WO2003037356A1 - Pharmazeutische zusammensetzung, einen wachstumsfaktor und/oder ein zytokin und ein antiseptisches biguanid umfassend - Google Patents

Pharmazeutische zusammensetzung, einen wachstumsfaktor und/oder ein zytokin und ein antiseptisches biguanid umfassend Download PDF

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WO2003037356A1
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wound
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pdgf
biguanide
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Wolfram Eichner
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Fresenius Kabi Deutschland Gmbh
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics

Definitions

  • a pharmaceutical composition comprising a growth factor and / or a cytokine and an antiseptic biguanide
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a growth factor and / or a cytokine and an antiseptic biguanide.
  • the present invention further relates to the use of a corresponding composition for treating wounds.
  • PHMB poiy (hexamethylene) biguanide
  • PHMB has been mixed with various other active ingredients, as well as carriers and auxiliaries. From DE 3 537 627 it is known, for example, that a combination of PHMB with polyethylene glycol can be used as a disinfectant and local antiseptic.
  • WO97 / 00076 relates to the production of pharmaceutical compositions for the topical treatment of microbial infections, the pharmaceutical compositions containing a PHMB salt, for example the hydrochloride salt.
  • EP 450 117 uses a lactate-free Ringer solution which contains 0.1-0.2% of a concentrate from a 20% aqueous PHMB hydrochloride solution.
  • PHMB can also be used to heal wounds that are free from infections, since the active substance has a granulation-promoting activity and thus itself has a healing effect.
  • PHMB is also used in other areas as a disinfectant, for example for cleaning and disinfecting rooms and equipment in the food industry, for stabilizing beverages, and for fighting algae and bacterial growth in swimming pools (Wall Reviewss, KH, practice of sterilization, disinfection , Preservation; germ identification - industrial hygiene; Thieme 1995).
  • Polyhexanide acts on bacterial cells by triggering changes in permeability of the cell wall and charge shifts in the cell membrane, inhibiting membrane-constant metabolic processes and causing the coagulation of cell contents (Davies, et al. J. appl. Bact. (1969) 32, 233- 243; Broxton, Woodcock et al. Microbios. (1983) 40. 187-193; Broxton, Woodcock et al. Microbios. (1984) 41. 15-22; Broxton, Woodcock et al. J. appl. Bact.
  • Non-infected, chronic wounds are treated with growth factors, for example.
  • Growth factors are polypeptides that interact with certain cell receptors and can stimulate cell division.
  • the wound healing process in particular is controlled by growth factors, which have mitogenic properties, for example. and stimulate cellular poliferation, have angiogenic properties and stimulate the growth of new blood vessels, and control the production and degradation of the extracellular matrix.
  • growth factors which have mitogenic properties, for example. and stimulate cellular poliferation, have angiogenic properties and stimulate the growth of new blood vessels, and control the production and degradation of the extracellular matrix.
  • the growth factor PDGF (“platelet derived growth factor”) obtained from platelets is present as an essential growth factor in serum, but not in plasma (Antoniades et al., Processings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1975, vol. 72: 2635-2639; and Ross and Vogel, Cell, 1978, vol. 14: 203-210).
  • PDGF is mainly secreted by thrombocytes, but also by other cell types (Pierce et al., Journal of Cellular Biochemistry, 1991, Vol. 45: 319-326) and acts as a mitogen on the cells of the connective tissue and on most mesenchy cells - paint origin (Pierce and Mustoe, Annual Review of Medicin, 1995, Vol. 46: 467-481).
  • a and B Three different isoforms of PDGF have been isolated, each homo- or heterodimeric combinations of two different peptide chains, designated A and B (Meyer-Ingold and Eichner, Cell Biology International, 1995, Vol. 19, 389-398).
  • Recombinant PDGF-BB is highly active in vitro, but it has been shown that in vivo activity, that is to say an effect which promotes wound healing, is difficult to achieve. This is primarily due to the complex situation in the wound in which for example, proteases are present in a relatively high concentration, which attack and inhibit PDGF.
  • a protease inhibitor has therefore been applied together with the growth factor in order to prevent proteolytic degradation of the growth factor (Wlaschek et al., Br. J. Deratol., 137 (1997), 646; Kiyohara et al ., Biol. Pharm. Bull., 16 (1993), 73-76; Kiyohara et al., J. Pharmacobiodyn, 14 (1993), 47-52).
  • Gels which contain PDGF as the active ingredient and which are suitable for use as a wound dressing are described, for example, in WO 97/12601.
  • the gels consist of a pharmaceutically acceptable cellulose polymer and, in addition to the PDGF, can contain a preservative and, as a stabilizer, a charged group.
  • Combinations of different growth factors or combinations of growth factors with other active substances have also been proposed in the prior art for wound treatment.
  • WO 92/16181 discloses a pharmaceutical composition which contains PDGF and dexamethasone, and their use for tissue regeneration.
  • growth factors are not used to treat infected wounds, since the growth factor as a protein can itself be a source of nutrients for the microorganisms.
  • the object of the present invention is to provide pharmaceutical compositions which enable improved wound healing, in particular improved healing of infected wounds.
  • compositions comprising a growth factor and / or a cytokine and an antiseptic biguanide.
  • a growth factor and / or a cytokine and an antiseptic biguanide.
  • the present invention thus provides an advantageous combination of active ingredients and their use for the treatment of acute and chronic wounds.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can contain one or more of the known growth factors and / or one or more of the known cytokines.
  • the corresponding selection can easily be made by the person skilled in the art depending on the planned medical use.
  • the use of PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, factor XIII, CSF, TGF, TGF-ß, EGF, TNF, somatomedin and / or a lymphokine is preferred.
  • a combination of different growth factors, different isoforms of a growth factor, different cytokines or mixtures thereof can of course also be used.
  • the use of the growth factor PDGF-BB is particularly preferred.
  • Biguanides are compounds that are derived from biguanide (C 2 H 7 N 5 ), especially its polymers.
  • Antiseptic biguanides are compounds that have an antimicrobial effect, that is to say act as bacteriostatics or preferably as bactericides.
  • the compounds preferably have a broad activity against many bacteria and can be characterized by an antimicrobial activity against E. coli of at least 0.5 ⁇ g / ml, preferably at least 12 or at least 25 ⁇ g / ml (minimum microbicidal concentration or MMK; measured in the suspension test ).
  • the MMK can reach maximum values of up to 1000 or 2000 ⁇ g / ml.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises a poly (imino [imidocarbonyl] iminopolymethylene), the use of poly (hexame- thylene) biguanide (PHMB), which is also known as polyhexanide, is particularly preferred as an antiseptic biguanide.
  • PHMB poly (hexame- thylene) biguanide
  • the compounds can be present as racemates or pure isoforms.
  • the concentration of the growth factor and the biguanide in the pharmaceutical composition according to the invention can be selected by the person skilled in the art by simple experiments depending on the intended use, in particular depending on the type of formulation of the composition (cream, gel, etc.). According to the invention, it is preferred that the growth factor is present in a concentration of 1.0 ⁇ g / g to 700 ⁇ g / g of pharmaceutical composition, a concentration of 50 to 90 ⁇ g / g being preferred.
  • the biguanide can be present, for example, in a concentration of 0.0001 to 0.1% by weight, based on the weight of the pharmaceutical composition, a concentration of 0.0005 to 0.006% by weight being preferred.
  • the biguanide can have any molecular weight distribution, an average molecular weight distribution up to 15,000, in particular in the range from 1,000 to 8,000, being preferred. An average molecular weight of 2,800 is particularly preferred.
  • the type of pharmaceutical composition according to the invention depends on the intended medical use.
  • the composition can be formulated as a cream, oil, oil in water or water in oil emulsion, plaster, wound dressing or gel.
  • the preparation of a gel according to the invention is shown in Example 4.
  • composition according to the invention can be used for the treatment of chronic or acute wounds, soft tissue wounds, in particular for the treatment of infected wounds or for the treatment of the consequences of a surgical intervention.
  • compositions according to the invention are particularly suitable for chronic, infected and difficult to heal wounds, such as diabetic ulcer, especially on the foot.
  • the present invention further relates to processes for producing a pharmaceutical composition, in which a growth factor and an antiseptic biguanide are mixed with pharmaceutically acceptable carriers and / or auxiliaries.
  • Fig. 1 PHMB cytotoxicity on Balbc-3T3 cells
  • Fig. 2 PHMB cytotoxicity on HUVE cells
  • Fig. 4 Mitogenic activity of the PDGF after incubation with different concentrations of Lavasept.
  • the cytotoxic effect of Lavasept was tested on Balbc-3T3 fibroblasts (mouse cell line) and examined. For this, cells were seeded in a 96-well microtiter plate and contacted with different concentrations of Lavasept (0.001%, 0.002%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% and 0.2%; these and all The following percentages relate to% by volume; all dilutions were made in BSA-containing PBS buffer, "phosphate buffered saline", pH 7.4) and the cytotoxicity was examined by microscopic and macroscopic observation of the cells and the color of the medium.
  • Lavasept Lavasept concentrate No.4927031, batch IBX 00301.2001, Fresenius
  • Lavasept cytotoxicity on Balbc-3T3 mouse cells and human vascular endothelial cells (“human umbelical vein endothelial cells", HUVE cells) was also determined using the sensitive MTT test.
  • the MTT test is based on the reduction of the dye 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (thiazolyl blue), which leads to a change in color (yellow to violet).
  • the reduction occurs in living cells through active mitochondrial dehydrogenases; A corresponding conversion of the dye is not possible in dead cells.
  • a photometric measurement allows the percentage of living cells to be determined (cf. Shi et al., J. Immunol. Methods, 164 (1993), 149-154).
  • Balbc-3T3 fibroblasts are excellently stimulated with PDGF and are known in the art as a robust cell type. In contrast, human endothelial cells are much more sensitive and demanding to cultivate and pass through.
  • the stability of recombinant, human PDGF-AB in the presence of Lavasept was examined.
  • the protein was incubated with different Lavasept concentrations.
  • the integrity of the protein was then determined using SDS gel electrophoresis and the activity was determined using the established mitogen assay.
  • the PDGF-AB was obtained from Strathmann (code PDGF-AB-10) and was reconstituted in PBS according to the manufacturer. In addition, an excess of BSA was added. The BSA is intended to protect the growth factor as a carrier protein at low protein concentrations.
  • the protein concentration of the reconstituted PDGF was 100 ⁇ g / ml.
  • PDGF was diluted with Lavasept and adjusted to a concentration of 50 ⁇ g / ml (500 ng / ⁇ l). The final concentration of the Lavasept was 0.0%, 0.005%, 0.025%, 0.05% and 0.25%.
  • the concentration of the growth factor was a constant 50 ⁇ g / ml.
  • the growth factor / Lavasept solution was stored at -20 ° C for at least one and at most eight weeks.
  • FIG. 3 shows, PDGF-AB is very stable under the chosen conditions. Incubation of the PDGF with 0.005% up to 0.05% Lavasept does not lead to a degradation of the protein. At a final concentration of 0.25% Lavasept, no degradation products can be seen, but the protein band is somewhat weaker, which may be due to a partial breakdown. Overall, however, it can be clearly seen that the selected concentration range has no significant influence on the stability of the protein. This result is also confirmed by the mitogenicity test.
  • FIG. 3 shows, PDGF-AB is very stable under the chosen conditions. Incubation of the PDGF with 0.005% up to 0.05% Lavasept does not lead to a degradation of the protein. At a final concentration of 0.25% Lavasept, no degradation products can be seen, but the protein band is somewhat weaker, which may be due to a partial breakdown. Overall, however, it can be clearly seen that the selected concentration range has no significant influence on the stability of the protein. This result is also confirmed by the mitogenicity test.
  • FIG. 4 shows the uptake of 3 H-tymidine by Balbc-3T3 cells in the presence of a combination of PDGF-AB and different concentrations of the Lavasept.
  • the growth factor was pre-incubated with Lavasept in the range of 0.01% to 0.5% and diluted to a final concentration before the start of the test, which is not cytotoxic, but at which the growth factor is detectable (10-25 ng / ml).
  • FIG. 4 shows, the mixture of PDGF with Lavasept has no negative influence on the activity of the growth factor.
  • Ringer's solution is placed in the batch container; the glycerin is stirred in.
  • Lavasept concentrate is stirred in and the mixture is " heated to 40-70 ° C. to avoid lump formation when sprinkling in the hydroxyethyl cellulose.
  • Powdery hydroxyethyl cellulose and PDGF are slowly added with stirring. The mixture is homogenized until the gel is clear.
  • the gel is filled into suitable tubes, syringes etc., which are provided with a corresponding label, whereby only completely clear gel is used!

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Waschstumsfaktor und/oder ein Zytokin und ein antiseptisches Biguanid.

Description

Pharmazeutische Zusammensetzung, einen Wachstumsfaktor und/oder ein Zytokin und ein antiseptisches Biguanid umfassend
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Wachstumsfaktor und/oder ein Zytokin und ein antiseptisches Biguanid umfaßt. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer entsprechenden Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden.
Die Behandlung von Wunden und WundheilungsStörungen, beispielsweise nach schweren chirurgischen Eingriffen, sowie bei aktuten oder chronischen Wundinfektionen ist ein akutes Problem in klinischen Alltag. In den letzten Jahren wurde dieses Problem durch das Aufkommen infektiöser Mikroorganismen mit Resistenzen gegen eine Vielzahl von Antibiotika wesentlich verschärft.
Zur Behandlung entsprechender Wunden werden im Stand der Technik verschiedene lokale Antiseptika und Antibiotika verwendet. Das grundsätzliche Problem jeder antiseptischen Wundbehandlung besteht jedoch darin, da'ss chemische Substanzen mit guter bakterizider Wirkung in der Regel auch zytotoxisch wirken und die Wundheilung aus diesem Grund beeinträchtigen. Die Spülung von Wunden mit antiseptischen Lösungen, beispielsweise mit chlorhaltigen Lösungen, organischen Silberverbindungen, alkoholische Gemische mit quarternären Ammoniumverbindungen oder Iodophoren, konnte sich aufgrund der Nebenwirkungen zunächst im klinischen Alltag nicht durchsetzen (Hernandez-Richter, H.J., Struck, H. : Die Wundheilung, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1970) .
Im Rahmen einer größeren Studie wurde schließlich festgestellt, dass ein Poiy(hexamethylen) biguanid (nachfolgend als PHMB bezeichnet) zur lokalen antiseptischen Wundbehandlung besonders geeignet ist (Willenegger, H. Unfallchirurgie, 1994, 20(2): 94- 110; und GB 1,202,495). Die Kombination aus geringer zytotoxi- scher Wirkung und guter antiseptischer Wirkung hat dazu geführt, dass sich PHMB für die lokale Behandlung infizierter Wunden und auch für die prophylaktische Behandlung während, bzw. nach einer Operation durchgesetzt hat (vgl. Roth und Baltzer, Z. Unfall- chir. Versicherungsmed. 1990, 83(4): 224-6; und Wagner, M. , Orthopädie, 1995, 24(4): 319-325).
Für diese pharmazeutische Verwendung ist PHMB mit verschiedenen anderen Wirkstoffen, sowie Träger- und Hilfsstoffen vermischt worden. Aus der DE 3 537 627 ist beispielsweise bekannt, dass eine Kombination von PHMB mit Polyethylenglykol als Desin- fektionsmittel und lokales Antiseptikum verwendet werden kann. WO97/00076 betrifft demgegenüber die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die topische Behandlung i- krobieller Infektionen, wobei die pharmazeutische Zusammensetzungen ein PHMB-Salz, beispielsweise das Hydrochloridsalz , ent- hält. EP 450 117 verwendet demgegenüber eine Lactat-freie Ringerlösung, welche 0,1-0,2% eines Konzentrates aus einer 20%-igen wässrigen PHMB Hydrochloridlösung enthält.
WO00/33829 offenbart, dass PHMB auch zur Heilung von Wunden verwendet werden kann, die frei von Infektionen sind, da der Wirkstoff eine granulationsfördernde Aktivität aufweist und somit selbst heilungsfördernd wirkt. PHMB wird darüber hinaus auch in anderen Bereichen als Desinfektionsmittel eingesetzt, beispielsweise zur Reinigung und Desinfektion von Räumen und Geräten in der Lebensmittelindustrie, zur Stabilisierung von Getränken, sowie zur Bekämpfung von Algen- und Bakterienwuchs in Schwimmbädern (Wallhäußer, K.H. , Praxis der Sterilisation, Desinfektion, Konservierung; Keimidentifizierung - Betriebshygiene; Thieme 1995) .
Polyhexanid wirkt dabei auf Bakterienzellen, indem es Permeabi- litätsänderungen der Zellwand und Ladungsverschiebungen in der Zellmembran auslöst, Membran-ständige Stoffwechselprozesse hemmt und die Koagulation von Zeilinhaltsstoffen bewirkt (Davies, et al. J. appl. Bact. (1969) 32. 233-243; Broxton, Woodcock et al . Microbios. (1983) 40. 187-193; Broxton, Woodcock et al . Micro- bios. (1984) 41. 15-22; Broxton, Woodcock et al . J. appl. Bact.
(1983) 54. 345-353; Broxton, Woodcock et al . J. appl. Bact.
(1984) 57. 115-125; Mitchinson et al . Biochem. -Biophys . Acta. (1983) 31-36; Ikeda et al . , Biochem. -Biophys . Acta. (1983) 380- 386; Ikeda et al . , Biochem. -Biophys . Acta. (1984) 57-66; Ikeda et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. (1985) 58. 705-709; Gilbert et al . J. appl. Bact. (1990) 69(4). 585-592; Gilbert et al . J. appl. Bact. (1990) 69(4). 593-598).
Diese Wirkungen des Polyhexanid sind nur in abgeschwächter Form bei Eukaryontenzellen zu beobachten, die diese eine andere Zellmembran und insbesondere primär neutrale Lipidstrukturen in der Membran aufweisen.
Im Stand der Technik gibt es selbstverständlich eine Vielzahl von alternativen Behandlungsmöglichkeiten für akute und chronische Wunden. Nicht-infizierte, chronische Wunden werden beispielsweise mit Wachstumsfaktoren behandelt.
Wachstumsfaktoren sind Polypeptide, welche mit bestimmten Zell- Rezeptoren interagieren und zur Zellteilung anregen können.
Insbesondere der Wundheilungsprozeß wird durch Wachstumsfaktoren gesteuert, welche beispielsweise mitogene Eigenschaften aufwei- sen und zelluläre Poliferation stimulieren können, angiogene Eigenschaften aufweisen und das Wachstum neuer Blutgefäße stimulieren können, sowie die Produktion und den Abbau der extrazellulären Matrix steuern können.
Der aus Thrombözyten gewonnene Wachtstumfaktor PDGF ( "platelet derived growth factor") liegt als wesentlicher Wachstumsfaktor im Serum vor, jedoch nicht im Plasma (Antoniades et al . , Pro- ceedings of the National Academy of Sciences of the United Sta- tes of America, 1975, Vol. 72:2635-2639; und Ross und Vogel, Cell, 1978, Vol. 14:203-210).
PDGF wird vorwiegend von Thrombözyten, aber auch von anderen Zelltypen sekretiert (Pierce et al . , Journal of Cellular Bio- chemistry, 1991, Vol . 45: 319-326) und wirkt als Mitogen auf die Zellen des Bindegewebes sowie auf die meisten Zellen mesenchy- malen Ursprungs (Pierce und Mustoe, Annual Review of Medicin, 1995, Vol. 46:467-481).
Drei unterschiedliche Isoformen von PDGF wurden isoliert, jeweils homo- oder heterodimere Kombinationen aus zwei verschiedenen Peptid-Ketten, die als A und B bezeichnet werden (Meyer-Ingold und Eichner, Cell Biology International, 1995, Vol. 19, 389-398) .
Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von PDGF die Wundschließung verbessert (vgl. Greenhalgh, D.G., The Journal of Trauma, Injury, Infection and Critical Care, 1996, Vol. 41:159- 167). Inzwischen wurde ein Gel, welches rekombinantes PDGF-BB in einer Konzentration von 0,01% enthält, durch die US FDA und weitere Zulassungsbehörden zur Behandlung von diabetischem Ulcus am Fuß zugelassen.
Rekombinantes PDGF-BB ist zwar in vitro hochaktiv, es hat sich jedoch gezeigt, dass in vivo Aktivität, also eine die Wundheilung förderende Wirkung, nur schwer zu erreichen ist. Dies hängt primär mit der komplexen Situation in der Wunde zusammen, in der beispielsweise Proteasen in relativ hoher Konzentration vorliegen, welche PDGF angreifen und inhibieren. Im Stand der Technik ist daher ein Protease-Inhibitor zusammen mit dem Wachstumsfaktor appliziert worden, um einen proteolytische Abbau des Wachstumsfaktor zu verhindern (Wlaschek et al . , Br. J. Der- atol., 137 (1997), 646; Kiyohara et al . , Biol . Pharm. Bull., 16 (1993), 73-76; Kiyohara et al . , J. Pharmacobiodyn, 14 (1993), 47-52) .
Gele, die als Wirkstoff PDGF enthalten und die zur Verwendung als Wundauflage geeignet sind, werden beispielsweise in WO 97/12601 beschrieben. Die Gele bestehen aus einem pharmazeutisch verträglichem Zellulose-Polymer und können über das PDGF hinaus ein Konservierungsmittel und als Stabilisator eine geladene Gruppe enthalten. Auch Kombinationen verschiedener Wachstumsfaktoren oder Kombinationen aus Wachstumsfaktoren mit anderen Wirkstoffen sind bereits im Stand der Technik für die Wundbehandlung vorgeschlagen worden. WO 92/16181 offenbart beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die PDGF und Dexamethason enthält, sowie deren Verwendung zur Gewebe-Regeneration.
Wachstumsfaktoren werden jedoch nicht zur Behandlung infizierter Wunden eingesetzt, da der Wachstumsfaktor als Protein selbst Nährstoffquelle für die Mikroorganismen sein kann.
Gegenüber diesem Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die eine verbesserte Wundheilung, ins- besondere eine verbesserte Heilung infizierter Wunden, ermöglichen.
Diese Aufgabe wurde nunmehr-durch -pharmazeutische Zusammenset- - zungen gelöst, die einen Wachstumsfaktor und/oder ein Zytokin und ein antiseptisches Biguanid umfassen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass Wachstumsfaktoren und Zytokine in Gegenwart von antiseptischen Konzentrationen des Biguanids über einen langen Zeitraum stabil und aktiv sind. Durch die vorliegende Erfindung wird somit eine vorteilhafte Kombination von Wirkstoffen und deren Verwendung zur Behandlung von akuten und chronischen Wunden zur Verfügung gestellt.
Im Stand der Technik sind eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Zytokinen bekannt. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einen oder mehrere der bekannten Wachstumsfaktoren und/oder einen oder mehrere der bekannten Zytokine enthalten. Die entsprechende Auswahl kann vom Fachmann in Abhängigkeit der geplanten medizinischen Verwendung ohne weiteres ge- troffen werden. Die Verwendung von PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, Faktor XIII, CSF, TGF, TGF-ß, EGF, TNF, Somatomedin und/oder einem Lymphokin ist bevorzugt. Es kann selbstverständlich auch eine Kombination verschiedener Wachstumsfaktoren, verschiedener Isoformen eines Wachstumsfaktors , verschiedener Zytokine oder Mischungen derselben zum Einsatz kommen. Die Verwendung des Wachstumsfaktors PDGF-BB ist besonders bevorzugt.
Als Biguanide werden Verbindungen bezeichnet, die sich vom Biguanid (C2H7N5) ableiten, insbesondere dessen Polymere. Antisep- tische Biguanide sind solche Verbindungen, die eine antimikro- bielle Wirkung aufweisen, also als Bakteriostatika oder vorzugsweise als Bakterizide wirken. Die Verbindungen weisen vorzugsweise eine breite Wirkung gegen viele Bakterien auf und können durch eine antimikrobielle Wirkung gegen E.coli von mindestens 0,5 μg/ml, vorzugsweise mindestens 12 oder mindestens 25μg/ml gekennzeichnet werden (minmial mikrobizide Konzentration oder MMK; gemessen im Suspensionsversuch) . Die MMK kann jedoch Höchstwerte von bis zu 1000 oder 2000μg/ml erreichen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ein Poly(imino[imidocar- bonyl]iminopolymethylen) , wobei die Verwendung von Poly(hexame- thylen)biguanid (PHMB), das auch als Polyhexanid bezeichnet wird, als antiseptisches Biguanid besonders bevorzugt ist. Die Verbindungen können dabei als Racemate oder reine Isoformen vorliegen.
Die Konzentration des Wachstumsfaktors und des Biguanids in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann vom Fachmann durch einfache Versuche in Abhängigkeit der geplanten Verwendung, insbesondere in Abhängigkeit der Art der Formulie- rung der Zusammensetzung (Creme, Gel, etc.), gewählt werden. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass der Wachstumsfaktor in einer Konzentration von 1,0 μg/g bis 700 μg/g pharmazeutischer Zusammensetzung vorliegt, wobei eine Konzentration von 50 bis 90μg/g bevorzugt ist.
Das Biguanid kann beispielsweise in einer Konzentration von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% bezogen auf das Gewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen, wobei eine Konzentration von 0,0005 bis 0,006 Gew.-% bevorzugt ist. Das Biguanid kann eine beliebige Molukulargewichtsverteilung aufweisen, wobei eine mittlere Molukulargewichtsverteilung bis 15.000, insbesondere im Bereich von 1.000 bis 8.000 bevorzugt ist. Ein mittleres Molekulargewicht von 2.800 ist besonders bevorzugt.
Die Art der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung hängt von der geplanten medizinischen Verwendung ab. Die Zusam- menetzung kann als Creme, Öl, Öl in Wasser oder Wasser in Öl Emulsion, Pflaster, Wund-Dressing oder Gel formuliert sein. Die Formulierung als Gel, insbesondere als Hydroxyethylcellulose-Gel ist besonders bevorzugt. Die Herstellung eines erfindungsgemäßen Gels ist in Beispiel 4 dargestellt.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Behandlung chronischer oder akuter Wunden, Weichteilwunden, insbesondere zur Behandlung infizierter Wunden oder zur Behandlung der Folgen eines operativen Eingriffs verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind insbesondere zur Be- handlung chronischer, infizierter und schwer-heilender Wunden, wie beispielsweise des diabetischen Ulcus , insbesondere am Fuß, geeignet .
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, bei denen man einen Wachstumsfaktor und ein antiseptisches Biguanid mit pharmazeutisch verträglichen Träger- und/oder Hilfsstoffen vermischt.
Kurze Beschreibung der Figuren:
Fig.l: PHMB-Zytotoxizität auf Balbc-3T3-Zellen;
Fig.2: PHMB-Zytotoxizität auf HUVE-Zellen;
Fig.3: PDGF auf einem SDS-PAGE-Gel nach Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen Lavasept;
Fig.4: Mitogene Aktivität des PDGF nach Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen Lavasept.
Beispiel 1 Zytotoxische Wirkung des Lavasept
Die zytotoxische Wirkung des Lavasept (Lavasept Konzentrat No.4927031, Batch IBX 00301.2001, Fresenius) wurde an Balbc-3T3- Fibroblasten (Maus-Zelllinie) und untersucht. Dafür wurden Zellen in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät, mit unterschiedlichen Konzentrationen an Lavasept kontaktiert (0,001%, 0,002%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% und 0,2%; diese und alle folgenden Prozentangaben beziehen sich auf Vol.-%; alle Verdünnungen erfolgten in BSA haltigem PBS-Puffer, "phosphate buffered saline", pH 7,4) und die Zytotoxizität wurde durch mikroskopische und makroskopische Betrachtung der Zellen und der Färbung des Mediums untersucht . Dabei wurde festgestellt, dass bei einer Konzentration von 0,1% und 0,2% Lavasept keine oder kaum noch Zellen zu erkennen sind; alle Zellen sind lysiert. Bei 0,05% Lavasept werden vereinzelt Zellausläufer identifiziert, während bei geringerer Konzentra- tion die zytotoxische Wirkung abnimmt. Jedoch wurde bereits bei einer Konzentration von 0,005% Lavasept und einer Inkubation von 6 Tagen eine geringe Zytotoxizität gefunden.
Diese Beobachtungen werden durch die Auswertung der Färbung des Mediums bestätigt, die ergeben, dass eine Zytotoxizität bereits bei 0,004% Lavasept einsetzt.
Beispiel 2 Zytotoxische Wirkung des Lavasept
Die Lavasept-Zytotoxizität auf Balbc-3T3 Zellen der Maus und humane vaskuläre Endothelzellen ( "human umbelical vein endothe- lial cells", HUVE-Zellen) wurde auch unter Verwendung des sensitiven MTT-Tests bestimmt . Der MTT-Test beruht auf der Reduktion des Farbstoffes 3- (4 , 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyltetra- zoliumbromid (Thiazolylblau), was zu einer Änderung der Farbe führt (gelb zu violett). Die Reduktion erfolgt in lebenden Zellen durch aktive mitochondriale Dehydrogenasen; in toten Zellen ist keine entsprechende Umsetzung des Farbstoffes möglich. Eine photometrische Messung erlaubt die Bestimmung des prozentualen Anteils lebender Zellen (vgl. Shi et al . , J. Immunol. Methods , 164 (1993), 149-154).
Balbc-3T3 Fibroblasten lassen sich ausgezeichnet mit PDGF stimulieren und sind im Stand der Technik als robuster Zelltyp bekannt. Humane Endothelzellen sind demgegenüber wesentlich sensitiver und anspruchsvoller in der Kultivierung und Passagie- rung.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 3, sowie in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Tabelle 1 MTT-Test bei Verwendung von Bal c-3T3 Zellen
Figure imgf000011_0001
Tabelle 2 MTT-Test bei Verwendung von Balbc-3T3 Zellen
Figure imgf000011_0002
Tabel l e 3 MTT-Test bei Verwendung von HUVEC-Zel l en
Figure imgf000012_0001
Zusammenfassend ist festzustellen, dass bei der mikroskopischen Auswertung von 3T3-Zellen nach Lavasept-Behandlung bereits bei einer Konzentration zwischen 0,005 und 0,01% deutlich zytotoxi- sehe Effekte in Form von Zellablösungen oder einem Verlust der Feinstruktur zu erkennen sind. Höhere Konzentrationen führen zum Zelltod und zur Zellyse sowie zur Denaturierung der Proteine. Mittels des MTT-Tests wurde gezeigt, dass bereits Lavasept-Kon- zentrationen im Bereich von 0,002 bis 0,005% eine zytotoxische Wirkung aufweisen.
Lavasept wird jedoch von Balbc-3T3-Zellen bis zu einer Konzentration von etwa 0,01% toleriert und führt lediglich zu einer Inhibition des Zellwachstums von etwa 40 bis 70%.
Humane primäre Endothelzellen reagieren sensitiver auf die Zugabe von Lavasept. Konzentrationen bis zu 0,001% werden noch toleriert und "führen zu einer Inhibition des Zellwachstums von 22%. Eine Erhöhung der Lavasept-Konzentration auf 0,005% wird jedoch nicht mehr toleriert. Beispiel 3 Stabilität des humanen PDGF-AB in Gegenwart von Lavasept
In dem vorliegenden Experiment wurde die Stabilität von rekom- binantem, humanem PDGF-AB in Gegenwart von Lavasept untersucht. Dafür wurde das Protein mit unterschiedlichen Lavasept-Kon- zentrationen inkubiert. Anschließend wurde die Integrität des Proteins mit SDS-Gelelektrophorese und die Aktivität mittels des etablierten Mitogen-Assays bestimmt.
Das PDGF-AB wurde von der Firma Strathmann erhalten (Code PDGF- AB-10) und wurde nach Angaben des Herstellers in PBS rekonstituiert. Zusätzlich wurde ein Überschuß an BSA zugegeben. Das BSA soll den Wachstumsfaktor als Carrier-Protein bei gerin- gen Proteinkonzentrationen schützen. Die Proteinkonzentration des rekonstituierten PDGF betrug 100 μg/ml. Für die Analyse wurde PDGF mit Lavasept verdünnt und auf eine Konzentration von 50 μg/ml (500 ng/μl) eingestellt. Die Endkonzentration des Lavasept betrug 0,0%, 0,005%, 0,025%, 0,05% und 0,25% . Die Konzen- tration des Wachstumsfaktors betrug konstant 50 μg/ml.
Die Wachstumsfaktor/Lavasept-Lösung wurde für mindestens eine und höchstens acht Wochen bei -20°C gelagert.
Für die Analyse der Stabilität des Proteins wurden alle Fraktionen auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt und die Proteine unter Verwendung der Silberfärbung sichtbar gemacht. Wie Figur 3 zeigt, ist PDGF-AB unter den gewählten Bedingungen sehr stabil. Eine Inkubation des PDGF mit 0,005% bis zu 0,05% Lavasept führt nicht zu einer Degradation des Proteins. Bei einer Endkonzentration von 0,25% Lavasept sind keine Degradationsprodukte zu erkennen, die Proteinbande fällt jedoch etwas schwächer aus, was- möglicherweise auf einen partiellen Abbau zurückzuführen ist. Insgesamt ist jedoch klar erkennbar, dass der gewählte Konzentrationsbereich keinen signifikanten Einfluß auf die Stabilität des Proteins ausübt. Dieses Ergebnis wird auch durch den Mitogenitätstest bestätigt . Figur 4 zeigt die Aufnahme von 3 H-Tymidin durch Balbc-3T3-Zel- len in Gegenwart von einer Kombination aus PDGF-AB und verschiedenen Konzentrationen des Lavasept. Für die Durchführung dieses Tests wurde der Wachstumsfaktor mit Lavasept im Bereich von 0,01% bis 0,5% vorinkubiert und vor dem Versuchsbeginn auf eine Endkonzentration verdünnt, die nicht zytotoxisch ist, bei der der Wachstumsfaktor jedoch nachweisbar ist (10-25 ng/ml) .
Wie Figur 4 zeigt, hat die Mischung von PDGF mit Lavasept keinen negativen Einfluß auf die Aktivität des Wachstumsfaktors .
Beispiel 4 Herstellung eines Wundauflage-Gels, das Lavasept und PDGF enthält
Die Bestandteile:
Nr. Rohstoffe Menge
1 Glycerin 100% (wasserfrei),
DAB Qualität 85,00 g
2 Lavasept Konzentrat (Fresenius) 2,00-5,00 g
3 Hydoxyethylcellulose, Ph.Eur. 32,50 g 4 PDGF-BB 0,05-0,1 g
5 Ringerlösung ad 1000,00 g
werden in folgendem Verfahren miteinander vermischt:
Ringerlösung wird im Ansatzbehälter vorgelegt; das Glycerin wird untergerührt . Lavasept Konzentrat wird untergerührt und der Ansatz wird" zur Vermeidung von Klumpenbildung beim Einstreuen der Hydroxyethylcellulose auf 40-70°C erwärmt. Pulverförmige Hydroxyethylcellulose und PDGF wird unter Rühren langsam zugegeben. Der Ansatz wird bis zum klaren Gel homogenisiert.
Das Gel wird in geeignete Tuben, Spritzen etc., die mit einem entsprechenden Etikett versehen werden, abgefüllt, wobei nur vollständig klares Gel verwendet wird!

Claims

Patentansprüche
L. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Wachstumsfaktor und/oder ein Zytokin und ein antiseptisches Biguanid.
i. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wachstumsfaktor PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, Faktor XIII, CSF, TGF, TGF-ß, EGF, TNF, Somatomedin und/oder ein Lymphokin ist .
!. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Wachstumsfaktor in einer Konzentration von 1,0 μg/g bis 700 μg/g, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 μg/g bis 90 μg/g pharmazeutischer Zusammensetzung vorliegt.
:. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das antiseptische Biguanid Poly(hexamethylen) biguanid (PHMB) ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das antiseptische Biguanid in einer Konzentration 0,0001 bis 0,1 Gew.-% bezogen auf das Gewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegt .
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Biguanid eine mittlere Molukulargewichtsverteilung im Bereich von 1.000 bis 8.000 aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis '6, dadurch gekennzeichnet, "dass die' pharmazeutische Zu-- sammensetzung als Creme, Öl, Öl in Wasser oder Wasser in Öl Emulsion, Pflaster, Wund-Dressing oder Gel formuliert ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel ein Hydroxyet- hylcellulose-Gel ist.
9. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Behandlung chronischer oder akuter Wunden.
10. Verwendung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wunde Folge eines operativen Eingriffs ist.
11. Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Wunde infiziert ist.
12. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Wunde eine chronische, infizierte Wunde ist.
13. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Wunde eine Weichteilwunde ist.
14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Wunde ein diabetischer Ulcus ist, insbesondere ein diabetischer Ulcus am Fuß.
15. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Wachstumsfaktor und ein antiseptisches Biguanid mit pharmazeutisch verträglichen Träger- und/oder Hilfsstoffen vermischt.
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