DE2846482C2

DE2846482C2 - Verfahren zur Gewinnung eines polysaccharidhaltigen Präparates zur Bekämpfung von Neoplasmen

Info

Publication number: DE2846482C2
Application number: DE19782846482
Authority: DE
Inventors: Witold Julian Dr.Med. Adamek; Wojciech Dr. Czyzewski; Jozef Dr.Med. Dec; Zygmunt Dr. Dudek; Stanislaw Dr. Kukla; Waleria Prof. Dr. Olechnowicz-Stepien; Halina Prof. Dr. Rzadkowsak-Bodalska; Stanislaw Prof. Dr. Tolpa; Henryka Dr. Breslau Wrobel-Pieciul
Original assignee: AKADEMIA ROLNICZA WE WROCLAWIU WROCLAW PL
Current assignee: AKADEMIA ROLNICZA WE WROCLAWIU WROCLAW PL
Priority date: 1977-10-25
Filing date: 1978-10-25
Publication date: 1983-03-24
Also published as: DE2846482A1; CH639279A5; PL124110B1; PL201762A1

Description

a) noch einmal alkalisch hydrolisiert und das nach der Abtrennung des Niederschlages gewonnene Filtrat erneut angesäuert und konzentriert und dann neutralisiert und zur Trockne eingedampft wird,

b) daß der trockene Rückstand mit wäßrigem Ethanol aufgenommen wird, der erhaltene Extrakt von Ballastsubstanzen befreit, bis zum Salzausscheiden konzentriert und filtriert wird, und

c) das so erhaltene Filtrat mit einer Mischung aus Ethanol und einem anderen organischen Lösungsmittel extrahiert, das dabei ausfallende anorganische Salz abfiltriert, die abgetrennte wäßrige Schicht nochmals konzentriert und zentrifugiert wird, und

d) dss klare Filtrat chromatografisch fraktioniert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das selektive Entfernen von Basen und Säuren in den Verfahrensstufen a + b mittels Ionenaustausch durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines polysaccharidhaltigen Präparates aus angesäuertem, alkalischen Hydrolysat von Torf, mit 8- bis 30%igem Aschegehalt, 30- bis 70%iger Zersetzungsstufe und einem pH-Wert von 3,5 bis 7,0, zur Bekämpfung von Neoplasmen.

Die Gewinnung von Substanzen aus Torf, die gegen Neoplasmen wirken, und bei welchen die Konzentration von Polysacchariden sehr hoch (bis 95%) ist, ist bekannt. Bei dem bekannten Verfahren wird reiner und ausgetrockneter Torf unter stundenlangem periodischen Rühren mit ca. 8%iger, wäßriger NaOH kalt extrahiert. Die erhaltene Mischung wird filtriert und der Rest noch einmal mit einer wäßrigen NaOH extrahiert, bis der pH-Wert des Gesamtextraktes unter Anwendung von 4n HCl den Wert 2 annimmt. Anschließend wird das Ganze zentrifugiert und der Überstand einer 48 Stunden andauernden Dialyse unter fließendem Wasser unterzogen.

Das Dialysat wird in einer Reihe von Chromatografiesäulen von Salz gereinigt. Das abgesonderte Produkt weist eine gegen Neoplasmen wirkende Aktivität bei Mäusen auf (Hayoshida, Takuya, Kumakura, Mikio: Anticancer preparations from peat; Chemical Abstract, 1974, Vol. 80,41 027 j).

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung eines polysaccharidhaltigen Präparates zur Verfügung zu stellen, welches die Gewinnung eines Produktes ermöglicht, das gegen Neoplasmen in besonderem Maße aktiv wirkt und sich insbesondere für die Anwendung am Menschen eigneu

Die vorstehende Aufgabe wird durch das eingangs genannte Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das als Ausgangsmaterial verwendete saure Filtrat

a) noch einmal alkalisch hydrolysiert und das nach der Abtrennung des Niederschlages gewonnene Filirat erneut angedauert und konzentriert und dann

ι (i neutralisiert und zur Trockne eingedampft wird,

c) das so erhaltene Filtrat mit einer Mischung aus Ethanol und einem anderen organischen Lösungsmittel extrahiert, das dabei ausfallende anorganische Salz abfiltriert, die abgetrennte wäßrige Schicht nochmals konzentriert und zentrifugiert :·ο wird, und

d) das klare Filtrat chromatografisch fraktioniert wird.

Gemäß der Erfindung wird das das Ausgangsprodukt

.-■i bildende saure Filtrat, das auf bekannte Weise erhalten wurde, nämlich durch die Hydrolyse von Torf, mit einen, Aschegehalt von 8 bis 30%, einer Zersetzungsstufe von 30 bis 70% und einem pH-Wert von 3,5 bis 7, nochmals mittels wäßriger Alkalilösung hydrolysiert, und das nach

:;o Entfernung des Niederschlages gewonnene Filtrat wieder angesäuert und konzentriert, anschließend neutralisiert und zur Trockne eingedampft. Daraufhin wird der trockene Rückstand mit hydratisiertem Ethanol extrahiert. Der auf diese Weise gewonnene Extrakt wird vom Überschuß an Ballastsubstanzen abgetrennt, bis zum Ausscheiden anorganischer Salze konzentriert und nochmals filtriert. Das erhaltene Filtrat wird mittels einer Mischung von Ethanol mit anderen organischen Lösungsmitteln extrahiert, der dabei ausfallende Niederschlag wird von anorganischen Salzen abfiltriert und die abgetrennte Wasserschicht konzentriert, zentrifugiert und filtriert. Das klar gewordene Filtrat wird auf Chromatografiesäulen fraktioniert, die mit Biogel oder Cellulose gefüllt sind, unter Einsatz von Wasser oder hydratisiertem Ethanol als Lösungsmittel. Die selektive Entfernung des

Überschusses von Alkalien oder Säuren wird durch Ionenaustausch durchgeführt.

In dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren

so erhaltenen Endprodukt liegen neben der Polysacchariden bestimmte Mineralsalze vor.

Das gemäß der Erfindung erhaltene Endpräparat unterscheidet sich von dem des Standes der Technik durch seine chemische Zusammensetzung sowie durch die experimentell bestätigte starke Aktivität gegen Neoplasmen.

Das gewonnene Präparat, untersucht in vitro an lymphoidalen Zellen, Typus SL 2, welche Mäusen entnommen wurden, wies Aktivität bei einer Konzentration von 0,5 μg/ml auf. Auf menschliche Neoplasmenzellen, Typus KB wurde im Bereich der Konzentrationen von 1,6—5,5μg/ml eine Aktivität beobachte". Das Präparat wurde in den einzelnen Bearbeitungsstadien, in einem Zeitraum von über 10 Jahren durch vorläufige

ij> Untersuchungen in bezug auf die Toxizität und die gegen Neoplasmen wirkende Aktivität geprüft. In onkostatischen Untersuchungen wurden Mäuse der Rasse Porton (durchschnittliches Gewicht ca. 35 s) und

zwei transplantierbare Neoplasmenarten des Crocker- und Ehrlich-Types getestet. Die Versuchsgruppen enthielter, je 50 Mäuse, die Kontrollgruppen je 10 Mäuse. Der Ehrlich-Krebs wurde den Mäusen subkutan in die Gegend der Leisten in einer Menge von je 1 200 000 Zellen implantiert 6 Stunden nach der Implantation des Neoplasmas wurde den Tieren subkutan das Torfpräparat in einer Menge von 20 mg/kg und 10 mg/kg verabreicht. Nach 14 Tagen wurden die Geschwülste auspräpariert, gewogen und mit dem Gewicht der Geschwülste der Kontrollgruppe verglichen. Die prozentuale Hemmung der Geschwulstentwicklung betrug bei Anwendung des erfindungsgemäßen Präparates entsprechend der eingesetzten Dosis 98% und 89%.

Ähnliche Untersuchungen wurden mit dem transplantierbaren Crocker'schen Sarkom durchgeführt, und zwar durch subkutane Injektion von Neoplasmen7ellen in einer Menge von 6 000 000. Das Präparat wurde oral und als Kompresse bzw. Umschlag verabreicht. Bei Dosen von 20 mg/kg wurde eine 100%ige Hemmung der Entwicklung der Geschwulst erreicht. Es wurde auch festgestellt, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Präparates die unverschiebbaren Geschwülste von dem nicht erkrankten Gewebe abgetrennt wurden, was einen chirurgischen Eingriff ermöglichte. Es wurde weder eine akute noch eine chronische Toxizität festgestellt.

Das Präparat wird in Form von Lösungen peroral oder parenteral (i. m.), in Form von Umschlagen und als Salben verabreicht, je nach der Art der Neoplasmenerkrankungen und dem Entwicklungsstadium des Neoplasmas.

Das gemäß der Erfindung gewonnene Torfpräparat mit einer gegen Neoplasmen wirkenden Aktivität führt während der Anwendungszeit nicht zu negativen r> Nebenwirkungen; im Gegenteil beobachtet man eine Verbesserung des Blutbildes sowie eine Appetit- und Gewichtszunahme.

Beispiel 1

I kg lufttrockener Torf wird zerkleinert und mit 8 0,1- bis 8%iger wäßriger NaOH 36 h lang bei Raumtemperatur unter ständigem Mischen extrahiert. Der alkalische Extrakt wird zentrifugiert, um die unzerlegten Pflanzenteile zu entfernen, anschließend mit Salzsäure auf ca. pH 1 angesäuert und über 12 h stehen gelassen. Der abgeschiedene Niederschlag wird filtriert und das klare Filtrat wird mit NaOH bis pH = 9 alkalisch gemacht und dann wieder filtriert. Das Filtrat wird mit Salzsäure angesäuert und unter vermindertem Druck auf etwa ¹A des Volumens konzentriert, mit Natriumhydroxid neutralisiert, bis zur Trockenheit eingedampft und mit hydratisiertem Ethanol extrahiert.

40 Der alkoholisch-wäßrige Extrakt wird von den Schmier- und ölbestandteilen und den anorganischen Salzen befreit und dann bis zum Salzausscheiden konzentriert Nachdem das ausgeschiedene Salz abfiltriert worden ist, wird das Filtrat mit einer Mischung aus Ethanol und anderen organischen Lösungsmitteln im Verhältnis 1 :3 extrahiert. Das weiter ausfallende anorganische Salz wird abnitriert und das wäßrige Filtrat auf die Hälfte eingedampft, dann zentrifugiert und filtriert. Das klare Filtrat wird nach dem Konzentrieren in Chromatografiesäulen auf Biogel und unter dem Einsatz von Wasser entsprechend aufgeteilt, um die gegen Neoplaimen wirkende Fraktionen abzutrennen. Das gewonnene Präparat ist eine hellbraune, amorphe Substanz mit einem Wassergehalt von bis 10%; sie löst sich in Wasser auf und ist unlösbar in organischen Lösungsmitteln. Nach saurer Hydrolyse ergibt sich eine positive Reaktion mit Reagenzien auf Zucker. Das IR-Spektrum ist typisch für Polysaccharide. Nach Verbrennung bei 700⁰C erhält man einen Rückstand von etwa 7% (Metalloxide). Die Farbreaktion des Präparates mit Nihydrin ist positiv.

Beispiel 2

1 kg lufttrockener Torf wird zerkleinert und mit einer wäßriger. NaOH-Lösung wie im Beispiel 1 extrahiert. Der klare alkalische Extrakt wird auf pH 7 auf einem Ionenaustauscher Dowex 50 W · 8, mesh 50—100, neutralisiert. Die neutrale Lösung wird mit Salzsäure auf ca. pH 1 engesäuert und für ca. 12 h stehen gelassen. Der ausgeschiedene Niederschlag wird filtriert und das saure Filtrat auf einem Ionenaustauscher IRA 410 neutralisiert, erneut mit wäßriger Lösung von NaOH auf pH 9 alkalisiert und der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert. Das alkalische Filtrat wird auf den oben genannten Ionenaustauschern neutralisiert und mit Salzsäure auf pH 2 angesäuert, dann auf V₅ des Volumens bei erniedrigtem Druck eingedampft, auf Ionenaustauschern neutralisiert, bis zur Trockenheit abgedampft und mit wäßriger Ethanoülösung extrahiert. Der alkoholisch-wäßrige Extrakt wird weiter wie im Beispiel 1 behandelt.

Das erhaltene Präparat weist eine analoge chemische Zusammensetzung und Eigenschaften wie das Präparat aus dem Beispiel 1 auf.

Die in den dargestellten Beispielen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens erhaltenen Nebenprodukte weisen nach entsprechender Verarbeitung eine biologische Aktivität auf und können als Mittel mit bakteriostatischer und antiviröser Wirkung verwendet werden. Sie sind auch geeignet zur Verwendung in der Landwirtschaft sowie bei der Pflanzen- und Tierproduktion.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung eines polysaccharidhaltigen Präparates aus angesäuertem, alkalischen Hydrolysat von Torf, mit 8- bis 30%igem Aschegehalt, 30- bis 70%iger Zersetzungsstufe und einem pH-Wert von 34 bis 7,0, zur Bekämpfung von Neoplasmen, dadurch gekennzeichnet, daß das als Ausgangsmaterial verwendete saure Filtrat