PL170294B1

PL170294B1 - Sposób otrzymywania z torfu aktywnego, nietoksycznego preparatuo dzialaniu immunomodulacyjnym i stymulujacym wytwarzanie w organizmie cytokin PL

Info

Publication number: PL170294B1
Application number: PL92296811A
Authority: PL
Inventors: Jan Z Mioduszewski; Krystyna Witkiewicz; Magdalena Kowalska; Joanna Goral; Magdalena Klimecka
Original assignee: Torf Corp Fabryka Lekow Sp Z O
Priority date: 1992-12-02
Filing date: 1992-12-02
Publication date: 1996-11-29
Also published as: TW272129B; LT3241B; LTIP1509A; AU5629594A; EE03136B1; CO4180517A1; ZA938950B; PL296811A1; PE55894A1; WO1994012197A1

Abstract

1 Sposób otrzymywania z torfu aktywnego, nietoksycznego preparatu o dzialaniu immunomodula- cyjnym i stymulujacym wytwarzanie w organizmie cytokin, nadajacego sie do stosowania w lecznictwie 1 profilaktyce u ludzi i zwierzat, obejmujacy ekstrakcje surowca torfowego 1 uwolnienie ekstraktu od substancji humusowych przez wytracenie w srodowisku kwasnym, znamienny tym, ze ekstrakt torfowy uwolniony od substancji humusowych przez zakwaszenie kwasem solnym do pH w granicach 1,5-3,0 i oddzielenie wytraconych substancji zateza sie przez odparowanie pod zmniejszonym cisnieniem i/lub na drodze procesu nanofiltracji z jednoczesnym usunieciem soli nieorganicznych, po czym ustala sie odczyn otrzymanego roztworu w granicach wartosci pH od 6,0 do 7,2, zageszcza sie go do konsystencji syropu 1 ogrzewa w temperaturze 70-90°C, korzystnie 80°C, przez czas potrzebny do zajscia reakcji przegrupowa- nia Amadoriego z utworzeniem zwiazków amino kwasowych i/lub peptydowych podstawionych przy grupie aminowej, niezwiazanej wiazaniem peptydowym, reszta odpowiedniej 1- deoksy-2-ketozy przyla- czonej weglem C1 do grupy aminowej, której to reakcji ulegaja polaczenia powstajace z obecnych w ekstrakcie cukrów, wielocukrów i/lub polisacharydów oraz aminokwasów i/lub peptydów, 1 która to reakcje przerywa sie po osiagnieciu optymalnego stopnia przemiany przez schlodzenie, po czym z otrzymanego produktu usuwa sie substancje o charakterze hydrofobowym, obnizajace aktywnosc immu- notropowa preparatu przez selektywne zaadsorbowanie ich na specyficznej wysokoporowatej, niejonowej zywicy sorpcyjnej, bedacej aglomeratem olbrzymiej ilosci niewielkich polistyrenowych mikroperelek, lub innej zywicy o analogicznych wlasciwosciach PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania z torfu nietoksycznego preparatu o działaniu immunomodulacyjnym oraz stymulującym wytwarzanie cytokin (interferonów i czynnika bójczego nowotworów) po podaniu ludziom lub zwierzętom.

W literaturze znany jest szereg sposobów wytwarzania z torfu ekstraktów o działaniu immunotropowym lub przeciwnowotworowym.

Patent japoński (Hyoshita Takuya; Kumakura Mikio, Chem, Abstr., 1974, 80,47021j) opisuje proces, w którym torf ekstrahuje się kilkakrotnie 8% ługiem sodowym, ekstrakt zakwasza się, odwirowuje od osadu, następnie dializuje się i oczyszcza na kolumnach chromatograficznych. Frakcja złożona głównie (95%) z polisacharydów wykazywać ma działanie przeciwnowotworowe.

Polski patent z 1977 r. nr 124 110 (S. Tołpa, S, Kukla., H. Rządkowska-Bodalska i wsp.) różni się sposobem dalszego przerobu ekstraktu otrzymanego w sposób analogiczny do opisanego

170 294 w patencie japońskim. Ekstrakt po zakwaszeniu jest ponownie alkalizowany, zakwaszany, zagęszczany przez odparowanie, zobojętniany, zagęszczany, ekstrahowany mieszaniną wody i alkoholu, a po częściowym zagęszczeniu ekstrahowany eterem lub innym nie mieszającym się z wodą rozpuszczalnikiem organiczny^m. Końcową warstwę wodną oddziela się i oczyszcza na kolu^mnach z wypełnieniem do filtracji żelowej. Autorzy nie precyzują jakie frakcje stanowią korzystny preparat końcowy.

Z polskiego opisu patentowego Tarchomińskich Zakładów Farmaceutycznych Polfa nr 158 565 znany jest proces, w którym ekstrakcję wodną torfu prowadzi się w środowisku kwaśnym, a nie w alkalicznym, a zobojętniony ekstrakt zagęszcza się nie przez odparowanie lecz na drodze ultrafiltracji lub odwróconej osmozy przy użyciu membran o granicy retencji („cut off‘) od 500 do 10.000. Dalej produkt rozdzielany jest chromatograficznie przez kolumnową filtrację żelową lub na anionowych wymieniaczach jonowych. Autorzy opisują możliwość uzyskiwania frakcji o różnym stopniu odsolenia i różnym stosunku zawartości polisacharydów do glikoproteidów, stwierdzając jednak, że wszystkie otrzymywane mieszaniny są nietoksyczne i mają działanie immunotropowe.

Streszczone powyżej znane metody wykazują szereg cech wspólnych wynikających z zasad klasycznego procesu izolacji substancji czynnych z surowca naturalnego, prowadzonego na tyle zachowawczo, ażeby wykluczyć możliwość reakcji wtórnych, mogących spowodować rozkład lub dezaktywację aktywnych substancji czynnych. Autorzy cytowanych patentów nie precyzują bliżej charakteru chemicznego związków warunkujących aktywność biologiczną mieszaniny. Wymieniane polisacharydy oraz stosowanie operacji odrzucających frakcje drobnocząsteczkowe (dializa, ultrafiltracja) wykazują, ze w znanych sposobach wytwarza się preparaty, których aktywność wiązana jest z frakcjami o wysokim ciężarze cząsteczkowym.

Obecne badania nad ekstraktami torfowymi wykazały, że ekstrakty otrzymywane w warunkach możliwie zachowawczej izolacji substancji aktywnych zawartych w torfie (także według opisanych metod) posiadają stosunkowo niewielką aktywność immunotropową, bądź zawierają trudne do oddzielenia substancje balastowe, w tym sole nieorganiczne, których obecność utrudnia przetwarzanie ich na postaci farmaceutyczne, eliminuje szereg zastosowań terapeutycznych, a także zwiększa praco- i energochłonność ich przetwarzania.

Celem wynalazku jest opracowanie nowego sposobu pozyskiwania i przetwarzania ekstraktu torfowego, prowadzącego do otrzymywania preparatu o działaniu immunomodulacyjnym i stymulującym wytwarzanie cytokrn z większą wydajnością, pozbawionego wad znanych sposobów.

Nieoczekiwanie okazało się, że przy stosowaniu warunków, w których możliwe jest zachodzenie pewnych reakcji wtórnych pomiędzy składnikami ekstraktu z wytworzeniem związków określonego typu, które w takich ekstraktach pierwotnie nie występują lub występują w znikomych ilościach, oraz w których cenne i dobroczynne składniki ekstraktu nie są eliminowane przy okazji usuwania substancji balastowych występujących w ekstraktach, pochodzących z surowca torfowego lub wprowadzonych wraz z czynnikami ekstrahującymi, aktywność immunotropową każdej szarży otrzymywanego preparatu utrzymuje się w korzystnych granicach przy jednoczesnym zwiększeniu wydajności substancji organicznych w końcowym preparacie.

Substancjami organicznymi związanymi z obserwowaną aktywnością biologiczną i terapeutyczną preparatów torfowych, w tym także Preparatu Torfowego Tołpy* (nazwa zastrzeżona na rzecz TORF CORPORATION) są związki stanowiące produkty przegrupowania Amadoriego, jakiemu ulegają połączenia aldoz z aminokwasami, a więc związki o ogólnym wzorze: R1 -CO-CH 2-NH-R 2 gdzie R1 jest resztą l-deoksy-2-keto-cukru, oligo- lub polisacharydu, w którym ta reszta stanowi zakończenie łańcucha, a R2 jest resztą aminokwasu lub peptydu, w którym ten aminokwas stanowi końcowy człon, z grupą -NH 2 niezaangażowaną we wiązanie peptydowe, których sposób otrzymywania i wykorzystania opisany został we wcześniejszym polskim zgłoszeniu patentowym P-293464 (B UP Nr 17/93).

Obecnie okazało się, że można uzyskiwać ekstrakty torfowe bogate zarówno w substraty do syntezy takich związków: cukry, oligo- i polisacharydy, aminokwasy i peptydy, jak i zawierające naturalne katalizatory tej reakcji: kwasy organiczne 1 związki zawierające aktywną grupę metylenową.

170 294

Sposób otrzymywania z torfu aktywnego, nietoksycznego preparatu o działaniu immunomodulacyjnym i stymulującym wytwarzanie w organizmie cytokin (interferonów i czynnika bójczego nowotworów), nadającego się do stosowania w lecznictwie i profilaktyce u ludzi i zwierząt, obejmujący ekstrakcję surowca torfowego i uwolnienic ekstraktu od substancji humusowych przez wytrącenie w środowisku kwaśnym, według wynalazku polega na tym, ze ekstrakt torfowy, uwolniony od substancji humusowych przez zakwaszenie kwasem solnym do pH w granicach 1,5-3,0 i oddzielenie wytrąconych substancji, zatęza się przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem i/lub na drodze procesu nanofiltracji, z jednoczesnym usunięciem soli nieorganicznych, po czym ustala się odczyn otrzymanego roztworu w granicach wartości pH od 6,0 do 7,2, zagęszcza się go do konsystencji syropu i ogrzewa w temperaturze 70-90°C, korzystnie 80°C, przez czas potrzebny do zajścia reakcji przegrupowania Amadoriego z utworzeniem związków aminokwasowych i/lub peptydowych podstawionych przy grupie aminowej, niezwiązanej wiązaniem peptydowym, resztą odpowiedniej 1-deoksy-2-ketozy przyłączonej węglem C1 do grupy aminowej, której to reakcji ulegają połączenia powstające z obecnych w ekstrakcie cukrów, wielocukrów i/lub polisacharydów oraz aminokwasów i/lub peptydów, i którą to reakcję przerywa się po osiągnięciu optymalnego stopnia przemiany przez schłodzenie, po czym z otrzymanego produktu usuwa się substancje o charakterze hydrofobowym, obniżające aktywność immunotropową preparatu przez selektywne zaadsorbowanie ich na specyficznej wysokoporowatej, niejonowej żywicy sorpcyjnej, będącej aglomeratem olbrzymiej ilości niewielkich polistyrenowych mikroperełek, lub innej żywicy o analogicznych właściwościach.

Wskazana specyficzna żywica sorpcyjna jest żywicą typu Amberlite XAD, korzystnie typu XAD-2 lub XAD-4.

Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem wyjściowy ekstrakt jest mieszaniną ekstraktu alkalicznego i wodnego otrzymanych przez kolejne ekstrahowanie roztworem ługu i wodą torfu, ewentualnie uprzednio krótko przemytego roztworem kwasu. Korzystnie przy tym, jako surowiec torfowy stosuje się torf niski o stopniu humifikacji H6 do H10.

Korzystnie w sposobie według wynalazku reakcję przegrupowania Amadoriego prowadzi się w stężonym roztworze wodnym lub w stężonym roztworze wodno-alkoholowym.

Korzystnie, sorpcję niepożądanych substancji prowadzi się przy odczynie kwaśnym lub obojętnym, a następnie eluuje się wodą destylowaną i rozcieńczonymi alkaliami. Z finalnego roztworu produkty czynne biologicznie i terapeutycznie wydziela się w postaci stałej na drodze suszenia rozpyłowego.

Postęp reakcji przegrupowania Amadoriego w sposobie według wynalazku można kontrolować przy pomocy reakcji redukcji zelazicyjanku potasowego przez powstające związki w środowisku alkalicznym. W temperaturze pokojowej reduktany (typu np. kwasu askorbinowego) redukują zelazicyjanek w środowisku alkalicznym w czasie około 1 minuty, pożądane związki bębące produktami przegrupowania Amadoriego - po 5 minutach, a cukry redukujące po 15-30 minutach. Produkt redukcji żelazocyjanek potasu daje z siarczanem żelazawym błękit pruski, co może służyć do fotometrycznego oznaczenia ilościowego. Kontrolując próbki mieszaniny reakcyjnej w trakcie przebiegu przegrupowania reakcję przerywa się gdy intensywność zabarwienia przestaje wzrastać.

Okazało się, że reakcja ta w mieszaninie, jaką stanowi ekstrakt torfowy przebiega nawet łatwiej niż w mieszaninie odpowiednich cukrów i aminokwasów stosowanej w procesie syntezy.

Dalej okazało się, że pewne substancje zawarte w ekstrakcie torfowym wzmagają efekt biologiczny otrzymanych preparatów w stosunku do aktywności produktów syntetycznych, inne natomiast znacznie ten efekt zmniejszają.

Według wynalazku otrzymuje się ekstrakt torfowy bogaty w cukry i azot aminowy, według znanych procedur opisanych w literaturze. Korzystnym surowcem jest torf niski o wysokim stopniu humifikacji (np. o stopniu H6 do H10 według Posta, Moor und Torf-Kunde, wydawca Karlhans Gottlich, Stuttgart, 3 wyd. 1990 r.) i o wartości stosunku zawartości węgla do azotu w granicach od 15 do 35. Samo otrzymanie ekstraktu wodnego może być przeprowadzone przy użyciu każdej z metod literaturowych, a więc przy odczynie obojętnym, alkalicznym lub kwaśnym albo też w kombinacji tych warunków. Tak na przykład korzystne może być wymywanie torfu przy odczynie

170 294 kwaśnym w temperaturze pokojowej przez krótki okres czasu - przykładowo 1-2 godziny, dla usunięcia części substancji nieorganicznych (węglany, tlenki metali), następnie ekstrahowanie przez kilka do kilkudziesięciu godz. roztworem alkalicznym (przykładowo 0,2% do 0,6% roztworowa NaOH)przy te^aperaturze 20-50°C, co pozwala na częsciow*e rozpuszczenie kwasów hu^musowych i fulwowych, a następnie przez dalsze kilkanaście do kilkudziesięciu godzin ekstrahowanie wodą, korzystnie wodą destylowaną, przy temperaturze 30-60°C. W takim układzie ekstrakt kwaśny odrzuca się, a alkaliczny i wodny łączy się i przerabia dalej.

Znane są trudności związane z oddzieleniem torfu poekstrakcyjnego od ekstraktu, co wymaga w znanych metodach użycia drogich separatorów wirówkowych. Trudności tych unika się według wynalazku przez zastosowanie specjalnego ekstraktora, w którym, torf stanowi fazę stacjonarną i nie jest mieszany, natomiast roztwór cyrkuluje poprzez warstwę torfu. Bliższe szczegóły prowadzenia procesu ekstrakcji ilustrują przykłady zamieszczone w dalszej części opisu.

Alkaliczny ekstrakt wodny zakwasza się według wynalazku do wartości pH roztworu w granicach 1,5 do 3,0 (korzystnie do wartości 2,3-2,5) dla wytrącenia kwasów humusowych. Korzystnie do zakwaszenia stosuje się 6N kwas solny. Po kilkunastu do kilkudziesięciu godzinach osady ulegają sedymentacji i ekstrakt może być znad nich zdekantowany, a pozostałości oddzielone przez odwirowanie lub filtrację.

Ekstrakt zatęża się następnie w wyparce próżniowej do 1/10 pierwotnej objętości lub też może być zatęzony i/lub uwolniony od soli nieorganicznych, po odpowiedniej korekcie pH za pomocą nanofiltracji. Przez termin „nanofiltracja“ rozumie się odmianę procesu odwróconej osmozy, w którym stosuje się membrany o porach przepuszczających jedynie cząsteczki o bardzo małych wymiarach, na przykład proste sole nieorganiczne. Membrany takie nie są na ogół charakteryzowane granicą retencji lecz przepuszczalnością dla chlorku sodowego. Korzystne okazało się stosowanie membran typu HC50PP o przepuszczalności dla NaCl 40-60%; lub typu CA865PP o przepuszczalności 66-74% (produkcja Dow Danmark). Proces prowadzony przy użyciu takich lub zbliżonych membran pozwala na zatężenie roztworu z jednoczesnym częściowym usunięciem elektrolitów, prawie bez strat niskocząteczkowych związków organicznych, które w sposobie według wynalazku (w odróżnieniu od metod znanych) po następnych stadiach obróbki wnoszą również istotny udział do aktywności biologicznej preparatu.

Oba warianty procesów zagęszczania mogą być także kombinowane - korzystnie stosuje się najpierw zagęszczanie w wyparce próżniowej, następnie roztwór neutralizuje się i poddaje nanofiltracji, zagęszczając do zawartości suchej masy 8-12g/100ml. O ile dla określonych zastosowań preparatu wskazany jest wysoki stopień odsolenia, w czasie procesu roztwór może być okresowo, lub w sposób ciągły uzupełniany wodą destylowaną (diafiltracja), a kationy o większych wymiarach (Ca, Fe, Al), które znacznie wolniej migrują przez membrany, mogą być przed rozpoczęciem, procesu nanofiltracji zamienione na kation sodowy przez przepuszczenie roztworu przez kolumnę ze słabo kwasowym wymieniaczem jonowym (przykładowo Amberlite R IRC 50) w formie sodowej.

Po zakończeniu nanofiltracji kontroluje się pH roztworu i w razie potrzeby koryguje do wartości w przedziale od 6,0 do 7,2 - korzystnie zaś do wartości 6,5-6,8 anastępnie przenosi do próżniowej wyparki rotacyjnej i w temperaturze 35-40°C zagęszcza do około połowy objętości (do konsystencji syropu). Następnie przy ciśnieniu atmosferycznym i mieszaniu przez rotację podnosi się temperaturę cieczy do 70-90°C, korzystnie do 80°C i prowadzi ogrzewanie, pobierając próbki początkowo co 30 minut, a po upływie 1,5 godziny - co 15 minut i kontroluje narastanie intensywności zabarwienia w reakcji omówionej uprzednio redukcji żelazicyjanku potasowego. O ile kolejna próba nie wykazuje wzrostu intensywności zabarwienia lub wykazuje spadek tej intensywności reakcję przerywa się przez szybkie schłodzenia łaźni ogrzewającej. Alternatywnym sposobem przeprowadzenia reakcji jest zagęszczenie ekstraktu w sposób poprzednio opisany, następnie rozcieńczenie 50% wodnym roztworem etanolu, użytym w ilości wystarczającej do rozpuszczenia produktu i ogrzewanie pod chłodnicą zwrotną do wrzenia, przy kontroli postępu reakcji jak opisano wyżej (z pobieranych próbek etanol odparowuje się przed przeprowadzeniem testu redukcyjności). Po zakończeniu reakcji alkohol oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem.

170 294

Po oznaczeniu suchej masy produkt reakcji rozcieńcza się wodą destylowaną do stężenia 10%-12% i powoli przepuszcza przez kolumnę wypełnioną niejonową żywicą sorpcyjną typu XAD (produkt firmy Rohm and Haas), korzystnie typu XAD-2 lub XAD-4. W czasie kontaktu z sorbentem najsilniej adsorbowane są związki o cechach hydrofobowych, natomiast najsłabiej związki hydrofilne (przykładowo cukry). Zbierany jest wyciek z kolumny, następnie zaś osobno porcje eluatu wodnego z wymywania kolumny wodą destylowaną. Skład eluatów kontroluje się chromatograficznie i/lub wyrywkowo badając ich aktywność testami biologicznymi. Frakcje eluatów łączy się z wyciekiem w całości lub w ilościach zależnych od ich oznaczonych właściwości i załozonego dla danego preparatu stosunku aktywności określonych w poszczególnych testach biologicznych opisanych poniżej. Następnie najsilniej zaadsorbowane związki eluuje się rozcieńczonym roztworem alkaliów do chwili, gdy wyciek ma jeszcze odczyn obojętny. Dalsze porcje eluatów alkalicznych są odrzucane, gdyż zawierają one substancje silnie hamujące aktywność biologiczną preparatu.

Roztwór po tej operacji poddaje się wyjałowieniu na drodze filtracji membranowej i suszy się w suszarce rozpyłowej, w warunkach sterylnych, przy temperaturze wlotowej powietrza 180-185°C i temperaturze odlotowej około 80°C.

Uzyskuje się beżowy proszek, który przechowywany przy temperaturze pokojowej, w szczelnym naczyniu i bez dostępu światła zachowuje aktywność biologiczną co najmniej przez rok.

Dla oceny aktywności preparatu stosuje się zestaw testów pozwalających ocenić wpływy tego preparatu na poszczególne reakcje układu odpornościowego:

1. Oznaczenie odsetka splenocytów stworzących rozety E, metodą Bacha i Dardenna (Celi. Immunol. 3. 1-16, 1972)

2. Oznaczenie ilości splenocytów produkujących przeciwciała hemolityczne typu IgM - met. Jernego w modyfikacji Mishella i Duttona (J. Exp. Med. 126, 423-442, 1967)

3. Miano przeciwciał hemaglutynacyjnych 19S - 7S i 7S metodą hemaglutynacji czynnej Adlera (J. Immunol. 95, 26-38, 39-47, 1965)

4. Test przeżywalności tymocytów myszy w 20 godzinnych hodowlach z hydrokortyzonem (test cytotoksyczny)

5. Test na indukcję wytwarzania interferonów

6. Test na indukcję wytwarzania TNF (dokładny opis testów 5 i 6 podano w polskim zgłoszeniu patentowym nr P-293464).

We wszystkich wymienionych testach preparat wykazywał stymulację w porównaniu z kontrolnymi próbami: przy stężeniach od 0,05 do 1 mg/kg - w testach 1-3, względnie przy stężeniach od 10 do 100/zg/ml - w testach 5 do 6, lub od 0,05 do 10/(g/ml - w teście 4.

Odnośnie pozostałych cech produktów otrzymywanych według wynalazku, to spełniają one wszystkie wymogi ustalone przez Ministerstwo Zdrowia dla zarejestrowanego w Polsce preparatu biomodulatora PTT (Preparatu Torfowego Tołpy), wyspecyfikowane w normie dla tego preparatu.

Zastosowanie sposobu według wynalazku pozwala na uzyskiwanie wydajności 10 razy wyższej niż przy stosowaniu metody według polskiego opisu patentowego nr 124 110, zmniejsza więc zuzycie cennego surowca jakim jest torf. Torf poekstrakcyjny według obecnego wynalazku przemywany jest w ekstraktorze (in situ) wodą po zakończeniu ekstrakcji, nie zawiera więc zanieczyszczeń (alkaliów lub kwasów) i nie stanowi zagrożenia ekologicznego lecz przeciwnie może być wykorzystany w ogrodnictwie.

Sposób według wynalazku eliminuje też potrzebę stosowania w produkcji niebezpiecznych rozpuszczalników jak eter etylowy. Dzięki zwiększeniu zawartości aktywnych związków, także w postaci związków o niższym ciężarze cząsteczkowym, resorpcja preparatu przy podawaniu doustnym jest ułatwiona.

Wynalazek bliżej objaśniają poniższe przykłady:

Przykład I. W półtechnicznym ekstraktorze specjalnym do torfu umieszczono 45 kg torfu o wilgotności 64-65%, rozdrobnionego i przesianego przez sito z otworami o średnicy 14 mm. W zbiorniku zasilającym przygotowano 1801 0,4% ługu sodowego. Następnie uruchomiono bardzo powolny przepływ ługu przez złoze tak, że poziom cieczy początkowo wzrastał z prędkością około 1 cm/min. Po wypełnieniu ekstraktora przepływ zwiększono stopniowo do prędkości 5001/godz.

170 294

Cyrkulację ługu utrzymywano przez 27 godz. przy temperaturze cieczy 40°C ( + /-2°C). Po tym czasie zatrzymano pompę i przełączono zawory na komunikację z drugim zbiornikiem, w którym przygotowano 1201 wody destylowanej i kontynuowano cyrkulację przez dalsze 16 godzin przy tej samoj ΛΛθί¹

OUU1UJ UkUl. £->\c ~~t\s V-.··

Ekstrakty alkaliczne i wodny połączono, uzyskując w sumie 2401 cieczy, po zdekantowaniu znad niewielkiej ilości zawiesiny, o pH = 12,1. Otrzymany połączony ekstrakt zachowano do dalszego przerobu. Całość podzielono na dwie połowy i każdą z nich przerabiano oddzielnie.

Przykład II. Połowę ekstraktu otrzymanego w powyższym przykładzie I przerabiano w następujący sposób: Porcję 1201 ekstraktu zakwaszono do pH = 2,1 zużywając do tego celu 1,61 6N kwasu solnego. Pozostawiono zawiesinę do sedymentacji kwasów humusowych na 24 godziny. Po tym czasie zdekantowano 751 klarownego roztworu odzyskując dalsze 251 przez filtrację osadu. Połączone roztwory zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce cyrkulacyjnej szklanej (Simax) do objętości 191. Następnie skorygowano pH ługiem sodowym do wartości 6,8. Roztwór przefiltrowano, rozcieńczono wodą destylowaną do objętości 501 i poddano nanofiltracji w urządzeniu LabUnit M20 (firmy Dow Separation System Danmark), wyposażonym w membrany płaskie typu HC50PP o sumarycznej powierzchni filtrującej 0,36 m ², przy ciśnieniu 2MPa i temperaturze 21°C, prowadząc filtrację do końcowej objętości cieczy 71. Zagęszczony ekstrakt miał pH = 6,6 i nie wymagał korekty pH przed następną operacją.

Ekstrakt przeniesiono do wyparki próżniowej rotacyjnej (Buchi, Szwajcaria) i zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości około 1,31. Następnie, już pod ciśnieniem atmosferycznym, podniesiono temperaturę do 80°C i kontynuowano ogrzewanie przy mieszaniu przez rotację, kontrolując postęp reakcji przez oznaczenie w pobieranych próbkach wzrostu intensywności zabarwienia w reakcji redukcji żelazicyjanku potasu. Po 2 godzinach i 15 minutach nastąpiła stabilizacja i nieznaczny spadek intensywności zabarwienia. Reakcję przerwano przez ochłodzenie do temperatury 20°C, przeniesiono roztwór do mniejszej wyparki laboratoryjnej i dodatkowo zagęszczono pod próżnią do objętości 800 ml (sucha masa wynosiła 13,25 g/100 ml). Po przesączeniu roztwór przepuszczono przez kolumnę o średnicy 26 mm ze złożem sorbenta XAD-2 (270 ml) z prędkością 0,8ml/min. Po zebraniu wycieku złoże eluowano wodą destylowaną, zbierając 3 kolejne frakcje (1-3) o objętościach: 160 ml, 240 ml i 400 ml. Następnie jako eluat wprowadzono 0,1% roztwór ługu sodowego zbierając jeszcze frakcję 4 o objętości 220 ml i pH = 7,0 (do momentu wzrostu pH eluatu). Skład frakcji kontrolowano chromatograficznie (HP-LC). Frakcje nr 1i 2 oraz 300 ml z frakcji 3 i 150 ml z frakcji 4 połączono, zagęszczono do objętości 100 ml i dołączono do wycieku. Roztwór wyjałowiono przez filtrację w sterylnych warunkach przez membranę o porach 0,22 pm i wysuszono w warunkach sterylnych w suszarce rozpyłowej przy temperaturze wlotowej powietrza 185°C i odlotowej 81°C. Otrzymano 96g końcowego produktu.

Przykład III. Drugą połowę ekstraktu otrzymanego w powyższym przykładzie I przerabiano w następujący sposób: Porcję 1201 ekstraktu zakwaszono (jak w przykładzie II) do pH = 2,3 oddzielono osady humusowe jak poprzednio uzyskując 981 kwaśnego roztworu. Roztwór zobojętniono 4N roztworem NaOH do pH — 6,7 pozostawiono na 12 godzin, przefiltrowano i poddano nanofiltracji w warunkach opisanych w przykładzie II. Po zagęszczeniu do objętości 10 litrów dodano 20 litrów wody destylowanej, zagęszczono ponownie do 101, dodano 201 wody destylowanej i zagęszczono do końcowej objętości 7 litrów. Dalej przerabiano jak w przykładzie II z tym, że czas reakcji tworzenia połączeń Amadoriego wynosił w tym przypadku 110 minut. Otrzymano 84 g końcowego produktu.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania z torfu aktywnego, nietoksycznego preparatu o działaniu immunomodulacyjnym i stymulującym wytwarzanie w organizmie cytokin, nadającego się do stosowania w lecznictwie i profilaktyce u ludzi i zwierząt, obejmujący ekstrakcję surowca torfowego i uwolnienie ekstraktu od substancji humusowych przez wytrącenie w środowisku kwaśnym, znamienny tym, że ekstrakt torfowy uwolniony od substancji humusowych przez zakwaszenie kwasem solnym do pH w granicach 1,5-3,0 i oddzielenie wytrąconych substancji zatęża się przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem i/lub na drodze procesu nanofiltracji z jednoczesnym usunięciem soli nieorganicznych, po czym ustala się odczyn otrzymanego roztworu w granicach wartości pH od 6,0 do 7,2, zagęszcza się go do konsystencji syropu i ogrzewa w temperaturze 70-90°C, korzystnie 80°C, przez czas potrzebny do zajścia reakcji przegrupowania Amadoriego z utworzeniem związków aminokwasowych i/lub peptydowych podstawionych przy grupie aminowej, niezwiązanej wiązaniem peptydowym, resztą odpowiedniej 1- deoksy-2-ketozy przyłączonej węglem C1 do grupy aminowej, której to reakcji ulegają połączenia powstające z obecnych w ekstrakcie cukrów, wielocukrów i/lub polisacharydów oraz aminokwasów i/lub peptydów, i którą to reakcję przerywa się po osiągnięciu optymalnego stopnia przemiany przez schłodzenie, po czym z otrzymanego produktu usuwa się substancje o charakterze hydrofobowym, obniżające aktywność immunotropową preparatu przez selektywne zaadsorbowanie ich na specyficznej wysokoporowatej, niejonowej żywicy sorpcyjnej, będącej aglomeratem olbrzymiej ilości niewielkich polistyrenowych mikroperełek, lub innej żywicy o analogicznych właściwościach.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wyjściowy ekstrakt stosuje się mieszanię ekstraktu alkalicznego i wodnego, otrzymanych przez kolejne ekstrahowanie roztworem ługu i wodą torfu, ewentualnie uprzednio krótko przemytego roztworem kwasu.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako surowiec torfowy stosuje się torf niski o stopniu humifikacji H6 do H10.
4 Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze sorpcję niepożądanych substancji prowadzi się przy odczynie kwaśnym lub obojętnym, a następnie eluuje się wodą destylowaną i rozcieńczonymi alkaliami.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkty wydziela się w postaci stałej przez wysuszenie w suszarce rozpyłowej, ewentualnie po uprzedniej sterylizacji.