE/mg 1 bis 16 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden, mit 3 bis 10%, vorzugsweise 5% des Volumens an Magnesiumoxyd bei 10 bis 50°C, vorzugsweise 25°C rührt, vom mit Ballaststoffen beladenen Magnesiumoxyd abtrennt und gegebenenfalls anschließend in bekannter Weise Kationen mit einem Kationenaustauscher entfernt, den Wirkstoff aus dem erhaltenen Filtrat durch Versetzen mit dem 2- bis 6fachen Volumen, vorzugsweise dem 4fachen Volumen, an niederen aliphatischen Alkoholen, vorzugsweise Äthanol, oder Aceton in bekannter Weise ausfällt, abtrennt und in pyrogenfreiem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung aufnimmt.