DE2154557B2 - Verfahren zur Herstellung von hochreiner Kallidinogenase (Kallikrein) und ein die danach erhaltene kristalline Kallidinogenase enthaltendes Arzneimittel - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von hochreiner Kallidinogenase (Kallikrein) und ein die danach erhaltene kristalline Kallidinogenase enthaltendes Arzneimittel.

Bei Einwirkung auf körpereigenes Kininogen setzt Kallikrein die kreislaufwirksamen Kinine frei. KaIIikrein-Präparate werden daher zur Therapie verschiedener Durchblutungsstörungen therapeutisch verwendet (E. K. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke, Stuttgart 1968, S. 15Off).

Bisher verwendete man dazu teilweise gereinigte Präparate des Kallikrein aus Pankras, Submaxillaris oder Harn.

Es ist bereits bekannt geworden, daß man Präparate des Kallikrein aus Pankreas, Submaxillaris oder Harn gewinnen kann. Zur Gewinnung von teilweise gereinigtem Kallikrein sind verschiedene Verfahren bekannt geworden, z. B. können nach DE-PS 890857 Kallikreinhaltige Drüsen in wäßriger Suspension bei Temperaturen zwischen 38 und 65 ° C thermolysiert und die kallikrein-haltigen wäßrigen Phasen von unlöslichen Anteilen abgetrennt werden. Zur Gewinnung von teilweise gereinigtem Kallikrein können auch nach DE-PS 910850 Harn sowie Autolysate von Pankreas oder Submaxillaris mit wäßrigen Lösungen von Blei- oder Zinksalzen gefällt, die Fällungen abgetrennt, in Phosphatpufferlösungen, vornehmlich in Diammoniumhydrogenphosphat-Lösungen, gelöst, die Lösungen dialysiert, die Dialysate konzentriert und der Wirkstoff aus den Konzentraten mit organischen Lösungsmitteln, z. B. mit Äthanol oder Aceton gefällt werden.

Die noch unreinen Kallikrein-Präparate können z. B. nach DE-PS 1102973 so weiter gereinigt werden, daß Kallikrein bei pH-Werten von 3 bis 10, vornehmlich bei pH 6,0 bis 7,5 an basisch substituierte Zellulosen adsorbiert wird, die basisch substituierten Zellulosen abgetrennt und unwirksame Begleitstoffe mit einer stark verdünnten Pufferlösung ausgewaschen werden. Der Wirkstoff kann von der basisch substituierten Zellulose mit 1 bis 5%igen Elektrolytlösungen desorbiert werden. Es werden Präparate miit ungefähr 50 bis 100 KE/mg Protein (KE= KaIIikrein-Einheit; Bestimmung der Kallikrein-Einheiit durch Messung der Blutsenkung am Hund [E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke-Verlag, Stuttgart 1968, S. H]) erhalten. Noch sehr unreine Kallikrein- -> Präparate können auch nach DE-PS 1124187 zur weiteren Reinigung einer Elektrodialyse unter Verwendung von Austauschermembranen unterworfen werden. Es werden so Präparate mit 50 KE/mg gewonnen.

in So gereinigte Kallikrein-Präparate eignen sich nur bedingt zur parenteralen Anwendung. Einmal kann der Gehalt an Fremdproteinen zur immunologischen Sensibilisierung und bei mehrmaliger Anwendung dann zum lebensgefährlichen anaphylaktischen ι "> Schock führen. Zum anderen war es mit den bisherigen Reinigungsverfahren schwierig, Präparate zu erhalten, die ausreichend frei von pyrogenen Stoffen waren. Es war auch nicht möglich, Pyrogene durch Filtration durch Klär- und Steril-Filterschichten zu JIi entfernen, da Kallikrein von diesen Materialien in hohem Maße selbst adsorbiert wird.

Es ist weiterhin bereits bekannt geworden, daß man kleinere Mengen von hochgereinigtem Kallikrein nach verschiedenen Verfahren gewinnen kann. Nach j-, H. Fritz et al. (Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 348,1120-1132 [1967]) erhält man ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 1516 KE/mg Protein, indem man ein nach DE-PS 910580 vorgereinigtes Produkt ein- bis dreimal an Hydroxylapatit-Zellulose tu chromatographiert. Es ist dabei jedoch erforderlich, die optimale Konzentration des Elutionspuffers für jede Kallikrein-Probe und jede neue Charge der Hydroxylapatit-Zellulose in Vorversuchen neu zu bestimmen. Diese Methode ist deshalb verfahrenstechr. nisch nicht realisierbar.

Nach einem anderen Vorschlag (H. Moriya et al., Biochem. Pharmacol. 18,549-552 [1968])erhält man elektrophoretisch reines Kallikrein in 6 bis 9% Ausbeute, ausgehend von autolysiertem Pankreasbrei in durch aufeinanderfolgende Anwendung von Diäthylaminoäthylgruppenhaltiger Zellulose, Fällung mit 2-Äthoxy-o^-diaminoacridiniumlactat, Extraktion des Niederschlages mit Ammoniumsulfatlösung, Fällung mit Aceton, Chromatographie an Hydroxylapatit und r, Chromatographie an quervernetztem Polydextrangel mit einem Ausschlußvolumen für Molekulargewichte größer als 150000.

Auch dieses Verfahren ist wegen der geringen Ausbeute und der Vielzahl der Schritte technisch un- -,Ii brauchbar.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche hochreine und gegebenenfalls kristalline Kallidinogenase (Kallikrein) besitzt überraschenderweise eine wesentlich höhere Reinheit als die gemäß V) DE-OS 1617476 erhältliche Kallidinogenase, wobei bei der Injektion der gebrauchsfertigen Lösungen das Risiko von Nebenwirkungen und Schock wesentlich vermindert wird.

Kristallines Kallikrein ist bisher noch nicht darge_hii stellt worden.

Die vorliegende Erfindung behandelt nun ein einfaches Verfahren zur Gewinnung des reinen, gegebenenfalls kristallinen Kallikrein in hoher Ausbeute.

Es wurde gefunden, daß das reine Kallikrein ge- ^ wonnen werden kann, indem man ein nach DE-PS 910580 aus dem Niederschlag der Blei- oder Zinksalz-Fällung gewonnenes Eluat entsalzt, die entsalzte Lösung an einem geeigneten basisch substituierten

makroporösen Anionenaustauscher, Diäthylaminoäthylgruppen-haltiger Zellulose oder Diäthylaminoäthylgruppen-haltigem quervernetztem Polydextrangel chromatographiert, die so gewonnene Lösung des teilweise gereinigten Kallikrein mit einem geeigneten sauer substituierten makroporösen Kationenaustauscher, wie z. B. Carboxymethylgruppen-haltigem quervernetztem Polydextrangel oder Sulfoäthylgruppen-haltigem quervernetztem Polydextrangel behandelt und das Kallikrein gegebenenfalls kristallisiert. Das so erhabene gegebenenfalls kristalline Kallikrein übertrifft in der spezifischen Aktivität alle bisher bekannt gewordenen Präparate und ist frei von antigen wirksamen Fremdproteinen und Pyrogenen.

Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Kallikrein erfolgt durch Messung der Hydrolyse von N-Benzoyl-1-arginin-äthylester (E. Werle und B. Kaufmann-Bretsch,Naturwissenschaften 46, 559 [1959]) in der von der F. I. P. (Federation Internationale Pharmaceutique) standardisierten Ausführungsform als titrimetrischer Test (Publikation 1972 in J. mond. Pharm.). Für die Umrechnung der enzymatischen Einheiten in die durch Messung der Blutdrucksenkung am Hund bestimmten biologischen Kallikrein-Einheiten (KE) (E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke, Stuttgart 1968, S. 11) wird der Faktor 1 KE = 6,37 F. I. P.-Einheiten benutzt. Der Protein-Gehalt von Lösungen des reinen Kallikrein wird aus der Extinktion bei 280 nm bestimmt, wobei ein Extinktionskoeffizient von E^ = 19,3 (= Extinktion einer l%igen Lösung von Kallikrein bei pH 7,0) zugrunde gelegt wird.

Es wurde gefunden, daß die Entsalzung des nach DE-PS 910580 gewonnenen Eluats durch Dialyse oder durch Gelfiltration erfolgen kann. Für die darauffolgende Chromatographie an basisch substituierten makroporösen Anionenaustauschern werden erfindungsgemäß insbesondere basisch substituierte Zellulosen oder basisch substituierte Gele mit genügender Porenweite verwendet. Bevorzugt wird dieser Reinigungsschritt an Säulen von Diäthylaminäthylgruppenhaltigen quervernetztem Polydextrangel durchgeführt. Die Adsorption erfolgt bei einem pH von 4,0 bis 8,0, bevorzugt bei pH 4,5 bis 5,0. Die Elution erfolgt durch Erhöhung der Salzkonzentration bei konstantem pH oder Senkung des pH-Wertes bei konstanter Salzkonzentration oder eine Kombination beider Verfahren. Die Veränderung von pH und Salzkonzentration kann kontinuierlich als Gradientenelution oder stufenweise erfolgen. Es können alle bekannten Puffersalze verwendet werden; bevorzugt werden flüchtige Puffersalze, z. B. Ammoniumformiat, Ammoniumacetat, Ammoniumpropionat oder die entsprechenden Alkylammoniumsalze, z. B. Triäthylammoniumformiat, verwendet. In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Kallikrein aus 0,2 M Ammoniumacetat pH 5,0 an Diäthylaminoäthylgruppen-haltiges quervernetztes Polydextrangel in Form einer Säule adsorbiert, inaktives Protein mit 0,25 M Ammoniumacetat pH 5,0 ausgewaschen und anschließend angereichertes Kallikrein mit 0,3 M Ammoniumacetat pH 4,5 eluiert.

Die Chromatographie an basisch substituierten makroporösen Anionenaustauschern stellt eine wesentliche Verbesserung des Verfahrens nach DE-PS 1102973 dar. das an Ausbeute und Einfachheit der Durchführung im technischen Maßstab entscheidend übertroffen wird.

Das so angereicherte Kallikrein wird erfindungsgemäß durch Behandlung mit sauer substituierten makropcrösen Kationenaustauschern weiter gereinigt. Es werden dadurch Präparate von etwa 90% Reinheit erhalten. Als makroporöse Kationenaustauscher können insbesondere sauer substituierte Zellulosen oder sauer substituierte Gele, z. B. aus quervernetzten Dextranen oder Polyacrylamid, mit genügender Porenweite verwendet werden. Die Behandlung der Lösung des angereicherten Kallikrein mit dem Kationenaustauscher kann erfolgen, indem man die Lösung mit dem Austauscher ausrührt oder indem man die Lösung durch Schichten des Austauschers filtriert. Verwendet man Säulen, so ist es zweckmäßig, die Lösung des angereicherten Kallikrein aus der vorherigen Stufe zu konzentrieren und zu entsalzen. Während des Ausrührens oder während des Filtrationsvorganges werden von den Gelen Begleitstoffe zurückgehalten, während Kallikrein ungehindert durch die Filtration läuft.

Die zur Filtration oder zum Ausrühren verwendeten sauer substituierten makrokporösen Kationenaustauscher werden in bekannter Weise vorbehandelt. Zur Filtration werden sie mit verdünnten Pufferlösungen angerührt und z. B. in Säulen eingeschlämmt. Das Verhältnis Säulenlänge/Säulendurchmesser ist für den Filtrationsvorgang von sekundärer Bedeutung. Bevorzugt verwendet werden Säulen mit großem Säulendurchmesser. Zur Herstellung der Pufferlösungen werden die bekannten Puffersalze, vornehmlich aber flüchtige Puffersalze, z. B. Ammoniumformiat, Ammoniumacetat, Ammoniumpropionat oder die entsprechenden Alkylammoniumsalze, z. B. Triäthylammoniumformiat, verwendet. Der pH-Wert der Pufferlösungen kann zwischen 4,5 und 8,5, vornehmlich zwischen 5,0 und 7,0, gewählt werden.

Das hochgereinigte Kallikrein wird gegebenenfalls erfindungsgemäß durch Zusatz von Ammoniumsulfat in fester Form oder als konzentrierte Lösung bei einem pH-Wert von 4,0 bis 8,0 kristallisiert. Die Kristallisation setzt bei einer Ammoniumsulfat-Sättigung von etwa 45% innerhalb weniger Tage ein, vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 25° C. Die Kristalle haben die Form dünner Nadeln, die sich in Büscheln zusammenlagern. Die Kristalle können von der Mutterlauge durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt, mit 50% gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung gewaschen und in verdünnten Salzlösungen oder Wasser gelöst werden.

Die Kristalle bestehen aus reinem Kallikrein. Die spezifische Aktivität von ca. 1600 KE/mg Protein läßt sich auch durch mehrmaliges Umkristallisieren nicht weiter steigern.

Überraschenderweise gelingt es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, teilweise gereinigtes Kallikrein von seinen Begleitstoffen und von Fremdenzymen äußerst einfach und ohne Anwendung umständlicher Elutions-Methoden abzutrennen und gegebenenfalls zu kristallisieren. Es war nicht vorauszusehen, daß die Begleitstoffe und die Fremdenzyme, nicht aber Kallikrein von den sauer substituierten makroporösen Kationenaustauschern festgehalten werden und das in Lösung bleibende Kallikrein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in sehr guten Ausbeuten und in hoher Reinheit erhalten wird. Durch die Kristallisation werden auch schwer zu entfernende pyro-

gene Substanzen praktisch vollständig abgetrennt. Die Einfachheit des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt die Durchführung auch im technischen Maßstab. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine Bereicherung der Technik dar. ί

Die Lösung der Kristalle ist charakterisiert durch ein UV-Spektrum bei pH 7 mit einem Maximum bei 2:82 nm, einem Minimum bei 251 nm, 2 Schultern bei 277 und 290 nm und einem Verhältnis der Extinktionen bei 280 und 260 nm von 1,78 (siehe Fig. 1, nicht in unterbrochene Kurve). In 0,1 η NaOH zeigt das L¹V-Slpektrum zwei Maxima bei 280 und 289 nm (siehe Fig. 1 gestrichelte Kurve).

Das erfindungsgemäß erhaltene kristalline Kallikrein kann als wirksamer Bestandteil von Arzneimit- ι > teln verwendet werden. Infolge ihrer gefäßerweiternden Wirkung werden Kallikrein enthaltende Arzneimittel, wie bereits bekannt, insbesondere bei peripheren Durchblutungsstörungen, z. B. Endangiitis obliterans, Arteriosclerosis obliterans, Morbus Raynaud, _>o bei gestörter Fraktur- und Wundheilung, z. B. Sudecksches Syndrom, Verbrennungen, und bei Zirkulationsstörungen des Alters mit Erfolg verwendet.

Die Anwendung kann oral in Form von Tabletten oder Dragees, die das kristalline Kallikrein in Mi- r> schung mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen enthalten oder parenteral als intramuskuläre oder auch intravenöse Injektion einer wäßrigen Lösung des kristallinen Kallikrein erfolgen. Insbesondere für die parenterale Anwendung jn bietet das kristalline Kallikrein gegenüber weniger reinen Präparaten den Vorteil der weit geringeren Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen und allergischer Reaktionen.

Durch Zusatz von hochmolekularen Kolloiden r> nach DE-PS 941685, z. B. Polyvinylpyrrolidon oder Dextran, oder durch Bildung des Komplexes mit dem Kallikrein-Inhibitor Aprotinin nach DE-PS 1000566 können aus kristallinem Kallikrein verzögert wirkende Injektionspräparate hergestellt werden. Kalli- w krein für Injektionszwecke kann sowohl als gebrauchsfertige isotonische Lösung hergestellt werden, als auch in fester Form durch Gefriertrocknen einer Mischung vcn kristallinem Kallikrein mit geeigneten Trägerstoffen, z. B. Dextran, Mannit, Lactose, GeIa- j-, tine, woraus durch Auflösen in einem geeigneten Lösungsmittel die gebrauchsfertige Lösung unmittelbar vor der Anwendung hergestellt wird.

Beispiel .₍₍

a) 2001 eines nach DE-PS 910580 aus Schweinepankreas gewonnenen und dialysierten Eluats einer Bleisalz-Fällung, enthaltend 10,8 Mio. KE, wurden im Dünnschichtverdampfer auf 15 I eingeengt und dann durch Gelfiltration über eine Säule von quervernetztem Polydextrangel mit einem Ausschlußvolumen für Molekulargewichte größer als 5000 entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde mit Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt und eine dabei entstandene geringe Fällung abfiltriert. Sodann wurde festes Ammoniumacetat bis zur spezifischen Leitfähigkeit 12 mS zugesetzt. Diese Lösung wurde über eine 20 X 65 cm große Säule (20 1) von Diäthylaminoäthylgruppenhaltigen quervernetztem Polydextrangel, äquiiibriert mit 0,2 M Ammoniumacetat pH 5,0, gegeben, wobei Kallikrein adsorbiert wird. Die Säule wurde anschließend zuerst mit ca. 40 1 0,25 M Ammoniumacetat pH 5,0 und dann mit 0,3 M Ammoniumacetat pH 4,5 eluiert. Kallikrein erscheint im Eluat kurz nachdem der pH-Wert auf etwa 4,5 gesunken ist (Fig. 2). Die aktiven Fraktionen enthielten 9,35 Mio KE 86,5%). Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert und über eine Säule von quervernetztem Polydextrangel mit einem Ausschlußvolumen für Molekulargewichte größer als 5000 entsalzt: eine lyophilisierte Probe hatte die spezifische Aktivität von 414 KE/mg Einwaage.

b) Die entsalzte Lösung mit einem Volumen von 300 ml wurde über eine 10 X 130 cm große Säule (10 1) von carboxymethylgruppen-haltigem quervernetztem Polydextrangel, äquiiibriert mit 0,01 M Ammoniumacetat pH 5,0, filtriert. Im Eluat erschien zuerst Kallikrein, gefolgt von inaktiven Verunreinigungen (Fig. 3). Die KaIIikrein-Fraktion (930 ml) enthielt 5,5 Mio KE (59%). Eine lyophilisierte Probe hatte die spezifische Aktivität 1060 KE/mg Einwaage bzw. 1220 KE/mg Protein. Die Fieberwirkung betrug nach DAB 1,85 (1[AT]¹ von 3 Tieren).

c) Ein Teil der Lösung, enthaltend 115000 KE, wurde auf 5 ml konzentriert und mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung bis 45% Sättigung versetzt. Nach 6 Tagen bei 20 bis 25° C setzte die Kristallisation ein. Nach 3 Wochen wurden die Kristalle abzentrifugiert, mit 5 ml 50% gesättigter Ammoniumsulfatlösung einmal gewaschen und in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst. Die spezifische Aktivität des Kallikrein in dieser Lösung war 1560 KE/mg Protein. Die Ausbeute betrug 71 %, die Fieberwirkung nach DAB 0,32.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von hochreiner Kallidinogenase (Kallikrein), dadurch gekennzeichnet, daß der aus Organen nach bekannten Methoden durch Metallsalzfällung gewonnene Niederschlag eluiert, das Eluat entsalzt, an geeigneten basisch substituierten makroporösen Ionenaustauschern Chromatographien, dann mit einem geeigneten sauer substituierten Ionenaustauscher behandelt und die reine Kallidinogenase (Kallikrein) gegebenenfalls aus der so erhaltenen Lösung durch Zusatz eines geeigneten Fällungsmittels kristallisiert wird.

2. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an kristalliner Kallidinogenase (KallilTein) gemäß Anspruch 1.