DE2201669C3

DE2201669C3 - Pyrogenfreier Blutplasmaersatz

Info

Publication number: DE2201669C3
Application number: DE2201669A
Authority: DE
Inventors: Kodo Tokyo Okada; Kazunari Tokyo Shirai; Terumi Tamada
Original assignee: Kyorin Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kyorin Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1971-08-21
Filing date: 1972-01-14
Publication date: 1981-05-07
Also published as: AU3771272A; MY7400261A; JPS5439444B2; GB1339210A; HU164073B; ZA728667B; BE778156A; AU464057B2; DE2201669A1; JPS4828618A; FR2150272B1; ES402085A1; FR2150272A1; DE2201669B2; CA965006A

Description

Es sind bereits viele Arten von kolloidalem Blutplasmaersatz und viele kolloidale Blutplasmaexpander in der Klinik angewendet worden. Obwohl sich die meisten der kolloidalen Substanzen physiologisch nicht homogen verhalten, sind diese Substanzen mit einer hohen Viskosität in der Lage, den Blutdruck aufrechtzuerhalten. Die Ausscheidung der inhomogenen Substanzen im Urin ist jedoch ungenügend, so daß wegen der Anhäufung dieser Substanzen Gewebeschädigungen auftreten können. Solche kolloidalen Substanzen sind z. B. Arginin, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon (PVP).

Gegenwärtig wird in der Klinik vorzugsweise Dextran oder modifizierte Gelatine als Blutplasmaexpander oder Blutplasmaersatz verwendet Diese Substanzen haben jedoch ebenfalls Nachteile. So verursacht Dextran bei 6 bis 8 Prozent der Patienten eine Nierenschädigung oder einen anaphylaktischen Schock.

Da die modifizierte Gelatine bei Raumtemperatur geliert, ist diese Substanz zum Gebrauch in Notfällen ungeeignet. Ferner zerstört die modifizierte Gelatine rote Blutzellen. Dextran und modifizierte Gelatine sind somit keine idealen Ausgangsmaterialien zur Herstellung von Blutplasmaexpander und Blutplasmaersatz.

Ferner ist aus der DE-OS 18 13 571 ein Plasmastreckmittel aus einem Stärkederivat, z. B. Hydroxyäthylstärke, bekanntgeworden, das eine kurzfristige hohe Anfangskonzentration und eine langfristige vollständige Ausscheidbarkeit besitzt. Neben diesen an sich sehr wünschenswerten Eigenschaften können sich — wie festgestellt wurde — derartige, relativ hojphsubstituierte Hydroxyäthylstärken im Gewebe ablagern und zu Gewebeschädigungen führen. «

Aufgabe der Erfindung war es daher, einen pyrogenfreien Blutplasmaersatz zu schaffen, der die vorgenannten Nachteile nicht aufweist und mit größmöglicher Risikolosigkeit und hoher Wirksamkeit angewendet werden kann.

Es ist gefunden worden, daß es bei einer Verwendung von Hydroxyäthylstärke beim Ersatz von Blutplasma darauf ankommt, daß die Hydroxyäthylstärke die in den beiden Ansprüchen definierten Werte hinsichtlich des Substitutionsgrades und der Viskositätszahl aufweisen muß, um die gestellte Aufgabe lösen zu können. Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung einer Hydroxyäthylstärke vom Substitutionsgrad 0,5 bis 0,6 und einer Viskositätszahl von 0,08 bis 0,14 beim Ersatz von Blutplasma.

Eine bevorzugte Ausführungsform sieht die Verwendung einer Hydroxyäthylstärke vom Substitutionsgrad

ίο 0,5 bis 0,6 und einer Viskositätszahl von 0,08 bis 0,14 in einer Menge von 5,8 bis 6,2 Gewichts-Volumprozent in zur Injektion geeignetem destilliertem Wasser vor, das

0,5 Gewichts-Volumprozent 0,03 Gewichts-Volumprozent 0,02 Gewichts-Volumprozent

Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchloriddihydrat,

0,224 Gewichts-Volumprozent Natriumacetat und 1,00 Gewichts-Volumprozent Glucose

enthält, wobei die wäßrige Lösung einen pH-Wert von 6,2 ± 0,5 aufweist, beim Einsatz von Blutplasma.

Die Herstellung von Hydroxyäthylstärken mit derartigen Substitutionsgraden und mit derartigen Viskositätszahlen ist aus einem Aufsatz in Chem. Pharm. BuIU 19 (1971), Stiten 286 bis 291, bekannt Jedoch geht aus diesem Aufsatz nicht hervor, daß es gerade auf die Kombination von bestimmten Viskositabzahlen und Substitutionsgraden einer Hydroxyäthylstärke ankommt, um einen besonders gut verträglichen Blutpias-.

maersatz zu erhalten. Zur Definition der Viskositätszahl vgL diese Publikation.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der anspruchsgemäß definierten Hydroxyäthylstärke kann man einen Blutplasmaersatz mit größtmöglicher Risiko losigkeit und hoher Wirksamkeit erhalten, der sich klinisch einsetzen läßt und sich ausgezeichnet zur Aufrechterhaltung des Blutdruckes beim hämorrhagischen Schock eignet, wobei nachteilige Wirkungen, wie die Anhäufung kolloidaler Substanzen im Gewebe und dessen Zerstörung und die Agglutination von roten Blutzellen, nicht auftreten. Die vorgenannten Nachteile werden jedoch häufig bei Verwendung anderer polymerer Substanzen als Blutplasmaersatz beobachtet Ein weiterer Vorteil des mit der erfindungsgemäß zu verwendenden Hydroxyäthylstärke erhaltenen Blutplasmaersatzes ist, daß er ausgezeichnet intravenös in großen Mengen injiziert werden kann, wobei Schüttelfrost, Fieber und Antigenwirkung nicht auftreten, da der Blutplasmaersatz bei der Herstellung des Injektionsmit tels pyrogenfrei gemacht wird.

Stärke hat eine ähnliche Struktur wie Glycogen und ist mit dem Körpergewebe verträglich, da die Stärke in vivo nicht als Fremdsubstanz wirkt Lösliche Stärke wird jedoch im Blut durch oc-Amylase so rasch hydrolysiert, daß sie nicht als Blutplasmaersatz verwendet werden kann.

Seit M. Wiedersheim in Arch. Intern. Pharmacodyn., 111 (1957), S. 353 ff, berichtete, daß eine hydroxyäthylierte Stärke wegen ihrer geringen Toxizität und ihrer hohen Beständigkeit gegen «-Amylase als Blutplasmaersatz verwendbar sei, wurden viele Untersuchungen fiber Hydroxyäthylstärke, nachstehend als HES bezeichnet, als Blutplasmaexpander durchgeführt Bei diesen Untersuchungen wurde jedoch lediglich die Wirkung von HES mit hohem Substitutionsgrad (Grad der Substitution mit Hydroxyäthyl-Gruppen, nachstehend als DS bezeichnet) und hohem Molekulargewicht geprüft Die Ausscheidung, Anhäufung und Hydrolyse

von HES im Körpergewebe wurde nicht untersucht Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die kolloidale Lösung als Blutplasmaersatz nicht verwendet werden kann, weil durch die Anhäufung der als Blutplasmaersatz verwendeten Substanzen eine Gewebeschädigung auftritt Die der Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen wurden deshalb darauf gerichtet, die Gewebeschädigung bei Verabreichung von HES zu vermeiden, selbst wenn dabei die Expandierwirkung geringfügig abnimmt >o

Die voniegende Erfindung basiert auf den nachstehenden Feststellungen:

1. Konzentration der kolloidalen Substanzen im Blut und im Urin nach intravenöser Infusion von HES, löslicher Stärke, Dextran und PVP bei Kaninchen

15

Nach intravenöser Verabreichung isotonischer Lösungen, die 6 Prozent HES mit verschiedenem DS, im Handel erhältliches Dextran, 6 Prozent lösliche Stärke und 3,5 bzw. 6 Prozent PVP enthalten, werden die Konzentrationen der kolloidalen Substanzen im Blut jede Stunde bestimmt Aus F i g. 1 ist ersichtlich, daß HES in Abhängigkeit vom Ansteigen des Molekulargewichts nur langsam aus dem Blut verschwindet HES mit hohem DS verweilt länger im Blut als HES mit gleichem Molekulargewicht In F i g. 2 ist die Beziehung zwischen der Verweildauer der kolloidalen Substanzen im Blut und der Ausscheidung im Urin in Abhängigkeit vom Substitutionsgrad dargestellt Aus den F i g. 1 und 2 geht hervor, daß die Verweildauer von HES mit DS 0,5 bis 0,6 im Blut annähernd gleich ist mit der Verweildauer von Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht von 75 000. Daraus ist abzuleiten, daß sich HES mit DS 0,55 bevorzugt als Blutplasmaersatz eignet

2. Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und der Viskositätszahl von HES und dessen

Halbwertszeit im Blut

Während eines Monats wird Kaninchen täglich intravenös HES (DS 0,54, Molekulargewicht 233 600), das im Blut dieselbe Konzentration wie Dextran (mittleres Molekulargewicht 75 000) ergibt, und Dextran infundiert Das Hauptgewebe der Tiere wird pathologisch untersucht. Bei einer Verabreichung von 10 bzw. 30 ml/kg wird keine Schädigung des Hauptgewebes beobachtet; bei einer Verabreichung von 90 ml/kg HES tritt jedoch eine stärkere Gewebeschädigung auf als im Gewebe der mit Dextran behandelten Kaninchen. Unter Berücksichtigung der vorstehenden Ergebnisse wird nach der Hydrolyse von HES mit Salzsäure zur Herstellung der erwünschten HES mit niedrigem Molekulargewicht die günstige Beziehung zwischen Molekulargewicht und Viskositätszahl und der Halbwertszeit der hydrolysierten HES im Blut erhalten.

In Fig.3 ist die Beziehung zwischen dem nach Archibald bestimmten mittleren Molekulargewicht und der Viskositätszahl dargestellt. Die nachstehende Gleichung wird aus der F i g. 3 erhalten:

Durchschnittliches Molekulargewicht = 1,037 χ 10» χ [η]- 7,360 χ 10«. [η]: 0,103 bis 0,300 im Blut dargestellt Aus der vorstehend erhaltenen Beziehung geht hervor, daß die Viskositätszahl von HES als objektiver und verläßlicher Parameter hinsichtlich der Qualität der HES betrachtet werden kann. Es ist somit möglich, die mit einer hohen Sicherheit einsetzbare HES aufgrund ihrer Viskositätszahl auszuwählen.

3. Hydrolysegeschwindigkeit von HES durch Schweine-Pankreas-«-Aniylase

Die Hydrolysegeschwindigkeit von HES durch at-Amylase ist lediglich vom Grad der Substitution der HES mit Hydroxyäthyl-Gruppen abhängig, jedoch nicht vom Molekulargewicht der HES. Unter den Bedingungen, bei denen lösliche Stärke zu 77 Prozent durch Λ-Amylase hydrolysiert wird, wird HES mit DS 0,92 nicht zersetzt Aus F i g. 5 ist die Beständigkeit von HES mit DS im Bereich von 0,4 bis 0,7 dargestellt Aus F i g. 5 ist ersichtlich, daß HES mit hohem DS lange im Körpergewebe verbleibt, da HES mit einem DS über 0,6 gegen «-Amylase sehr beständig ist und nur in geringem Maß der Hydrolyse unterliegt Gemäß den in F i g. 1 bis 3 dargestellten Ergebnissen ist HES mit einem DS von 0,5 bis 0,6 und einer Viskositätszahl von 0,8 bis 0,14 bevorzugt als Blutplasmaersatz geeignet Zur Herstellung von HES-Präparaten in großem Maßstab müssen jedoch weitere Faktoren geklärt werden. Es ist erforderlich, das Molekulargewicht der als Ausgangsmaterial dienenden HES-Präparate von 200 000 bis 300 000 reproduzierbar auf das erwünschte Molekulargewicht zu reduzieren. Ferner müssen die pyrogenen Substanzen und die durch kolloidale Substanzen verursachte Trübung vollständig entfernt werden.

Die erfindungsgemäß verwendbare HES mit konstantem und niedrigem Molekulargewicht läßt sich nach den Ausführungen in Chem. Pharm. Bull, 19 (1971), Seiten 286 bis 291, durch Behandeln einer verdünnten Lösung mit HES mit hohem Molekulargewicht mit einer verdünnten Säure herstellen. Bei dieser Behandlung kann auch die weiße Trübung entfernt werden. Dies ist in den Beispielen beschrieben. Wenn HES mit pyrogenen Substanzen verunreinigt ist, können diese leicht gemäß der in der JP-PS 6 09 559 beschriebenen Methode entfernt werden. Durch diese Behandlungen sind die mit der Herstellung eines Blutplasmaersatzes verbundenen Probleme gelöst

Zur Herstellung eines für klinische Zwecke ideal geeigneten Blutplasmaersatzes werden die Wirkungen gegenüber roten Blutzellen, die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung des Blutdruckes, die Verhinderung der Azidose und das rasche Verschwinden aus dem Gewebe im Falle der intravenösen Infusion großer Mengen untersucht Die unter den nachfolgenden Punkten 4 bis 9 zusammengestellten Ergebnisse bestätigen, daß das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 am besten geeignet ist.

In F i g. 4 ist die Beziehung zwischen der Viskositätszahl und der Halbwertszeit von HES mit DS 0,5 bis 0,6

4. Erniedrigung der akuten Toxizität

Das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 wird mit 6prozentiger, nicht mit Säure behandelter HES (DS 0,54, η 0,300) und mit Dextran (Molekulargewicht 75 000) verglichen. Aus den in Tabelle I zusammengestellten Ergebnissen ist ersichtlich, daß die mit dem erfindungsgemäßen HES-Präparat erreichte Sicherheit wegen der Erniedrigung der akuten Toxizität stark ansteigt.

Tabelle I	Verabreichung	Geschlecht	HES-Präparat gemäß Beispiel 7	HES (DS 0,55; MG 230 000) 6 Prozent in physiologischer Kochsalzlösung	Dextran-75 (mit GIu- cosezusatz)
	intravenös	männlich weiblich	416 419	225 230	323
LDso-Werte (ml/kg)	intravenös	männlich weiblich	360	210 216	208 202
Versuchstiere	intraperitoneal	männlich weiblich	>600 >600	>450 >450	—
Kaninchen	Ratten intravenös MG = Molekulargewicht	männlich weiblich	262 193		136 125
Mäuse

5. Morphologischer Einnuß auf rote Blutzellen

Die lsotoxizitäten von verschiedenem Blutplasmaersatz werden anhand der morphologischen Änderungen 2s roter Blutzellen von Kaninchen und Menschen geprüft, nachdem die Blutzellen mit dem Blutplasmaersatz inkubiert wurden. Bei Verwendung physiologischer Kochsalzlösung und des HES-Präparates gemäß Beispiel 7 wird keine morphologische Änderung der roten Blutzellen beobachtet Hingegen agglutinieren rote Blutzellen von Kaninchen, die mit Dextran (Molekulargewicht 40 000) und mit in der Klinik verwendetem Dextran (Molekulargewicht 70 000) inkubiert wurden. Aus den Fig.6 und 7 ist ersichtlich, daß einige modifizierte Gelatine-Präparate den ungünstigsten Einfluß auf die roten Blutzellen ausüben.

7. Verweildauer von HES im Blut von Kaninchen

40

6. Aufrechterhaltung des Blutdruckes in
hämorrhagischen Hunden

Wenn anästhesierten Hunden pro kg Körpergewicht 30 ml Blut mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/Minute entnommen wird und den Hunden sofort intravenös dasselbe Volumen Blutplasmaersatz (6 Prozent HES in 0,9prozentiger NaCl-Lösung) verabreicht wird, zeigt dieser Blutplasmaersatz dieselbe Wirkung bezüglich der Aufrechterhaltung des artiellen Blutdruckes wie Dextran (mittleres Molekulargewicht 75 000). Diese Ergebnisse sind aus Fig.8 ersichtlich. Aus Fig.9 ist ersichtlich, daß der pH-Wert des artiellen Blutes von mit Ringer-Lösung behandelten Hunden abnimmt Das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 kann hingegen die Tendenz zur Azidose des artiellen Blutes verhindern.

50

55

Die Konzentration kolloidaler Substanzen, die im Blut verbleiben, wird nach intravenöser Infusion bei Kaninchen geprüft Die Abnahmegeschwindigkeit von HES gemäß Beispiel 7 im Bhit ist geringfügig höher als bei klinisch verwendetem Dextran. Die Verwefldauer von HES ist jedoch, verglichen mit Dextran (mittleres Molekulargewicht 40 000), für einen Bhitplasmaersatz ausreichend. Die Ergebnisse sind in F i g. 10 zusammengestellt

8. Untersuchung der Anhäufung von HES

Eine Anhäufung von HES gemäß Beispiel 7 in Geweben wird bei Mäusen nach intravenöser Infusion

65 einer üblichen Dosis nicht beobachtet Ferner wird keine Schädigung der Funktion des retikuloendothelialen Systems verursacht, selbst wenn HES sofort in der Leber und in der Milz nachgewiesen wird. Wenn klinisch verwendetes Dextran (mittleres Molekulargewicht 75 000) Kaninchen in Mengen von 100 ml/kg intravenös infundiert wird, werden histologische Schädigungen der Niere und der Leber beobachtet Bei intravenöser Verabreichung derselben Menge von HES gemäß Beispiel 7 werden hingegen keine Nieren- und Leberschädigungen beobachtet In F i g. 11 sind die entsprechenden Nieren- und Lebergewebe abgebildet

9. Anaphylaxieähnliche Reaktion

Es ist bekannt, daß sich die anaphylaxieähnliche Reaktion bei Ratten und Mäusen gegen Dextran in Form von Ödemen und Erythemen der Pfoten, Ohren und der Schnauze äußert Es ist ferner gezeigt worden, daß bei einer der Verabreichung von Dextran vorhergehenden Agar-Injektion eine mit einer Purpura-Reaktion kombinierte anaphylaxieähnliche Reaktion auftritt Die Forscher, die diese Untersuchungen durchgeführt haben, weisen nachdrücklich auf die Freisetzung von Histamin aus Mastzellen hin.

Eine intravenöse Injektion von Dextran ruft eine akute, schwere anaphylaxieähnliche Entzündung der Ohren, der Schnauze und des Schwanzes bei Ratten und Mäusen hervor.

Wenn den Tieren hingegen das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 injiziert wird, wird keine solche Entzündung beobachtet Ferner tritt bei Ratten und Mäusen eine anaphylaxieähnliche Purpura-Reaktion der Pfoten, Ohren und des Schwanzes auf, wenn den Tieren vor der Verabreichung von Dextran Agar injiziert wird. Bei Tieren, denen das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 und Agar injiziert wird, werden keine Symptome der anaphylaxieähnlichen Purpura-Reaktion beobachtet Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß unter den Versuchsbedingungen das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 keine Histamin-Freisetzung aus Mastzellen hervorruft

Immunverhalten

Kaninchen, Meerschweinchen und Mäusen wird Dextran oder das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 mit komplettem Adjuvans nach Freund injiziert Sämtliche

Sera werden mittels der passiven kutanen Anaphylaxie-Reaktion untersucht. Zusätzlich wird bei Kaninchen die Arthus-Reaktion und bei Meerschweinchen die aktive Anaphylaxie-Reaktion durchgeführt.

Bei Kaninchen und Meerschweinchen konnten keine Antikörper gegen Dextran und gegen das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 nachgewiesen werden. Dieser Befund zeigt, daß unter den vorliegenden Bedingungen Dextran und das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 bei Kaninchen und Meerschweinchen nicht immunisierend wirken.

Wenn Mäusen geringe Mengen von Dextran oder des HES-Präparats gemäß Beispiel 7 injiziert werden, werden zirkulierende Antikörper festgestellt. Mäuse können jedoch durch die Injektion relativ großer Polysaccharidmengep. gelähmt werden.

Große Volumina von Dextran oder des HES-Präparats gemäß Beispiel 7 führen bei intravenöser Verabreichung an nicht immunisierte Menschen zu keiner Antikörperbildung. Hohe Dosen können eventuell beim Menschen wie bei der Maus einen Zustand von immunologischer Lähmung hervorrufen.

Es ist gezeigt worden, daß menschliche Sera verschiedene Typen von Antikörpern gegen Dextran enthalten. Diese Antikörper reagieren nach der Infusion mit dem Dextran und rufen so eine anaphylaktische Reaktion hervor.

106 normale menschliche Sera werden mittels der passiven kutanen Anaphylaxiereaktion in Gegenwart von Antikörpern untersucht, die auf Dextran oder auf das HES-Präparat gemäß Beispiel 7 reagieren. 3 Sera ergaben eine positive Reaktion gegen Dextran Eines dieser Sera reagierte schwach mit dem HES-Präparat gemäß Beispiel 7. Wie bereits erwähnt, kann man annehmen, daß die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten der Anaphylaxiereaktion bei dem HES-Präparat gemäß Beispiel 7 geringer ist als bei Dextran.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

7 g Hydroxyäthylstärke (DS 0,50 bis 0,60, Viskositätszahl 0,28 bis 0,30) werden unter Rühren bei etwa 50⁰C in 80 ml destilliertem Wasser zur Injektion (japanische Pharmakopöe VIII) gelöst. Die so erhaltene Lösung wird mit 3,5 ml 0,5 η-Salzsäure und 0,1 bis 1,0 g Aktivkohle versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei schwachem Sieden gehalten. Nach dem Abkühlen wird der pH-Wert auf 7,0 bis 7,4 durch Zugabe von entweder 1 n-Natriumhydrogencarbonat oder 1 n-Natronlauge eingestellt Wenn das Reaktionsgemisch nicht pyrogenfrei ist wird es mit 5 bis 50 mg eines pyrogenfreimachenden Mittels, vorzugsweise mit Raney-Nickel, behandelt Die unslöslichen Bestandteile werden abfiitriert Das klare Filtrat wird mit destilliertem Wasser zur Injektion (japanische Pharmakopöe VIII) auf ein Volumen von insgesamt 100 ml eingestellt Die erhaltene, klare und viskose wäßrige Lösung enthält 5,8 bis 6,2 Prozent Hydroxyäthylstärke und Natriumchlorid. Die Lösung hat eine Trübung von 6,1 ppm und eine Viskosität von 1,85 cP (Viskositätszahl von 0,08 bis 0,14). Ein isotonisches Blutplasmaersatz-Injektionsmittel wird durch mäßige Zugabe von Natriumchlorid und anderen Salzen zu der vorstehend erhaltenen Lösung hergestellt

Beispiel 2

7 g Hydroxyäthylstärke (DS 0,5 bis 0,6, Viskositätszahl 030) werden bei etwa 50⁰C unter Rühren in 80 ml destilliertem Wasser zur Injektion (japanische Pharmakopöe VIII) gelöst. Diese Lösung wird mit 1,0 ml 1 η-Salzsäure und 0,1 bis 1,0 g Aktivkohle versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei schwachem Sieden gehalten. Nach dem Abkühlen wird der pH-Wert des Gemisches auf 7,0 bis 7,4 durch Zugabe von 1 n-Natriumhydrogencarbonat oder 1 η-Natronlauge eingestellt. Wenn das Reaktionsgemisch nicht pyrogenfrei ist, wird es mit 5 bis 50 mg eines pyrogenfreimachenden Mittels, vorzugsweise mit Raney-Nickel, behandelt. Das Gemisch wird filtriert. Das klare Filtrat wird mit destilliertem Wasser zur Injektion (japanische Pharmakopöe VIII) auf ein Volumen von 100 ml eingestellt. Die so erhaltene Lösung wird zur Herstellung eines isotonischen Blutplasmaersatz-Injektionsmittels mit Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat und Glucose versetzt.

Beispiel 3

14 g Hydroxyäthylstärke (DS 0,5 bis 0,6, Viskositäts-

2t) zahl 0,30) werden bei etwa 50⁰C unter Rühren in 140 ml destilliertem Wasser zur Injektion (japanische Pharmakopöe VIII) gelöst. Die so erhaltene Lösung wird mit 3,26 ml 0,5 η-Salzsäure und 0,1 bis 1,0 g Aktivkohle versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei schwachem Sieden gehalten. Nach dem Abkühlen wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 n-Natriumhydrogencarbonat oder 1 η-Natronlauge auf 7,0 bis 7,4 eingestellt. Wenn das Reaktionsgemisch nicht pyrogenfrei ist, wird es mit 1 bis 50 mg eines pyrogenfreimachenden Mittels, wie Raney-Nickel, behandelt. Das Gemisch wird filtriert. Das klare Filtrat wird durch Zugabe von Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat, Glucose und destilliertem Wasser zur Injektion (japanische Pharmakopöe VIII) auf ein Volumen von 200 ml eingestellt. Die so erhaltene Lösung kann abgefüllt, verschlossen und 1 Stunde bei 100⁰C sterilisiert werden.

Beispiel 4

14 g Hydroxyäthylstärke (DS 0,5 bis 0,6, Viskositätszahl 030) werden bei etwa 50⁰C unter Rühren in 140 ml destilliertem Wasser zur Injektion (japanische Pharmakopöe VIII) gelöst. Diese Lösung wird mit 3,26 ml 0,5 η-Salzsäure versetzt 1 Stunde bei 100° C gehalten und dann abgekühlt. Das Gemisch kann, falls notwendig, mit Aktivkohle behandelt werden. Nach dem Abkühlen wird der pH-Wert des Gemisches auf 7,0 bis 7,4 durch Zugabe von 1 n-Natriumhydrogencarbonat oder 1 η-Natronlauge eingestellt. In dieser Lösung werden dann 1,0 g Natriumchlorid, 0,06 g Kaliumchlorid, 0,04 g Calciumchlorid-dihydrat, 0,448 g Natriumlactat und 2 g Glucose gelöst. Die so erhaltene Lösung wird, falls notwendig, mit einem pyrogenfreimachenden Mittel, wie 1 bis 50 mg Raney-Nickel, versetzt, und das Gemisch wird 30 Minuten auf 90 bis 100° C erhitzt.

Anschließend wird das Gemisch mit Aktivkohle versetzt, gründlich gerührt und filtriert Das Filtrat wird mit destilliertem Wasser zur Injektion (japanische Pharmakopöe VIII) auf ein Volumen von 200 ml eingestellt Der pH-Wert dieser Lösung wird auf 6,2 ±0,5 eingestellt Die Lösung wird filtriert, in einen Behälter verpackt und verschlossen. Die Lösung kann 1 Stunde bei 100° C sterilisiert werden.

Beispiel 5

Hydroxyäthylstärke wird gemäß Beispiel 1 mit Salzsäure hydrolysiert Die bei verschiedenen Salzsäurekonzentrationen erhaltenen Trübungs- und Viskositätswerte sind in Tabelle II zusammengestellt

Tabelle II

Beziehung zwischen der Salzsäurekonzentration und der Trübung bzw. der Viskosität von HES-Lösungen:

Salzsäurekonzentration,	Trübung, ppm	Viskosität,
Normalität		cP
0,00625	22,6	4,64
0,01250	18,0	3,11
0,01875	10,5	2,34
0,02500	8,0	1,87
0,03125	4,0	1,57
0,03750	4,3	1,57

10

15

Die Trübung wird mit Hilfe eines Nephelometers (TY3-Typ), hergestellt von Corp. Eimer Optical) gemessen. Die Viskosität wird mittels eines Rotationsviskosimeters (BL-Typ, hergestellt von Tokyo Keiki Co., Ltd.) gemessen.

Beispiel 6

HES (DS 0,54, Viskositätszahl 0,30, Molekulargewicht 232 000) wird gemäß Beispiel 1 mit 0,0125 n-Salzsäure behandelt. Die so erhaltene HES-Lösung ist klar und hat einen DS von 0,54, eine Viskositätszahl von 0,101 und eine Trübung von 6,0 ppm. Diese Lösung wird der Gel-Filtration an einem vernetzten Dextrangel (Säule: 2,5 χ 40 cm, Verwendung eines Durchflußadapters) unterworfen. Die Elution wird aufsteigend mit einer Geschwindigkeit von 0,2 bis 0,3 ml/Minute (0,048 bis 0,061 ml/cmVMinute) durchgeführt. Das für den nachstehenden Test benötigte Volumen beträgt 0,25 ml (2,5 mg); das Volumen einer Fraktion beträgt 3 mi. Die Saccharidbestimmung wird nach der Anthron-Methode durchgeführt Die Ergebnisse sind in F i g. 12 zusammengestellt. Es ist ersichtlich, daß durch die Säurebehandlung eine Verschiebung nach niedrigeren Molekulargewichten von etwa 40 Prozent erfolgt ist Aus der -»o Viskositätszahl der Hydroxyäthylstärke in der zuletzt genannten Lösung errechnet sich ein mittleres Molekulargewicht von etwa 40 000.

Beispiel 7

HES (DS 0,5 bis 0,6, vorzugsweise 0,55, Viskositätszahl 0,3) wird gemäß den Beispielen 1 bis 5 behandelt Die so erhaltene HES-Lösung hat einen DS von 0,55 und eine Viskositätszahl von 0,08 bis 0,14, vorzugsweise von 0,10. Der pH-Wert dieser Lösung wird auf 6,2±0,5 so eingestellt Die Lösung wird auf ein Volumen von 100 ml mit einem Gehalt von 6 Gewichts-Volumprozent Hydroxyäthyistärke, 0,5 Gewichte-Volumprozent Natriumchlorid (einschließlich des bei der Neutralisation entstandenen Natriumchlorids), 0,03 Gewichts-Volumprozent Kaliumchlorid, 0,02 Gewichts-Volumprozent Calciumchlorid-dihydrat, 0,224 Gewichts-Volumprozent Natriumlactat und 1 Gewichts-Volumprozent Glucose eingestellt Die leicht trübe Lösung wird filtriert und in Flaschen abgefüllt die verschlossen werden. Dieses HES-Präparat kann nach 1 stündigem Sterilisieren bei 100° C als Blutplasmaersatz verwendet werden.

Vergleichsversuche

Es sind Vergleichsversuche durchgeführt worden, die nachstehend näher erläutert werden. Gegenübergestellt werden die Wirkungen der Hydroxyäthylstärke nach der Erfindung, im folgenden kurz als HES-K bezeichnet. und die Wirkungen der Hydroxyäthylstärke nach der DE-OS 18 13 571, im folgenden kurz als HES-A bezeichnet. Es werden zwei verschiedene HES-A-Plasmastreckmittel verwendet, von denen die eine als HES-G und die andere als HES-m bezeichnet wird und die beide in einer Menge von 6 Prozent in physiologischer Kochsalzlösung vorliegen. Der Substitutionsgrad von HES-G beträgt 0,7 und die innere Viskosität 0,25 dl/g. Der Substitutionsgrad von HES-m ist ebenfalls etwa 0,7, aber seine innere Viskosität beträgt 0,19 bis 0,20 dl/g. Sowohl Substitutionsgrad als auch innere Viskosität von HES-G liegen innerhalb des bevorzugten Bereiches nach der Entgegenhaltung. Dagegen scheinen die Werte bei der HES-m etwas niedriger als die bevorzugten Bereiche zu liegen, obwohl sie innerhalb der beanspruchten Grenzen liegen. Des weiteren werden Dextran-Plasma-Sireekmittel bei den Vergleichsversuchen mit untersucht, die 6 Prozent klinisches Dextran in 5 Prozent D-Glukose (im folgenden kurz als Dex-75 bezeichnet) bzw. 10 Prozent niedermolekulares Dextran in 5 Prozent D-Giukose enthalten (im folgenden kurz als Dex-40 bezeichnet).

1. Sedimentationsgeschwindigkeit
von Erythrocyten

Vor und nach einer intravenösen Infusion von 500 ml bei jedem operierten Patienten wird die Sedimentationsgeschwindigkeit der Erythrocyten (ESR) nach der Westergren-Methode bestimmt.

Tabelle	111	Dosis	Anzahl	Vor der	Nach der
Einfluß			der	Infusion	Infusion
	(ml)	Patienten
	500	24	6,8 ±0,7	7,9 ± 1,5
von HES-K-Plasmaersatz und anderen Plasma-	500	11	7,8 ±1,7	56,6 ± 16,0
Streckmitteln auf ESR (Durchschnitt von 1 Stunde)	500	13	7,5 ± 1,6	28,8 ±5,7
	500	11	7,1 ±1,9	37,4 ±11,4
	500	10	7,9 ±2,1	14,9 ±4,8

HES-K
HES-G
HES-m
Dex-75
Dex40

Die Ergebnisse sind aus Tabelle III ersichtlich. Nach der Infusion von 6 Prozent HES-G in physiologischer Kochsalzlösung wird der ESR um mehr als das 7fache beschleunigt Die Verarbreichung von 6prozentiger HES-m in physiologischer Kochsalzlösung beschleunigt die ESR um etwa das 4fache. Die Einflüsse von HES-G- und HES-m-Plasmastreckmittel auf das ESR sind stärker oder ähnlich dem Einfluß von Dex-75. Andererseits zeigt der erfmdungsgemäße HES-K-PIasmaersatz keinen bemerkenswerten Einfluß auf die ESR. Aus den Ergebnissen ist demzufolge ersichtlich, daß HES-G und HES-m nach einer intravenösen Verabreichung eine Aggregation von Erythrocyten verursachen.

2. Suspensionsstabilität

In Kapillaren oder kleinen Venen kann ein Absetzen von Blut auftreten, wenn die Suspensionsstabilität der Erythrozyten herabgesetzt wird. Es ist deshalb sehr bedeutungsvoll die Einflüsse von Plasmaersatz und Plasmastreckmittel auf die Suspensionsstabilität zu vergleichen.

Zu einer 3,8prozentigen Natriumcitratlösung wird menschliches Blut gegeben. Dann wird das Gemisch 10 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert. Die Erythrozytenschicht (rote Blutkörperchen) wird 2mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Dann werden die fest zusammengeballten roten Blutkörperchen in entsprechenden Untersuchungslösungen suspendiert, so daß man eine 30prozentige Suspension von roten Blutkörperchen erhält. Die Suspension wird in ein Westergren-Röhrchen überführt und 24 Stunden stehengelassen. Dann wird die Abscheidung der Lösungsschicht (obere Schicht) und die Schicht der roten Blutkörperchen

10η

6-4·
2
0

(Sediment) bestimmt.

Die Suspensionsstabilität wird durch den relativen Suspensionswert (RSV) wiedergegeben, der nach der Gleichung berechnet wird:

RSV =

TkT

χ 10

ίο Ho: ursprüngliche Höhe der Suspensionsschichl
H: Höhe der Schicht der roten Blutkörperchen nach 24 Stunden.

1 ; Plasma

2 ; HES-G

3 ; HES-m

4 ; HES-K

3,811,2 2,3 ± 0,3 2,3 ± 0,2 4,6 1 0,3

12 3 4

Fi/;. 13 Relative S η π ρ or,.'.;:! onov;ortc

Die Ergebnisse sind in Fig. 13 zusammengefaßt. Die physiologischen Kochsalzlösungen mit jeweils 6 Prozent HES-G bzw. 6 Prozent HES-m setzen die Blutsuspensionsstabilität im Vergleich zu Plasma herab, während der erfindungsgemäße HES-K-Plasmaersatz eine ausgezeichnete Wirkung auf die Suspensionsstabilität zeigt

3. Elektrische Ladung der roten Blutkörperchen

Im normalen Blut sind die roten Blutkörperchen elektrisch negativ geladen. Die elektrische Ladung ist physiologisch bedeutsam, da sie eine abstoßende Wirkung jedes roten Blutkörperchens vom anderen verursacht Plasmastreckrnittel, die die Ladung der roten Blutkörperchen herabsetzen, bewirken eine Aggregation der Erythrozyten. Aus diesem Grunde ist ein Vergleichsversuch hinsichtlich der Einwirkungen auf die elektrische Ladung von roten Blutkörperchen sehr wichtig.

Die elektrische Ladung von roten Blutkörperchen wird mittels Elektrophorese einer Suspension von roten Blutkörperchen in einer gepufferten Testlösung geprüft.

Die fest zusammengeballten roten Blutkörperchen werden nach dem gleichen Verfahren erhalten, wie es beim vorhergehenden Versuch beschrieben worden ist. Jede Testlösung wird mit dem gleichen Volumen einer isotonischen Phosphatpufferlösung vom pH 6,8 vermischt, um die gepufferte Testlösung zu erhalten. Die fest zusammengeballten roten Blutkörperchen werden dann zu der gepufferten Testlösung gegeben, so daß man eine Suspension mit 30 Prozent roten Blutkörperchen erhält Dann wird die Suspension in ein einfaches U-Rohr gegeben und mit gepufferter Testlösung überschichtet. Dann wird Gleichstrom von 40 mA durch das Rohr geschickt und die Wanderung der Grenzfläche zwischen der Suspensionsschicht und der Lösungsschicht zur Anode bestimmt.

50

Plasma | — T~—~~-τΓΞ~-.'ϊξ~^··~^

HES-G

HES-m P==-

HES-K ΐΞΞΞτ~-=^:==^^

²r°

4,0 6,0

8,0

10,0

( mm/Minute )

FiK. 14 Elelrtrophor? tische Gcsch'-vinnigkcit von roten Blutkörperchen

Aus der Fig. 14 ist ersichtlich, daß HES-G- und HES-m-Plasmastreckmittel die Elektronegativität gegenüber Plasma schwächen. Demzufolge haben HES-G und HES-m unerwünschte Wirkungen, da sie die Aggregation von Erythrozyten und ein Absetzen des Blutes beschleunigen. Andererseits erhöht der erfindungsgemäße HES-K-Plasmaersatz die Elektronegativität der roten Blutkörperchen. Von Dex-40 ist bekannt, daß es eine gegenteilige Wirkung auf Absetzen durch Erhöhen der negativen Ladung der roten Blutkörperchen besitzt Demanch kann man aus den Ergebnissen folgern, daß der erfindungsgemäße HES-K-Plasmaersatz ebenfalls eine gegenteilige Wirkung auf das Absetzen der roten Blutkörperchen aufweist

4. Morphologische Änderung der
roten Blutkörperchen

In der Beschreibung zu vorliegender Erfindung ist bereits festgestellt worden, daß der erfindungsgemäße HES-K-Plasmaersatz keine morphologische Änderung der roten Blutkörperchen hervorruft, wohingegen Dextran- und Gelatineplasmastreckmittel eine Aggregation erzeugen. Beim vorstehenden Versuch ist bereits deutlich geworden, daß HES-K-Plasmaersatz auf rote Blutkörperchen physiologisch vorteilhaft einwirkt. Andererseits wirken HES-G- und HES-m-Plasmastreckmiljtel in bemerkenswerter Weise anders als der erfindungsgemäße HES-K-Plasmaersatz, indem sie höchst unerwünschte Wirkungen auf die roten Blutkörperchen zeigen. Mikroskopische Beobachtungen von roten Blutkörperchen zeigen diese Unterschiede unmittelbar.

Aus der Ohrvene einer gesunden männlichen Ratte wird Blut entnommen und in einem Röhrchen mit 3,8prozentiger Natriumcitratlösung versetzt. Die roten Blutkörperchen werden durch lOminütiges Zentrifugieren mit 3000 UpM vom Plasma abgetrennt und 2mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. 0,5 ml der roten Blutkörperchen werden in 2 ml der jeweiligen Testlösung suspendiert. Morphologische Änderungen der roten Blutkörperchen werden unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops mit 400facher Vergrößerung untersucht.

Bei dieser Untersuchung mit dem Phasenkontrastmikroskop ist festgestellt worden, daß das HES-G-Plasmastreckmittel einen bemerkenswerten Einfluß auf die roten Blutkörperchen ausübt, denn es wird eine sehr starke Aggregation beobachtet. Dagegen zeigt der erfindungsgemäße HES-K-Plasmaersatz keinerlei unerwünschte Einflüsse, denn die roten Blutkörperchen behalten ihr normales Aussehen bei.

Um Einflüsse auf einzelne rote Blutkörperchen zu beobachten, sind weitere Untersuchungen durchgeführt worden. AUe roten Blutkörperchen, die aus 1 ml Rattenblut erhalten worden sind, werden in 20 ml der jeweiligen Testlösung suspendiert Die Suspension wird sofort mit der gleichen Menge Testlösung auf das 5fache verdünnt Die roten Blutkörperchen werden unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops mit 700facher Vergrößerung jedesmal nach der Verdünnung beobachtet, d. h. nach 30,60 und 180 Minuten. Die ι ο Ergebnisse dieser Untersuchung sind folgende:

Physiologische Kochsalzlösung:

Kein bemerkenswerter Einfluß auf das einzelne rote Blutkörperchen.

Dex-40:

Die Gestalt jedes roten Blutkörperchens bleibt wohl erhalten, doch wird ein geringes Anschwellen des Blutkörperchens beobachtet.
Dex-75:

Die roten Blutkörperchen neigen zu einer Aggregation. Besonders nach 180 Minuten wird eine deutliche Geldrollenanordnung der Erythrozyten beobachtet Die Gestalt jeder Zelle wird ballähnlich und die Anzahl der einzelnen Zellen geringer.

HES-G:

Nach 180 Minuten wird die Geldrollenanordnung der Erythrozyten deutlich beobachtet. Die Oberfläche des Blutkörperchens ändert sich zu einer unregelmäßigen Scheibe. Die Grenze zwischen den aneinanderstoßenden Zellen kann zwar beobachtet werden, doch wird sie linear.

HES-m:

Die roten Blutkörperchen neigen zur Aggregation. 180 Minuten nach der Verdünnung ist eine deutliche Geldrollenanordnung der Erythrozyten ersichtlich. Die Oberflächengestaltung ändert sich wie bei HES-G. Die morphologische Wirkung von HES-m auf rote Blutkörperchen ist sehr ähnlich derjenigen auf HES-G.

HES-K:

Die Gestalt jedes roten Blutkörperchens ist normal, und jede einzelne Zelle ist deutlich von der benachbarten Zelle getrennt. Eine Aggregation oder eine Geldrollenanordnung kann nicht beobachtet werden.

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß HES-G- und HES-m-Plasmastreckmittel unerwünschte Wirkungen auf rote Blutkörperchen haben. Derartige nachteilige Wirkungen darf jedoch ein geeigneter Plasmaersatz nicht aufweisen.

Hierzu 12 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprache:

1. Verwendung von Hydroxyäthylstärke vom Substitutionsgrad 0,5 bis 0,6 und einer Viskositätszahl von 0,08 bis 0,14 beim Ersatz von Blutplasma.

2. Verwendung von Hydroxyäthylstärke vom Substitutionsgrad 0,5 bis 0,6 und einer Viskositätszahl von 0,8 bis 0,14 nach Anspruch 1 in einer Menge von 5,8 bis 6,2 Gewichts-Volumprozent in zur Injektion geeignetem destillierten Wasser, das 0,5 Gewichts-Volumprozent Natriumchlorid, 0,03 Gewichts-Volumprozent Kaliumchlorid, 0,02 Gewichts-Volumprozent Calciumchlorid-dihydrat, 0,224 Gewichts-Volumprozent Natriumlactat und 1 Gewichts-Volumprozent Glukose enthält, wobei die wäßrige Lösung einen pH-Wert von 6,2 ±0,5 aufweist