DE1617930B - Verfahren zur Reinigung roher Pra parate des Proteasen Inhibitors aus Rin derlunge - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung roher Lösungen des aus Rinderlunge gewonnenen Proteasen-Inhibitors.

Der Proteasen-Inhibitor aus Rinderlunge wird in der Humanmedizin zur Therapie von Pankreatitiden sowie als Antifibrinolytikum angewandt. Die Applikation erfolgt parenteral. Auch in der klinischen Diagnostik und der biochemischen Forschung findet der Inhibitor Verwendung.

Es ist bekannt, daß besonders Rinderorgane wie z. B. Parotis, Pankreas und Lunge einen Proteasen-Inhibitor enthalten. Bei diesem Wirkstoff handelt es sich um ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 11600. Der Wirkstoff inhibiert unter anderem Trypsin, Chymotrypsin und das blutdrucksenkende Kreislaufenzym.

Die deutsche Auslegeschrift 1 084 433 beinhaltet ein Verfahren zur Herstellung reiner Lösungen des Inhibitors, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das darin enthaltene Ballasteiweiß mit Sulfosalicylsäure ausgefällt und die überschüssige Sulfosalicylsäure durch Behandlung mit Anionen- und Kationenaustauschern entfernt wird.

Es ist weiter aus der deutschen Auslegeschrift 1 155 563 ein Verfahren bekannt, das bei Zugabe von Metaphosphorsäure zur Wirkstofflösung den Inhibitor ausfällt. Der abgetrennte Niederschlag wird durch Lösung in Lauge oder Salzlösung zerlegt und die Lösung mittels bekannter Methoden, z. B. Behandlung mit Ionenaustauschern oder Membrandialyse von Salzen befreit.

Nach der deutschen Auslegeschrift 1 193 200 wird der Inhibitor aus seinen Lösungen mit wasserlöslichen Salzen der Metaphosphorsäure unter Vermeidung eines Überschusses ausgefällt und der abgetrennte Niederschlag durch Auflösen in Ammoniak, Laugen oder Salzlösung zerlegt. Die resultierende Lösung wird nach bekannten Methoden, wie z. B. Behandlung mit Ionenaustauschern oder Membrandialyse von Salzen befreit.

kannt ist weiterhin ein Verfahren, wonach man hibitor aus seinen Lösungen mit Polyphosphor- oder deren wasserlöslichen Salzen ausfällt .?den Niederschlag durch Lösen in Lauge oder Üsafzlösungen zerlegt (deutsche Auslegeschrift 1181371).

Die bekannten Verfahren zur Reinigung roher, protein haltiger Inhibitorlösungen bedienen sich einerseits zur Entfernung dieser störenden Begleitproteine der Ausfällung mit Eiweißfällungsmitteln wie Sulfosalicylsäure, Trichloressigsäure und Perchlorsäure.

Dabei muß anschließend das überschüssige Fällungsmittel quantitativ entfernt werden, falls das gewonnene Präparat therapeutische Verwendung finden soll. Dies kann durch Umsetzung mit Anionen- und Kationenaustauschern oder mittels Dialyse durch semipermeable Membranen bzw. durch Filtration über vernetzte Dextrangele geschehen.

Andererseits bedienen sich bekannte Verfahren des Prinzips der Ausfällung des Inhibitors aus der Lösung, z. B. durch Zusatz von Metaphosphorsäure, Gerbsäure oder Ammoniumsulfat. Auch hierbei besteht die Notwendigkeit der vollständigen Abtrennung der Fällungsmittel durch Gelfiltration, Dialyse oder Behandlung mit Ionenaustauschern.

Alle angeführten Veifahren erscheinen in irgendeiner Weise mangelhaft. Sowohl die Verfahren zur Ausfällung von Ballaststoffen als auch diejenigen zur Fällung des Wirkstoffes haben zur Folge, daß das

Fällungsmittel aus der Lösung quantitativ zu entfernen ist, was mit einem erheblichen Aufwand verbunden ist.

Insbesondere bedeutet ein Arbeiten mit Anionenaustauschern eine starke Belastung, da diese nach dem Aufladen durch Lauge mit großen Mengen bidestillierten Wassers gewaschen werden müssen. Darüber hinaus sind für den Austauschprozeß verhältnismäßig große Mengen des Austauschers notwendig.

ίο Die Membrandialyse und noch mehr die Filtration über vernetzte Dextrangele sind für eine großtechnische Produktion ungeeignet. Die mit der Durchführung dieser Methoden verbundenen längeren Behandlungszeiten bieten günstige Entwicklungsbedingungen für Mikroorganismen, wodurch eine Bildung von Pyrogenen möglich wird. Dadurch wird eine Verwendung der Inhibitorlösung in der Therapie unmöglich gemacht. Mit der Erfindung war beabsichtigt, eine Beseitigung der beschriebenen Mängel herbeizuführen. Es bestand die Aufgabe, nach Adsorbentien zu suchen, die die Fähigkeit besitzen, die in der rohen Inhibitorlösung vorhandenen Begleitproteine und Farbstoffe zu binden und auf diese Weise eine Reinigung zu bewirken. Dabei war streng darauf zu achten, daß Wirk-Stoffverluste durch Adsorption oder Einschluß minimal blieben.

Das zu suchende Verfahren sollte auch großtechnisch leicht durchführbar sein und nur wenige Arbeitsstufen enthalten.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß es möglich ist, ein klinisch hochverträgliches, reines Präparat des Proteasen-Inhibitors aus Rinderlunge zu erhalten, wenn in folgender Weise vorgegangen wird:

Eine ungereinigte, aus Rinderlunge gewonnene, den Inhibitor enthaltende wäßrige Lösung mit einer Aktivität von 800 bis 1300 Anti-Trypsin-Einheiten (ATrE) pro Millimeter und einem pH-Wert von 8,5 bis 9,5 wird mit 3 bis 10 %> vorzugsweise 5°/₀, an reinem Magnesiumoxyd (MgO) versetzt und 1 bis 16 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden, mechanisch bei Temperaturen zwischen 10 und 50⁰C, vorzugsweise bei 25°C gerührt. Das mit Proteinen und Farbstoffen beladene Magnesiumoxyd wird darauf durch Filtration über eine Nutsche abgetrennt. Die anfänglich gelblich- bis bräunlichgefärbte Inhibitorlösung wird dabei fast farblos. Die Adsorption von Proteinen dokumentiert sich in einem Absinken der relativen Extinktionswerte von Ausgangslösung und der Lösung nach Magnesiumoxydbehandlung im Ultraviolettgebiet bei 280 μηι.

Die Entfernung von Pigmenten kann zusätzlich durch Messung der Extinktion bei 555 nm verfolgt werden. Wenn auch das Magnesiumoxyd als Adsorptionsmittel bekannt ist, so muß doch seine selektive Adsorptionswirkung für Proteine, nicht aber für relativ nieder- molekulare Polypeptide wie z. B. den Proteaseninhibitor als außerordentlich überraschender Effekt bezeichnet werden. Die Oxyde anderer zur Gruppe der Erdalkalien gehörender Metalle, des Kalziums und des Bariums sind nicht wie das Magnesium für die Reinigungsprozedur des Proteaseninhibitors geeignet, wenngleich sie im Prinzip den gleichen Effekt aufweisen. Auch viele andere Adsorbentien, die untersucht wurden, bewirkten entweder eine zu hohe Adsorption des Wirkstoffes oder eine zu geringe Bindung der Ballaststoffe.

Am Magnesiumoxyd werden außer den Ballaststoffen nur etwa 10°/₀ des eingesetzten Wirkstoffes adsorptiv festgehalten. Nach dem Abtrennen des be-

ladenen MgO über eine Nutsche enthält die Wirkstofflösung noch Spuren von Mg-Ionen, die zwar physiologisch unbedenklich sind, jedoch gegebenenfalls durch Behandlung mit einem Kationenaustauscher vom Typ eines Polymerisationsharzes auf der Basis von Polystyrol mit Divinylbenzol als Vernetzer im Rührverfahren leicht entfernt werden können.

Nach dem Abtrennen des beladenen Austauschers über eine Nutsche wird das erhaltene Filtrat mit dem doppelten bis öfachen, vorzugsweise 4fachen Volumen an niederen aliphatischen Alkoholen, vorzugsweise Äthanol, oder mit Aceton versetzt. Dabei ist das Fällungsmittel zweckmäßig auf -5⁰C vorher abzukühlen und die Mischung zur Vervollständigung der Ausfällung des Wirkstoffes über Nacht in der Kälte aufzubewahren. Es entsteht ein feiner, reinweißer Niedei schlag, der zweckmäßig durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Der Niederschlag wird entweder durch Waschen mit Äthanol bzw. Aceton zu einem Trockenpulver verarbeitet oder in pyrogenfreiem Wasser bzw. physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen, wobei er sich ohne Rückstand löst.

Diese Inhibitorlösung mit einem pH-Wert von 2,5 bis 3,5 besitzt eine Aktivität von etwa 2500 ATrE/ml. Die Ausbeute liegt zwischen 80 und 95%. bezogen auf eingesetztes Material.

Der Reinheitsgrad steigt von 80 bis 140 ATrE/mg in der Ausgangslösung auf 600 bis 1000 ATrE/mg im Endprodukt. Die Inhibitorlösung wird in bekannter Weise sterilfiltriert und kann ohne weiteres therapeutisch verwendet werden.

In der erfindungsgemäß hergestellten Inhibitorlösung lassen sich weder Proteine mittels Sulfosalicylsäure noch Magnesiumionen mit der empfindlichen Titangelb-Reaktion nachweisen.

Die Aktivität des Proteaseninhibitors aus Rinderlunge wird in Anti-Trypsin-Einheiten (ATrE) angegeben. Die Bestimmung erfolgt nach einer von Markwardt und W a 1 s m a η η beschriebenen Methode (F. Markward t, P. Walsmann.· Zur quantitativen Bestimmung von Proteaseninhibitoren. Die Pharmazie; 19 [1964], S. 453).

Beispiel

650 ml einer aus Rinderlunge hergestellten Inhibitorlösung mit einer Aktivität von 918 ATrE/ml werden bei einem pH von etwa 8,5 mit 32,5 g Magnesiumoxyd versetzt und 3 Stunden bei 25 ⁰C mechanisch gerührt. Nach anschließendem Abtrennen auf einer Nutsche erhält man 580 ml Inhibitorlösung mit 774 ATrE/ml und einem pH von 10,0, wobei die relative Extinktion bei 280 nm von 0,190 auf 0,089 absinkt. Das fast farblose Filtrat wird mit 60 ml Kationenaustauscher Wofatit KPS (Warenzeichen) im Rührverfahrem behandelt, auf der Nutsche abgesaugt und anschließend mit dem 4fachen Volumen konzentrierten Äthanols von -5⁰C versetzt. Zum Vervollständigen der entstandenen Fällung wird die Mischung über Nacht in der Kälte aufbewahrt.

Der feine weiße Niederschlag wird abzentrifugiert und in 225 ml pyrogenfreier, physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.

Das so erhaltene Inhibitorkonzentrat mit einer relativen UV-Extinktion von 0,056 hat eine Aktivität von 2502 ATrE/ml. Der Reinheitsgrad ist gegenüber der Ausgangslösung von 124,2 ATrE/mg auf 695 ATrE/ mg angestiegen, die Ausbeute beträgt 94,2 %·

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Reinigung roher Präparate des Proteaseninhibitors aus Rinderlunge, dadurch gekennzeichnet, daß man eine den Inhibitor enthaltende wäßrige Lösung mit einem Reinheitsgrad von 80 bis 140 ATrE/mg 1 bis 16 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden, mit 3 bis 10 %> vorzugsweise 5°/₀ des Volumens an Magnesiumoxyd bei 10 bis 50⁰C, vorzugsweise 25° C rührt, vom mit Ballaststoffen beladenen Magnesiumoxyd abtrennt und gegebenenfalls anschließend in bekannter Weise Kationen mit einem Kationenaustauscher entfernt, den Wirkstoff aus dem erhaltenen Filtrat durch Versetzen mit dem 2- bis 6fachen Volumen, vorzugsweise dem 4fachen Volumen, an niederen aliphatischen Alkoholen, vorzugsweise Äthanol, oder Aceton in bekannter Weise ausfällt, abtrennt und in pyrogenfreiem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung aufnimmt.