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Verfahren zur Reinigung von rohem Heparin
Das in der Therapie als blutgerinnungshemmendes Mittel (Antikoagulans) verwendete Heparin wird bekanntlich aus tierischen Geweben, meistens aus Rindslungen hergestellt.
Die Gewinnung des Proteins erfolgt im allgemeinen derart, dass man das tierische Organ mit verdünnten wässerigen Alkalien behandelt, wobei ein Heparin-Protein-Komplex extrahiert wird ; dieser rohe Komplex wird dann mit Hilfe von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln oder mit Säuren aus der alkalischen Lösung gefällt. Im derart gewonnenen Niederschlag ist das Heparin noch in ziemlich geringer, 1% nicht überschreitender Konzentration anwesend ; die Hauptmenge des Niederschlages besteht aus Protein- und Lipoidstoffen.
In der USA-Patentschrift Nr. 2, 797, 184 wurde ein Verfahren vorgeschlagen, nach welchem die Trennung des Heparins von den Proteinen durch eine entsprechende Einstellung der Elektrolytkonzentration und eine gleichzeitige entsprechende Abänderung des pH-Wertes erreicht wird. Diese Methode ist auch zum Zersetzen des mit technischen Verfahren gewonnenen, also denaturierte Proteine enthaltenden Komplexes geeignet ; im Sinne dieses Verfahrens wird derart vorgegangen, dass man den auf bekannte Weise gewonnenen und durch Zugabe von Säure gefällten Komplex in einem wässerigen alkalischen Medium (pH zwischen 10 und 7) löst, dann die Lösung mit einer solchen Menge eines wasserlöslichen Salzes versetzt, dass die Elektrolytkonzentration in der Lösung grösser als l Mol/l sein soll.
Dann wird die Lösung bis zu einem pH-Wert zwischen 2, 5 und 7 angesäuert, wodurch die Proteine gefällt werden, während das Heparin in der Lösung bleibt. Die von dem überwiegenden Teil der Proteine derart befreite elektrolythaltige wässerige Lösung wird dann neutralisiert und das Heparin durch Zugabe von einem zweifachen Volumen von Äthanol gefällt.
Die technische Durchführung dieses Verfahrens ist aber ziemlich schwierig. Seine wesentlichsten Nachteile sind die Notwendigkeit der mehrfachen Umstellung des pH-Wertes, die Unentbehrlichkeit einer Dialyse zur Trennung des Heparins von dem begleitenden Salz und der Umstand, dass die nach der Fällung des Proteins gewonnene heparinhaltige Lösung meistens trüb oder wenigstens opalisierend bleibt, und auch durch längeres Zentrifugieren nicht geklärt werden kann ; der letztgenannte Nachteil hat dann meistens zur Folge, dass das Heparin in der Begleitung von Verunreinigungen, meistens von Lipoproteiden gefällt wird. Die durch Säure gefällten Proteine tragen auch eine erhebliche Menge von Heparin mit sich, wodurch die Ausbeute des Heparins verringert wird.
Durch die vorliegende Erfindung wurde ein Verfahren zur Reinigung des in Form eines ProteinHeparin-Komplexes erhaltenen rohen Heparins geschaffen, welches sämtliche oben erwähnten Nachteile und Schwierigkeiten der bekannten Verfahren beseitigt. Im Sinne der Erfindung wird der auf bekannte Weise, durch saure Fällung gewonnene rohe Heparin-Protein-Komplex-im Gegensatz zu den bisher bekannten Verfahren-nicht in alkalischem Medium gelöst, sondern das Heparin wird unmittelbar aus dem
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erwähnte organische Lösungsmittel gleichzeitig auch die fettartigen Verunreinigungen (Lipoproteide und Lipoide) entfernt werden. Bei dieser Extraktion wird nur das Heparin gelöst ; aus der erhaltenen wasserklaren, von Proteinen und fettartigen Stoffen freien sauren Lösung wird dann das Heparin, ebenfalls bei dem ursprünglich vorhandenen sauren pH-Wert, in an sich bekannter Weise, z.
B. durch Zugabe von Alkohol, gefällt.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren entfällt also das Entfetten der Lösung im alkalischen Medium und die durch Ansäuern erfolgende Fällung der Proteine ; das Heparin wird durch einen einzigen Verfahrensschritt, nämlich die Extraktion, frei von Proteinen und Lipoiden, in einer zur alkoholischen Fällung genügenden Reinheit gewonnen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein Verfahren zur Gewinnung von Heparin aus dem durch saure Fällung erhaltenen, aus einem rohen Protein-Heparin-Gemisch bestehenden nassen Nieder-
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Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht. Im Beispiel l wurde das neue Verfahren mit dem aus der USA-Patentschrift Nr. 2, 797, 184 bekannten Verfahren verglichen.
Beispiel 1 15 1 roher Extrakt, welcher aus Rindslungen mit der bekannten Charles-Scott'schen Methode hergestellt wurde, wurde mit Salzsäure bis pH = 2 angesäuert, dann sedimeniteren gelassen.
Nach 24 h wurden 1600 ml Sediment erhalten ; das Sediment wurde abgetrennt und nach Bestimmung des Wirkstoffgehaltes in zwei Teile geteilt. Der nach der bekannten Koagulationsmethode (USP XIV) bestimmte Wirkstoffgehalt dieses Sediments betrug 70, 5 E/ml. a) 800 ml des Sediments wurden nach der oben erwähnten bekannten Methode aufgearbeitet. Der pH-Wert des Sediments wurde mit Natronlauge auf 8, 5 gestellt, dann wurden 80 g Kochsalz zugesetzt, das Gemisch zu pH = 2, 5 angesäuert und 15 min zentrifugiert. Die derart erhaltene 780 ml schwach trübe überstehende Lösung enthielt 62, 5 E/ml Heparin (es waren also noch 86% des im Sediment anwesenden Heparins vorhanden).
Diese Lösung wurde mit Natronlauge auf pil = 6 gestellt, dann mit zweifachem Volumen Äthanol versetzt, das Gemisch zentrifugiert, der Niederschlag getrennt, mit Äthanol gewaschen und getrocknet.
Es wurden 1, 35 g eines leicht grau gefärbten Pulvers erhalten ; dieses in Wasser lösbare Produkt zeigte mit Trichloressigsäure eine starke Protein-Reaktion. Der Wirkstoffgehalt des trockenen Produkts war 33, 6 E/mg, was einer 51% igen Ausbeute (auf den Heparingehalt des Sediments berechnet) entspricht. b) Der zweite Teil (800 ml) des im Beispiel l erwähnten Sediments wurde erfindungsgemäss aufgearbeitet. Das Sediment wurde ohne Änderung des pH-Wertes mit einem Gemisch von 8 ml Chloroform und 160 ml Äthanol, dann mit 88 g NaC1 versetzt. Nach 15 min Rühren wurde das Gemisch 15 min lang zentrifugiert. 860 ml klare, schwach gelbliche, überstehende Lösung wurde erhalten, deren Wirkstoffgehalt 61 E/ml war (es waren also 93% des im Sediment anwesenden Heparins in dieser Lösung vorhanden).
Die Lösung wurde dann, unter Beibehaltung des bestehenden sauren pH-Wertes mit 1, 3 Volumen Äthanol versetzt, der entstandene Niederschlag zentrifugiert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet.
Es wurden 0, 75 g eines leicht grau gefärbten Pulvers erhalten ; dieses in Wasser klarlösliche Produkt gab mit Trichloressigsäure keine Proteinreaktion. Der Wirkstoffgehalt dieses Pulvers betrug 66 E/mg, was einer 88%igen Ausbeute (auf den Heparingehalt des als Ausgangsprodukt benützten Sediments berechnet) entspricht.
Aus dem Vergleich der unter a) und b) beschriebenen Methoden ist es ersichtlich, dass das erfindunggemässe Verfahren wesentlich einfacher und schneller durchführbar ist, zu einem wesentlich reineren,
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vermischt. Die derart erhaltene Suspension zeigte einen Trockengehalt von 18, 3 mg/ml und einen Wirkstoffgehalt von 63 E/ml.
Die 750 1 braune, trübe Suspension wurde mit einem Gemisch von 150 1 Äthanol und 22 1 Trichlor- äthylen, dann mit 82, 5 kg NaC1 versetzt, 1/2 h gerührt und dann über Nacht stehen gelassen. Am andern Tag wurde die überstehende klare Flüssigkeit (6001) abgesaugt, und der sedimentierte Niederschlag zentrifugiert, wodurch weitere 200 1 klare Flüssigkeit erhalten wurde. Die vereinigten Flüssigkeiten (insgesamt 8001) zeigten einen Heparingehalt von 48 E/ml ; der durch Zentrifugieren abgetrennte breiartige ProteinNiederschlag (120 1) erhält noch erhebliche Mengen von Heparin. Dieses Heparin wurde durch Waschen aus dem Niederschlag gewonnen.
Zu diesem Zweck wurde der Niederschlag mit zweifacher Menge (2401) Wasser verdünnt und mit 26 kg NaCl, dann mit einem Gemisch von 50 1 Äthanol und 7 1 Trichloräthylen versetzt. Die Suspension wurde 1/2 h gerührt und dann zentrifugiert. Es wurden 310 1 einer schwach opalisierenden Lösung, mit einem Wirkstoffgehalt von 15 E/ml erhalten. Diese Flüssigkeit wurde ebenfalls mit der heparinhaltigen Lösung vereinigt, welche dann mit 130 Vol-% (1440 1) Äthanol versetzt wurde.
Es entstand ein weisser, sich rasch absetzender Niederschlag. Nach einigen Stunden wurde die wasserklare überstehende Flüssigkeit abgesaugt, und zur Zurückgewinnung des Äthanols verwendet. Das Sediment (etwa 150 1) wurde zentrifugiert, der erhaltene, im feuchten Zustand 4, 1 kg wiegende Niederschlag mit Äthanol gewaschen und getrocknet. Es wurden 550 g pulverförmiges Produkt erhalten, mit einem Wirkstoffgehalt von 74 E/mg. Gesamtausbeute auf den Heparingehalt des rohen Proteinkomplexes berechnet : 86, 5%.
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