DE2800943C2

DE2800943C2 - Verwendung von Darm-Salzlake zur Gewinnung von reinem Heparin

Info

Publication number: DE2800943C2
Application number: DE2800943A
Authority: DE
Inventors: Hans-Jörg Dr. 1000 Berlin Vidic
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1978-01-06
Filing date: 1978-01-06
Publication date: 1984-09-27
Also published as: FI65073C; GR72952B; PL117279B3; YU301878A; FI65073B; IT7919085A0; GB2012790B; DE2800943A1; JPS5943042B2; AT365073B; PL212596A1; SE7900077L; FI783904A7; ZA787305B; JPS5497693A; IT1109918B; AR220734A1; NL187070B; ATA6879A; ES476623A1

Description

Gegenstand von Patent 26 52 272 ist die Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einstreuen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen mit festem Kochsalz erhalten worden ist, zur Gewinnung von reinem Heparin.

In weiterer Ausbildung dieses Patents wurde nun gefunden, daß reines Heparin auch durch Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einlegen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen in 3-molare bis gesättigte Kochsalzlösungen erhalten worden ist, gewonnen werden kann.

Mit Heparin steht der Medizin seit langem ein natürlich vorkommendes Antikoagulierungsmittel zur Verfugung, das auch in der modernen Medizin nach wie vor unentbehrlich ist und immer breitere Anwendung findet

In den letzten Jahren wurden eine Reihe von Verfahren bekannt, die alle zum Ziel haben, den Wirkstoff Heparin auf immer schonendere Weise aus Heparinhzhigem tierischen Gewebe wie Lunge, Leber und in neuerer Zeit vor allem aus Darmschleim (Mucosa) von Schweinen, Rindern und Schafen zu isolieren (GB-PS 7 54 835, DE-PS 12 28 241, US-PS 30 58 884, DE-PS 12 53 868). Derartige Rohstoffe haben wegen ihrer leichten Verderblichkeit den Nachteil einer begrenzten Lagerfähigkeit, die durch Gefrieren zwar verlängert werden kann, was jedoch neben technischen Mehraufwand auch zu erheblichen Kostensteigerungen führt. Bei der Aufarbeitung werden sowohl das Betriebspersonal als auch Anwohner aus der angrenzenden Umgebung nicht selten wegen der damit verbundenen Geruchsbelästigung vor unzumutbare Probleme gestellt.

In der DE-PS 12 53 868 wird die Gewinnung von Heparin für einige übliche Verfahren zusammenfassend beschrieben. Danach bringt man das tierische Gewebe in der Anfangsstufe mit einer heißen wäßrigen Salzlösung in Berührung, um das Heparin aus den Zellen herauszulösen. Der Heparinanteil des dabei anfallenden Mediums ist äußerst gering.

Es wurde nun gefunden, daß in den Schlachthöfen und Darmschleimereien anfallende Salzlake Heparin enthält. Diese Salzlake entsteht, wenn man Tierdärme, die vorher vom Darmschleim befreit wurden, zur Konservierung und Entwässerung in Kochsalzlösungen einlegt.

Es ist deshalb im Hinblick auf die DE-PS 12 53 868 als ausgesprochen überraschend zu bezeichnen, daß die beim Einlegen von tierischen Därmen in Kochsalzlösung entstandene Salzlake größere Mengen Heparin enthält. Es war auch nicht zu erwarten, daß dieses Heparin fast völlig frei von chemisch verwandten Nebenprodukten vorkommt, so daß Salzlake, bisher nur als umweltbelastendes Abfallprodukt bekannt, eine neue Rohstoffquelle für das durch Rohstoffengpässe bereits sehr knappe Heparin darstellt. Durch das weitgehende Fehlen von Verunreinigunen kann die Aufarbeitung zum Rohhcparin besonders schonend vorgenommen werden und es entfallen damit die nach dem bisherigen Stand der Technik bekannten aufwendigen Isolierungsmethoden (siehe US-PS 34 51 996 und GB-PS 12 21 784). Man gelangt schließlich zu Heparinqualitäten, die in den auf dem Markt verfügbaren Heparinpräparaten bei weitem nicht erreicht werden. Die nach bekannten Aufarbeitungsverfahren aus erfindungsgemäß verwendeter Darm-Salzlake als Rohstoff isolierten Rohheparine liegen bereits in solcher Reinheit vor, daß die sich anschließende Reinigung zu Heparinen mit weit über 200 USP-Einheiten/mg führt. Die bis jetzt im Handel erhältlichen

ίο Heparinpräparate besitzen in der Regel Heparin- Qualitäten von 150 USP-Einheiten/mg, in einigen wenigen Fällen auch 155 USP-Einheiten/mg. Dabei versteht man unter einer USP-Einheit/mg die spezifische Aktivität, die sich aus dem U.S.P. assay ergibt, mit den* die Hemmung der Klümpchenbildung von konserviertem Schafspiasma gemessen wird. 1 USP-Einheit entspricht etwa 1,1 internationalen Einheiten (UI). Da <*L· Aktivitätswerte der im Handel befindlichen Heparin-Präparate trotz zahlreicher Verfahrensverbesserungen weiterhin unbefriedigend sind, schreibt z. B. USP vor, daß Heparinpräparate (aus Darmschleim) mindestens 140 USP-Einheiten enthalten müssen. Lediglich im Labor gelang es bisher L W. Kananagh und L B. Jaques [Arzneimittelforschung (Drug Res.) 24, Nr. 12, 1942 (1974)] Heparin durch wiederholte Kristallisation als Bariumsalz mit maximal 175 USP-E/mg zu isolieren.

Zur Konservierung und Entwässerung von Tierdärmen eignen sich Kochsalzlösungen, deren Gehalt an Kochsalz 3 Mol bis Sättigungsmolmenge pro Liter Lösung beträgt Unter Sättigungsmolmenge versteht man die Molmenge, die eine konzentrierte wäßrige Lösung bei Raumtemperatur eines Schlachthofes an gelöstem Kochsalz enthält. (Eine konzentrierte wäßrige Kochsalzlösung ist ca. 26,4%ig).

In der Regel werden die entschleimten Tierdärme 2 Std. bis zu 3 Tagen mit Kochsalzlösungen behandelt Meistens ist die Behandlung der Tierdärme jedoch schon nach 3—24 Std. beendet. Nach Entfernen der konservierten und entwässerten Tierdärme aus der Kochsalzlösung erhält man eine Darm-Salzlake, die einen überraschend hohen Gehalt an Heparin besitzt.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung derartiger Darm-Salzlaken als Rohstoff gelang es Heparin auch in technischem Maßstab in einer Reinheit zu isolieren, daß es als nahezu farblose Substanz vorliegt. Alle bis heute aus anderen Rohstoffen verfügbaren Rohheparine müssen dagegen erst durch aufwendige und verlustreiche Verfahren entfärbt werden (US-PS 31 79 566).
Darm-Salzlake ist darüber hinaus e"'n lagerfähiger,

so fast geruchsloser Rohstoff, der durch lange Lagerung keine Qualitätseinbußen erfährt. Damit entfallen chemische und andere Konservierungsmethoden.

Beispiel 1

3 I Salzlake wurden mit 12 I Wasser auf eine Chlorid-Molarität von ca. 0,85 verdünnt. Dann wurden 50 g Kieselgur sowie eine Lösung von 6 g Bezethonium-chlorid ( = Hyamin · 1622, Rohm Haas) in 100 ml Wasser zugegeben. Nach einigen Stunden wurde dekantiert und der Rest abgesaugt. Nach dem Waschen mit Wasser wurde der noch feuchte Niederschlag dreimal nach dem Verfahren aus der DE-PS 12 28 241 mit je 200 ml 2-molarer Kochsalzlösung extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 2 Volumenteilen Methanol gefällt. Der isolierte und getrocknete Niederschlag wog 465 mg und besaß eine Aktivität von 155 USP-Einheiten/mg.

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Beispiel 2

301 Salzlake wurden mit 1201 Wasser auf eine ChIorid-Molarität von ca. 0,85 verdünnt (vgL DE-PS 11 56 938). Dann wurde mit Essigsäure (ca. 50 ml) auf pH 3,2 angesäuert Nach einigen Stunden hatte sich eine Fällung abgesetzt, die nach dem Dekantieren des klaren Oberstandes abzentrifagiert wurde. Nach dem Trocknen erhielt man 111g Rohheparin mit 6,5 USP-Einheiten/mg. Ein Aliquot des so erhaltenen Rohheparins ent- sprechend ca. 425 000 USP-Einheiten, bzw. 65,5 g wurden dreimal mit je 200 ml zweimolarer Kochsalzlösung extrahiert, wobei jeweils eine Stunde bei 60⁰C gerührt wurde. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser verdünnt, bis die Lösung ca. 03 Mol/l Chloridionen enthielt Es wurden nun 200 ml eines Anionenaustauschers (Lewatit · CA 9249) in der Chlorid-Form zugegeben, und man rührte eine Stunde. Anschließend wurde abgesaugt und mit ca. 200 ml 0,9 molarer Kochsalzlösung nachgewaschen. Der Ionenaustauscher wurde dann fünf Stunden mit zweimolarer Kochsalzlösung bei 40⁰C gerührt und danach abgesaugt und mit zweimolarer Kochsalzlösung nachgewaschen. Die Eiutionsiösung wurde mit der Waschlösung vereinigt und mit dem 1,5-fachen Volumen Methanol gefällt Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, erst mit ca. 5OmI Wasser-Methanol (1 + 1,5 Volumenteile), dann mit ca. 50 ml Methanol nachgewaschen und getrocknet

Nach der Reinigungsstufe über Ionenaustauscher erhielt man 196 g Na-Heparinat mit 198 USP-Einheiten pro mg.

15 g eines in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Natriumhe^arinats mit ca. 200 USP-Einheiten pro mg wurden in 200 ml 2-normaIerⁱ^alciumchloridlösung aufgelöst Die Lösung wurde über eine Nutsche gesaugt und der Rückstand wurde mit zunächst 30 ml 2-normaler Calciumchloridlösung, dann mit ca. 250 ml vollentsalztem Wasser gewaschen. Die vereinigten Lösungen wurden nun mit vollentsalztem Wasser auf eine Chlorid-Molarität von 03 gebracht Nun wurde wie vorstehend mit einem Liter Lewatit^β CA 9249 gerührt. Die Elution und das Nachwaschen wurden mit 2-normaler Calciumchloridlösung anstelle von Kochsalzlösung durchgeführt

Die vereinigte Elutions- und Waschlösung wurde wie oben weiterverarbeitet Nach dem Waschen und Trocknen der Fällung erhielt man 10,7 g Calciumheparinat, das eine Aktivität von 260 USP-Einheiten pro mg besaß.

B e i s ρ i e 1 3

101 Salzlake wurden mit 401 Wasser auf eine Chlorid-Molarität von ca, 0,85 verdünnt. Diese Lösung wurde durch ein Filter über eine Ionenaustauschersäule mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Länge von 380 mm gepumpt (ca. 3 l/h). Es wurde ein mittelbasisches makroporöses Anionenaustauscherharz in der Cl--Form verwendet (Lewatit · CA 9249). Es können auch andere Anionenaustauscherharze verwendet werden, wie z. B. das in der DE-PS 12 53 868 beschriebene Dowex®l-X-1.

Anschließend wurde das Harz aus der Säule entfernt, zweimal mit 500 ml 0,9 molarer Kochsalzlösung gewaschen und mit 400 ml 2 molarer Kochsalzlösung 5 Stunden bei 40⁰C unter Rühren eluiert. Diese Lösung wurde mit 1,5 Volumenteilen Methanol gefällt. Der isolierte und getrocknete Niederschlag wog 1,2 g und besaß 149 USP-Einheiten/mg.

Claims

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Patentanspruch:

Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einlegen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen in 3-molare bis gesättigte Kochsalzlösungen erhalten worden ist, zur Gewinnung von reinem Heparin.