DE69726457T2

DE69726457T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen mit antimikrobieller wirkung

Info

Publication number: DE69726457T2
Application number: DE69726457T
Authority: DE
Inventors: János ILLES; Erzsebet Nesmelyi; Bela Stefko; Kálmán BURGER
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1996-09-12
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2017-09-12
Also published as: HU225329B1; RU2204394C2; AU4469197A; HUP9602498A3; EP0964687A1; ATE254922T1; JP2009114206A; US6348190B1; HU9602498D0; DK0964687T3; JP2001500860A; CN1130204C; ES2212131T3; KR20000036098A; CN1230117A; UA66766C2; PT964687E; EP0964687B1; HUP9602498A2; KR100489494B1

Description

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen mit antimikrobieller Aktivität, enthaltend Assoziate (Komplexe) der Hyaluronsäure, wie auch ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieser Hyaluronsäureassoziate (Komplexe) zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen mit antimikrobieller Aktivität und ein Verfahren zur Behandlung von Mikrobeninduzierten klinischen Bildern.
Es wurde nun festgestellt, dass Assoziate (Komplexe) der Hyaluronsäure, d. h. Zink- und Kobalthyaluronate, antimikrobielle Aktivität zeigen und dass sie insbesondere günstige antibakterielle und fungizide Wirkungen gegen aerobe und anaerobe Mikroorganismen aufweisen.
Assoziate der deprotonierten Hyaluronsäure mit 3d-Metallionen der 4. Periode des Periodensystems, wie z. B. Zink- und Kobalthyaluronate, mit einer heilenden Wirkung, insbesondere für krurale Geschwüre, Decubitus oder dergleichen werden in HU-PS 203 372 diskutiert.
Das als Hyaluronsäure bekannte Makromolekül, das in der Regel in Form seines Natriumsalzes auftritt, ist eine Verbindung, die seit mehr als 50 Jahren bekannt ist. Sie wurde zunächst von Meyer et al. (J. Biol. Chem. 107, 629 (1934); J. Biol. Chem. 114, 689 (1939)] beschrieben. Meyer isolierte die Hyaluronsäure unter sauren Bedingungen. Die Carboxylgruppen sind jedoch bei physiologischem pH-Wert dissoziiert und der Name des Polysaccharids ist Natriumhyaluronat, wenn das Umgebungskation Natrium ist. Die Strukturbestimmung wurde von Weissman et al. [J. Am. Chem. Soc. 76, 1753 (1954)] durchgeführt. Die Bestimmung des Umgebungskations ist nicht immer einfach, daher ist wie von Balázs (The Biology of Hyluronan 1989, John Wiley and Sons, Ciba Foundation Symposium, Seite 143) vorgeschlagen der allgemeine Name des Polysaccharids (sowohl der Hyaluronsäure als auch des Natriumhyaluronats) Hyaluronan.
Die Hyaluronansäure ist ein hochviskoses natives Glucosaminglycan, enthaltend alternierende β1-4-Glucosamin-Einheiten; ihr Molekulargewicht liegt zwischen 50.000 und einigen Millionen. Hyaluronsäure wird in Binde geweben aller Säugetiere gefunden. Sie tritt in höherer Konzentration in der Haut auf, im Glaskörper des Auges, in der Gewebeflüssigkeit, der Nabelschnur wie auch in Knorpelgewebe. Die Gewinnung der Hyaluronsäure ist eine alte Aufgabe, die Abtrennung und Verwendung von hochreiner Hyaluronsäure werden z. B. in den US-PSen 4 141 973 und 4 303 676 und in EP-PS 0 144 019 beschrieben.
Eine Anzahl von Referenzen, die die Verbindung zwischen Hyaluronsäure und Wundheilung betreffen, wird in der Literatur angetroffen. Gemäss Toole und Gross [B. P. Toole und Gross: "The extracellular matrix of the regenerating new limb: synthesis and removal of hyaluronate prior to differentiation", Dev. Biol. 25, 55–57 (1971)] ist die Hyaluronsäure als Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix für die Migration verschiedener Zelltypen verantwortlich. Die obigen Autoren stellten durch experimentelle Untersuchungen fest, dass die lokale Konzentration der Hyaluronsäure während der Wundheilung anstieg, wodurch die für die Geweberegeneration notwendigen zellulären Reaktionen stimuliert wurden. Zusätzlich zu dem obigen bestätigen auch andere experimentelle Ergebnisse, dass die Hyaluronsäure die wundheilenden physiologischen zellulären Ereignisse durch Bereitstellung der optimalen Bedingungen für die Migration und Proliferation aller Zellen, die an der Geweberegeneration beteiligt sind, reguliert.
Bis in die letzten Jahre wurde Hyaluronsäure als Natriumsalz in der Therapie angewendet – im wesentlichen in der Ophthalmologie, Dermatologie, Chirurgie, Gefässtherapie – und in der Kosmetik. Die Salze der Hyaluronsäure, gebildet mit Alkali-, Erdalkali-, Magnesium-, Aluminium-, Ammonium- und substituierten Ammoniumionen, können als Träger für die Unterstützung der Absorption von Arzneimitteln dienen (siehe BE-PS 904 547). Schwermetallsalze der Hyaluronsäure, unter diesen das Silbersalz, werden als Fungizide verwendet, während das Goldsalz für die Behandlung von Arthritis verwendet wird (siehe WO87/05517). Es ist jedoch bekannt, dass schwere nachteilige Wirkungen der Silber- und Goldverbindungen bestehen, d. h. ihre Wirkungen auf das Immunsystem, die hämatopoietischen Organe und das Nervensystem [M. Shinogi, S. Maeizumi: "Effect of preinduction of metallothionein on tissue distribution of silver and hepatic lipid peroxidation", Biol. Pharm. Bull. (Japan) 16, 372–374 (1993); C. Masson et al.: Rev. Med. Interne (France) 13, 225–232 (1992)].
US-PS 5 472 958 betrifft Hyaluronsäureassoziate (Komplexe) von 3d-Metallionen der 4. Periode des Periodensystems, insbesondere Zink- und Kobalthyaluronat. Es ist offenbart, dass Zusammensetzungen, enthaltend Zink- und Kobalthyaluronat, therapeutisch wirksam zur Beschleunigung der Epithelbildung von epitheldefizienten Körperoberflächen sind, für die Heilung von kruralen Geschwüren, Decubitus, zunächst nicht-heilenden Wunden, Verbrennungen, bestrahlungs- oder wärmeinduzierten Wunden, gewöhnlicher Akne und zusammengeballter Akne. Alle diese therapeutischen Verwendungen betreffen jedoch nicht die Behandlung mikrobieller Infektionen. Obwohl US-PS 5 472 958 zusätzlich einen in vitro-Test beschreibt, betreffend Zink- oder Kobalthyaluronatassoziat, enthaltend Lösungen, die künstlich mit gewählten Bakterien inokuliert sind, lehrt die Offenbarung der antibakteriellen Eigenschaft des Zink- und Kobalthyaluronatassoziats in vitro jedoch nicht die Verwendung von Zink- oder Kobalthyaluronatassoziat für die Behandlung bakterieller (mikrobieller) Infektionen in vivo.
Wir haben überraschend festgestellt, dass Hyaluronsäureassoziate, d. h. Zink- und Kobalthyaluronate, die für die Beschleunigung der Epithelbildung von epitheldefizienten Körperoberflächen für die Heilung von kruralen Geschwüren wie auch Decubitusgeschwüren, geeignet sind, eine signifikante antimikrobielle, insbesondere antibakterielle und fungizide Wirkung besitzen. Zusätzlich haben sie sich innerhalb der antibakteriellen Aktivität als aktiv auch gegen Helicobacter pylori-Bakterien erwiesen, die seit kurzem als verantwortlich für die Entwicklung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren angesehen werden.
Die antibakteriellen Wirkungen der Hyaluronsäureassoziate werden als überraschend angesehen, da angenommen werden kann, dass die wundheilenden Epithelbildung-unterstützenden Hyaluronsäureassoziate, die bis jetzt bekannt waren, auf dem oben diskutierten körperfreundlichen Verhalten der Hyaluronsäure während der Wundheilung basieren, jedoch kann die antimikrobielle Wirkung der Hyaluronsäureassoziate nicht daraus geschlossen werden.
Gemäss unseren Untersuchungen erwiesen sich Zink- und Kobaltassoziate der Hyaluronsäure als sehr aktiv gegen sowohl aerobe als auch anaerobe Bakterien, wie z. B. Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp., E. coli und Helicobacter pylori.
Da Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa die beiden Bakterienarten sind, die an Augeninfektionen beteiligt sind, ist die Tatsache, dass die Hyaluronatkomplexe gegen beide dieser Mikroorganismen wirksam sind, sehr wichtig, und die Verwendung der Hyaluronsäureassoziate in der Ophthalmologie scheint besonders vielversprechend zu sein.
Die intraokulare Verwendung von Natriumhyaluronat in der Ophthalmologie ist bekannt. Seit 1980 wird sie weitverbreitet im Fall von Cataract chirurgie, künstlichen Linsenimplantaten und Keratoplastie verwendet. Wenn sie der Vorkammer zugeführt wird, inhibiert sie deren Zusammenbruch während der Operation und schützt die empfindlichen Gewebe und Zellen. Nach dem chirurgischen Eingriff wird das Natriumhyaluronat aus dem Auge gewaschen, um einen Anstieg des Augendrucks zu vermeiden, der in einigen Fällen auftritt.
Natriumhyaluronat wird auch für die Behandlung des "trockenen Augen"-Syndroms verwendet [F. M. Polack et al.: "The treatment of the dry eyes with Na-hyaluronate", Cornea, 133–136 (1982)].
Die topische antibakterielle Behandlung von Augeninfektionen ist ein anderes wichtiges Verwendungsgebiet der Assoziate der vorliegenden Erfindung.
Aufgrund ihrer antibakteriellen Wirkung scheinen die Zink- und Kobalthyaluronatassoziate insbesondere nützlich in ophthalmologischen Therapeutika zu sein; insbesondere Zinkhyaluronat scheint sehr vielversprechend auf diesem Gebiet zu sein. Zusätzlich zu seinem Gleitmitteleffekt kann Zinkhyaluronat vorteilhaft als topisches antibakterielles Mittel in der Ophthalmologie verwendet werden; es kann jedoch auch aufgrund der antibakteriellen Wirkung in der Okularchirurgie als Kompetitor für Natriumhyaluronat verwendet werden, das seit 1980 weitverbreitet intraokular verwendet wird, um die auftretenden milden entzündlichen Reaktionen zu überwinden [K. L. Goa et al.: "Hyaluronic Acid, a Review of its Pharmacology and Use", Drugs 47, 536–566 (1994)] und um das Risiko einer Infektion während der Operation zu reduzieren. Die Rolle von Zink als essentielles Spurenelement im Auge ist seit langem anerkannt [D. A. Newsome, R. J. Rothman: "Zinc uptake in vitro by human retinal pigment epithelium", Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28, 795–799 (1987)]. Zinkhyaluronat hat den besonderen Vorteil, dass die Abnahme von Zink, die möglicherweise während Augenoperationen auftreten kann, durch seine Verwendung vermieden werden kann. Insbesondere kann die Hyaluronsäure als ein Polyanion Kationen durch Auswaschen nach der Operation entziehen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass Zink, das auch durch eine koordinative Bindung an Hyaluronat gebunden ist, im Auge abnehmen kann. Dieses Phänomen kann durch die Verwendung von Zinkhyaluronat eliminiert werden.
Es ist bekannt, dass die bakterielle Kontamination des Auges ein schwerwiegendes Gesundheitsproblem darstellt. Der häufigste Kontaminant gehört zur Staphylococcus-Gruppe. Weniger häufiger ist der Kontaminant Pseudomonas aeruginosa, der für das Auge auch sehr gefährlich ist. Die Infektion des Auges mit diesen Bakterien kann in einer 24- bis 48-stündigen Zeitspanne zu vollständiger Blindheit führen. Die Infektionen des Auges werden häufig durch kontaminierte ophthalmologische Lösungen (Augentropfen, Lösungen für die Lagerung von Kontaktlinsen oder dergleichen) ausgelöst. Solche kontaminierten ophthalmologischen Lösungen treten in Beratungsräumen, Kliniken und sehr häufig bei der Verwendung zuhause auf. Die kontaminierende Mikrobe gehört besonders häufig zur Staphylococcus-Gruppe, jedoch kann auch der seltenere, aber gefährlichere Pseudomonas aeruginosa schnell in ophthalmologischen Lösungen wachsen (Remington's Ophthalmic Preservatives, Kapitel 86, 1588). So kann die Verwendung von Zink- und Kobalthyaluronatassoziaten in der Ophthalmologie durch ihr starke Aktivität gegen beide Arten der obigen Mikroorganismen sehr wichtig sein.
Die antimikrobielle Wirkung der Verbindungen wurde durch mikrobiologische Untersuchungen bestätigt. Zinkhyaluronat- und Kobalthyaluronatlösungen gemäss HU-PS 203 372 wurden für diese Überprüfungen verwendet, während Natriumhyaluronatlösungen als Referenzlösungen dienten.
Das folgende Beispiel 1 zeigt die Herstellung einer 0,5 %-igen Zinkhyaluronatlösung. Wenn nicht anders angegeben, sind die hier angegebenen Prozentzahlen immer Gewichts/Volumen-Werte.
Lösungen mit einer Konzentration von 0,1 bzw. 0,2% wurden durch Verdünnung von 0,5 %-igen Zinkhyaluronatlösungen mit destilliertem Wasser in einer Qualität gemäss dem Beispiel erhalten.
BEISPIEL 1
Herstellung von 100 ml 0,5 %-iger Zinkhyaluronatlösung:
Die Eigenschaften des Natriumhyaluronats, das für die Herstellung der Lösung verwendet wurde, sind die folgenden:

Molekulargewicht: 1.000.000 Dalton

Proteingehalt: 0,045 1%

UV-Absorption: A_{257 nm} 0,085 1% A_{280 nm} 0,050 C → O

Viskosität: η_25°C = 17,25 dl/g

Hyaluronsäuregehalt: 99,3%
Die unten beschriebenen Arbeitsschritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Nach Abwiegen von 0,50 g Natriumhyaluronat in einen 100 ml-Kolben wurden 12,50 ml Zinkchloridlösung mit einer Konzentration von 0,10 mol/l, hergestellt mit zweifach destilliertem Wasser (Wasser zur Verwendung für Injektionen, pyrogenfrei, steril) zugefügt, dann wurde das Volumen mit zweifach destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt. Ein Schwellen über Nacht wird ermöglicht, dann wird durch Schütteln aufgelöst und mit zweifach destilliertem Wasser aufgefüllt. Nach Filtern der Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengrösse von 0,45 μm wird eine Lösung, enthaltend 0,50% Zinkhyaluronat, erhalten.
BEISPIEL 2
Herstellung von 100 ml 0,5 %-iger Natriumhyaluronatlösung:
0,50 g Natriumhyaluronat, verwendet in Beispiel 1, wird in 100 ml zweifach destilliertem Wasser (Wasser zur Verwendung für Injektionen, pyrogenfrei, steril) wie zuvor beschrieben gelöst, um eine 0,5 %-ige Natriumhyaluronatlösung zu erhalten. Lösungen mit 0,1 bzw. 0,2% werden hergestellt durch Verdünnung der 0,5 %-igen Lösung mit destilliertem Wasser der obigen Qualität.
Erste Versuchsreihe:

Zink- und Natriumhyaluronatlösungen mit 0,2% (erhalten durch Verdünnung der Lösungen mit 0,5%, hergestellt gemäss den Beispielen 1 und 2) wurden künstlich durch identische Keimzahlen unterschiedlicher Testorganismen infiziert und die Veränderung der Keimzahl wurde gegen die Zeit aufgetragen. Die Keimzahl wurde zu einem Zeitpunkt durch ein Plattierungsverfahren bestimmt. Die Überprüfung wurde bei Schimmel visuell durchgeführt und durch Verwendung einer automatisierten Kolonienzählvorrichtung für Bakterien und Pilze.

Verwendetes Medium:	Soja-Kaseinagar (Caso-Agar – Merck). Mikroorganismen, aufgeführt in der National Strain Collection of National Institute of Public Health (HNCMB) wurden aus Testorganismen verwendet.
Verwendete Mikroorganismen:	Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. Escherichia coli, Salmonella sp. Candida albicans

Aspergillus niger

Startzahl der Testorganismen: ∑ 10⁶/ml
Zahl der parallelen Experimente: 3

Angewendete Lösungen:

1. – wässrige Lösung aus Zinkhyaluronat mit 0,2%
2. – wässrige Lösung aus Natriumhyaluronat mit 0,2%

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt.
Aus den in den Tabellen 1 und 2 zusammengefassten Ergebnissen kann abgeleitet werden, dass ein essentieller Unterschied in den antimikrobiellen Wirkungen nach 24 Stunden auftrat. Die 0,2 %-ige Zinkhyaluronatlösung induzierte eine Reduktion in mehrfacher Grössenordnung einer Vielzahl der untersuchten Testorganismen, während die Zahl der Testorganismen in der Natriumhyaluronatlösung nicht deutlich verändert wurde.
Zweite Versuchsreihe:
Um die antimikrobielle Wirkung von Zinkhyaluronat zu beweisen, wurden die Experimente weiterhin auf Lösungen ausgedehnt, die andere Konzentrationen als 0,2% aufwiesen, zusammen mit verschiedenen Verlängerungen der Testzeit. Die Wirkungen von 0,1% Zinkhyaluronat- bzw. Natriumhyaluronatlösungen auf drei unterschiedliche Testorganismen sind in Tabelle 3 angegeben.
TABELLE 3
Es kann festgestellt werden, dass bei den Experimenten mit Zinkhyaluronat die Zahl von Staphylococcus- und Salmonella-Testorganismen praktisch in 48 Stunden auf Null reduziert wurde, während die Ergebnisse der Untersuchungen mit Natriumhyaluronat im wesentlichen in derselben Grössenordnung verblieben. Ein späterer Wirkungsbeginn wurde bei Pseudomonas aeruginosa beobachtet, wo eine signifikante Abnahme erst am zweiten Tag auftrat.
Dritte Versuchsreihe:
Aufgrund der ophthalmologischen Wichtigkeit von Pseudomonas aeruginosa wurden die Wirkungen von Zinkhyaluronatlösungen unterschiedlicher Konzentrationen auf Pseudomonas aeruginosa im Vergleich mit Natriumhyaluronatlösungen derselben Konzentrationen untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 4 angegeben.
TABELLE 4 Wirkung von Zinkhyaluronat auf Pseudomonas aeruginosa
TABELLE 5 Wirkung von Natriumhyaluronat auf Pseudomonas aeruginosa
Aus den Ergebnissen der Tabellen ergibt sich ein vorteilhaftes Bild: Die Zinkhyaluronatlösungen sind nämlich eindeutig wirksamer als Natriumhyaluronatlösungen und die 0,1 %-ige Zinkhyaluronatlösung zeigt bereits dieselbe Aktivität wie die 0,2 %-ige bzw. die 0,5 %-ige Zinkhyaluronatlösung. Basierend auf diesem Ergebnis kann eine effektive Zusammensetzung für die externe Verwendung entwickelt werden.
Die antibakterielle Wirkung von Kobalt(II)hyaluronat wurde ebenfalls untersucht. Die Herstellung der Kobalthyaluronatlösung ist in Beispiel 3 beschrieben.
BEISPIEL 3
Herstellung einer 0,1 %-igen Kobalthyaluronatlösung:
Nach Abwiegen von 0,10 g Natriumhyaluronat gemäss Beispiel 1 in einen 100 ml-Kolben wurden 2,50 ml Kobaltchloridlösung mit einer Konzentration von 0,10 ml/l, hergestellt mit zweifach destilliertem Wasser (Wasser zur Verwendung für Injektionen, pyrogenfrei, steril) zugefügt, dann wurde das Volumen mit zweifach destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt. Dieses durfte über nacht schwellen, wurde dann durch Schütteln gelöst und schliesslich mit zweifach destilliertem Wasser aufgefüllt. Nach Filtern der Lösung durch einen Membranfilter mit einer Porengrösse von 0,45 μm wurde eine Kobalthyaluronatlösung mit einer Konzentration von 0,10% erhalten.
Vierte Versuchsreihe:
Die mikrobiologischen Untersuchungen wurden auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben durchgeführt, ausser dass anstelle von Salmonella sp. E. coli-Bakterien verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
TABELLE 6
Aus den obigen Ergebnissen der Tabelle 6 wird klar, dass die Kobalthyaluronatlösung eine ähnliche Aktivität wie die Zinkhyaluronatlösungen auf beide untersuchten Testorganismen zeigt, während die Vergleichs-Natriumhyaluronatlösungen sich als inaktiv erwiesen, auch wenn die Abweichungen in den Messverfahren in die Betrachtungen mit einbezogen werden.
Fünfte Versuchsreihe:
Die antibakterielle Wirkung des Zinkhyaluronatassoziats kann durch die folgenden Werte einer minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) und mikrobiziden Konzentrationen (CID) im Vergleich mit den korrespondierenden Werten für Natriumhyaluronat gekennzeichnet werden.
MIC- und CID-Werte werden durch Verwendung von Lösungen mit einer 0,2 %-igen Konzentration bestimmt. Die Bestimmungen wurden auf bekannte Weise durchgeführt. Eine serielle Verdünnung wurde aus den zu untersuchenden Substanzen hergestellt und diese Lösungen wurden künstlich durch die korrespondierenden Verdünnungen der gewählten Testorganismen infiziert.
Nach Inkubation bei geeigneter Temperatur für eine geeignete Zeit wurden die Konzentrationsreihen visuell bewertet und die minimale Konzentration wurde bestimmt, die das Wachstum der Mikroorganismen inhibierte (MIC-Wert) oder den Tod der Mikroorganismen induzierte (CID-Wert). Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
TABELLE 7 MIC- und CID-Werte von Zinkhyaluronat (μg/ml)
Die 0,2 %-ige Natriumhyaluronatlösung übte selbst in einer Konzentration von 2.000 μg/ml keine inhibitorische Wirkung auf irgendeinen der Testorganismen aus. Daher konnten die MIC-Werte nicht bestimmt werden.
Aus den Ergebnissen der obigen Tabelle 7 ist klar, dass die MIC-werte von Zinkhyaluronat eine deutliche mikrobiologische Wirkung der Verbindung anzeigen, die um einige Grössenordnungen besser ist als die von Natriumhyaluronat.
Sechste Versuchsreihe:
Die Möglichkeit einer vielversprechenden ophthalmologischen Verwendung der Hyaluronsäureassoziate benötigt eine gute mikrobielle Stabilität der Zusammensetzungen, nämlich eine geeignete Resistenz gegen eine Infektion durch verschiedene Mikroorganismen. Ausgedehnte Untersuchungen wurden für die Bestimmung der mikrobiologischen Stabilität der Zink- und Kobalthyaluronatlösungen im Vergleich mit dem gewöhnlich in der Ophthalmologie verwendeten Natriumhyaluronat durchgeführt. Es wurde auch untersucht, ob es notwendig war, die Lösungen, enthaltend Zinkhyaluronat, durch Verwendung eines Konservierungsmittels zu konservieren.
Diese Untersuchungen wurden gemäss dem Artikel der USP XXII Ausgabe (Seite 1478) mit dem Titel "Antimicrobial preservatives effectiveness" durchgeführt. Das Prinzip der Untersuchung war das folgende. Die zu untersuchende Substanz wurde künstlich durch verschiedene Testorganismen infiziert und die Veränderung der Zahl der koloniebildenden Einheiten wurde als Funktion der Zeit überwacht. Mikroben, eingetragen in der National Strain Collection des National Institute of Public Health (HNCMB) wurden als Testorganismen verwendet. Die Untersuchungen wurden mit Zink- und Natrium hyaluronatlösungen unterschiedlicher Konzentrationen in Gegenwart oder ohne Konservierungsmittel durchgeführt.
Die Zahl der koloniebildenden Einheiten (Zahl der Keime) der Proben wurden durch Ausplattier (Plattenschimmel)-Verfahren bestimmt. Die Bewertung wurde unter Verwendung einer automatisierten Koloniezählvorrichtung für Bakterien und Pilze oder visuell in bezug auf Schimmel durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen dargestellt. Jedes Ergebnis bedeutet den durchschnittlichen Wert von drei parallelen Proben, ausgedrückt als Koloniezahl/ml.
Gemäss den Anforderungen, beschrieben in USP XXII, und den allgemeinen Anforderungen ist eine Substanz hinreichend konserviert, wenn die Zahl der durch künstliche Infektion eingeführten Bakterien auf 99% während 14 Tagen reduziert wird; wenn selbst während 14 Tagen keine Testorganismen propagieren, wie auch dann, wenn kein temporäres Wachstum von irgendeinem Testorganismus während 28 Untersuchungstagen beobachtet wird.
Aus den Ergebnissen der Untersuchung kann abgeleitet werden:

1. Die mikrobiologische Stabilität einer 0,1 %-igen Zinkhyaluronatlösung entspricht den Anforderungen der USP XXII bei Betrachtung von 4 Organismen (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans) von 5 Mikroorganismen nicht nur das nötige Ableben zeigten, sondern dass sogar keine lebenden Keime in einer Probe nachgewiesen werden konnten, die am 28. Tag genommen wurde. Das Verhalten von Aspergillus niger ist regulär und zeigt sogar eine Reduktion um zwei Grössenordnungen.
2. Die mikrobiologische Stabilität der 0,2 %-igen Zinkhyaluronatlösung ist ähnlich der Stabilität der 0,1 %-igen Zinkhyaluronatlösung und entspricht daher den Anforderungen der USP XXII.
3. Die Stabilität der 0,5 %-igen Zinkhyaluronatlösung entspricht erwartungsgemäss den Anforderungen der USP XXII. Tatsächlich zeigen die Ergebnisse an, dass die Stabilität durch Erhöhung der Zinkhyaluronatkonzentration ansteigt.
4. Die Stabilitätseigenschaften der Lösung, enthaltend 0,5% Zinkhyaluronat und 0,1% Kaliumsorbat, sind durch das Kaliumsorbat-Konservierungsmittel ausreichend jedoch nicht deutlich (wesentlich) verbessert.
5. Die 0,5 %-ige Natriumhyaluronatlösung, enthaltend 0,1% Kaliumsorbat, entspricht in allen Fällen der überprüften Mikroorganismen ebenfalls den Anforderungen der USP XXII.

Aus diesen Ergebnissen kann der sehr wichtige Schluss gezogen werden, dass für die Zinkhyaluronatlösung gegenüber dem Natriumhyaluronat, das selbst in Gegenwart des Konservierungsmittels eine niedrigere Stabilität als die Zinkhyaluronatlösung zeigt, kein Konservierungsmittel nötig ist. Ein Konservierungsmittel ist für die Natriumhyaluronatlösung unbedingt nötig, da diese sonst leicht infiziert werden kann.
Diese Erkenntnis hat eine grosse Bedeutung, da Konservierungsmittel häufig eine Allergie-induzierende Wirkung ausüben können und daher ihre Eliminierung die Verwendung von Zinkhyaluronat insbesondere in der Ophthalmologie als sehr hoffnungsvoll erscheinen lässt.
Siebte Versuchsreihe:
Die Kennzeichnung der mikrobiologischen Stabilität von Kobalthyaluronat ist in Tabelle 13 dargestellt.
TABELLE 13 Mikrobiologische Stabilität einer 0,1 %-igen Kobalthyaluronatlösung
Wie aus der Tabelle ersichtlich, ist die mikrobiologische Stabilität einer 0,1 %-igen Kobalthyaluronatlösung gegen Pseudomonas aeruginosa-Bakterien ähnlich gut wie die der 0,1 %-igen Zinkhyaluronatlösung.
Es kann beobachtet werden, dass eine fast sofortige Wirkung nach der Inokulierung auftritt. Nach Beendigung eines 72-stündigen Versuchs wurde eine Sterilitätsüberprüfung mit dem Ergebnis durchgeführt, dass die Wirkung von Kobalthyaluronat auf die untersuchten Bakterien in ihrem Charakter nicht statisch ist, sondern eine bakterizide Wirkung darstellt.
Die Herstellung von ophthalmologischen bzw. dermatologischen Zusammensetzungen für die externe Verwendung wird in den folgenden Beispielen beschrieben.
BEISPIEL 4
Augentropfen, enthaltend Zinkhyaluronat:
Herstellung von 100 ml Augentropfen, enthaltend 0,1% Zinkhyaluronat.
Natriumhyaluronat, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde für die Herstellung von Augentropfen verwendet.
Nach Abwiegen von 0,10 g Natriumhyaluronat mit "Purum Pulvis" (reines Pulver)-Qualität in einen 100 ml-Kolben wurden 1,87 ml Zinkchloridlösung mit einer Konzentration von 0,10 mol/l und 27,50 ml einer Sorbitlösung mit einer Konzentration von 1,00 mol/l zugefügt. (Die Lösungen wurden mit zweifach destilliertem Wasser hergestellt). Darauffolgend wurde das Volumen mit zweifach destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt. Dies darf über Nacht schwellen, wird dann durch Schütteln gelöst und bis zur Markierung mit zweifach destilliertem Wasser aufgefüllt. Schliesslich wird die Lösung durch einen Membranfilter gefiltert (Porengrösse: 0,45 μm).
BEISPIEL 5
Dermatologische Zusammensetzung, enthaltend Zinkhyaluronat:
Herstellung von 100 g eines Gels, enthaltend 0,2% Zinkhyaluronat.
Eigenschaften von Natriumhyaluronat, verwendet zur Herstellung des Gels:

Molekulargewicht: 800.000 Dalton

Proteingehalt: 0,094% 1%

UV-Absorption: A_{257 nm} 1% A_{280 nm} C → O

Viskosität: η_25°C = 14,5 dl/g

Hyaluronsäuregehalt: 95,2%
Nach Lösen von 0,2 g Natriumhyaluronat in etwa 30 ml destilliertem Wasser wurden 5,0 ml einer 0,1 molaren Zinkchloridlösung zugefügt.
1,0 g Carbopol 934-Gelierungs (gelbildendes)-Mittel wird mit 40 ml destilliertem Wasser gemischt, für 1 bis 1,5 Stunden gerührt, für 10 bis 12 Stunden gequollen und dann werden 1,0 ml einer 20 %-igen Natriumhydroxidlösung zugefügt.
Die zuvor hergestellte Zinkhyaluronatlösung wird durch einen Filter mit einer Porengrösse von 0,45 μm filtriert, unter kontinuierlichem Rühren auf das Gel gegossen dann mit destilliertem Wasser auf 100 g aufgefüllt.
Die für Pilz- und Schimmelarten erhaltenen guten Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen, wie in den Tabellen 8 bis 12 dargestellt, zeigen, dass Zinkhyaluronat nicht nur eine antibakterielle, sondern auch eine signifikante Anti-Pilz-Wirkung zeigt.
Achte Versuchsreihe:
Die Wirksamkeit der Verbindungen auf Helicobacter pylori-Bakterien hat auch eine ähnlich grosse Bedeutung. Basierend auf dieser Wirkung sind diese Verbindungen nützlich zur Behandlung oder Prophylaxe der Entwicklung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren und insbesondere zur Prophylaxe einer erneuten Infektion nach der Heilung.
Untersuchung der Wirksamkeit gegen Helicobacter pylori-Bakterien:
Diese Untersuchungen wurden durchgeführt unter Verwendung einer 1,0 Gew./vol.-%-igen Zinkhyaluronatlösung auf Helicobacter pylori-Stämme, die aus gastrischen Biopsieproben von Patienten, die an verschiedenen Ge schwüren litten, kultiviert wurden. Eine 1 %-ige Lösung von De-Nol (kolloidales Wismutsubcitrat) wurde als Referenzsubstanz verwendet. Ein Agar-Kulturmedium (Nährmedium), supplementiert mit 10 %-igem Rinderblut, wurde für die Untersuchungen verwendet. Platten ohne zu testende Verbindung wurden als Kontrolle verwendet. Die inokulierten Platten wurden 3 bis 5 Tage bei 37°C in gasförmiger Umgebung, enthaltend 5% Sauerstoff und 7 bis 8% Kohlendioxid, inkubiert. Der Wert der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) wurde als minimale Konzentration der Substanzen betrachtet, die die Propagierung von Bakterien, die auf den Kontrollplatten gut wuchsen, vollständig inhibierte. Die MIC-Werte von Zinkhyaluronat bzw. De-Nol, gemessen an den überprüften Stämmen, sind in Tabelle 14 dargestellt.
TABELLE 14
Aus den in der Tabelle dargestellten Ergebnissen ist klar, dass die in vitro-Aktivität von Zinkhyaluronat auf Helicobacter pylori vergleichbar ist mit der Aktivität von De-Nol, das für die Therapie verwendet wird. Diese Tatsache ist betrachtenswert, da De-Nol eine wismuthaltige Zusammensetzung mit Nebenwirkungen ist (Toxizitätsprobleme; zusätzlich ist ihre Einnahme für den Patienten unangenehm), die nicht vernachlässigt werden können, während solche Nebenwirkungen vermutlich nicht erwartet werden können, wenn Zinkhyaluronat verwendet wird.

Claims

Verwendung von Zink- oder Kobalthyaluronatassoziat (Komplex) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mikrobiellen Infektionen.
Verwendung gemäss Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von bakteriellen Infektionen.
Verwendung gemäss Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Pilzinfektionen.
Verwendung gemäss Anspruch 1 oder 2, worin die Infektionen hervorgerufen werden durch anaerobe Bakterien.
Verwendung gemäss Anspruch 4, worin die anaeroben Bakterien Helicobacter pylori umfassen.
Verwendung gemäss Anspruch 5, worin die Behandlung die Vorbeugung der Wiederinfektion nach der Heilung von Helicobacter pylori-induzierten Magengeschwüren und Zwölffingerdarmgeschwüren einschliesst.