DE2158467C3 - Nierenfunktionsdiagnosticum und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein neues Nierenfunktionsdiagnostikum auf der Basis von Polyfructosanen, das parenteral verabreicht werden kann, im Körper weder abgebaut noch verändert und durch die Nieren ausgeschieden wird, so daß aufgrund der Ausscheidungsgeschwindigkeit und der ausgeschiedenen Menge Rückschlüsse auf die Funktion der Nieren gezogen werden können, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Bereits vor etwa 35 Jahren wurde Inulin, ein Polyfructosan aus den unterirdischen Speicherorganen gewisser Compositenarten (z. B. Inula helenium, Helianthus tuberosus und Cichorium intybus) in der Nierendiagnostik als Clearance-Substanz zur Bestimmung der Größe des Glomerulumfiltrats eingeführt (vgl. A. N. Richards, B. B. Westfall und P. A. Pott, »Proc. Soc. Exper. Biol.« (N. Y.), 32,73 (1934); J. A. Shannon, »Amer. J. Physiol.« 112,405 (1935); und J. A. Shannon und H. W. Smith, »J.Clin. Invest.«, 20,169 (1935)). Zu diesem Zweck wird eine bekannte Menge Inulinlösung parenteral zugeführt und die Ausscheidung des Inulins durch periodische Konzentrationsbestimmungen im Blut und Harn verfolgt. Voraussetzung für diese Verwendung ist die Eigenschaft des Inulins, im Körper weder gespeichert noch chemisch verändert zu werden.

Trotz gewisser praktischer Nachteile hat sich Inulin bis heute als Standardsubstanz für diese Aufgabe bestens bewährt Hauptnachteil bei der Verwendung von Inulin ist jedoch seine Schwerlöslichkeit in kaltem Wasser. Die üblicherweise angewendete 10%ige Lösung kristallisiert in der Kälte unter Bildung eines krustenförmigen Niederschlags. Vor der Verabreichung an den Patienten muß dieser durch Erwärmen wieder in Lösung gebracht werden. Hierbei besteht einerseits die Gefahr der Hydrolyse zu niedermolekularen Bruchstükken und zu Fructose, die im Unterschied zu Inulin im Körper abgebaut werden, andererseits kann es nach der Injektion ungenügend aufgelöster Präparate zu Verstopfungen der feinen Blutgefäße und hierdurch zu schweren Zwischenfällen kommen.

Aus »Kin. Wochenschr.«, 41 (1953), Seiten 769 ff und 868 ff, war zwar bereits ein aus Inulin und auf ganz anderem Wege hergestelltes Polyfructosan bekannt, das eine bessere Löslichkeit in kaltem Wasser aufweist, die Herstellung dieses Polyfructosans war jedoch außerordentlich umständlich und teuer, so daß bisher in der Praxis nur das in Wasser schwer-lösliche Insulin mit den vorstehend angegebenen technologischen Nachteilen für die Nierendiagnostik eingesetzt wurde.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Nierenfunktionsdiagnostikum zu entwickeln, das die vorstehend geschilderten Nachteile nicht aufweist, bei dem insbesondere keine Lösungsprobleme in kaltem Wasser auftreten und das auf technisch einfache und wirtschaftliche Weise hergestellt werden kann.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe gelöst werden kann mit einem Nierenfunktionsdiagnostikum auf der Basis von Polyfructosanen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es leicht wasserlösliche Polyfructosane aus den Speicherorganen von monocotylen Pflanzen, insbesondere solchen aus den Familien der Liliaceen und Gramineen, enthält.

Mit den erfindungsgemäß verwendeten Polyfructosanen steht erstmalig ein gut wasserlösliches Polyfructosan für den angegebenen Zweck zur Verfügung, das nach dem einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildenden, weiter unten beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren auf technisch einfache und wirtschaftliche Weise hergestellt werden kann.

Aus wirtschaftlichen Gründen werden in dem erfindungsgemäßen Nierenfunktionsdiagnostikum als Polyfructosane vorzugsweise verwendet Sinistrin, das Polyfructosan aus der Meerzwiebel (Urginea maritima) (vgl. O. Schmideberg, »Hoppe Seyler s Z. physiol. Chem.«. 3, 112 (1879), und H.H. Schlubach und W. Flörsheim, »Ber. dtsch. Chem. Ges.«, 62, 1491 (1929)) sowie das Polyfructosan aus Knoblauch (Allium sativum), ferner das Graminin und das Triticin (vgl. G. Klein, »Handbuch der Pflanzenanalyse«, Springer 1932, 1. Teil, Seiten 866 bis 873, und K. Paech und M. V. Tracey, »Moderene Methoden der Pflanzenanalyse«, Springer 1955,2. Band, Seiten 184 bis 196).

Alle diese Polyfructosane sind in Wasser leicht löslich, durch Säuren leicht hydrolysierbar, ihr mittleres Molekulargewicht beträgt etwa 3000, entsprechend etwa 18 Monosaccharid-Einheiten, ihre Fructosereste sind hauptsächlich j3-l,2-verknüpft (vgl. H. H. Schlubach und O. K. Sinh, »Liebis Ann.« 544, 111 (1940)). Bei der klinischen und pharmakologischen Prüfung haben sie sich alle als völlig untoxisch erwiesen.

Für die technische Herstellung der genannten, erfindungsgemäß verwendeten, in Wasser gut löslichen Polyfructosane sind die bisher in der Literatur

beschriebenen Verfahren wenig geeignet (vgl. O. Schmieieberg, »Hoppe Seyler's Z. physiol. Chem.« 3, 112(1879), und G. Klein, »Handbuch der Pflanzenanalyse«, Springer 1932, 1. Teil, Seiten 866-873). Sie bestehen im Prinzip darin, daß ein wäßriger Extrakt hergestellt wird, aus dem ein Teil der Ballaststoffe durch Fällung mit Bleiessig entfernt wird. Anschließend wird entbleit und die Polyfructosane werden in Form von Kalk- oder Baryt-Verbindungen durch Zusatz von Kalkmilch oder Barytwasser ausgefällt Nach dem Absaugen und Waschen werden sie durch Kohlensäure oder Oxalsäure zerlegt, die auf diese Weise gereinigten Polyfructosanlösungen werden zu einem Sirup eingeengt und mit Alkohol gefällt Da mit den Fällungen sehr hatnäckig Asche, Monosaccharide und sonstige Verunreinigungen mitgerissen werden, sind in der Regel zahlreiche Umfällungen erforderlich, um einen genügend hohen Reinheitsgrad zu erzielen.

Es wurde nun gefunden, daß diese erfindungsgemäß verwendeten, in Wasser leicht löslichen Polyfructosane •auf technisch einfachere und wirtschaftlichere Weise unter Anwendung des nachfolgend beschriebenen, einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildenden Verfahrens hergestellt werden.

Das einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildende Verfahren zur Herstellung eines Nierenfunktionsdiagnostikums der vorstehend beschriebenen Art ist dadurch gekennzeichnet daß man die betreffenden Drogen mit niederen Alkoholen oder Aceton mit einem Wassergehalt von 80 bis 40% extrahiert, den Extrakt vorzugsweise mit Calciumhydroxid auf pH 9 einstellt, die Mischung filtriert und unter vermindertem Druck zu einem dicken Sirup einengt, worauf man den eingedickten Extrakt durch Zusatz von etwa seinem halben Gewicht an einen niederen Alkohol, vorzugsweise Methanol, mit einer starken Säure, vorzugsweise mit Salzsäure bis zu einem pH-Wert zwischen 1 und 3 ansäuert und anschließend das Polyfructosan mit dem 2-bis 8fachen Gewicht an einen niederen Alkohol, vorzugsweise Methanol, oder mit Aceton ausfällt und die erhaltene Fällung durch mehrmaliges Verkneten mit wasserfreiem Fällungsmittel in eine pulverig-kristalline Form bringt, worauf man die Lösung des erhaltenen Polyfructosans über Austauscher total entsalzt, mit Aktivkohle filtriert und entweder direkt nach Entfernung der organischen Lösungsmittelreste durch Destillation in Ampullen füllt oder nach Einengung zur Sirupkonstistenz im Vakuum in dünner Schicht trocknet.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig wie folgt durchgeführt:

Das grob zerkleinerte Pflanzenmaterial wird mit einem wäßrigen Alkohol oder Aceton, vorzugsweise Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Aceton mit 80 bis 40% Wasser durch Perkolation, gegebenenfalls bei erhöhter Temperatur, erschöpfend extrahiert. Die Funktion des organischen Lösungsmittels ist hierbei erstens die Vorbeugung vor Befall durch Mikroorganismen, zweitens die Unterdrückung der Wirkung drogeneigener, polyfructc3anabbauender Fermente und drittens die Verhinderung der Auflösung störender Pektin- und Schleimstoffe. Die auf diese Weise erhaltenen Extrakte werden mit Kalkmilch bis auf pH 9 alkalisch gemacht, filtriert und das Filtrat wird im Vakuum zu einem Sirup mit einem Trockensubstanzgehalt von etwa 70 bis 80% eingedampft. Nach dem Abkühlen wird portionsweise mit einer solchen Menge eines niederen Alkohols oder Acetons,, vorzugsweise Methanol, versetzt, daß eben noch kein bleibender Niederschlag entsteh!, dann wird die Mischung mit konzentrierter Salzsäure auf pH 1 bis 3, vorzugsweise 2,5 versetzt und es wird eine solche Menge des gleichen Lösungsmittels zugegeben, daß eine vollständige Ausfällung auftritt Durch den Säurezusatz wird erreicht daß ein Großteil der vorhandenen Salze und Farbstoffe, die sonst mitgefällt würden, in Lösung bleibt Die aus einer weißlichen, zähen Masse bestehende Fällung wird von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und mehrmals mit kleinen Portionen des Lösungsmittels durchgeknetet, wobei sie nach und nach in ein feinkörniges kristallines Produkt übergeht, das zuletzt auf der Zentrifuge oder Nutsche von anhaftender Flüssigkeit befreit wird.

Die auf diese Weise erhaltene Substanz ist zwar bereits sehr rein, sie muß aber von der parenteralen Anwendung noch nachgereinigt werden durch Durchlaufenlassen durch einen Ionenaustauscher und Filtrieren der entsalzten Lösung unter Zusatz von Aktivkohle. Schließlich kann die erhaltene Lösung entweder nach dem Entfernen der Lösungsmittelreste durch Destillation und unter Einstellung der gewünschten Konzentration direkt in Ampullen abgefüllt oder nach dem Eindampfen zu einem dicken Sirup auf Glas- oder Stahlplatten im Vakuum bei maximal 80^cC getrocknet werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert

Beispiel 1

Herstellung eines Polyfructosans (Sinistrin)
aus roten Meerzwiebeln (Urginea maritima)

100 kg handelsübliche getrocknete rote Meerzwiebeln wurden in einer Messermühle mit einem Siebeinsatz mit 4 mm Lochdurchmesser grob gemahlen, mit 200 kg 30%igem wäßrigem Methanol angefeuchtet und nach 24stündigem Stehenlassen mit dem gleichen Lösungsmittel bei Raumtemperatur mit einer Ablaufgeschwindigkeit von etwa 4 kg pro Stunde perkoliert. Dabei wurden 300 kg Extrakt aufgefangen.

Der Extrakt wurde mit einer Aufschlämmung von 250 g Calciumhydroxid in wenig Wasser auf pH 9 gebracht, der Niederschlag wurde abfiltriert und die Flüssigkeit wurde im Vakuum zu einem dicken Sirup eingedampft. Dabei wurden etwa 75 kg Sirup mit einem Feststoffgehalt von 80% erhalten. Unter kräftigem Rühren wurden nun in dünnem Strahl 30 kg Methanol eingetragen und die fast klare Lösung wurde auf 15° C abgekühlt.

Unter weiterem kräftigem Rühren wurde eine gekühlte Mischung aus 3 1 konzentrierter Salzsäure und 8 kg Methanol und sofort anschließend weitere 250 kg reines Methanol zugegeben. Dabei wurde das Polyfructosan (Sinistrin) in Form einer zähen, perlmuttartig glänzenden, gelblich weißen Masse ausgefällt. Die nach kurzem Stehenlassen erhaltene klare gelbe Lösung wurde möglichst vollständig abgegossen. Sie enthielt Salze, Fructose und niedermolekulare Oligosaccharide. Aus ihr konnte das Methanol durch Destillation und Rektifikation zurückgewonnen werden.

Der Polyfructosan-Niederschlag, etwa 40 kg wurde in einer Knetvorrichtung dreimal mit je 40 kg Methanol kräftig durchgeknetet, das überstehende Methanol wurde jeweils abgegossen und mit dem bei der ersten Fällung erhaltenen vereinigt, wobei zuletzt die gesamte Masse zu einer feinkörnigen kristallinen Suspension zerfiel. Nach dem Zentrifugieren wurde die Substanz,

etwa 35 kg, in 70 kg Wasser gelöst Die erhaltene Lösung wurde mit 3 kg Aktivkohle verrührt, filtriert und anschließend mit einer Geschwindigkeit von etwa 151 pro Stunde über ein Mischbett aus 51 schwach saurem Kationenaustauscher in der H+-Form und 101 stark basischem Anionenaustauscher in der OH--Form laufen gelassen. Die dabei erhaltene Reinsinistrinlösung wurde im Vakuum zu einem dicken Sirup eingeengt und in dünner Schicht in Stahlwannen in einem Vakuum-Trockenschrank getrocknet Es blieb eine weiße, spröde, leicht pul ^risierbare, geruchlose und fast geschmacklose Masse zurück, die langsam, aber in jedem Verhältnis in Wasser löslich, in den meisten organischen Lösungsmitteln mit Ausnahme von Pyridin, Formamid, Butylamin, Phenol, Acetamid und stark wasserhaltigen niederen Alkoholen unlöslich war. Das kryoskopisch ermittelte Molekulargewicht betrug 3000. Die erzielte Ausbeute betrug 31,5 kg, optisches Drehvermögen [«] l' = -39,2° (c= 10, H₂O).

Herstellung des erfindungsgemäßen
Nierenfunktionsdiagnostikums

25,0 kg des vorstehend erhaltenen Polyfructosans (Sinistrin) wurden in «twa 70 kg bidestilliertem Wasser durch Rühren bei 50⁰C gelöst, die Lösung wurde mit 5,0 g reinstem Natriumhydrogencarbonat auf pH 7,5 eingestellt, abgekühlt und mit bidestilliertem Wasser auf 1001 aufgefüllt Die Lösung wurde über Entkeimungsschichten filtriert und sofort in Ampullen mit einem Inhalt von 20 ml (entsprechend 5 g Polyfructosan) abgefüllt. Anschließend wurde 30 Minuten lang bei 110⁰C sterilisiert. Der Ampulleninhalt wurde bei der Prüfung als steril und pyrogenfrei befunden und erwies sich bei Untersuchungen an Versuchstieren und an Menschen als zur Nierendianostik geeignet.

Beispiel 2

Herstellung eines Polyfructosans
aus Knoblauch (Allium sativum)

100 kg Knoblauch wurden grob von den Stielen, Wurzeln und äußeren trockenen Häutchen befreit und der Rest wurde unter Verwendung eines Fleischwolfes zerkleinert Der dabei erhaltene Brei wurde sofort mit 30 kg Isopropanol kräftig gemischt und nach 12stündigem Stehenlassen mit 30%igem wäßrigen Isopropanol bei einer Ablaufgeschwindigkeit von etwa 2,5 kg pro Stunde perkolliert Es wurden insgesamt 200 kg Extrakt aufgefangen. Die weitere Verarbeitung erfolgte auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 angegeben. Die erzielte Ausbeute betruf 10,5 kg, optisches Drehvermögen [oi] f = -40,5° (c= 10, H₂O). Die übrigen Eigenschaften waren die gleichen wie in Beispiel 1 angegeben.

Herstellung eines erfindungsgemäßen
Nierenfunktionsdiagnostikums

Aus dem vorstehend erhaltenen Knoblauch-Polyfructosan erhielt man nach der Reinigung und dem Hindurchlaufenlassen durch einen Ionenaustauscher 19,5 kg einer 25,6°/oigen Reinlösung, die 5,0 kg Polyfructosan enthielt. Diese Lösung wurde in einer Glas-Destil-Iationsapparatur durch Destillation im Vakuum unter periodischem Nachziehen von Wasser von dem Lösungsmittel vollständig befreit mit 1,7 g reinstem Natriumhydrogencarbonat auf pH 7,5 eingestellt, abgekühlt und mit bidestilliertem Wasser auf 20,01 aufgefüllt. Nach dem Abfüllen in Ampullen mit einem Inhalt von 20 ml (entsprechend 5 g Polyfructosan) wie in Beispiel 1 wurde die Prüfung ebenfalls wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Nierenfunktionsdiagnostikum auf der Basis von Polyfructosanen, dadurch gekennzeichnet, daß es leicht wasse. lösliche Polyfructosane aus den Speicherorganen von monocotylen Pflanzen, insbesondere solchen aus den Familien der Liliaceen und Gramineen, enthält.

2. Verfahren zur Herstellung des Nierenfunktionsdiagnostikums nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man die betreffenden Drogen mit niederen Alkoholen oder Aceton mit einem Wassergehalt von 80 bis 40% extrahiert, den Extrakt vorzugsweise mit Calciumhydroxid auf pH 9 einstellt, die Mischung filtriert und diese unter vermindertem Druck zu einem dicken Sirup einengt, worauf man den eingedickten Extrakt nach Zusatz von etwa seinem halben Gewicht an einen niederen Alkohol, vorzugsweise Methanol, mit einer starken Säure, vorzugsweise mit Salzsäure, bis zu einem pH-Wert zwischen 1 und 3 ansäuert und anschließend das Polyfructosan mit dem 2- bis 8fachen Gewicht an einen niedrigen Alkohol vorzugsweise Methanol, oder mit Aceton ausfällt und die erhaltene Fällung durch mehrmaliges Verkneten mit wasserfreiem Fällungsmittel in eine pulverig-kristalline Form bringt, worauf man die Lösung des erhaltenen Polyfructosans über Austauscher total entsalzt, mit Aktivkohle filtriert und entweder direkt nach Entfernung der organischen Lösungsmittelreste durch Destillation in Ampullen füllt oder nach Einengung zur Sirupkonsistenz im Vakuum in dünner Schicht trocknet.

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