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Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids mit Anticancerwirkung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids mit Anticancerwirkung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass fein zerteilte Blätter und Stengel von zumindest einer Pflanze der Familie Gramineae oder Melassen davon, u. zw. solche der Gattungen Sasa, Phyl- lostachys, Pleioblastus, Oryza, Hordeum, Triticum, Avena, Miscanthus, Phragmites, Setaria, Panicum, Sorghum, Tea und Saccharum, mit Wasser extrahiert werden und durch Einengen des Filtrates ein Rohextrakt hergestellt wird, welcher gegebenenfalls durch Dialyse, Aussalzen, Behandlung mit Ionenaustauscherharzen und mit Entfärbungsharzen oder Bleiacetat oder durch Kombination mehrerer dieser Massnahmen gereinigt wird.
Im Vergleich mit bekannten Anticancerwirkung besitzenden Stoffen zeigen die erfindungsgemäss herstellbaren Stoffe beträchtliche Anticancerwirkung ohne Nebeneffekte. Untersuchungen der erfindungsgemäss herstellbaren Stoffe geben, wie später noch im einzelnen erläutert wird, Anlass zu der Annahme, dass es sich hiebei um eine Art von Polysacchariden handelt. Der Wirkungsme- chanismus dieser Stoffe in von Tumoren befallenen Tieren ist äusserst interessant und wird im folgenden im einzelnen erläutert.
Beispiele für das erfindungsgemässe Verfahren brauchbarer Rohstoffe sind
Phyllostachys pubescens MAZEL,
Pleioblastus Simonii NAKAI,
Pleioblastus Chino MAKINO forma
Phyllostachys bambusoides SIEB, e ZUCC.,
Phyllostachys nigra MUNRO,
Sasa nipponica MAKINO et SHIBATA,
Sasa albo-marginata MAKINO et SHIBATA,
Sasa paniculata MAKINO et SHIBATA,
Pleioblastus Chino MAKINO,
Pleioblastus variegatus MAKINO var.
Insbesondere Sasa albo-marginata, MAKINO et SHIB, Sasa paniculata, MAKINO et SHIB, oder nahe Verwandte dieser in vielen Gebieten Japans wild wachsenden Pflanzen sind brauchbar. Prinzipiell werden die Blätter und Stengel dieser Pflanzen als Rohstoffe verwendet.
Weitere für das erfindungsgemässe Verfahren als Ausgangsstoffe geeignete Pflanzen sind beispielsweise
Oryza sativa L.,
Hordeum vulgare L. var. Hexastichon ASCHERS.,
Triticum aestivum L.,
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Avena fatua L.,
Miscanthus sinensis ANDERSS.,
Phragmites communis TRINIUS,
Setaria italica BEAUV..
Panicum miliaceum L.,
Sorghum bicolor MOENCII,
Zea Mays L.,
Saccharum officinarum L.
Von diesen Pflanzen werden prinzipiell die Blätter und Stengel verwendet.
Ein weiteres für das erfindungsgemässe Verfahren brauchbares Rohmaterial sind Bagassen von Saccharum officinarum L. Wenn Polysaccharidfraktionen mit Anticancerwirkung aus Pflanzen der Gruppe Gramineae hergestellt werden, sind grosse Mengen der entsprechenden Pflanzen erforderlich. Aus diesem Grunde ist das Sammeln und das Verladen der Rohstoffe nicht leicht. Diese Rohstoffe in grossen Mengen zur Herstellung der Stoffe mit Anticancerwirkung zu verwenden, ist wenig zweckmässig.
Wenn jedoch Melassen und Bagassen als Rohstoffe verwendet werden, können die Stoffe mit Anticancerwirkung in vorteilhafter Weise und in grossem Massstab hergestellt werden, da Melassen von Saccharum offici- narum L. in grossen Mengen anfallen und geringen Preis besitzen, weiters eine Extraktion der als Ausgangsstoff verwendeten Pflanze mit heissem Wasser nicht notwendig ist und die Reinigung vereinfacht wird. Ein weiteres für das erfindungsgemässe Verfahren brauchbares Rohmaterial ist Rohzucker von Saccharum officinarum L.
Im folgenden wird das erfindungsgemässe Verfahren durch Beispiele erläutert, in welchen Bambus, Bambusgras und andere Pflanzen der Familie Gramineae als Rohstoffe verwendet werden.
Bei Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden die frischen Rohstoffe in kleine Stücke geschnitten oder nach dem Ernten getrocknet und konserviert. Je nach Erfordernis werden diegeschnittenen und konservierten Rohstoffe verwendet. Um die Extraktion zu erleichtern, ist es wünschenswert, die Rohstoffe vor ihrer Verwendung so weitgehend als nur möglich zu zerkleinern.
Die Extraktion mit heissem Wasser kann derart durchgeführt werden, dass die Rohstoffe mit einer entsprechenden Menge Wasser in ein Gefäss aus rostfreiem Stahl oder Eisen eingebracht und darin auf 60 - 1000 C erhitzt werden. Im Falle, dass im Laufe der Zeit der pH-Wert des Extraktes sich nach dem sauren Bereich hin verschiebt, ist es von Vorteil, den PH-Wert mittels anorganischer schwacher Basen, beispielsweise Natriumkarbonat, Calciumhydroxyd u. dgl. auf 5 - 9 einzustellen, um die Extraktion zu fördern. Im allgemeinen wird zweimal extrahiert und wenn das Filtrat alkalisch ist, wird es mit Säuren neutralisiert. Anschliessend wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt.
Das erhaltene Konzentrat wird mit einer semipermeablen Membran, beispielsweise einer Membran aus Zellophan, in Berührung gebracht und einer Dialyse mit Wasser unterworfen, das, um Stoffe niedrigen Molekulargewichtes zu entfernen, an der andern Seite der Membran 24 - 48 h vorbeigeführt wird.
Anschliessend wird das Konzentrat unter vermindertem Druck auf eine geeignete Konzentration eingeengt. Sodann wird das Konzentrat mit Ammonsulfat oder Natriumchlorid gesättigt und 24 h stehen gelassen, worauf der entstandene Niederschlag abfiltriert wird. Nach einmaligem Auswaschen des Niederschlages mit gesättigter Ammonsulfatlösung wird der Niederschlag in Wasser gelöst, worauf die erhaltene Lösung zwecks Entfernung anorganischer Salze dialysiert wird. Nun wird die nicht weiter dialysierbare Flüssigkeit mit Essigsäure oder Trichloressigsäure angesäuert, um Proteine abzutrennen.
Die erhaltene saure Flüssigkeit wird über ein Entfärbungsharz, beispielsweise Duolite S-30 (gebrauchsfertiges Harz der Chemical Process Co.) geleitet, wobei dunkelbraune Verunreinigungen, welche keine anticancerogene Wirksamkeit besitzen, am Harz niedergeschlagen werden und die Flüssigkeit nahezu vollständig entfärbt wird. Zwecks Entfärbung der Lösung kann auch eine Behandlung derselben mit Bleiacetatvorgenommen werden, da dadurch färbende Stoffe und andere Verunreinigungen ausgefällt werden. Über-
EMI2.1
mittel, beispielsweise Methanol, Äthanol und Aceton, zugegeben wird. Zum gleichen Zweck kann auch zur Trockne eingedampft werden. Gemäss der Erfindung ist dieAnticancerwirkung des hergestellten Polysaccharids grösser, wenn ein Aussalzen vorgenommen wird.
Rohextrakt von Bambus und Bambusgras enthält verschiedene Stoffe, darunter auch solche, die auf KrebsgeschwUre wachstumsbeschleunigend wirken. Die Dialyse, das Aussalzen, die Behandlung mit einem lonenaustauschsalz, die Behandlung mit einem entfärbenden Harz und die Behandlung mit Bleiacetat kann in anderer Reihenfolge als der angege-
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benen vorgenommen werden. Bei angeänderter Reihenfolge der Behandlungsstufen wird im wesentlichen ein Produkt mit denselben Eigenschaften erhalten, wobei jedoch die auftretenden Schwierigkeiten beim Arbeiten anders geartet sind und andere Ausbeuten erzielt werden.
Das erfindungsgemäss hergestellte Polysaccharid ist nicht hygroskopisch, stellt ein hellgraues oder blasses gelblichbraunes Pulver dar, ist leicht löslich in Wasser aber unlöslich in den üblichen organischen
EMI3.1
BeidenFarbreaktionen mito-Naphtol-HTriptophan-HSO, Anthron-HSO u. dgl. reagieren diese Stoffe positiv und die Fehling-, Benedictund Tollenreaktion verläuft negativ. Sie sind nicht reduzierbar. Auch die Elson-Morgan-, Ninhydrinund Biuretreaktion ist negativ. Polypeptide und Proteine sind nicht vorhanden. Weiters zeigt dieses Polysaccharid kein Absorptionsmaximum im Ultraviolett oberhalb 220 mp. Das bedeutet, dass Nukleinsäuren und Proteine nicht anwesend sind. Das Infrarotabsorptionsspektrum ist typisch für Polysaccharide.
Absorptionslinien, welche auf Hydroxylgruppen zurückzuführen sind, verschwinden bei der Acetylierung dieser Stoffe. Es wird angenommen, dass die erfindungsgemäss herstellbaren Polysaccharide ss-Polysaccharide sind.
Die Elementaranalyse des erfindungsgemäss herstellbaren Polysaccharids ergibt 44-46% C und 5, 94% H. Spuren an Asche und Stickstoff sind darin enthalten, aber Schwefel und Phosphor sind darin nicht enthalten. Dieses Polysaccharid ist ein nicht hygroskopisches Pulver, welches in Wasser löslich, in den üblichen organischen Lösungsmitteln jedoch unlöslich ist, neutral reagiert, wärmebeständig ist, jedoch beim Erhitzen im neutralen oder sauren Milieu zersetzt wird. Dieses Polysaccharid enthält keine reduzierenden Zucker, Monosaccharide, Aminozucker und Aminosäuren. Die Prüfung auf Harnsäure verläuft negativ. Die Elementaranalyse des Acetylderivats ergibt die Summenformel (C 30 400 20) bei 49,72 % C und 5, 59 % H.
Bei Hydrolyse des erfindungsgemäss herstellbaren Polysaccharids mit n-6chwe- felsäure bei 1000 C über 22 h werden im wesentlichen drei Monosaccharide erhalten. Durch Papierchromatographie und Säulenchromatographie über stark basische Ionenaustauschharze wurde festgestellt, dass diese Monosaccharide Xylose, Arabinose und Galactose sind.
Die Anticancerwirkung des erfindungsgemäss herstellbaren Polysaccharids wurde wie folgt festgestellt, wobei sowohl festes Ehrlich-Carcinom und Sarcom-180 verwendet wurde. 2000000 - 6000000 Krebs- zellen in einer eine Woche alten, ascitischen Flüssigkeit wurden auf den Rücken einer Maus subkutan verpflanzt. Eine Versuchsgruppe bestand aus 10 Mäusen. Eine dieser Versuchsgruppen diente Vergleichszwecken und in dieser Gruppe wurde die Behandlung mit physiologischer Kochsalzlösung vorgenommen.
Die Verabreichung der Chemikalien erfolgte 24 h nach der Implantation intraperitoneal jeden zweiten Tag und wurde 11 mal wiederholt. Die Wachstumsbedingungen des eingepflanzten Carcinoms und Sarcoms werden in Abhängigkeit von der Zeit festgehalten. Nach 25 Tagen wird das Durchschnittsgewicht der Maus, das Inhibitionsverhältnis des Tumorwachstum, das Rückbildungsverhältnis des Tumors und die Sterblichkeitsrate der Mäuse festgestellt und mit den entsprechenden Werten der Vergleichsgruppe verglichen. Die anticancerogene Wirkung des durch Extraktion des Rohmaterials erhaltenen Rohextraktes und die anticancerogene Wirkung des gemäss Beispiel 1 erfindungsgemäss hergestellten Polysaccharids mit Anticancerwirkung sind in Tabelle I und II gezeigt.
Tabelle I
EMI3.2
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> auf <SEP> Ehrlich-Carcinom
<tb> Durchschnitt- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> liche <SEP> inhibi-
<tb> Änderung <SEP> tationsdes <SEP> Körper- <SEP> Sterb- <SEP> ver- <SEP> RückVerabreichte <SEP> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> lieh-hältnis <SEP> bildung
<tb> Stoff <SEP> (mg/kg) <SEP> (g) <SEP> keit <SEP> (0/0) <SEP> in <SEP> (%)
<tb> Rohextrakt <SEP> 600 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 0/10 <SEP> 97, <SEP> 3 <SEP> 50
<tb> Polysaccharid
<tb> gemäss <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> + <SEP> 3, <SEP> 21 <SEP> 0/10 <SEP> 96,5 <SEP> 90
<tb> Vergleichsstoff <SEP> Saline <SEP> +3,
<SEP> 17 <SEP> 0/10-0 <SEP>
<tb>
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Tabelle II
EMI4.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> auf <SEP> Sarcom-180
<tb> Durchschnittli-Tumorehe <SEP> inhibi <SEP> - <SEP>
<tb> Änderung <SEP> tationsdes <SEP> Körper- <SEP> Sterb- <SEP> ver- <SEP> Rück- <SEP>
<tb> Verabreichte <SEP> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> lieh-tiältnis <SEP> bildung
<tb> Stoff <SEP> (mg/kg) <SEP> (g) <SEP> keit <SEP> ('lu) <SEP> in <SEP> (0/0) <SEP>
<tb> Rohextrakt <SEP> 600 <SEP> +2,5 <SEP> 0/10 <SEP> 79 <SEP> 80
<tb> Polysaccharide
<tb> gemäss <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> +2,3 <SEP> 0/10 <SEP> 93 <SEP> 80
<tb> Vergleichs-Saline <SEP> +2,8 <SEP> 0/10-0
<tb> Stoff
<tb>
Das gemäss Beispiel 1 hergestellte gereinigte Polysaccharid wirkt in Mengen von 50 mg/kg gegen Ehrlich-Carcinom und Sarcom-180 stark anticancerogen und kann Tumore in den meisten Tieren rückbilden.
Die inokulierten Zellen wachsen bis etwa zum elften Tag nach der Implantation allmählich weiter, jedoch setzt vom elften Tag an eine Rückbildung des Tumors in jener Gruppe von Tieren ein. wel- che mit dem erfindungsgemäss hergestellten Polysaccharid behandelt wurden. Etwa nach dem zwanzigsten Tag verschwindet der Tumor grösstenteils. Auch dann, wenn Reste des Tumors bestehen bleiben, handelt es sich nur mehr um kleine Klümpchen von Bindegewebe. Eine solche Wirkung kann in der Vergleichszwecken dienenden Tiergruppe nicht festgestellt werden.
Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt konnte nicht festgestellt werden, dass irgend einer der Stoffe, von welchen gesagt wird, dass sie wirksame Krebsbehandlungsmittel darstellen, solche feste Tumore ohne gleichzeitige Verringerung des Körpergewichtes des vom Tumor befallenen Tieres rückbilden und keine Nebeneffekte zeigen. Die Eigenschaften des erfindungsgemäss hergestellten Stoffes sind beachtlich.
Im folgenden wird die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens bei Verwendung von Melassen als Ausgangsstoff erläutert. Hiebei werden gemäss der Erfindung Melassen unter Verwendung einer semipermeablen Membran, z. B. einem Zellophanpapier, gegen fliessendes Wasser dialysiert, um in der Melasse enthaltene Stoffe niedrigen Molekulargewichtes, z. B. Rohrzucker, Invertzucker, stickstoffhaltige Verbindungen, Asche u. dgl. zu entfernen. Das nicht Dialysierbare wird sodann weiterbehandelt, wobei die nicht dialysierbaren Stoffe durch Sättigung der Lösung mit anorganischen Salzen, beispielsweise Ammonsulfat, ausgesalzen werden und die Proteine durch Ansäuern entfernt werden. Anschliessend wird mit Entfärbungsharz behandelt. Erforderlichenfalls wird eine Behandlung mit Bleiacetat und eine Behandlung mit einem Ionenaustauschharz durchgeführt, um eine Feinreinigung zu erzielen.
Die Reihenfolge der verschiedenen Massnahmen kann je nach Erfordernis abgeändert werden.
Für das erfindungsgemässe Verfahren als Rohstoffe geeignete Melassen fallen bei der Rohrzuckergewinnung, also bei der Herstellung von Rohrzucker durch Einengung des bei der Extraktion von Zuckerrohr erhaltenen Extraktes oder bei der Reinigung von rohem Rohrzucker, an.
In Melassen ist noch eine beträchtliche Menge an Rohrzucker oder Invertzucker enthalten. Auch hochmolekulare Polysaccharide liegen vor. Der erfindungsgemäss herstellbare Stoff mit anticancerogener Wirksamkeit ist ein bestimmter Bestandteil dieser hochmolekularen Stoffe und kann durch anorganische Salze, beispielsweise Ammonsulfat ausgesalzen werden. Dementsprechend kann das gewünschte Polysaccharid mit Anticancerwirkung auch erhalten werden, indem ohne vorhergehende Dialyse dieses Polysaccharid ausgesalzen wird, worauf organische und anorganische Verunreinigungen mittels Bleiacetat oder Ionenaustauschharzen entfernt werden können. Um jedoch eine besonders wirksame Reinigung bewerkstelligen zu können, ist es von Vorteil, zunächst eine Dialyse vorzunehmen, um den grössten Teil der Stoffe niederen Molekulargewichtes zu entfernen.
Die Dialyse der Melassen wird unter Verwendung einer semipermeablen Membran, beispielsweise Zellophanpapier, während 24 h gegen fliessendes Wasser vorgenommen, wobei allerdings die Dauer der Dialyse je nach dem verwendeten Rohstoff und der Konzentration desselben, je nach dem verwendeten
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Gefäss oder andern Gegebenheiten verschieden gewählt werden kann. Die meisten durch Dialyse entfernbaren Stoffe werden innerhalb 12 - 24 h ausgelaugt. Als semipermeable Membran kann eine Membran aus tierischen Häuten, beispielsweise Schweinsblase, eine Kollodiummembran u. dgl. verwendet werden. Zellophanpapier, welches seiner Natur nach homogen ist und grosstechnisch hergestellt wird, ist besonders geeignet.
Nach der Dialyse wird die durch Dialyse nicht entfernbares Material enthaltende Lösung unter vermindertem Druck eingeengt. Nachdem auf eine geeignete Konzentration eingeengt wurde, wird die Lösung bei Raumtemperatur mit anorganischen Salzen gesättigt, worauf die gesättigte Lösung über Nacht stehengelassen wird. Als anorganisches Salz kann Natriumchlorid verwendet werden. Da jedoch mit Ammoniumsulfat gute Ausbeuten erzielt werden, ist dieses das geeignetste anorganische Salz. Nach dem Abzentrifugieren des Niederschlages und nach mehrmaligem Waschen desselben mit einer gesättigten Salzlösung wird der Niederschlag wieder in Wasser gelöst, worauf die verschiedenen anorganischen Salze entweder durch Dialyse oder unter Verwendung von lonenaustauschharzen entfernt werden.
Die verbleibende Lösung wird auf eine zweckentsprechende Konzentration eingeengt, worauf durch Ansäuern des Konzentrats, beispielsweise mittels Trichloressigsäure oder Essigsäure, Proteine entfernt werden. Das klare saure Filtrat wird auf eine mit Entfärbungsharz, beispielsweise aktiviertem Duolite - S - 30 oder Duolite A-7 (Chemical Process Co.) gefüllte Kolonne aufgegeben und der Ablauf aus der Kolonne wird unter vermindertem Druck auf eine zweckentsprechende Konzentration eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wird entweder mit mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln. beispielsweise Methanol, Äthanol, Aceton u. dgl. vermischt, um eine Fällung zu erzielen oder zur Trockne eingedampft.
Zwecks Reinigung des erhaltenen Produktes kann erforderlichenfalls eine Behandlung mit Bleiacetat oder mit einem lonenaustauschharz vorgenommen werden, um ein Produkt bestimmter Qualität zu erhalten. Das so erhaltene Polysaccharid wird weder mit dem Bleiacetat gefällt noch am Ionenaustauschharz adsorbiert.
Auch wenn das Aussalzen unterlassen und das Protein aus der durch Dialyse nicht weiter reinigbaren Lösung direkt entfernt wird, kann eine Polysaccharidfraktion erhalten werden. Im Hinblick auf die vorzunehmende Reinigung ist es jedoch von Vorteil, ein Aussalzen vorzunehmen, obzwar hiedurch die erzielbare Ausbeute etwas verringert wird. Die Reinigung kann derart vorgenommen werden, dass der Rohstoff ohne vorhergehende Dialyse einem Aussalzen unterworfen wird, die ausgesalzenen Stoffe gesammelt und einer Dialyse unterworfen werden, worauf die Proteine entfernt werden und eine Behandlung mit den Harzen vorgenommen wird. Bei einem solchen Vorgehen treten jedoch bei Verwendung eines viskosen Rohstoffes grössere Verluste auf als sonst.
Die Wirkstoffe werden durch das Aussalzen mit hohem Wirkungsgrad konzentriert, jedoch werden hiebei auch Verunreinigungen, wie Proteine und färbende Bestandteile, konzentriert. Es ist aus diesem Grunde zweckmässig, die Proteine in der üblichen Weise zu entfernen. Da jedoch die Menge der vorhandenen Proteine gering ist, kann diese Massnahme entfallen. Sowohl Proteine als auch färbende Begleitstoffe werden bei der Behandlung mit Entfärbungsharz am Harz festgehalten und damit entfernt. Auch bei der Behandlung mit Bleiacetat werden färbende Begleitstoffe und andere Verunreinigungen mit Erfolg abgetrennt.
Die Anticancerwirkung des erfindungsgemäss aus Melasse hergestellten Polysaccharids wurde in der oben erwähnten Weise bestimmt und die erhaltenen Ergebnisse sind in den unten stehenden Tabellen III und IV angegeben.
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Tabelle III
EMI6.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> auf <SEP> Ehrlich-Carcinom
<tb> TumorinhiDurch-bitationsDurchschnitt-schnitt-ver-Rückliche <SEP> Änderung <SEP> Sterb- <SEP> liches <SEP> hält- <SEP> bilDosierung <SEP> des <SEP> Körper- <SEP> lich- <SEP> Gewicht <SEP> nis <SEP> dung
<tb> (mg/kg) <SEP> gewichtes(g) <SEP> keit <SEP> des <SEP> Tumors(g) <SEP> (%) <SEP> in(%)
<tb> Vergleichs- <SEP> physiologigruppe <SEP> sche <SEP> Koch- <SEP> +2, <SEP> 82 <SEP> 0/10 <SEP> 1, <SEP> 38-0
<tb> salzlösung
<tb> Behandelte
<tb> Gruppe <SEP> 100 <SEP> +3,
<SEP> 4 <SEP> 0/10 <SEP> 0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb>
Tabelle IV
EMI6.2
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> auf <SEP> Sarcom-180
<tb> TumorDurch-inhischnitt-bitationsDurchschnitt- <SEP> liches <SEP> ver- <SEP> Rück- <SEP>
<tb> liche <SEP> Änderung <SEP> Sterb- <SEP> Gewicht <SEP> hält- <SEP> bilDosierung <SEP> des <SEP> Körper- <SEP> lich- <SEP> des <SEP> nis <SEP> dung
<tb> (mg/kg) <SEP> gewichtes <SEP> (g) <SEP> keit <SEP> Tumors <SEP> (g) <SEP> (0/0) <SEP> in <SEP> (%)
<tb> Vergleichsgruppe <SEP> 0 <SEP> +2, <SEP> 42 <SEP> 0/10 <SEP> 1,83 <SEP> 0
<tb> Behandelte
<tb> Gruppe <SEP> 50 <SEP> +2, <SEP> 6 <SEP> 0/10 <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP> 94 <SEP> 80
<tb>
Wie sich aus den obigen Tabellen deutlich ergibt,
zeigt das erfindungsgemäss aus Melasse hergestellte Polysaccharid eine beträchtliche Wirksamkeit gegen Ehrlich-Carcinom und Sarcom-180 und ist dazu geeignet Tumore in Mäusen rückzubilden. Die in Tiere der beiden Versuchsgruppen, u. zw. der Gruppe der behandelten Tiere und der Vergleichsgruppe von Tieren, eingepflanzten Tumore wuchsen allmählich bis zum elften Tag nach der Übertragung. Nach dem elften Tag wurden die Tumore in Tieren, welche mit dem erfindungsgemäss hergestellten Polysaccharid behandelt wurden, allmählich reduziert und etwa um den zwanzigsten Tag verschwanden die Tumore nahezu zur Gänze. Nach den Tumoren zurückbleibende Reste stellen kleine Klümpchen von Bindegewebe dar. Diese Erscheinung konnte an Tieren der Vergleichsgruppe nicht festgestellt werden.
Tieren, an welche das erfindungsgemäss hergestellte Polysaccharid verabreicht wurde, wachsen normal und eine toxische Wirkung konnte nicht festgestellt werden. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind keine chemischen Verbindungen mit so starker anticancerogener Wirksamkeit bekanntgeworden und hiebei keine Nebeneffekte zeigen.
Das Verfahren zur Herstellung des Rohextraktes, die Toxizität und die Anticancerwirkung desRohextraktes, die Reinigung des Rohextraktes, die Eigenschaften des gereinigten Materials, die Hydrolyse des gereinigten Materials und die Anticancerwirkung des gereinigten Polysaccharids u. dgl., welches aus Bambus und Bambusgras erhalten wurde, wird im folgenden im einzelnen beschrieben.
I. Rohextrakt :
Blätter wurden getrocknet, in feine Stücke geschnitten und dann 5 h mit der siebenfachen Menge des Rohmaterials an Wasser bei 90-100 C unter Rühren extrahiert. Soferne der Extrakt im Laufe der
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Zeit sauer wurde, wurde eine geringe Menge an Calciumhydroxyd zugegeben, um den PH-Wert im Neutralbereich zu halten. Nach dem Kühlen wurde der Extrakt filtriert und das Filtrat unter verminder - tem Druck zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Pulver wird "Rohextrakt" genannt. Die Analyse des
Rohextraktes war 1, 96% N, 24, 6% Asche.
Toxizität des Rohextraktes :
Die akute Toxizität wurde an Mäusen (DDY-Stamm) mit einem Gewicht von 18 bis 20 g bestimmt.
Wenn ü25 mg/kg eines aus Sasa albo-marginata (Makino et Shibata), welches im Feber 1962 bei Mt. Tanzawa geerntet wurde, hergestellten Rohextraktes den Mäusen intravenös injiziert wurde, blieb die
Maus am Leben, bei Injektion von 1250 mg Rohextrakt/kg starb die Maus unmittelbar nach der lnjektion. Bei intraperitonealer Injektion in einer Menge von 1000 mg/kg blieben von 10 Mäusen 7 Mäuse am
Leben, jedoch starben bei Verabreichung von 2500 mg/kg alle Mäuse innerhalb von 24 h.
Anticancerwirkung :
Die Anticancerwirkung des Rohextraktes auf transplantationsfähige Mäusetumore wurde ebenfalls geprüft. a. Ascitische Tumore :
Einzelheiten über die angewendete Methode sind dem Abschnitt VI zu entnehmen. Die an asciti- sehen Tumoren beobachteten Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt.
Tabelle V
EMI7.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> des <SEP> Rohextraktes <SEP> auf <SEP> ascitische <SEP> Tumore
<tb> Durchschnittliche <SEP> Überlebens- <SEP>
<tb> dauer <SEP> in <SEP> Tagen
<tb> Verabreichter <SEP> Dosierung <SEP> Ehrlich- <SEP>
<tb> Stoff <SEP> (mg/kg) <SEP> Carcinom <SEP> Sarcom-180 <SEP>
<tb> Vergleichsstoff <SEP> Kochsalzlösung <SEP> 12,2 <SEP> 15,8
<tb> Kuma-sasa <SEP> vom
<tb> Mt. <SEP> Tanzawa
<tb> Feber <SEP> 1962 <SEP> 600 <SEP> 13,2 <SEP> 18,6
<tb> Kuma-sasa <SEP> vom
<tb> Mt. <SEP> Tanzawa
<tb> Feber <SEP> 1962 <SEP> 400 <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Kuma-sasa <SEP> vom
<tb> Mt. <SEP> Tanzawa
<tb> Feber <SEP> 1962 <SEP> 200 <SEP> 14,2
<tb>
Mit Ausnahme einer Maus, welche mehr als 50 Tage weiterlebte.
Wenn ein Rohextrakt, der aus am Mt. Tanzawa geerntetem Rohmaterial hergestellt wurde, in einer
Menge von 600 oder 200 mg/kg intraperitoneal injiziert wurde, sowarbeiEhrlich-Carcinomund
Sarcom-180 die Überlebensquote Null. b. Subkutaner Tumor :
Einzelheiten der angewendeten Methode sind dem Abschnitt VI zu entnehmen.
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Tabelle VI
EMI8.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> des <SEP> Rohextraktes <SEP> auf <SEP> subcutan <SEP> eingepflanztes
<tb> Ehrlich-Carcinom.
<tb>
Durchschnittliche <SEP> Durch-
<tb> Änderung <SEP> schnittliches <SEP> Tumor-Tumordes <SEP> Tumor-Sterb-inhibitions-entVerabreich- <SEP> Dosierung <SEP> Körper- <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> verhältnis <SEP> wicklung <SEP>
<tb> ter <SEP> Stoff <SEP> (mg/kg) <SEP> gewichtes <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> ja <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP>
<tb> Vcrgleichsstoff <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +1, <SEP> 1 <SEP> 1,55 <SEP> 0/10 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 7
<tb> Kuma-sasa
<tb> Mt. <SEP> Zao, <SEP> 1961 <SEP> 400 <SEP> +2,5 <SEP> 0,94 <SEP> 2/10 <SEP> 39 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Vergleichsstoff <SEP> +2, <SEP> 1 <SEP> 2,05 <SEP> 0/10 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 9
<tb> Kuma-sasa
<tb> Mt.
<SEP> Tanzawa
<tb> Feber <SEP> 1962 <SEP> 600 <SEP> +1, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> 0/10 <SEP> 97 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> Kuma-sasa
<tb> Mt. <SEP> Tanzawa
<tb> Feber <SEP> 1962 <SEP> 400 <SEP> +2,0 <SEP> 1, <SEP> 20 <SEP> 1/10 <SEP> 42 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP>
<tb> Kuma-sasa
<tb> Mt.
<SEP> Tanzawa
<tb> Feber <SEP> 1962 <SEP> 200 <SEP> +2, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 82 <SEP> 0/10 <SEP> 11 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 6
<tb> Vergleichsstoff <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +1, <SEP> 3 <SEP> 3,61 <SEP> 1/10-0019
<tb> Kuma-sasa
<tb> Bandai <SEP> area
<tb> April <SEP> 1962 <SEP> 600 <SEP> +2, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 62 <SEP> 0/10 <SEP> 83 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 3
<tb> Nemagari-take
<tb> Bandai <SEP> area
<tb> April <SEP> 1962 <SEP> 600 <SEP> +1, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 19 <SEP> 0/10 <SEP> 39 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 5
<tb> Vergleichsstoff <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +1, <SEP> 1 <SEP> 1,55 <SEP> 0/10-0127
<tb> Sasa, <SEP> Yakushima <SEP> 1961 <SEP> 400 <SEP> +2, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP> 0/10 <SEP> 94 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> Vergleichsstoff <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +6, <SEP> 0 <SEP> 4,30 <SEP> 1/10-0018
<tb> Sasa,
<tb> Yakushima <SEP> 1961 <SEP> 200 <SEP> +6, <SEP> 2 <SEP> 2,56 <SEP> 0/10 <SEP> 41 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP>
<tb>
+ 1 = Zahl der resorbierten Tumore,
2 = Zahl der kleiner werdenden Tumore,
3 = Zahl der unveränderten Fälle, 4 = Zahl der Fälle mit weiterwachsendem Tumor
Die mit dem Rohextrakt an Ehrlich-Carcinom erzielten Ergebnisse sind in Tabelle VI enthalten.
Der aus bei Yakushima geerntetem Bambusgras hergestellte Rohextrakt erwies sich an wirksamsten, d. h., dass bei einer Dosis von 400 mg/kg ein Inhibitionsverhältnis von 94% erreicht wurde. Innerhalb von 25 Tagen wurden in 9 von 10 Mäusen die Tumore rückgebildet. Der in seiner Wirkung zweitstärkste Rohextrakt wurde aus am Mt. Tanzawa geerntetem Bambusgras hergestellt. Bei einer Dosis von 600 mg/kg ergab sich ein Inhibitionsverhältnis von 77%. Der Tumor wurde in 8 von 10 Mäusen rückgebildet. Eine
Wirkung wurde auch mit einem Rohextrakt erzielt, der aus am Mt. Zao und Mt. Bandai geerntetem
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Sasa albo-marginata Makino et Shibata (Kuma sasa) hergestellt worden war.
Der Vergleich der Wirksamkeit gegenüber Ehrlich Carcinom in Abhängigkeit vom Erntezeitpunkt ist in Tabelle VII gezeigt.
Die Rohextrakte wurden aus an den gleichen Stellen am Mt. Tanzawa im Feber, Juli und Oktober 1962 geeruteten Rohmaterialien unter Verwendung ein und desselben Extraktionsverfahrens hergestellt. Aus im Winter geerntetem Rohmaterial hergestellter Extrakt zeigt eine bessere Wirkung als ein Rohextrakt aus im Sommer geerntetem Material.
Tabelle VII
EMI9.1
<tb>
<tb> Durchschnittliche <SEP> Durch-
<tb> Änderung <SEP> schnittliches <SEP> Tumor-Tumordes <SEP> Körper- <SEP> Tumor- <SEP> Sterb- <SEP> inhibitions- <SEP> entwick- <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> verhältnis <SEP> lung
<tb> Datum <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +3,6 <SEP> 3,19 <SEP> 2/10 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 9
<tb> Fcber <SEP> 1962 <SEP> 600 <SEP> +2, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP> 0/10 <SEP> 75 <SEP> 5 <SEP> i <SEP> 1 <SEP> 3
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +0,8 <SEP> 2, <SEP> 23 <SEP> 0/10 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> I <SEP> 1 <SEP> 8
<tb> Juli <SEP> 1962 <SEP> 600 <SEP> +1, <SEP> 8 <SEP> 1,
<SEP> 46 <SEP> 1/10 <SEP> 35 <SEP> 2 <SEP> L <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP>
<tb> September
<tb> 19 <SEP> (j2 <SEP> 600 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 02 <SEP> 0/10 <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> L <SEP> 5
<tb>
Die Wirksamkeiten eines aus Kuma-sasa und Nemagari-take, welche zur gleichen Zeit am gleichen Ort geerntet wurden, hergestellte Rohextrakte wurden miteinander verglichen. Es wurden Inhibitionsverhältnisse von 830 ; 0 bzw. 390 ; 0 festgestellt, wobei Kuma-sasa wirksamer war als Nemagari-take.
Es wurde auch die Anticancerwirkung des Nitromins, des Mitomycins C und das Chromomycins A3, welche Stoffe als Anticancerwirkung besitzende Stoffe auf dem Markt sind, überprüft und die erhaltenen Ergebnisse wurden mit jenen verglichen, welche mit dem erfindungsgemäss hergestellten Rohextrakt erzielt wurden. Die an Ehrlich-Carcinom festgestellten Ergebnisse sind in Tabelle VIII gezeigt.
Tabelle VIII
EMI9.2
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> verschiedener <SEP> Anticancerstoffe <SEP> auf <SEP> subcutanes
<tb> Ehrlich-Carcinom
<tb> Durch-Durch-Tumorschnittliche <SEP> schnittli- <SEP> inhi-
<tb> Änderung <SEP> ches <SEP> bitionsver-Tumordes <SEP> Körper- <SEP> Tumor- <SEP> Sterb- <SEP> hält- <SEP> entwickDosierung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> nis <SEP> lung
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +2, <SEP> 2 <SEP> 1,46 <SEP> 1/10 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 6
<tb> Nitromine <SEP> 10 <SEP> +1, <SEP> 0 <SEP> 1,78 <SEP> 1/10 <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 8 <SEP>
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +2,0 <SEP> 2,05 <SEP> 0/10 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 9
<tb> Mitomycin <SEP> C <SEP> 1,
<SEP> 8 <SEP> +0, <SEP> 4 <SEP> 0,50 <SEP> 0/10 <SEP> 76 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 6
<tb> Mitomycin <SEP> C <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> +0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 4/10 <SEP> 85 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +1, <SEP> 3 <SEP> 3,61 <SEP> 1/10-0028
<tb> Chromomycin
<tb> Ag <SEP> 20 <SEP> +1, <SEP> 9 <SEP> 1,69 <SEP> 0/10 <SEP> 53 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 7 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Wie sich aus der Tabelle VIII ergibt, zeigte Nitromin keine Wirkung und das mit Mitomycin C und Chromomycin A3 erzielte Inhibitionsverhältnis betrug 76 bzw. 53%. Tumore wurden allerdings nicht rückgebildet. Es ist als schwierig anzusehen, unter Berücksichtigung einer Änderung des Körpergewichtes die Dosis zu erhöhen.
Bei Verwendung von erfindungsgemäss hergestelltem Rohextrakt konnte eine Verringerung des Körpergewichtes nicht beobachtet werden. Im Zusammenhang mit den in Tabelle XI zusammengefassten Ergebnissen gemachte makroskopische Beobachtungen sind folgende : in der Vergleichsgruppe litten 3 von 10 Mäusen an Anämie. Bei Verabreichung des Rohextraktes in Mengen von 600 mgtkg war der Befund von allen 10 Mäusen normal. Im Gegensatz dazu zeigte sich an den Mäusen der mit Mitomycin C behandelten Gruppe Atrophie und Anämie.
Tabelle IX zeigt die Ergebnisse, welche dann erzielt wurden, wenn die Verabreichung des Medikamentes vor bzw. nach der Inokulation von Zellen des Ehrlich-Carcinoms erfolgte. Jeden zweiten Tag wurden 400 mg/kg des aus Yakushima-take hergestellten Rohextraktes verabreicht. In jener Gruppe von Mäusen, an welche vor der Inokulation der Tumorzellen 10 Injektionen und nach der Inokulation insgesamt 21 Injektionen verabreicht wurden, zeigten sich keine besseren Ergebnisse als in jener Gruppe, in welcher nach der Inokulation 11 Injektionen verabreicht wurden. In jener Gruppe, in welcher 6 Verabreichungen erfolgten, waren die Ergebnisse hinsichtlich des Inhibitionsverhältnisses schlechter als in jener Gruppe, in welcher vor der Inokulation 10 Verabreichungen erfolgten. Die Rückbildung der Tumore erfolgte jedoch in allen Fällen etwa im gleichen Ausmasse.
Tabelle IX
EMI10.1
<tb>
<tb> Dosierung <SEP> 400 <SEP> mg/kg <SEP> des <SEP> Rohextraktes
<tb> Durch-Tumorschnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnittliches <SEP> bitionsver-Tumordes <SEP> Körper- <SEP> Tumor- <SEP> Sterb- <SEP> hält- <SEP> entwicklung <SEP>
<tb> Verabreichung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> nis <SEP>
<tb> vorher <SEP> nachher <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> 1234
<tb> Vergleich <SEP> + <SEP> L.
<SEP> 1 <SEP> 1,55 <SEP> 0/10-0 <SEP> 12 <SEP> 7 <SEP>
<tb> xll <SEP> +2, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP> 0/10 <SEP> 94 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> Vergleich <SEP> +2, <SEP> 22 <SEP> 1,46 <SEP> 1/10-l <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 6
<tb> X10 <SEP> xll <SEP> +3,3 <SEP> 0,19 <SEP> 0/10 <SEP> 87 <SEP> 7 <SEP> 030
<tb> x <SEP> 6 <SEP> +3, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 1/10 <SEP> 82 <SEP> 3 <SEP> 042
<tb> X <SEP> 10 <SEP> +3, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 83 <SEP> 1/12 <SEP> 42 <SEP> 3 <SEP> 044
<tb>
Diese Versuche wurden an festem Ehrlich-Carcinom durchgeführt, jedoch zeigte sich am Sarcom-180 eine gleich gute Wirkung wie am Ehrlich-Carcinom. Die Ergebnisse, welche mit aus am Mt. Tanzawa geernteten Kuma-sasa hergestellten Rohextrakt an Sarcom-180 erzielt wurden, sind in Tabelle X angegeben.
Tabelle X
EMI10.2
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> auf <SEP> Sarcom-180
<tb> Durch- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> schnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnittli- <SEP> bitions- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> des <SEP> Körper- <SEP> ches <SEP> Tumor- <SEP> Sterb- <SEP> verhält- <SEP> entDosierung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> nis <SEP> wicklung <SEP>
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 234 <SEP>
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +3, <SEP> 1 <SEP> 0,84 <SEP> 1/10-1035
<tb> Rohextrakt <SEP> 600 <SEP> +1, <SEP> 0 <SEP> 0,
<SEP> 18 <SEP> 0/10 <SEP> 79 <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Das Wachsen und die Rückbildung des mit dem Rohextrakt behandelte Ehrlich-Carcinoms wurde unter Zugrundelegung der Tumorfläche mit Mitomycin C behandelten Tumoren verglichen. Zur Bestimmung der Tumorfläche wurde die grösste Abmessung und die kleinste Abmessung des Tumors bestimmt und die erhaltenen Werte miteinander multipliziert. Die Bestimmung erfolgte am 9., 14., 17., 21. und 25. Tag nach der Inplantation. Die durchschnittliche Tumorfläche jeder Gruppe von Mäusen ist in Tabelle XI angegeben.
Tabelle XI
EMI11.1
<tb>
<tb> Entwicklung <SEP> des <SEP> Tumorbezirkes <SEP> in <SEP> mm <SEP> 2 <SEP>
<tb> Dosierung
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> 9. <SEP> Tag <SEP> 14. <SEP> Tag <SEP> 17. <SEP> Tag <SEP> 21. <SEP> Tag <SEP> 25. <SEP> Tag
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> 88 <SEP> 156 <SEP> 184 <SEP> 267 <SEP> 254
<tb> Rohextrakt <SEP> 600 <SEP> 79 <SEP> 67 <SEP> 44 <SEP> 26 <SEP> 19
<tb> Rohextrakt <SEP> 400 <SEP> 94 <SEP> 133 <SEP> 126 <SEP> 143 <SEP> 152
<tb> Mitomycin <SEP> C <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 42 <SEP> 72 <SEP> 85 <SEP> 116 <SEP> 106 <SEP>
<tb>
Die Tumore in jener Gruppe von Mäusen, in welcher 600 mg/kg des Rohextraktes verabreicht wurden, wuchsen während 9 Tagen ebenso wie in der Kontrollgruppe der Mäuse, jedoch wurden die Tumore nach diesem Zeitpunkt allmählich und ab dem 21.
Tag auffallend rasch rückgebildet, wobei der grösste Teil des Tumors am 25. Tag verschwunden war. Im Gegensatz dazu wuchsen vom Anbeginn an in der mit Mitomycin C behandelten Gruppe von Mäusen die Tumore langsam weiter und auch nach dem 25. Tag wurden die Tumore nicht rückgebildet.
II. Reinigung :
Wie oben erwähnt, wurde gefunden, dass Rohextrakte aus Bambus und Bambusgras beträchtliche Anticancerwirkung besitzen.
Die Überprüfung der Anticancerwirksamkeit wurde an subkutanem Ehrlich-Carcinom vorgenommen und zwecks Trennung und Reinigung der wirksamen Bestandteile wurden folgende Massnahmen aufgefunden : a. Fraktionierung mit Äthanol :
10 g pulveriger Rohextrakt, welcher aus Kuma-sasa, Sasaalbo-marginata vom Mt. Tanzawa (s. Tabelle VI), erhalten worden war, wurde unter Bildung von 20 ml Lösung in Wasser gelöst. Zu der Lösung wurden 40 ml Äthanol gegeben und der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert. Der Niederschlag wurde vom Filter gelöst und getrocknet (Fr. I).
Zum Filtrat wurden weitere 40 ml Äthanol gegeben und der erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt (Fr. II). Nun wurden zum vorliegenden Filtrat nochmals 80 ml Äthanol gegeben und der erhaltene Niederschlag abgetrennt (Fr. III). Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei ein Pulver erhalten wurde (Fr. IV). Näheres zeigt die Tabelle XII.
Tabelle XII
EMI11.2
<tb>
<tb> zugefügtes <SEP> ÄtOH <SEP> Gewicht <SEP> des
<tb> ÄtOH <SEP> Konzentration <SEP> Nieder-
<tb> (Äthanol) <SEP> im <SEP> Filtrat <SEP> schlages
<tb> Rohextrakt <SEP> (ml) <SEP> (v,,/0) <SEP> (g) <SEP> Fraktionen
<tb> 10 <SEP> g <SEP> in
<tb> 20 <SEP> ml <SEP> 40 <SEP> 66,7 <SEP> 0,5 <SEP> F-I
<tb> 40 <SEP> 80, <SEP> 0 <SEP> 1,4 <SEP> F-II
<tb> 80 <SEP> 89, <SEP> 0 <SEP> 1,4 <SEP> F-III
<tb> Filtrat-6, <SEP> 0 <SEP> F-IV <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
Die Prüfung der Fraktionen I-IV auf eine Anticancerwirkung gegenüber Ehrlich-Carcinom lieferte die in Tabelle XIII angeführten Ergebnisse.
Tabelle XIII
EMI12.1
<tb>
<tb> Durch-Tumorschnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnittliches <SEP> bitionsver-Tumordes <SEP> Körper- <SEP> Tumor- <SEP> Sterb- <SEP> hält- <SEP> ent- <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> nis <SEP> wick1ung <SEP>
<tb> Fraktionen <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +0, <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 1/10 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9
<tb> Rohextrakt <SEP> 600 <SEP> +1,4 <SEP> 0 <SEP> 2/10 <SEP> 100 <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Fr. <SEP> 1 <SEP> 30 <SEP> +1,7 <SEP> 1,20 <SEP> 0/10 <SEP> 38 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 5
<tb> Fr. <SEP> 11 <SEP> HO <SEP> +2. <SEP> 0 <SEP> 0,68 <SEP> 0/1 <SEP> I <SEP> G5 <SEP> 3 <SEP> I <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP>
<tb> Fr.
<SEP> III <SEP> 90 <SEP> +2, <SEP> 1 <SEP> 2,29 <SEP> 0/10 <SEP> -20 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 7
<tb> Fr. <SEP> [V <SEP> 3U <SEP> +1,6 <SEP> 2,92 <SEP> 0/10 <SEP> -53 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 9
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +3, <SEP> 0 <SEP> 2,83 <SEP> 0/0-1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP>
<tb> Fr. <SEP> l <SEP> 200 <SEP> +3, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 0/10 <SEP> 78 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP>
<tb> Fr. <SEP> Il <SEP> 200 <SEP> +3,0 <SEP> 1, <SEP> 11 <SEP> 0/10 <SEP> 61 <SEP> @ <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 3
<tb> Fr. <SEP> III <SEP> 400 <SEP> +1,9 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP> 0/10 <SEP> 98 <SEP> 541 <SEP> 0
<tb>
Es wurde gefunden, dass die Fraktionen I-III wirksam waren und die Fraktion IV nicht wirksam war und Wirkbestandteile bis zu einer Konzentration von etwa 90% Äthanol ausgefällt wurden.
Wenn äthanollösliche Stoffe (Fraktion IV) zur Behandlung des Carcinoms verwendet wurden, zeigte sich eine Verschlechterung des Tumors. Der äthanollösliche Anteil des Rohextraktes betrug 60 Gew.-%. Die Fraktionen 1-III werden im folgenden als eine einzige Fraktion behandelt und als"ÄtOH-Fällung" bezeichnet.
Weitere Beispiele für erhaltene "ÄtOH-Fällung" werden im folgenden angegeben. Bei Verabreichung von GOO mg/kg eines aus im Bandai-Distrikt geernteten Chimaki-sasa hergestellten Rohextraktes wurden folgende Ergebnisse erhalten : Durchschnittliches Tumorgewicht 0,62 g, inhibitionsverhältnis 82,8,Rückbildung 2 Fälle, Verringerung 4 Fälle, unverändert 1 Fall, Weiterbildung 3 Fälle (im Vergleichsfalle durchschnittliches Turnorgewicht 3,61 g, Rückbildung kein Fall, Verringerung kein Fall, unverändert 1 Fall, Weiterbildung 9 Fälle). 50 g dieses Rohextraktes wurden in 100 ml Wasser gelöst, worauf zur Lösung 800 ml Äthanol gegeben wurden. Die getrocknete "ÄtOH-Fällung" wog 23g. Die Anticancerwirkung dieser Fraktion bei der Anwendung in verschiedenen Mengen zeigt Tabelle XIV.
Tabelle XIV
EMI12.2
<tb>
<tb> Durch- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> schnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnittliches <SEP> bitionsver- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> des <SEP> Körper- <SEP> Tumor- <SEP> Sterb- <SEP> hält- <SEP> entDosierung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> nis <SEP> wicklung <SEP>
<tb> Fraktionen <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +2,32 <SEP> 2,7 <SEP> 1/10 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9
<tb> ÄtOH-Fällung <SEP> 50 <SEP> +2, <SEP> 19 <SEP> 0,76 <SEP> 0/10 <SEP> 72,0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP>
<tb> ÄtOH-Fällung <SEP> 100 <SEP> +2,38 <SEP> 1, <SEP> 21 <SEP> 1/10 <SEP> 55, <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP>
<tb> ÄtOH-Fällung <SEP> 200 <SEP> +1, <SEP> 3 <SEP> 0,40 <SEP> 0/10 <SEP> 85,
2 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Die Ergebnisse waren mit erhöhter Dosierung besser. Das Gewicht der äthanollöslichen Fraktion des Rohextraktes betrug etwa die Hälfte desselben, und diese Fraktion zeigte keine Anticancerwirkung. Durch die Äthanolbehandlung des Rohextraktes wird die Reinheit des Wirkstoffes auf das Doppelte gesteigert. b. Extraktion mit Äther :
Da die Wirkstoffe durch Äthanol ausgefällt werden, ist anzunehmen, dass die Wirkstoffe kaum in organischen Lösungsmitteln löslich sind. Trotzdem wird, wenn die Extraktion mittels Äther im sauren Milieu vorgenommen wird, vom Äther etwas gelöst. Aus diesem Grunde wurde die Anticancerwirkung der extrahierbaren Bestandteile überprüft.
5 g"ÄtOH-Fällung", welcher durch Behandlung von Rohextrakt mit Äthanol erhalten wurde, wurde unter Bildung von 10 ml Lösung in Wasser gelöst. Anschliessend wurde der PH-Wert dieser Lösung mit verdünnter Schwefelsäure auf 1 eingestellt. Die abgeschiedenen unlöslichen Stoffe wurden abfiltriert.
Zum Filtrat wurden 50 ml Äther gegeben und auf diese Weise wurde die Extraktion achtmal wiederholt, so dass insgesamt 40 ml Äther verwendet wurden. Der Äther wurde abdestilliert und der Rückstand wurde getrocknet. Es wurden 750 mg eines braunen Öls erhalten. Dieses braune Öl wird als Ätherextrakt bezeichnet. Der Rückstand nach der Extraktion mit Äther wurde sodann mit Äthylacetat extrahiert, wobei vom Lösungsmittel nahezu nicht gelöst wurde. Die wässerige Schicht wurde durch Ätzalkali auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt und sodann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 2, 3 g Trockenrückstand erhalten wurden. Die bei der Prüfung der erhaltenen Stoffe auf eine Anticancerwirkung derselben erhaltenen Ergebnisse zeigt Tabelle XV.
Tabelle XV
EMI13.1
<tb>
<tb> Durch- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> schnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnittliches <SEP> bitionsver-Tumordes <SEP> Körper-Tumor-Sterb-hält-entDosierung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> nis <SEP> wicklung <SEP>
<tb> Fraktionen <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 234 <SEP>
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +2,62 <SEP> 3, <SEP> 23 <SEP> 1/10-0018
<tb> Ätherextrakt <SEP> 250 <SEP> +2, <SEP> 26 <SEP> 2, <SEP> 34 <SEP> 1/10 <SEP> 27,5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 7 <SEP>
<tb> Rückstand <SEP> 400 <SEP> +1,55 <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 0/10 <SEP> 86,0 <SEP> 7 <SEP> 102 <SEP>
<tb>
Aus der Tabelle ergibt sich, dass die Wirkstoffe durch Äther nicht extrahiert werden. c.
Fraktionierung mittels lonenaustauschharzen.
EMI13.2
über eine mit 50 ml eines stark sauren lonenaustauschharzes der Sulfonsäuretype (Amberlite IR -120, H-Form, Rhom & Haas Co) geschickt, worauf mit 200 ml Wasser gewaschen wurde. Die Kolonne wurde sodann mit 500 ml 2n-Ammoniak eluiert. Das ammoniakalische Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei ein Rückstand von 0,5 g erhalten wurde, der aus basischen Stoffen und Aminosäuren bestand. Dieser Rückstand wurde als "basische Fraktion" bezeichnet. Dieser Rückstand liefert eine stark positive Ninhydrinreaktion.
Der Ablauf aus der mit Amberlite IR-120 gefüllten lonenaus- tauschsäule war sauer und dieser Ablauf wurde über eine mit 100 cm3 eines stark basischen lonenaustauschharzes mit tertiären Aminogruppen (Amberlite IRA-410, OH-From, Rhom & Haas Co.) gefüllte Kolonne geleitet. Die Kolonne wurde mit etwa 11 Wasser gewaschen und das Waschwasser wurde mit dem Ablauf aus der Kolonne vereinigt. Durch Trocknen der Lösung unter vermindertem Druck wurden 1, 7 g eines braunen Pulvers erhalten, das als"Neutralfraktion"bezeichnet wurde. Die mit dem Ionen- austauschharz IRA-410 gefüllte Kolonne wurde mit etwa 500 ml 2n-Ammonkarbonatlösung eluiert.
Nach dem Eindampfen des Eluats wurde das erhaltene Konzentrat über eine mit 20 ml Amberlite IR-120 (H-Form) gefüllte Kolonne geleitet, womit ein saurer Ablauf erhalten wurde, der nach dem Eindampfen und Trocknen einen Rückstand von 1, 6 g eines dunkelbraunen Pulvers lieferte. Dieses Pulver wurde "saure Fraktion" genannt. Die erhaltenen Ausbeuten und die Reaktionen dieser Fraktionen sind in Tabelle XVI angegeben.
<Desc/Clms Page number 14>
Tabelle XVI
EMI14.1
<tb>
<tb> eingesetzte
<tb> "ÄtOH-Fällung" <SEP> Verhältnis
<tb> Fraktionen <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g <SEP> in <SEP> % <SEP> PH <SEP> Reaktionen
<tb> "Neutralfraktion"i, <SEP> 7 <SEP> 8,4 <SEP> 7 <SEP> NHg-AgNOg
<tb> positiv
<tb> "Saure <SEP> Fraktion"1, <SEP> 6 <SEP> 26,7 <SEP> 2 <SEP> Organische
<tb> Säuren <SEP> positiv
<tb> "Basische <SEP> Fraktion" <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 28,4 <SEP> 11 <SEP> Ninhydrinreaktion <SEP> positiv
<tb> Verlust <SEP> 3,7 <SEP> 36, <SEP> 8-Anorganische
<tb> Salze
<tb>
Die Anticancerwirkung dieser Fraktion zeigt Tabelle XVII.
Tabelle XVII
EMI14.2
<tb>
<tb> Durch-Tumorschnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnittli- <SEP> bitionsverdes <SEP> Körper- <SEP> Tumor- <SEP> Sterb- <SEP> hält- <SEP> TumorDosierung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> nis <SEP> entwicklung <SEP>
<tb> Fraktionen <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Control <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +2,9 <SEP> 2,28 <SEP> 0/10-1027
<tb> "Neutralfraktion"300 <SEP> +2,6 <SEP> 0,58 <SEP> 0/10 <SEP> 74,6 <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Saure
<tb> Fraktion <SEP> 300 <SEP> +1, <SEP> 4 <SEP> 2,28 <SEP> 1/10 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 8
<tb> Basische
<tb> Fraktion <SEP> 100 <SEP> +4, <SEP> 4 <SEP> 2,83 <SEP> 0/10 <SEP> -24, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10
<tb>
Wie sich aus der obigen Tabelle ergibt,
besitzt ausser der "Neutralfraktion" keine der andern Fraktionen Anticancerwirkung. Daraus, dass die Wirkstoffe von den Ionenaustauschern nicht zurückgehalten werden, muss geschlossen werden, dass es sich bei den Wirkstoffen um neutrale organische Stoffe handelt, die weder Anionen noch Kationen aufweisen. Kohlehydrate sind in dieser Fraktion enthalten. d. Dialyse :
Im Handel erhältliches Zellophanpapier wurde als semipermeable Membran verwendet.
5 g "ÄtOH-Fällung" wurden in 10 ml Wasser gelöst und in einen Beutel aus Zellophanpapiereingebracht. Der Beutel wurde in 1 l Wasser eingehängt und darin über Nacht belassen. Anschliessend wurde die ausserhalb des Beutels befindliche Flüssigkeit gegen 11 frischen Wasser ersetzt, worauf die Dialyse über Nacht fortgesetzt wurde. Diese Behandlung wurde dreimal wiederholt. Anschliessend wurde die im Beutel befindliche Flüssigkeit und die ausserhalb des Beutels befindliche Flüssigkeit unter vermindertem Druck eingeengt.
Die aus der aussen befindlichenFlüssigkeit erhaltene braune Flüssigkeit, d. h. die durch Dialyse entfernbare Fraktion, wog 3, 5 g und die schwarze innere Flüssigkeit, d. i. die durch Dialyse nicht entfernbare Fraktion, wog 0, 6 g. Die Anticancerwirkung der beiden Fraktionen ist in Tabelle XVIII angegeben.
<Desc/Clms Page number 15>
Tabelle XVIII
EMI15.1
<tb>
<tb> Durch- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> schnittliche <SEP> Durch-inhibi-
<tb> Änderung <SEP> schnitt-tions-Tumordes <SEP> Körper- <SEP> liches <SEP> Tu- <SEP> Sterb- <SEP> ver- <SEP> ent <SEP> : <SEP> - <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> morgewicht <SEP> lieh-hältnis <SEP> in <SEP> wicklung
<tb> Fraktionen <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +2,62 <SEP> 3,23 <SEP> 1/10 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 8
<tb> Dialysierbare
<tb> Fraktion <SEP> 330 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 84 <SEP> 2, <SEP> 51 <SEP> 1/10 <SEP> 22,3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 8 <SEP>
<tb> Nicht <SEP> dialysierbare <SEP> Fraktion <SEP> 25 <SEP> + <SEP> 2, <SEP> 41 <SEP> 1, <SEP> 39 <SEP> 0/10 <SEP> 57,
<SEP> 0 <SEP> 4204
<tb>
Abgesehen von der geringen Dosierung erwies sich die durch Dialyse nicht entfernbare Fraktion als wirksam und die durch Dialyse entfernbare Fraktion als unwirksam. Damit muss angenommen werden, dass der Wirkstoff ein besonders hohes Molekulargewicht besitzt. Da bei der Dialyse etwa 1/6 des Rohmaterials als durch Dialyse nicht weiter reinigbare Fraktion anfiel und bei der Herstellung der"ÄtOH- Fällung" nur etwa 7 % des Rohstoffes aus dem Rohstoff herausfraktioniert wurden, kann gesagt werden, dass die Dialyse eine besonders gute Anreicherungsmethode und Reinigungsmethode ist.
Aus den oben angegebenen Versuchen kann folgendes geschlossen werden :
1. Das Molekulargewicht des Wirkstoffes ist relativ hoch.
2. Da der Wirkstoff in organischen Lösungsmitteln nicht löslich ist, enthält er offenbar keine Fette, Lipoide und Öle.
3. Er stellt weder ein Alkaloid noch eine Aminosäure, noch Tannin oder eine andere organische Säure dar.
4. Es handelt sich offenbar um eine neutrale organische Substanz.
Es wurde daher zunächst angenommen, dass der Wirkstoff ein Protein oder ein Polysaccharid ist. Um die Frage zu klären, wurde folgender Versuch durchgeführt. e. Entfernung von Proteinen :
Die Entfernung von Proteinen kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden. Im vorliegenden Falle wurden die Proteine unter Verwendung von Trichloressigsäure abgetrennt, welche für den vorliegenden Fall als am besten geeignet angesehen wurde.
Es wurden 500 ml des aus dem Rohextrakt erhaltenen, durch Dialyse aus dem Rohextrakt nicht entfernbaren Materials verwendet. Dieses durch Dialyse nicht entfernbare Material wurde in 30 ml Wasser gelöst, worauf das in der Lösung enthaltene Protein durch Zugabe von 3 g Trichloressigsäure ausgefällt wurde. Die Lösung wurde sodann zwei Tage in einem Eiskasten stehen gelassen, worauf der entstandene Niederschlag abgetrennt wurde. Es zeigte sich, dass nur eine Spur eines Niederschlages gebildet wurde.
Zur abgetrennten überstehenden Lösung wurde die achtfache Menge der Lösung an Äthanol gegeben, wobei ein Niederschlag entstand, der kein Protein enthielt und in der Biuretreaktion negativ reagierte und keine Eisench10ridreaktion und keine Liebermann-Burchard-Reaktion zeigte. In derMolish-UdranskyReaktion reagierte er deutlich positiv. Die durch Trichloressigsäure abgeschiedene Menge an Proteinen war so gering, dass der Niederschlag nicht auf Anticancerwirkung geprüft werden konnte.
Die bei der Prüfung der keine Proteine enthaltenden Fraktion auf eine Anticancerwirkung erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XIX angegeben.
<Desc/Clms Page number 16>
Tabelle XIX
EMI16.1
<tb>
<tb> Durch-Tumorschnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnittliches <SEP> bitionsver-Tumordes <SEP> Körper- <SEP> Tumor <SEP> - <SEP> Sterb- <SEP> hält- <SEP> ent- <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> nis <SEP> wicklung <SEP>
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +2,27 <SEP> 0,7 <SEP> 1/10 <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 5
<tb> Filtrat <SEP> 75 <SEP> +2,82 <SEP> 0,085 <SEP> 0/10 <SEP> 88,
0 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Da eine Anticancerwirkung an jener Fraktion festgestellt werden konnte, aus welcher das Protein entfernt worden war, wurde angenommen, dass der Wirkstoff ein Polysaccharid sei. f. Entfärbung :
Die durch Dialyse nicht entfernbare Fraktion des Rohextraktes ist nahezu schwarz gefärbt. Auch die, wie oben hergestellte proteinfreie Lösung ist gefärbt. Eine Entfärbung der Lösung durch Aktivkohle war nicht möglich, jedoch gelang die Entfärbung besonders gut bei Verwendung von Harzen, welche organische Farbstoffe selektiv absorbieren.
1, 1 g Trockenstoff des durch Dialyse nicht entfernbaren Materials wurde in 50 ml Wasser gelöst, worauf der PH-Wert der Lösung mit Essigsäure auf 2,5 eingestellt wurde und die Lösung filtriert wurde.
Zu einem Teil des Filtrates wurde Trichloressigsäure gegeben, wobei kein Niederschlag gebildet wurde, so dass angenommen werden konnte, dass das Protein durch die Essigsäure entfernt wurde. Die vorliegende Losung wurde über eine mit 50 ml Duolite S-30 gefüllte Kolonne geleitet, nachdem Duolite S-30 mit n-Essigsäure aktiviert worden war. Der Ablauf aus der Kolonne war entfärbt. Anschliessend wurde die Kolonne mit 200 ml n-Essigsäure gewaschen. Nach Dialyse des Ablaufes aus der Kolonne und der Waschflüssigkeit unter Verwendung von Zellophanpapier als semipermeable Membran, wobei die Essigsäure entfernt wurde, wurde die nicht dialysierbare Fraktion unter vermindertem Druck eingeengt. Diese Fraktion wurde "entfärbte Fraktion" genannt, Nun wurde die Kolonne nochmals mit Wasser gewaschen und anschliessend mit 0,5 n NaOH-Lösung eluiert.
Das Eluat wurde mit verdünnter Schwefelsäure neutralisiert und anschliessend mit fliessendem Wasser dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde "zurückgehaltene Fraktion" genannt. Die "entfärb - te Fraktion", ein blassbraunes Pulver, wog 450 mg und die "zurückgehaltene Fraktion", ein schwarzes Pulver, wog 550 mg. Diese beiden Fraktionen wurden auf ihre Anticancerwirkung geprüft. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XX angegeben.
Tabelle XX
EMI16.2
<tb>
<tb> Durch- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> schnittliche <SEP> Durch-inhi- <SEP>
<tb> Änderung <SEP> schnitt-bitions-Tumordes <SEP> Körper-liches <SEP> Tu-Sterb-ver-ent- <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> morgewicht <SEP> lich- <SEP> hältnis <SEP> wicklung
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 234 <SEP>
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +2, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> 1/10-0225 <SEP>
<tb> "Entfärbte
<tb> Fraktion" <SEP> 150 <SEP> +1, <SEP> 9 <SEP> 0,095 <SEP> 0/10 <SEP> 86,5 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> "Absorbierte <SEP> Fraktion"150 <SEP> +2, <SEP> 09 <SEP> 1,211 <SEP> 1/10-73, <SEP> 0 <SEP> 001 <SEP> 8 <SEP>
<tb>
Bei Verwendung von Entfärbungsharz Duolite S-30,
gelang es in Gegenwart von Essigsäure färbende Begleitstoffe von den Anticancerwirkung besitzenden Stoffen zum grössten Teil abzutrennen. Beim obigen Versuch wurden nicht wirksame Bestandteile in einer Menge von etwa der Hälfte der nicht dialysierbaren Fraktion entfernt.
<Desc/Clms Page number 17>
g. Aussalzen :
Aus Punkt e. ergibt sich, dass die Wirksamkeit in keinem Zusammenhang damit steht, ob das Protein abgetrennt wird. Da nun zahlreiche andere Methoden zur Entfernung von Protein zur Verfügung stehen und es im vorliegenden Falle erforderlich war, die Wirksamkeit der Proteinfraktion zu bestimmen, wurde mittels Ammonsulfat ausgesalzen, da hiebei mehr Niederschlag entsteht als unter Verwendung von Trichloressigsäure.
Das von den aussalzbaren Stoffen befreite Filtrat besass, wie gefunden wurde, keinerlei Wirksamkeit, jedoch zeigte sich, dass der Niederschlag selbst starke Anticancerwirkung besitzt. Wenn aus dem erhaltenen Niederschlag die Proteine mittels Essigsäure oder Trichloressigsäure entfernt wurden, so besassen die zurückbleibenden Stoffe starke Wirkung. Daraus kam man zu dem Schluss, dass der Wirkstoff aus der wässerigen Lösung durch Sättigung derselben mit Ammoniumsulfat herausfraktioniert wurde und dass es sich beim Wirkstoff nicht um ein Protein handelt.
Aus Kuma sasa, welches im Bandai-Distrikt geerntet worden war, hergestellter Rohextrakt wurde dialysiert. Der aus dem durch Dialyse nicht entfernbaren Material erhaltene Trockenstoff wurde als Ausgangsmaterial verwendet. 10 g dieses Trockenstoffes wurden in 200 ml Wasser gelöst, worauf die Lösung mit 165 g kristallisiertem Ammonsulfat gesättigt wurde. Die gesättigte Lösung wurde über Nacht stehengelassen, worauf der entstandene braune Niederschlag abzentrifugiert und mit gesättigter wässeriger Ammonsulfatlösung gründlich gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde sodann nochmals in Wasser gelöst und zwecks Entfernung anorganischer Salze nochmals unter Verwendung einer semipermeablen Membran aus Zellophanpapier gegen fliessendes Wasser dialysiert.
Nach dem Eindampfen der durch Dialyse nicht entfernbaren Fraktion zur Trockne, wurden 2 g eines schwarzen Pulvers erhalten. Auch die nach dem Aussalzen erhaltene Mutterlauge wurde dialysiert und in der angegebenen Weise getrocknet. Die Anticancerwirkung der beiden erhaltenen Substanzen wurde bestimmt und die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XXI gezeigt. Diese Ergebnisse wurden, wie Tabelle XXII zeigt, in weiteren Versuchen bestätigt.
Tabelle XXI
EMI17.1
<tb>
<tb> Durch- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> schnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnitt-bitions-Tumordes <SEP> Körper-liches <SEP> Tu-Sterb-ver-ent- <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> morgewicht <SEP> lieh-hältnis <SEP> Wicklung <SEP>
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> o <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +3, <SEP> 56 <SEP> 3, <SEP> 19 <SEP> 2/10-0017 <SEP>
<tb> ppt.
<SEP> 100 <SEP> +3, <SEP> 14 <SEP> 1, <SEP> 06 <SEP> 0/10 <SEP> 95, <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Filtrat <SEP> 100 <SEP> +3, <SEP> 15 <SEP> 2, <SEP> 15 <SEP> 0/10 <SEP> 32,5 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP>
<tb>
Tabelle XXII
EMI17.2
<tb>
<tb> Durch-Tumorschnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnitt-bitions-Tumordes <SEP> Körper-liches <SEP> Tu-Sterb-ver-ent- <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> morgewicht <SEP> lich-hältnis <SEP> wicklung <SEP>
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 234 <SEP>
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +5,8 <SEP> 1,97 <SEP> 1/10 <SEP> - <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 6
<tb> ppt. <SEP> (B) <SEP> 200 <SEP> +4,9 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0/10 <SEP> 92,3 <SEP> 5041
<tb> ppt.
<SEP> (B) <SEP> 25 <SEP> +3,9 <SEP> 1,55 <SEP> 0/10 <SEP> 21,3 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 7
<tb> ppt. <SEP> (T) <SEP> 100 <SEP> +5,5 <SEP> 0,06 <SEP> 0/10 <SEP> 97,0 <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb>
h. Behandlung mit Bleiazetat :
8,5 g der aus dem Rohextrakt erhaltenen, durch Dialyse nicht entfernbaren Substanz wurden in 100 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurde sodann 10oJoige Bleiazetatlösung unter Rühren zugefügt.
<Desc/Clms Page number 18>
Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag wurde in Wasser aufgenommen und mit Schwefelwasserstoff behandelt. Nach Abfiltrieren des entstandenen Bleisulfids wurde das Filtrat eingedampft und der Rückstand im Vakuum getrocknet. Es wurden auf diese Weise 1, 4 g eines trockenen Pulvers erhalten.
Das nach der Bleiazetatbehandlung verbliebene Filtrat wurde sodann miteiner 5% eigen Lösung von Bleisubazetat versetzt, worauf der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit Wasser gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde schliesslich wieder in Wasser aufgenommen und zwecks Abscheidung von Blei mit Schwefelwasserstoff behandelt. Auf diese Weise wurden 0, 7 g Trockenrückstand erhalten. Das nach der Behandlung mit Bleisubazetat vorliegende Filtrat wurde zwecks Abscheidung des Bleis ebenfalls mit Schwefelwasserstoff behandelt. Nach dem Eindampfen dieses Filtrats wurden 2,0 g eines farblosen trockenen Pulvers als durch Bleisalze nicht fällbare Fraktion erhalten.
Die Prüfung auf die Anticancerwirkung der erhaltenen drei Fraktionen lieferte die in Tabelle XXIII gezeigten Ergebnisse.
Tabelle XXIII
EMI18.1
<tb>
<tb> Durch-Tumorschnittliche <SEP> Durch-inhi-
<tb> Änderung <SEP> schnitt-bitions-Tumordes <SEP> Körper-liches <SEP> Tu-Sterb-ver-ent- <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> gewichtes <SEP> morgewicht <SEP> lich- <SEP> hältnis <SEP> wicklung <SEP>
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +3,56 <SEP> 3, <SEP> 19 <SEP> 2/10-0017 <SEP>
<tb> Niederschlag
<tb> mit <SEP> Bleiazetat <SEP> 100 <SEP> +2,28 <SEP> 4, <SEP> 36 <SEP> 2/10 <SEP> -45, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP>
<tb> Niederschlag
<tb> mit <SEP> basischem
<tb> Bleiazetat <SEP> 100 <SEP> +3, <SEP> 11 <SEP> 3, <SEP> 09 <SEP> 0/10 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 9 <SEP>
<tb> von <SEP> Bleisalzen
<tb> nicht <SEP> gefällt <SEP> 100 <SEP> +3,
<SEP> 04 <SEP> 1,93 <SEP> 1/10 <SEP> 39, <SEP> 6 <SEP> 2106
<tb>
III. Reinigungsverfahren :
Ein solches systematisches Reinigungsverfahren wird durch zweckmässige Abwandlung des unter II. geschilderten Verfahrens geschaffen. Aus zahlreichen bisher durchgeführten Versuchen konnten folgende Tatsachen entnommen werden :
1. Der Wirkstoff ist in organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, Äther u. dgl., unlöslich.
2. Der Wirkstoff ist seiner Natur nach neutral und nichtionogen.
3. Der Wirkstoff ist durch Dialyse nicht entfernbar.
4. Der Wirkstoff stellt kein Protein dar.
5. Der Wirkstoff wird durch Behandlung mit einem Harz entfärbt.
6. Der Wirkstoff kann ausgesalzen werden.
7. Der Wirkstoff ist durch Bleiazetat nicht fällbar.
Auf Grund der angeführten Eigenschaften des Wirkstoffes kann durch Dialysieren und Aussalzen die Anreicherung und Reinigung des Wirkstoffes am besten erfolgen. Es wurde deshalb das im folgenden beschriebene Verfahren erprobt, welches im wesentlichen in einer Dialyse und in einem Aussalzen besteht :
Das getrocknete Rohmaterial wird geschnitten und mit heissem Wasser zwecks Herstellung eines Rohextraktes extrahiert. Es ist nicht erforderlich, den Rohextrakt einzudampfen, bevor der nächste Arbeitsschritt vorgenommen wird. Das aus dem Rohextrakt erhaltene Konzentrat wird gegen fliessendes Wasser dialysiert. Der durch Dialyse nicht entfernbare Teil wird durch Sättigung mit Ammonsulfat ausgesalzen. Der erhaltene Niederschlag wird abzentrifugiert und in Wasser gelöst und schliesslich zwecks Entfernung anorganischer Salze nochmals dialysiert.
Die Lösung der durch Dialyse nicht entfernbaren Stoffe wird mit Essigsäure angesäuert. Nach dem Abzentrifugieren der Proteine wird die erhaltene Lö-
<Desc/Clms Page number 19>
sung durch eine mit einem Entfärbungsharz, beispielsweise Duolite S-30, gefüllte Kolonne geleitet, um den grössten Teil der färbenden Stoffe an diesem Harz zu adsorbieren. Der Ablauf aus der Kolonne wird eingeengt und sodann mit Äthanol versetzt, wobei ein Niederschlag entsteht. Dieser Niederschlag ist das in Frage kommende Material. Wenn dieser Niederschlag noch grössere Mengen an Asche bzw. Salzen enthält, so wird er unter Verwendung von lonenaustauschharzen deionisiert. Diesbezügliche Einzelheiten finden sich in den später angeführten Beispielen.
Zwecks Entfernung von Proteinen kann, wie bereits oben erwähnt wurde, an Stelle von Trichloressigsäure Essigsäure verwendet werden. In andern Versuchen wurde die durch Ammonsulfat ausgefällte Fraktion in Wasser gelöst und mit Trichloressigsäure versetzt, worauf der erhaltene Niederschlag, d. s. Proteine, hinsichtlich seiner Anticancerwirkung mit dem Filtrat verglichen wird, das eine proteinfreie Fraktion enthält. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XXIV angeführt.
Tabelle XXIV
EMI19.1
<tb>
<tb> Durch- <SEP> Durch- <SEP> Tumorschnittliche <SEP> schnitt-inhi-
<tb> Änderung <SEP> liches <SEP> bitions-Tumordes <SEP> Körper-Tumor-Sterb-verhält-entDosierung <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich-nis <SEP> wicklung <SEP>
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +5,8 <SEP> 1,97 <SEP> 0/10 <SEP> - <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 6
<tb> Protein <SEP> 100 <SEP> +4,4 <SEP> 1, <SEP> 01 <SEP> 0/10 <SEP> 48,6 <SEP> 021 <SEP> 7 <SEP>
<tb> NichtProtein <SEP> 100 <SEP> +5, <SEP> 2 <SEP> 0,05 <SEP> 0/10 <SEP> 97,5 <SEP> 7210
<tb> HOAcFiltrat <SEP> 100 <SEP> +4,9 <SEP> 0,20 <SEP> 0/10 <SEP> 90,0 <SEP> 701 <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Durch diese Ergebnisse wird bestätigt, dass die Proteinfraktion keine Anticancerwirkung besitzt,
während die proteinfreie Fraktion starke Anticancerwirkung besitzt.
Im folgenden wird ein Verfahren angegeben, bei welchem eine Dialyse nicht vorgenommen wird.
Bei dieser Arbeitsweise wird der Rohextrakt mit Schwefelsäure u. dgl. angesäuert, wobei einige Kationen und Proteine gefällt werden. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert. Unmittelbar darauf wird das Filtrat mit Ammonsulfat gesättigt, um ein Aussalzen zu bewirken. Der entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert und in Wasser gelöst. In dieser Lösung enthaltene anorganische Salze werden durch Verwendung von stark sauren Ionaustauschharzen und basischen Ionaustauschharzen entfernt. Der erhaltene neutrale Ablauf aus den Ionaustauschsäulen wird mit Essigsäure versetzt, worauf die angesäuerte Lösung durch eine mit einem Entfärbungsharz, beispielsweise Duolite S-30, gefüllte Kolonne geleitet wird, wobei die Lösung entfärbt wird.
Die entfärbte Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und sodann mit einem Lösungsmittel, wie Äthanol, Methanol oder Azeton, versetzt, wobei ein pulveriger Niederschlag gebildet wird. Einzelheiten sind in den Beispielen 3,4 und 5 angegeben.
Selbstverständlich kann das erfindungsgemäss herzustellende Material auch durch Kombination verschiedener anderer Massnahmen als den oben angegebenen erhalten werden. Es kann zweckmässig sein, ein-und dieselbe Operation mehrmals zu wiederholen, falls dies erforderlich ist. Die im Rahmen des angegebenen Verfahrens erzielten Ausbeuten sind in Tabelle XXV angegeben. Die Ausbeuten schwanken je nach Art des verwendeten Rohmaterials, der Erntezeit und anderer Bedingungen.
Tabelle XXV
EMI19.2
<tb>
<tb> Rohextrakt <SEP> aus <SEP> Endprodukt <SEP> Ausbeute
<tb> Kuma <SEP> sasa <SEP> (g) <SEP> (g) <SEP> (g)
<tb> 600 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 600 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP>
<tb> 590 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 03 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
IV. Eigenschaften :
Das schliesslich erhaltene Material stellt ein graues oder blassbraunes Pulver dar und enthält noch Verunreinigungen, wie farbende Stoffe, Asche und stickstoffhaltige Substanzen. Die Eigenschaften des schliesslich erhaltenen Produktes wurden an einem so weitgehend als möglich gereinigten Produkt studiert.
Der in erfindungsgemässer Weise herstellbare Stoff ist in Wasser löslich und kaum löslich in organischen Lösungsmitteln, wie Äthanol, Methanol, Azeton, Äther, Petroläther, Chloroform und Benzol. Dieser Stoff ist durch Dialyse nicht entfernbar, nichtionogen und kann ausgesalzen werden. Die Biuretreaktion und die NlI1hydrinreaktion fällt negativ aus, und Aminosäuren können nicht nachgewiesen werden. Der Nachweis von Aminosäuren wurde durch Papierchromatographie eines Hydrolysates dieses Stoffes versucht, war jedoch ebenfalls negativ. Damit wurde bestätigt, dass im Endstoff Proteine nicht enthalten sind. Die auf phenolischen Substanzen, wie Tamin u. dgl., ansprechende Eisenchloridreaktion ist ebenfalls negativ.
Negativ ist ebenfalls die Liebermann-Burchard-Reaktion auf Steoride ; auch Reaktionen auf Saponin-Glukoside sind negativ. Da bei mehr als 220 In/ keine charakteristischen Adsorptionsmaxi- ma im Ultraviolett auftreten, sind auch Flavonglukoside, Proteine und Nucleotide nicht anwesend. Der erfindungsgemäss herstellbare Stoff gibt eine intensiv positive Molisch-Udransky-Reaktion, Anthron-
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den, dass es sich um ein Polysaccharid handelt. Dies wird auch durch das Infrarotspektrum belegt. In Fig. l ist nun das Absorptionsspektrum des erfindungsgemäss herstellbaren Stoffes und in Fig. 2 das entsprechende Absorptionsspektrum des Acetylderivates dargestellt.
Im Falle des Acetylderivates tritt die in Fig. l für die OH-Gruppe gültige Absorptionslinie nicht mehr auf.
Acetylierung :
1 g des Polysaccharids wurde in 80'igem Pyridin gelöst, das in der fünffachen Menge des Polysaccharids verwendet wurde. Der Lösung wurde sodann allmählich eine Mischung der fünffachen Menge an Pyridin und der zehnfachen Menge an Essigsäureanhydrid unter Rühren zugesetzt, wobei das Ganze während 4 h bei 800C auf einem Wasserbad reagieren gelassen wurde. Nachdem das Reaktionsgemisch in Eis gegossen worden war, wurde Chloroform zugegeben und geschüttelt. Die Chloroformlösungwurdesodann abgetrennt, mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdampfen des Chloroforms wurde Petroläther zugegeben. Der entstandene Niederschlag wurde isoliert und getrocknet. Es wurden so 1, 25 g eines amorphen weissen Pulvers erhalten.
V. Hydrolyse :
Zwecks Feststellung, welche Monosaccharide das Polysaccharid aufbauen, wurde eine Hydrolyse vorgenommen.
5 mg des erfindungsgemäss hergestellten Polysaccharids wurden in 0,5 ml In-HSO gelöst. Die Lösung wurde in ein Rohr eingebracht, das verschlossen wurde. Die Hydrolyse wurde sodann 5 h in kochendem Wasser vorgenommen. Nach dem Abkühlen wurde zwecks Neutralisation der Lösung Bariumkarbonat zugegeben und filtriert.
Das Filtrat wurde einer Papierchromatographie unterworfen, wobei ein Filterpapier Nr. 51 der Toyo Roshi Co. verwendet wurde und steigend gearbeitet wurde. Als Lösungsmittel wurden folgende drei Lösungsmittelsysteme verwendet :
1. Äthylazetat : Pyridin : Wasser 2 : 1 : 2
2. Äthylazetat : Essigsäure : Wasser 3 : 1 : 3
3. Phenol : Wasser 5 : 1
Zur Entwicklung des Chromatogramms wurden verschiedene Reagenzien aufgesprüht, und das erhaltene Ergebnis ist in Tabelle XXVI angegeben.
Tabelle XXVI
EMI20.2
<tb>
<tb> RF-Wert
<tb> Lösungsmittel <SEP> Spot <SEP> Spot <SEP> Spot
<tb> (1) <SEP> (2) <SEP> (3)
<tb> Nr. <SEP> 1 <SEP> 0,38 <SEP> 0,33 <SEP> 0,235
<tb> Nr. <SEP> 2 <SEP> 0,265 <SEP> 0,22 <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP>
<tb> Nr. <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 54 <SEP> 0, <SEP> 44
<tb>
<Desc/Clms Page number 21>
Es wurde gefunden, dass das Hydrolysat drei verschiedene Monosaccharide enthält. Unter Verwendung des Lösungsmittelsystems 1 wurden verschiedene Reagenzien versprüht, wobei die in Tabelle XXVII angeführten Ergebnisse erhalten wurden.
Tabelle XXVII
EMI21.1
<tb>
<tb> Reagentien <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 235 <SEP>
<tb> Ammoniak-AgNO <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> m-Phenylendiamin <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Anilinphthalat <SEP> rot <SEP> rot <SEP> braun
<tb> Anisidin <SEP> -HCl <SEP> rötlichbraun <SEP> rötlichbraun <SEP> gelblichbraun
<tb> Resorcin-HCl <SEP> graublau <SEP> graublau
<tb> Anthron-H2SO4 <SEP> - <SEP> Ninhydrin <SEP> - <SEP> -
<tb>
Aus dieser Tabelle ergibt sich, dass im Hydrolysat 2-Aldopentose und 1-Aldohexose enthalten ist.
Aus dem Rf-Wert wurde geschlossen, dass es sich um Xylose, Arabinose und Galactose handelt. Die Papierchromatographie wurde unter Verwendung authentischer Muster wiederholt, wodurch die obige Annahme bestätigt wurde.
In der im folgenden angegebenen Weise wurde weiter papierchromatographisch bestimmt, in welchem Verhältnis diese hauptsächlich feststellbaren Monosaccharide das nach dem erfindungsgemässen Verfahren herstellbare Polysaccharid aufbauen. Die Papierchromatographie wurde unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems durchgeführt, in welchem das Verhältnis von Äthylazetat : Pyridin : Wasser 2 : 1 : 1 betrug und welches an AgNO 0, 15 n war. Auch hier wurde nach der aufsteigenden Methode gearbeitet.
Nach der Entwicklung des Chromatogramms wurde das Papier luftgetrocknet und 1 h in einem geschlossehen Gefäss stehengelassen, in welches etwas Ammoniak eingebracht worden war. Anschliessend wurde das Papier über 20 min auf 800 C erhitzt, wobei braune Flecken aufschienen. Die Intensität der Flecken wurde mit dem Densitometer bestimmt, worauf Vergleiche mit aus den authentischen Monosacchariden Xylose, Arabinose und Galactose in verschiedenen Verhältnissen hergestellten Mischungen vorgenommen wurden. Es wurde so festgestellt, dass das nach dem erfindungsgemässen Verfahren isolierbare Polysaccharid aus Xylose, Arabinose und Galactose im Molverhältnis von 1 : 1 : 1 besteht.
Die Chromatographie wurde auch unter Verwendung von Ionenaustauschern vorgenommen.
Saccharide verbinden sich leicht mit Borsäure oder Boraten, wobei negativ geladene Boratkomplexe entstehen. Unter Verwendung dieses Prinzips wurde die Chromatographie der Monosaccharide an Ionenaustauschern vorgenommen.
Als Ionenaustauschharz wurde das Austauschharz Dowex-1 der Dow Chemical Co. verwendet, welches unter Verwendung von Cholin hergestellt ist. Die mit dem Austauschharz gefüllte Kolonne wurde mit 1 n-HCl gewaschen, worauf 0, 1 m-Kaliumtetraborat (K2B.. 07) aufgegeben wurde. Die Boratlösung wurde so lange aufgegeben, bis im Ablauf aus der Kolonne kein Chlor mehr nachgewiesen werden konnte. Nachdem das Austauschharz in die Boratform übergeführt wurde, wurde das Ionenaustauschharz gut mit Wasser gewaschen.
Eine durch Auflösen von 25 mg der erfindungsgemäss erhältlichen Substanz in 1 ml In-HSO, Erhitzen der Lösung auf dem Wasserbad während 5 h, Abtrennung der Säuren aus der Lösung unter Verwendung von 5 ml eines auf der Basis von sekundären Aminen aufgebauten Ionenaus - tauschharzes (Dowex-3 der Dow Chemical Co.) und Eindampfen zur Trockne hergestellte Probe wurde in 10 ml 0,01 m-Kalium-Tetraborat gelöst. Diese Lösung wurde über die Kolonne geleitet, worauf die Kolonne mit Natriumtetraborat eluiert wurde. Die Menge einer Fraktion betrug jeweils 20 ml. In jeder Fraktion wurde das Monosaccharid durch die Orcin-HCl-Methode und durch die Anthron-HSO-Metho- de nachgewiesen. Die Auswertung erfolgte mittels eines Elektrophotometers mit Rotfilter.
Es zeigte sich, dass Xylose, Arabinose und Galactose vorhanden waren. Im Rahmen dieses Versuches wurde in Übereinstimmung mit der papierchromatographischen Methode festgestellt, dass Xylose, Arabinose und Galactose im Verhältnis 1 : 1 : 1 vorliegen.
VI. Anticancerwirkung des gereinigten Polysaccharids :
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Die Anticancerwirkung des aus dem Rohextrakt hergestellten gereinigten Polysaccharids (S P S) auf in Mäuse überpflanzte Tumore wird mit der Anticancerwirkung des auf dem Markt befindlichen Mitomycins C verglichen. Die gleichen Eigenschaften wurden nicht nur bei den aus Bambusgras gewonnenen Polysacchariden beobachtet, sondern auch bei jenen Polysacchariden, die aus Reispflanze, Weizenstroh, Gerstenstroh, Korn, Hafer, Stielblütengras, Nusseibe, Schilf, Kolbenhirse, Hirse, Zuckerrohr (Bagasse), Melasse und Rohzucker gewonnen worden waren.
Tumore :
Es wurden folgende Tumore verwendet : sowohl feste als auch ascitische Formen des Ehrlich-Carcinoms, die feste Form des Sarkoms 180, Ascite MH-129-E in C3H-Stamm und Friend-Virenerkrankung, welche aus DD/Albino-Mäusen stammte. Diese verpflanzbare Mäusekrankheit wurde von C. Friend vor etwa 6 Jahren entdeckt und wird von einem Virus ausgelöst.
Versuche an ascitischen Tumoren :
Frisch aspirierte ascitische Flüssigkeit aus Ehrlich-Carcinöm und MH-129-E, welche sich eine Wo- che nach der Inoculation gebildet hatte, wurde in Dosen von 0,2 ml intraperitoneal in eine Gruppe von
EMI22.1
Mit der Behandlung wurde 24 h nach und 10 Tage vor der Inoculation der ascitischen Flüssigkeit begonnen und täglich wiederholt. Als Kriterium für die Wirkung der zu prüfenden Substanz wurde die Anzahl der in jeder Gruppe überlebenden Versuchstiere genommen.
Versuche an der Friend'schen Viruskrankheit :
0, 2 ml einer l Obigen Saline-Suspension des Friend'schen Virus, welches in die Milz injiziert worden war, wurde intraperitoneal in Mäuse injiziert, die in Gruppen zu 10 zusammengefasst waren. Mit der Behandlung wurde 24 h nach bzw. 10 Tage vor der Injektion des homogenisierten Milzbreies begonnen und täglich wiederholt. Die Wirkung der untersuchten Verbindungen wurde durch Vergleich des Durchschnittsgewichtes der Milzen in behandelten und unbehandelten infizierten Mäusen drei Wochen nach Injektion des Milzbreies bewertet.
Versuch an subkutanen Tumoren :
0,2 ml ascitische Flüssigkeit aus einwöchigem Ehrlich-Carcinom und Sarkom-180, welche etwa 12 Millionen Zellen enthielten, wurden subkutan in die Leistengegend weiblicher DD/Albino-Mäuse mit einem Körpergewicht von etwa 20 g injiziert. Mit der Behandlung wurde einen Tag bzw. fünf Tage nach der intraperitonealen Verpflanzung begonnen, und diese Behandlung wurde täglich wiederholt.
Die Tumore wurden jeden Tag vermessen, und das Volumen dieser Tumore wurde angenähert berechnet. Nach dem 29. Tag wurden die Mäuse autopsiert und das Körpergewicht der Mäuse und das Gewicht der Tumore bestimmt. Das Inhibitionsverhältnis wurde aus den durchschnittlichen Tumorgewichten der behandelten Gruppe und den durchschnittlichen Tumorgewichten der Vergleichsgruppe berechnet.
Um das Tumorwachstum zahlenmässig zu beschreiben, wurden die Abmessungen der Tumore in den Mäusen jeder Gruppe am 29. Tag bestimmt und mit den Abmessungen der Tumore verglichen, welche diese am 11. Tag aufwiesen. Es kann so ausgedrückt werden, ob der Tumor rückgebildet wird, weiterwächst oder unverändert bleibt.
Ergebnisse :
Ascitische Tumore :
Die an ascitischen Ehrlich-Carcinomen und MH-129-E erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XXVIII gezeigt. In beiden Fällen wurde mit der Behandlung 10 Tage vor bzw. 24 h nach der Inoculation der ascitischen Flüssigkeit begonnen. Die Behandlung erfolgte durch intraperitoneale Injektion von SPS in Dosen von 100 mg/kg. Damit konnte das Wachstum der Tumore nicht verhindert werden, und auch die Lebenserwartung wurde nicht erhöht. Eine Ausnahme bildete lediglich eine Maus von 20 behandelten Mäusen. Die Menge an ascitischer Flüssigkeit nahm bis zum 20. Tag allmählich zu, jedoch nahm dann die Menge der Flüssigkeit allmählich ab, und die Flüssigkeit verschwand schliesslich.
<Desc/Clms Page number 23>
Tabelle XXVIII
EMI23.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> von <SEP> SPS <SEP> auf <SEP> ascitisches <SEP> Ehrlich-Carcinom <SEP> im
<tb> DD-Stamm <SEP> und <SEP> auf <SEP> MH-129-E <SEP> ascitisches <SEP> Hepatom <SEP> im
<tb> C3H-Stamm
<tb> . <SEP> ascitisches <SEP> EhrlichCarcinom <SEP> MH-129-E
<tb> durch-durchschnitt- <SEP> schnitt- <SEP>
<tb> liche <SEP> Zahl <SEP> liche
<tb> Behand- <SEP> Zahl <SEP> Überle- <SEP> der <SEP> ÜberleDosierung <SEP> lungs-Ge-der <SEP> benszeit <SEP> Ge- <SEP> Mäu- <SEP> benszeit <SEP>
<tb> Verbindung <SEP> (mg/kg) <SEP> beginn <SEP> schlecht <SEP> Mäuse <SEP> (Tage) <SEP> schlecht <SEP> se <SEP> (Tage)
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalz- <SEP> 1.
<SEP> Tag <SEP> F <SEP> 10 <SEP> 13, <SEP> 4 <SEP> M <SEP> 5 <SEP> 32, <SEP> 5 <SEP>
<tb> lösung <SEP> F <SEP> 5 <SEP> 25, <SEP> 4
<tb> SPS <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> Tage <SEP> F <SEP> 10 <SEP> 12,2 <SEP> M <SEP> 5 <SEP> 14,6
<tb> vorher <SEP> F <SEP> 5 <SEP> 14,2
<tb> SPS <SEP> 100 <SEP> 1. <SEP> Tag <SEP> F <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 12. <SEP> 8 <SEP> M <SEP> 5 <SEP> 16,8
<tb> F <SEP> 5 <SEP> 19,4
<tb>
EMI23.2
Intraperitoneale Injektion von SPS in Dosen von 100 mg/kg zeigte keinen Inhibitionseffekt, auf die durch den Virus erzeugte Leukämie sowohl dann, wenn mit der Behandlung 10 Tage vor als auch 24 h nach der Injektion des Milzbreies begonnen wurde. Im Gegensatz hiezu hatte die Behandlung mit Mitomycin C einen zerstörenden Einfluss auf die Krankheit, wie den Milzgewichten entnommen werden kann.
Tabelle XXIX
EMI23.3
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> von <SEP> SPS <SEP> und <SEP> Mitomycin <SEP> C <SEP> auf <SEP> die
<tb> Friend'sche <SEP> Viruskrankheit <SEP>
<tb> DurchDosierung <SEP> schnittli-
<tb> (mg/kg <SEP> mal <SEP> che <SEP> Ände-Durchschnittliches <SEP> Inhibitions- <SEP>
<tb> Zahl <SEP> der <SEP> rung <SEP> des <SEP> Kör- <SEP> Gewicht <SEP> Sterb- <SEP> ver- <SEP>
<tb> Do- <SEP> pergewichtes <SEP> der <SEP> Milz <SEP> lieh-hältnis
<tb> Verbindung <SEP> sen) <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> %
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> +2,7 <SEP> 3,0 <SEP> 0/10
<tb> SPS <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 18.
<SEP> +0, <SEP> 9 <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> 4/10 <SEP> - <SEP> 23 <SEP>
<tb> SPS <SEP> 50 <SEP> X <SEP> 13 <SEP> +2,9 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 5/10 <SEP> 0
<tb> Mitomycin <SEP> C <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 13 <SEP> +0, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 1/10 <SEP> 80
<tb>
Die Behandlung wurde 10 Tage nach der Verpflanzung begonnen.
Mit der Behandlung wurde einen Tag nach der Verpflanzung begonnen.
Subkutane Tumore :
Die auf SPS am stärksten ansprechenden Tumore waren subkutanes Ehrlich-Carcinom und Sarcom-180.
<Desc/Clms Page number 24>
Wie der Tabelle XXX entnommen werden kann, konnte eine völlige Rückbildung von subkutan verpflanztem, einen Tag bzw. fünf Tage altem Ehrlich-Carcinom in 90% bzw. in 60'lu der Mäuse festgestellt werden, die mit 200 mg/kg SPS behandelt wurden. Bei einer verabreichten Dose von 25 bis 100 mg/kg SPS im Falle einen Tag oder fünf Tage alten Tumoren konnte auch eine Inhibitioiswirkung festgestellt werden. Im Gegensatz dazu konnte eine völlige Rückbildung von einen Tag bzw. fünf Tage alten Tumoren nicht erzielt werden, wenn die Behandlung mit Mitomycin C vorgenommen wurde.
Tabelle XXX
EMI24.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> von <SEP> SPS <SEP> und <SEP> Mitomycin <SEP> C <SEP> auf <SEP> subkutan <SEP> verpflanztes <SEP> Ehrlich-Carcinom
<tb> Durch- <SEP> Durch- <SEP> Tumor- <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> schnittliche <SEP> schnittliches <SEP> inhibi-
<tb> (mg/kg <SEP> mal <SEP> Behand-Änderung <SEP> des <SEP> Tumor- <SEP> tions- <SEP> Tumorwachstum
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> lungs- <SEP> Körper- <SEP> ge- <SEP> Sterb- <SEP> verhält- <SEP> (Volumszunahme)
<tb> Do- <SEP> beginn <SEP> gewichtes <SEP> wicht <SEP> lich- <SEP> nis <SEP>
<tb> Verbindung <SEP> sen) <SEP> am <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> o <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> i <SEP> i <SEP>
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> 1. <SEP> Tag <SEP> +2,5 <SEP> 3,22 <SEP> 1/10 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 8
<tb> SPS <SEP> 200 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1.
<SEP> Tag <SEP> +0,8 <SEP> 0, <SEP> 19 <SEP> 0/10 <SEP> 94 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP>
<tb> SPS <SEP> 200 <SEP> x <SEP> 12 <SEP> 5. <SEP> Tag <SEP> +0, <SEP> 5 <SEP> 1,01 <SEP> 0/10 <SEP> 69 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> Vergleich <SEP> Kochsalzlösung <SEP> 1. <SEP> Tag <SEP> +3,6 <SEP> 1, <SEP> 97 <SEP> 1/10 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP>
<tb> SPS <SEP> 100x15 <SEP> 1.Tag <SEP> +1, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 0/10 <SEP> 71 <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> SPS <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 15 <SEP> 1. <SEP> Tag <SEP> +1, <SEP> 7 <SEP> 0,55 <SEP> 0/10 <SEP> 72 <SEP> 2314
<tb> SPS <SEP> 25 <SEP> x <SEP> 15 <SEP> 1. <SEP> Tag <SEP> +2, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 1/10 <SEP> 82 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP>
<tb> SPS <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 13 <SEP> 5.
<SEP> Tag <SEP> +3, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 0/8 <SEP> 81 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> SPS <SEP> 50x13 <SEP> 5.Tag <SEP> +1, <SEP> 0 <SEP> 0,87 <SEP> 0/8 <SEP> 56 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP>
<tb> Mitomycin <SEP> 1, <SEP> 8x15 <SEP> 1. <SEP> Tag <SEP> +1, <SEP> 5 <SEP> 1,24 <SEP> 1/9 <SEP> 37 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Mitomycin <SEP> 1, <SEP> 8x13 <SEP> 5. <SEP> Tag <SEP> +1, <SEP> 5 <SEP> 2,26 <SEP> 0/9 <SEP> -14 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 8 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 25>
EMI25.1
behandelten Mäuse zurückgebildet, und die entsprechenden Inhibitionsverhältnisse betrugen 97% bzw.
u8010. Im Rahmen dieses Versuches wurden bei Behandlung der Mäuse 1, 8 mg Mitomycin/kg einen Tag altes Sarcom-180 in 50% der Fälle rückgebildet, wobei das Inhibitionsverhältnis 85% betrug, jedoch konnte bei der Behandlung mit Mitomycin C an fünf Tage altem Sarcom-180 keine Rückbildung beobachtet werden. Während der ersten neun Tage war das durchschnittliche Volumen des Tumors sowohl in den behandelten Gruppen als auch in der unbehandelten Vergleichsgruppe im wesentlichen das gleiche.
Nach dem neunten Tag trat eine Rückbildung in allen behandelten Gruppen auf. Die Änderungen des durchschnittlichen Tumorvolumens in jeder behandelten Gruppe waren derart, dass bei den mit SPS behandelten Mäusen der Tumor rückgebildet wurde, bei den mit Mitomycin C behandelten Mäusen eine Rückbildung von fünf Tage alten Tumoren nicht zu beobachten war und in den Mäusen der Vergleichsgruppe der Tumor ständig wuchs.
In den mit 25 - 200 mg SPS/kg behandelten Gruppen konnte kein Gewichtsverlust der Mäuse und auch keine Schädigung wichtiger Gewebe festgestellt werden, und die bei Behandlung von Tumoren mit bakteriellen Polysacchariden so häufig auftretenden Blutungen blieben aus.
Die Anticancerwirkung der aus Bambussprösslingen, der Rinde von Bambussprösslingen und den Pflanzen, die ausser dem Bambusgras zur Familie Gramineae gehören, erfindungsgemäss hergestellten Polysaccharide gegenüber Ehrlich-Carcinom und Sarcom-180 ist in den Tabellen XXXII und XXXIII zusammengefasst. Die aus den oben angegebenen Materialien hergestellten Polysaccharide zeigten die gleiche ausgezeichnete anticarcinogene Wirkung wie das aus Bambusgras hergestellte Polysaccharid. Daraus ergibt sich klar, dass das wirksame Polysaccharid in verschiedenen Pflanzen, die zur Gattung Gramineae gehören, vorhanden und damit weit verbreitet ist.
Daher kann das erfindungsgemäss bergestellte Polysaccharid leicht industriell produziert werden, um dasselbe klinisch als Arzneimittel gegen verschiedene menschliche Krebsformen zu verwenden.
<Desc/Clms Page number 26>
Tabelle XXXI
EMI26.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> von <SEP> SPS <SEP> und <SEP> Mitomycin <SEP> auf <SEP> subkutan <SEP> verpflanztes <SEP> Sarcom-180
<tb> Durchschnittliche <SEP> Durch-TumorDosierung <SEP> Behand-Änderung <SEP> des <SEP> schnittliches <SEP> inhibi-Tumorwachstum
<tb> (mg/kg <SEP> mal <SEP> lungs- <SEP> Körper- <SEP> Tumor- <SEP> Sterb- <SEP> tions- <SEP> (Volumszunahme)
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> beginn <SEP> gewichtes <SEP> gewicht <SEP> lich- <SEP> verhältnis <SEP>
<tb> Verbindung <SEP> Dosen) <SEP> am <SEP> in <SEP> g <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> in <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Vergleich <SEP> physiologische <SEP> 1. <SEP> Tag <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 63 <SEP> 1/9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP>
<tb> Kochsalzlösung
<tb> SPS <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 15 <SEP> 1.
<SEP> Tag <SEP> +0,7 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0/9 <SEP> 97 <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> SPS <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 13 <SEP> 5. <SEP> Tag <SEP> +2, <SEP> 3 <SEP> 0,07 <SEP> 0/9 <SEP> 98 <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Mitomycin <SEP> C <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 15 <SEP> 1. <SEP> Tag <SEP> +1, <SEP> 3 <SEP> 0,4 <SEP> 0/10 <SEP> 85 <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP>
<tb> Mitomycin <SEP> C <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 13 <SEP> 5.
<SEP> Tag <SEP> +1, <SEP> 6 <SEP> 1,89 <SEP> 0/9 <SEP> 28 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 27>
Tabelle XXXII
EMI27.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> der <SEP> aus <SEP> verschiedenen <SEP> Rohstoffen <SEP> hergestellten <SEP> Polysaccharide
<tb> auf <SEP> subkutan <SEP> implantiertes <SEP> Ehrlich-Carcinom
<tb> Durch- <SEP> Durch- <SEP>
<tb> Dosierung <SEP> schnittliche <SEP> schnitt- <SEP> Tumor- <SEP> Veränderungen <SEP> des
<tb> (mg/kg <SEP> mal <SEP> Beginn <SEP> der <SEP> Änderung <SEP> liches <SEP> Sterb- <SEP> Hemm- <SEP> Tumorvolumens
<tb> Verbindung <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Be- <SEP> Behandlung <SEP> des <SEP> Körper- <SEP> Tumorge- <SEP> lich- <SEP> quote,
<tb> aus <SEP> handlungen)
<SEP> am <SEP> gewichtes <SEP> in <SEP> g <SEP> wicht <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> physiologische
<tb> Kontrolle <SEP> (K) <SEP> Kochsalzlösung <SEP> (P) <SEP> 1. <SEP> Tag <SEP> (T) <SEP> 1,0 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0/5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 5
<tb> Reispflanzenstroh <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0/5 <SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> K <SEP> P <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0/5 <SEP> 0005 <SEP>
<tb> Bagasse <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0/5 <SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> K <SEP> P <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 2,8 <SEP> 1, <SEP> 38 <SEP> 0/5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Melasse <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1.
<SEP> T <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0/5 <SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Blätter <SEP> und
<tb> Stämme <SEP> des <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0/5 <SEP> 100 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Maises
<tb> Stielblütengras <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 4,0 <SEP> 0, <SEP> 51 <SEP> 0/5 <SEP> 63 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> K <SEP> P <SEP> l. <SEP> T <SEP> 3,0 <SEP> 5, <SEP> 38 <SEP> 0/5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP>
<tb> Weizenstroh <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 94 <SEP> 0/5 <SEP> 46 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bambussprössling <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1.
<SEP> T <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 0,38 <SEP> 1/5 <SEP> 95 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Rinde <SEP> des <SEP> Bambussprösslings <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 84 <SEP> 0/5 <SEP> 66'0 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 28>
Tabelle XXXIII
EMI28.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> der <SEP> aus <SEP> verschiedenen <SEP> Rohstoffen <SEP> hergestellten <SEP> Polysaccharide
<tb> auf <SEP> subcutan <SEP> implantiertes <SEP> Sarcom-180
<tb> Durch-DurchDosierung <SEP> schnittliche <SEP> schnitt- <SEP> Tumor- <SEP> Veränderungen <SEP> des
<tb> (mg/kg <SEP> mal <SEP> Beginn <SEP> der <SEP> Änderung <SEP> liches <SEP> Sterb-Hemm-Tumorvolumens
<tb> Verbindung <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Be- <SEP> Behandlung <SEP> des <SEP> Körper- <SEP> Tumorge <SEP> - <SEP> lich- <SEP> quote <SEP>
<tb> aus <SEP> handlungen)
<SEP> am <SEP> gewichtes <SEP> in <SEP> g <SEP> wicht <SEP> in <SEP> g <SEP> keit <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> K <SEP> P <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 0/7 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP>
<tb> Bagasse <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0/7 <SEP> 99 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Melasse <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP> 0/7 <SEP> 70 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP>
<tb> K <SEP> P <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 18 <SEP> 0/7 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP>
<tb> Reispflanzenstroh <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 19 <SEP> 0/7 <SEP> 91 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Gerstenstroh <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1.
<SEP> T <SEP> 4,4 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0/7 <SEP> 85 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Blätter <SEP> und <SEP> Stämme <SEP> des <SEP> Maises <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 3,7 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0/7 <SEP> 87 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> K <SEP> P <SEP> l. <SEP> T <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 2, <SEP> 75 <SEP> 0/7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP>
<tb> Weidegras <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 79 <SEP> 0/7 <SEP> 71 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP>
<tb> K <SEP> p <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 4, <SEP> 82 <SEP> 0/8 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP>
<tb> Reisspreu <SEP> 100 <SEP> x <SEP> 14 <SEP> 1. <SEP> T <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP> 0/8 <SEP> 99 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
K : Kontrolle P :
physiologische Kochsalzlösung T : Tag
<Desc/Clms Page number 29>
Aus diesen Untersuchungen ergibt sich, dass bei geringster toxischer Wirkung durch interperitoneale Verabreichung von SPS subkutanes Sarcom-180 und Ehrlich-Carcinom in Mäusen zu einem hohen Prozentsatz rückgebildet wird. Im Gegensatz dazu zeigt isch keine Wirkung auf die ascitischen Formen.
Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt liegen nur wenige Berichte darüber vor, dass ein Polysaccharid ascitische Tumorzellen oder festen Tumor schädigt, ohne Blutungen im Tumorgewebe zu erzeugen. Lazal et al. berichteten über einen onkolytischen Effekt, der Methylcellulose auf Murphy-Sturm Lympho-Sarcom in Sprague-Dawley-Ratten. Bei den Versuchen dieser Autoren hatte die Injektion eine Wirkung auf die Zunahme (takes) oder das Wachstum des Tumors während der ersten zehn Tage nach der Transplantation, wobei jedoch zwischen dem 17. und dem 21. Tag nach der Transplantation die Tumore in zahlreichen Fällen völlig rückgebildet wurden.
Hinsichtlich der Wirkungsweise dieser Substanz sagen diese Autoren, dass die Methylcellulose die Funktion des Retikulo-Endothetialen Systems stimuliere und eine mögliche Erklärung für die Inhibierung des Tumorwachstums sei, dass eine Änderung im Immunitätsverhalten der behandelten Tiere in solcher Weise auftrete, dass die Eigenwirkung (homograft) des Tumors in verstärktem Masse zurückgewiesen wird. Diller et al. berichtete ebenfalls über die onkolytische Wirksamkeit von Polysacchariden der Hefe, nämlich Zymosan und Hydroglucan, welche beträchliche Wirkung auf subkutanes Sarcom-37, Sarcom-180 und Krebs-2 ausüben, jedoch keine Wirkung auf die entsprechenden ascitischen Formen zeigen.
Die onkolytische Wirkung dieser Hefepolysaccharide ist der Wirkung der erfindungsgemäss erhältlichen Polysaccharide ziemlich ähnlich, u. zw. werden feste Tumore resorbiert, die Necrosis ist nicht von Blutungen begleitet und gegenüber ascitischen Tumoren zeigt sich keine Wirkung. Auch Diller et al. schlossen bezüglich des Wirkungsmechanismus der fraglichen Substanzen, dass die Tumorresorption und die Necrosis über eine im Wirt ablaufende Reaktion eingeleitet wird, im Rahmen derselben die Leber und die Milz zur Produktion phagocytischer Elemente angeregt wird. Auch im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen zeigte sich keine Wirkung von SPS auf das Wachstum von subkutanen Tumoren während der ersten neun Tage nach der Transplantation.
Der erfindungsgemäss herstellbare Stoff scheint somit nicht direkt auf Tumorzellen zu wirken, sondern über einen unbekannten Stoff, der im Körper des Tieres sekundär erzeugt wird.
Es ergibt sich somit, dass der Wirkungsmechanismus von SPS nicht derselbe zu sein scheint wie jener der direkten Zerstörung des Tumors durch bakterielle Polysaccharide, worüber bereits von zahlreichen Autoren berichtet wurde. Ein Unterschied kann auch gegenüber jenen von Belkin et al. aus höheren Pflanzen isolierten Polysacchariden bestehen, welche ascitisches Sarcom-37 schädigten.
Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1: 10 kg getrockneter Blätter von Kuma-Sasa, Albo-Marginata, Makino et Shibata, wurden zerschnitten und mit 70 1 Wasser versetzt. Die Mischung wurde unter Rühren etwa 5 h auf 80 bis 1000 C erhitzt. Nach dem Absitzenlassen bei Raumtemperatur wurde filtriert. Zum Filtrationsrückstand wurden 60 l Wasser gegeben und nochmals extrahiert. Der erhaltene dunkelbraune Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Der PH-Wert des Extraktes lag etwa im Neutralbereich. Durch einmaliges Filtrieren des eingeengten Extraktes wurden Verunreinigungen entfernt. Das Filtrat wurde nun gegen fliessendes Wasser 24 - 48 h dialysiert, wobei als semi-permeable Membran ein Cellophanpapier verwendet wurde.
Die nach der Dialyse im von der Membran umschlossenen Raum verbleibende Flüssigkeit wurde filtriert, worauf das Filtrat unter vermindertem Druck auf etwa 2 1 eingeengt wurde. Dem Konzentrat wurde unter Rühren Ammonsulfat in Pulverform bis zur Sättigung zugegeben. Nachdem das Ganze in einem Kälteschrank über Nacht stehengelassen wurde, wurde die Lösung filtriert, wobei ein dunkelbrauner Niederschlag erhalten wurde. Dieser Niederschlag wurde mehrere Male mit einer gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat gewaschen, worauf der Niederschlag in etwa 2 1 Wasser gelöst wurde. Zwecks Entfernung von Verunreinigungen wurde filtriert, worauf das Filtrat 24 h gegen entionisiertes Wasser dialysiert wurde, wobei ein Cellophanpapier als semi-permeable Membran verwendet wurde. Die nunmehr vorliegende Lösung wurde unter vermindertem Druck auf etwa 11 eingeengt.
Nun wurden etwa 60 ml Eisessig zugefügt, sodass eine an Essigsäure l-normale Lösung erhalten wurde. Niederschläge, beispielsweise von Proteinen od. dgl. wurden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde auf eine mit Entfärbungsharz Duolite S-30 gefüllte Kolonne von etwa 200 ml Inhalt aufgegeben, nachdem das Entfärbungsharz mit 1 n-Essigsäure vorbereitet worden war. Der Ablauf aus der Kolonne war soweit entfärbt, dass er blassgelbe Farbe zeigte. Der Kolonnenablauf wurde unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml eingeengt, worauf zum Konzentrat 400 ml Äthanol gegeben wurden. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert und getrocknet. Es wurden so 3,4 g eines Polysaccharids erhalten. Das erhaltene Produkt besass blassgelbe Farbe, stellte ein feines Pulver dar und war löslich in Wasser, jedoch kaum löslich in üblichen organischen Lösungsmitteln.
Das Produkt war nicht hygroskopisch.
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:Beispiel 2 : Trockene Blätter von Kuma-Sasa, Sasa albo-marginata, welches im Dezember 1962 bei Okunikko geerntet worden war, wurde vermahlen und 390 kg hievon wurden in 3000 kg Wasser auf 60 - 800C erhitzt, wobei etwa 8 h kräftig gerührt wurde. Nach der Filtration des Extraktes wurde die Flüssigkeit unter vermindertem Druck auf etwa 160 1 eingeengt, worauf unter Zusatz von 12 kg Filterhilfe filtriert wurde. Das Filtrat wurde gegen fliessendes Wasser dialysiert, und die nicht dialysierbare Flüssigkeit wurde auf etwa 40 l eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wurde mit Ammonsulfat gesättigt und über Nacht stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert und zweimal mit gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen.
Der erhaltene Niederschlag wurde in 40 l Wasser gelöst, worauf die Flüssigkeit gegen fliessendes Wasser dialysiert wurde. Die nicht dialysierbare Flüssigkeit wurde auf 421 eingeengt, worauf 3 1 Essigsäure zum Konzentrat zugegeben wurden und über Nacht stehengelassen wurde. Die Flüssigkeit wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine mit Entfärbungsharz Duolite S-30 gefüllte Kolonne aufgegeben. Der Kolonnenablauf wurde filtriert, auf etwa 5 1 eingeengt, worauf das vierfache Volumen an Äthanol zugegeben wurde und über Nacht stehengelassen wurde. Es wurden so 70 g eines graubraunen amorphen Pulvers erhalten. Dieses rohe Pulver wurde wieder in 2 1 destilliertem Wasser gelöst, worauf unlösliche Stoffe abfiltriert wurden.
Das Filtrat wurde über eine mit 700 ml Austauschharz Amberlite IR-120, welches in H-Form gebracht wurde, gefüllte Kolonne und dann über eine mit 1000 ml Ionenaustauschharz Amberlite IRA-410, welches in OHForm gebracht wurde, gefüllte Kolonne geleitet. Der Ablauf aus der Kolonne wurde unter vermindertem Druck eingeengt, worauf dem Konzentrat das Vierfache an Äthanol zugegeben wurde und über Nacht stehengelassen wurde. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert und mit Äthanol und Äther gewaschen. Es wurden so 14 g eines grauen Pulvers erhalten, das stark positive Orein-, Molish- und Anthron-Reaktionen ergab, jedoch in der Fehling-, Tollen-, Elson-Morgan-und Ninhydrin-Reaktion negativ reagierte.
Das erhaltene Produkt ist leicht löslich in Wasser und unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln.
Die Analyse der erhaltenen Substanz war folgende : 44, 6% C ; 5, 94' H ; 0, 75% N ; 2, 1% Asche.
Beispiel ;S: Frische Blätter von Nemagari-take, Sasa-Paniculata, wurden fein geschnitten. 30 kg
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Da im Laufe des Extrahierens die Flüssigkeit sauer wurde, wurde, um die Flüssigkeit neutral zu halten, häufig pulverförmiges Kaliumhydroxyd zugegeben. Nach 3 h wurde die Flüssigkeit abstehen gelassen und der Extrakt filtriert. Der Rückstand wurde nochmals mit 100 I Wasser extrahiert. Im Laufe der gesamten Extraktion wurden 400 g Kalziumhydroxyd benötigt. Die Extrakte wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 200 I eingeengt. Dieses Konzentrat stellt den Rohextrakt dar.
Anschliessend wurde der pi- Wert dieses Extraktes mit verdünnter Schwefelsäure auf 3,5 eingestellt. Es schieden sich anschliessend Kalziumsalze und Proteine ab, die abfiltriert wurden. Dem Filtrat wird sodann unter Rühren verdünnte Natriumkarbonatlösung zugegeben, bis die Lösung neutral reagiert. Sodann wird zur Lösung pulveriges Ammonsulfat unter Rühren zugegeben, bis die Lösung an Ammonsulfat gesättigt ist. Nach dem Stehenlassen über Nacht wurde filtriert. Der abgeschiedene dunkelbraune Niederschlag wurde gesammelt. Der Niederschlag wurde sodann wieder in etwa 7 1 Wasser gelöst. Zwecks Entfernung von Verunreinigungen wurde die Lösung einmal filtriert, worauf das Filtrat mit Ammonsulfat gesättigt wurde. Das Aussalzen wurde mehrmals vorgenommen.
Nachdem das erhaltene Material mit gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen worden war, wurde es in etwa 3 1 destilliertem Wasser gelöst und über eine mit einem stark sauren Ionenaustauschharz gefüllte Kolonne und anschliessend über eine mit einem stark basischen Ionenaustauschharz gefüllte Kolonne geleitet, um anorganische Salze restlos zu entfernen. Der Ablauf aus den Kolonnen wurde mit Eisessig angesäuert, bis die Konzentration an Essigsäure etwa 1-normal war. Der entstandene geringfügige Niederschlag von Proteinen wurde sorgfältig abfiltriert. Anschliessend wurde das Filtrat über eine mit Entfärbungsharz Duolite S-30 gefüllte Kolonne geleitet. Der Kolonnenablauf wurde unter vermindertem Druck auf 200 ml eingeengt. Anschliessend wurden zum Konzentrat 800 ml Azeton gegeben.
Nach dem Abfiltrieren des Niederschlages wurde der Niederschlag mit 80% igem wasserhaltigem Azeton und dann mit wasserfreiem Azeton gewaschen und schliesslich getrocknet. Es wurden 5, 5 g eines dunklen Pulvers erhalten.
Die Analyse desselben war :
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9% C ; 5, 57% H ; 1, 3% N ; 3, 5% Asche.Beispiel 4 : 1, 2 kg geschnittene Reispflanzen, Cryza Sativa L,, wurden zu etwa 20 l Wasser gegeben und darin unter Rühren 5 h auf 90 - 930C erhitzt. Nach dem Abstehen der Mischung bei Raumtemperatur wurde filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck auf etwa 1, 21 eingeengt. Anschliessend wurde die Lösung mit 60 ml Essigsäure angesäuert. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert. Die erhaltene Lösung wurde auf 600 ml eingeengt, worauf die Lösung unter Rühren mit pulverförmigem Ammonsulfat gesättigt wurde. Nach dem Sättigen der Lösung wurde diese über Nacht in einem Eisschrank stehengelassen, worauf filtriert wurde.
Der entstandene dunkelbraune Niederschlag wurde abzentrifugiert und zweimal mit einer gesättigten Ammonsulfatlösung gewaschen. Sodann wurde der Niederschlag in etwa 500 ml Wasser gelöst und gegen fliessendes Wasser unter Verwendung eines Zellophanpapiers als semi-permeable Membran drei Tage gegen fliessendes Wasser dialysiert. Die nicht dialysierbare Lösung wurde unter vermindertem Druck auf 680 ml eingeengt. Nach Zugabe von etwa 42 ml Eisessig wurde die Lösung über eine mit Entfärbungsharz Duolite S-30 gefüllte Kolonne geleitet, wobei das in Wasser etwa ein Volumen von 100 ml besitzende Harz vorher mit 1n-Essigsäure vorbehandelt wurde. Der Kolonnenablauf wurde 3 Tage lang dialysiert und dann unter vermindertem Druck auf etwa 40 ml eingeengt.
Dem Konzentrat wurden sodann 160 ml Äthanol zugegeben, worauf der entstandene Niederschlag abzentrifugiert, gesammelt und getrocknet wurde. Es wurden so 0, 27 g eines Polysaccharids erhalten. Das erhaltene Produkt stellte ein graues feines Pulver dar, das in Wasser löslich, in üblichen organischen Lösungsmitteln jedoch kaum löslich war. Das Produkt war nicht hygroskopisch.
44, 1% C ; 5, 86% H ; 0, 9% N ; 2. 0% Asche.
Beispiel 5 : 10 kg getrockneter Blätter undStengeln vonZeaMays L. wurden vermahlen und mit etwa 70 l Wasser versetzt. Die Mischung wurde auf 80 - 1000C erhitzt und 5 h gerührt. Nach dem Filtrieren des Extraktes wurde der Rückstand an Blättern und Stengeln nochmals mit 70 1 Wasser versetzt und erneut erhitzt, worauf filtriert wurde. Die Extrakte wurden miteinander vermischt und auf etwa 10 1 unter vermindertem Druck eingeengt. Anschliessend wurden zum Konzentrat 600 ml Essigsäure gegeben.
Der gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert. Die erhaltene Lösung wurde auf etwa 4 l eingeengt und mit pulverigem Ammonsulfat unter Rühren gesättigt. Nachdem die Lösung gesättigt worden war, wurde sie in einem Eisschrank über Nacht stehengelassen und sodann filtriert. Der entstandene braune Niederschlag wurde abzentrifugiert und zweimal mit gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen. Der Niederschlag wurde sodann in etwa 4 l Wasser gelöst und gegen fliessendes Wasser 2 Tage unter Verwendung einer Membran aus Zellophanpapier dialysiert. Die nicht dialysierbare Lösung wurde unter vermindertem Druck auf 3 1 eingeengt. Nach Zugabe von 200 ml Essigsäure wurde die Lösung über eine Kolonne geleitet, die mit Duolite S-30 gefüllt war, das mit In-Essigsäure vorbehandelt worden war.
Der erhaltene Kolonnenablauf war entfärbt und besass blassgelbe Farbe. Der Kolonnenablauf wurde 2 Tage dialysiert und dann unter vermindertem Druck auf etwa 500 ml eingeengt. Sodann wurden 1, 5 1 Äthanol zugegeben, und der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert und sodann getrocknet. Es wurden 1,8 g eines lichtgelben Polysaccharids erhalten.
Die Analyse desselben war folgende :
42, 91oC ; 5, 691oH ; 1, 25% N ; 0, 8% Asche.
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auf 2, 3 l eingeengt. Das Konzentrat wurde 45 h unter Verwendung einer semi-permeablen Membran aus Zellophanpapier dialysiert, worauf auf 750 ml eingeengt wurde, Das erhaltene Konzentrat wurde mit Ammonsulfat gesättigt. Nach dem Stehenlassen der Lösung über Nacht wurde der gebildete braune Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wurde sodann wieder in 500 ml Wasser gelöst, worauf Verunreinigungen abfiltriert wurden. Das Filtrat wurde nochmals mit Ammonsulfat gesättigt. Der erhaltene Niederschlag wurde gut mit gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen und in 750 ml destilliertem Wasser gelöst.
Die erhaltene Lösung wurde über eine mit einem stark sauren Ionenaus- tauschharz gefüllte Kolonne und dann über eine mit einem stark basischen Ionenaustauschharz gefüllte Kolonne geleitet, um anorganische Salze restlos zu entfernen. Der schliesslich erhaltene Kolonnenablauf wurde mit 40 ml Eisessig angesäuert, bis die Lösung an Essigsäure etwa 1-normal war. Die auf diese Weise abgeschiedenen Proteine wurden sorgfältig abfiltriert. Anschliessend wurde das Filtrat über eine mit Entfärbungsharz Duolite S-30 gefüllte Kolonne geleitet, worauf der Kolonnenablauf unter vermindertem Druck auf 100 ml eingeengt wurde. Nach dem Filtrieren des Konzentrates wurden 400 ml Azeton dem Konzentrat zugegeben.
Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, gut mit 80%obigem Azeton und dann mit wasserfreiem Azeton gewaschen und schliesslich getrocknet. Es wurden 2, 4 g eines grauen Pulvers erhalten.
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Die Analyse desselben ergab : 42,5% C; 5,63% H; 1,1% N; 1, 8% Asche.
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permeablen Membran aus Zellophanpapier gegen fliessendes Wasser dialysiert. Es wurden so etwa 5 l nicht dialysierbare Lösung erhalten. Diese Lösung wurde unter vermindertem Druck auf etwa 600 ml eingeengt. Die Verunreinigungen wurden abzentrifugiert, wobei eine klare braune Flüssigkeit erhalten wurde. Dieser Flüssigkeit wurden 500 g Ammonsulfat zwecks Sättigung zugegeben. Nach dem Stehenlassen der Lösung über Nacht wurden die abgeschiedenen festen Stoffe abfiltriert oder abzentrifugiert.
Der Niederschlag wurde zweimal mit gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen und dann wieder in etwa 11 Wasser gelöst. Unlösliches wurde abfiltriert. Das erhaltene klare Filtrat wurde unter Verwendung von Zellophanpapier zwecks Entfernung von Salzen gegen fliessendes Wasser dialysiert. Die nicht dialysierbare Lösung wurde auf 800 ml eingeengt und sodann mit 50 ml Eisessig vermischt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert. Sodann wurde das Filtrat über eine Kolonne geleitet, die etwa 200 ml des Entfärbungsharzes Duolite S-30 enthielt, das mit ln-Essigsäure vorbehandelt worden war. Der entfärbte Ablauf aus der Kolonne wurde unter vermindertem Druck auf etwa 30ml eingeengt und mit 120 ml Methanol vermischt.
Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und in Vakuum getrocknet, wobei 550 mg eines grauen Pulvers erhalten wurden.
Das erhaltene graue Pulver besass nicht die Eigenschaft reduzierender Zucker, wie sich aus der Fehling-Reaktion ergab. Das erhaltene Produkt enthält Spuren von Stickstoff und Asche.
Die Analyse ergab : 42,7% C; 5,91% ES; 0,6% N; 1,3% Asche.
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permeable Membran gegen fliessendes Wasser dialysiert. Die nicht dialysierbare Lösung wurde unter vermindertem Druck auf etwa 11 einer dunkelbraunen Lösung eingeengt. Eine geringe Menge von abgeschiedenen Verunreinigungen wurde abfiltriert, worauf mit etwa 1, 5 kg Ammonsulfat gesättigt wurde. Nach dem Abstehenlassen der Lösung über Nacht wurde der gebildete Niederschlag abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde zweimal mit gesättigter wässeriger Ammonsulfatlösung gewaschen. Der erhaltene dunkelbraune Niederschlag wurde in etwa 200 ml Wasser angeteigt, worauf das Ganze in Zellophanpapier gegeben und gegen fliessendes Wasser 72 h dialysiert wurde. Es wurden so etwa 3 1 einer nicht dialysierbaren Lösung erhalten, die zwecks Klärung einmal filtriert wurde.
Das Filtrat wurde mit 200 ml Essigsäure vermischt, und die Mischung wurde wieder filtriert. Die abgeschiedene Menge an Proteinen war dieses Mal sehr gering. Anschliessend wurde das Filtrat durch eine mit 800 ml Entfärbungsharz Duolite A-7, welches mit 1n-Essigsäure vorbereitet worden war, gefüllte Kolonne geleitet, wobei die entfernten Stoffe adsorbiert wurden. Der Kolonnenablauf wurde bei niedriger Temperatur auf etwa 500 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 12 g neutralem Bleiazetat versetzt, wobei ein brauner Niederschlag entstand, der abzentrifugiert wurde. Die Flüssigkeit wurde sodann mit 10% figer Natriumkarbonatlösung auf einen PH- Wert von etwa 8, 0 eingestellt, wobei Bleikarbonat ausgefällt wurde.
Der gebildete Niederschlag an Bleikarbonat wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde sodann über eine mit
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aus der Kolonne austrat, betrug etwa 7. Der Kolonnenablauf wurde unter vermindertem Druck auf 100 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde unter Rühren mit 400 ml Äthanol vermischt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wobei 0, 9 g eines grauen Pulvers erhalten wurden.
Die Prüfung des Produktes auf Bleiion war negativ. Das erhaltene Produkt enthielt eine Spur Stickstoff und Asche. Die Prüfung auf Monosaccharid war negativ.
Die Analyse ergab : 43, 8% C ; 5, 76% H ; 0, 5% N ; 0, 1% Asche.
Beispiel 9 : 10 kg aus Zuckerrohr, Saccharum officinalum L., erhaltene Bagasse wurde mit 801 kochendem Wasser 6 h unter Rühren extrahiert. Der Extrakt wurde filtriert und unter vermindertem Druck auf etwa 5 l eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wurde unter Verwendung von Zellophanpapier als semi-permeable Membran 2 Tage dialysiert, worauf die nicht dialysierbare Lösung auf 1, 31 eingeengt wurde. Das Konzentrat wurde mit Ammonsulfat gesättigt. Nach dem Stehenlassen über Nacht wurde die Lösung zentrifugiert. Es wurde ein dunkelbrauner Niederschlag erhalten, der in 11 Wasser aufgelöst wurde, worauf eine geringe Menge an Unlöslichem abfiltriert wurde. Das klare Filtrat wurde nochmals mit Ammonsulfat gesättigt. Das Aussalzen wurde wiederholt vorgenommen.
Der schliesslich erhaltene Niederschlag wurde gut mit gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen und in 11 Wasser gelöst. Die erhal-
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tene Lösung wurde über eine mit einem sauren und eine mit einem basischen Ionenaustauschharz gefüllte Kolonne geleitet, um anorganische Salze zu entfernen. Der Kolonnenablauf wurde mit 65 ml Eisessig vermischt, worauf filtriert wurde, um den gebildeten Niederschlag zu entfernen. Das Filtrat wurde über eine mit Duolite S-30 und Dowex-3 (Dow Chemical Co.) gefüllte Kolonne geleitet, wobei die Essigsäure aus der Lösung entfernt wurde. Der Pu- Wert des Kolonnenablaufes lag etwa im Neutralbereich. Der Kolonnenablauf wurde unter vermindertem Druck auf 300 ml eingeengt. Dem Konzentrat wurden 1, 2 I Methanol zugegeben.
Es entstand ein Niederschlag, der abfiltriert, mit 80% gem Methanol und dann mit absolutem Methanol gewaschen wurde und schliesslich getrocknet wurde. Es wurden 0, 43 g eines grauen Pulvers erhalten.
Die Analyse ergab : 44, 1% C ; 5, 861oH ; 0, 35% N ; 0, 15% Asche.
Beispiel 10 : 3 kg getrockneter Blätter und Stengel von Gerstenstroh, Hordeum vulgäre L. var.
Hexastichon Aschers, wurden zerschnitten und mit 40 l kochendem Wasser 4 h unter Rühren extrahiert.
Die Mischung wurde filtriert und der Extrakt wurde unter vermindertem Druck auf etwa 2 1 eingeengt.
Das erhaltene Konzentrat wurde mit Schwefelsäure auf PH- Wert 3,5 angesäuert. Nach der Abtrennung des Niederschlages wurde das Filtrat mit Ammonsulfat gesättigt. Nach dem Stehenlassen über Nacht wurde die Lösung zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde gut mit gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen, dann in 0, 7 1 Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde unter Verwendung von Zellophanpapier 2 Tage dialysiert, worauf die nicht dialysierbare Lösung auf 1 l eingeengt wurde. Die erhaltene Lösung wurde über eine mit einem sauren und basischen Ionenaustauschharz gefüllte Kolonne geleitet.
Der Kolonnenablauf wurde unter vermindertem Druck auf 70 ml eingeengt. Dem Konzentrat wurden 210 ml Methanol zugegeben. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt. Nach Waschen mit 80% igem Methanol und dann mit absolutem Methanol wurden
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gBeispiel 11 : 2, 5 kg getrockneter Blätter und Stengel von Hafer, Avena fatua L., wurden nach der im Beispiel 10 beschriebenen Weise extrahiert. Nachdem der Extrakt durch Aussalzen mit Ammonsulfat, durch Dialyse, durch Behandlung mit Ionenaustauschharzen und durch Fällung nach der im Beispiel 10 beschriebenen Weise gereinigt wurde, wurden 1, 2 g eines grauen Pulvers erhalten.
Die Analyse ergab :
43, 3% C ; 5, 91% H ; l, 12% N ; l, 51% Asche.
Beispiel 12 : 8 kg getrockneter Blätter und Stengel von Stielblütengras, Miscanthus sinensis Anderss, wurden nach der in Beispiel 10 beschriebenen Weise extrahiert und gereinigt, wobei 1, 5 g eines bräunlich-grauen Pulvers erhalten wurden.
Die Analyse ergab :
42, 8% C ; 5, 641oH ; 0, 91oN-, 2, 3% Asche.
Beispiel 13 : 3 kg getrockneter Blätter und Stengel von Nusseibe"Phragmites communis Trinius, wurden nach der im Beispiel 10 beschriebenen Weise extrahiert und gereinigt, wobei schliesslich 1, 1 g eines grauen Pulvers erhalten wurden.
Die Analyse ergab :
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7% C ; 5, 59% H ; 1, 3% N : 1, 86% Asche.Beispiel 14 : 4,5 kg getrockneter geschnittener Blätter und Stengel von Schilf, Setaria italica Beano, wurden mit 50 1 auf 70 - 1000C erhitztem Wasser 4 h unter Rühren extrahiert. Nach dem Filtrieren der Mischung wurde das Filtrat unter vermindertem Druck auf etwa 1, 21 eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wurde mit Essigsäure auf PH- Wert 3, 5 angesäuert. Nach dem Abzentrifugieren des entstandenen Niederschlages wurde die Lösung mit Ammonsulfat gesättigt und über Nacht stehengelassen.
Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert und zweimal mit einer gesättigten Ammonsulfatlösung gewaschen. Sodann wurde der Niederschlag in 500 ml Wasser gelöst und die Lösung in Zellophanpapier 2 Tage gegen fliessendes Wasser dialysiert. Die Innenlösung wurde über eine mit einem sauren und basischen Ionenaustauschharz gefüllte Kolonne geleitet. Der Kolonnenablauf wurde unter Zugabe von Essigsäure weiter über eine mit Duolite S-30 gefüllte Kolonne geleitet. Der Kolonnenablauf wurde dann unter vermindertem Druck auf 65 ml eingeengt, worauf 130 ml Äthanol dazugegeben wurden. Nach dem Abfiltrieren des entstandenen Niederschlages wurde nochmals mit Äthanol aus wässeriger Lösung ausgefällt, worauf der erhaltene Niederschlag mit 80% gem Äthanol und schliesslich mit absolutem Äthanol gewaschen, abfiltriert und getrocknet wurde.
Es wurden so 1,6 g eines grauen Pulvers erhalten.
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:Beispiel 15 : 2, 5 kg getrockneter Blätter und Stengel von Kolbenhirse, Panicum miliaceum L., wurden mit heissem Wasser extrahiert, worauf der Extrakt nach der im Beispiel 14 beschriebenen Weise gereinigt wurde. Es wurden so 0, 9 g eines grauen Pulvers erhalten.
Die Analyse ergab :
42,3%C ;5,91%11;1,21%N;1,54%Asche, Beispiel 1 û : 0, 2 kg getrockneter Blätter und Stengel von Hirse, Sorghun bicolor M., wurden mit heissem Wasser extrahiert, worauf der Extrakt, wie im Beispiel 14 beschrieben, gereinigt wurde, womit schliesslich 1, 4 g eines grauen Pulvers erhalten wurden.
Die Analyse ergab :
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Wasser extrahiert, worauf der Extrakt, wie im Beispiel 8 beschrieben, gereinigt wurde. Es wurden so 0,8 g eines grauen Pulvers erhalten.
Die Analyse ergab :
43, 8 C ; 5, 58' 1l ; 0, 62 N ; 1, 86"/oAsche.
Beispiel18 :3,5kggetrockneterBlättervonPleioblastussimoniiN,wurdenmitheissemWasser extrahiert, worauf der Extrakt, wie im Beispiel 8 beschrieben, gereinigt wurde. Es wurden schliesslich 1, 2 g eines grauen Pulvers erhalten.
Die Analyse ergab :
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C ;Beispiel 19 : 3kg aus Zuckerrohr hergestellter Rohzucker wurden in Wasser gelöst. Die Lösung wurde unter Verwendung von Zellophanpapier gegen fliessendes Wasser dialysiert. Die Innenlösung wurde unter vermindertem Druck auf etwa 0, 5 l eingeengt, worauf mit Ammonsulfat gesättigt wurde. Der Niederschlag wurde einmal mit gesättigter wässeriger Ammonsulfatlösung gewaschen. Der erhaltene Niederschlag wurde in 200 ml Wasser gelöst, worauf das Ganze wieder gegen fliessendes Wasser 48 h dialysiert wurde. Die Innenlösung wurde einmal filtriert. Das Filtrat wurde mit Essigsäure angesäuert, worauf die Mischung wieder filtriert wurde.
Anschliessend wurde das Filtrat durch eine mit 200 ml Duolit S-30, welches mit In-Essigsäure vorbehandelt worden war, gefüllte Kolonne geleitet. Der Kolonnenablauf wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 4 Volumen Äthanol vermischt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wobei 0, 15 g eines grauen Pulvers erhalten wurden.
Die Analyse ergab :
43,6%C ;5,58%11;0,13%N;2,36%Asche.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharides mit Anticancerwirkung, dadurch gekennzeichnet, dass fein zerteilte Blätter oder Stengel von zumindest einer Pflanze der Familie Gramineae oder Melassen davon, u. zw. solche der Gattungen Sasa, Phyllostachys, Pleioblastus, Oryza, Hordeum, Triticum, Avena, Miscanthus, Phragmites, Setaria, Panicum, Sorghum, Zea und Saccharum, mit Wasser extrahiert werden und durch Einengen des Filtrates ein Rohextrakt hergestellt wird, welcher gegebenenfalls durch Dialyse, Aussalzen, Behandlung mit Ionenaustauscherharzen und mit Entfärbungsharzen oder Bleiazetat oder durch Kombination mehrerer dieser Massnahmen gereinigt wird.