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Verfahren zur Gewinnung von Heparin Gegenstand der Erfindung ist ein
verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Heparin aus tierischem Gewebe.
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Zur Gewinnung von Heparin aus tierischen Geweben z. B. Rinder- oder
Schweinelunge, -leber, -zwölffingerdarm und -muskeln, wendete man bisher allgemein
die Verfahren nach Charles und Mitarbeiter (J. Biol. Chem., 102, S. 425 [1933],
und Roy. Soc. Can. Trans., Bd. 28, § 5, S. 55 bis 58 [1934]) an. Diese bestehen
gewöhnlich in der Autolyse der tierischen Gewebe in Gegenwart von Wasser (Kuizenga
und Spaulding, J. Biol. Chem., Bd. 148, S. 641 [1943]) bei erhöhter Temperatur und
der alkalischen Extraktion des autolysierten Gewebes, worauf kurz auf etwa 800 C
erhitzt und zur Entfernung der koagulierten Substanz filtriert wird.
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Beim Ansäuern des Filtrats fällt ein Protein-Heparin-Komplex aus,
der einem fermentativen Aufschluß mit z. B. Trypsin unterworfen wird, um das an
das Heparin gebundene denaturierte Protein zu entfernen. Die nachfolgende Behandlung
des fermentativ aufgeschlossenen Gemisches mit einem Alkohol oder Aceton führt zur
Ausfällung des Heparins in roher Form.
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Man hat bereits vorgeschlagen, den Trypsinaufschluß des autolysierten
Gewebes durch einfachere und kürzere Verfahrensstufen zu ersetzen. So wird in der
britischen Patentschrift 735 739 vorgeschlagen, den fermentativen Aufschluß des
Heparin-Protein-Komplexes durch die Behandlung mit einem basischen Thiazinfarbstoff
zu ersetzen, worauf sich ein Farbstoffkomplex bildet, aus dessen Lösung das Heparin
mittels eines Elektrolyten und eines Fällmittels für das Heparin abgeschieden wird.
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Nach der deutschen Patentschrift 950594 soll an die Stelle des fermentativen
Abbaus eine unter alkalischen Bedingungen durchgeführte Salzextraktion treten.
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Die Autolyse des heparinhaltigen Gewebes schließen diese Verfahren
jedoch nicht aus. Sie ist zeitraubend und außerdem mit einer sehr unangenehmen Geruchsentwicklung
verbunden. Daneben besteht die Gefahr der Verunreinigung mit pyrogenen Stoffen,
deren Bildung auf die Wirkung anaerober Bakterien zurückgeführt wird. Diese vermehren
sich während der Autolyse ungeheuer stark, wodurch die Verunreinigung mit fiebererzeugenden
Stoffen verstärkt wird. Jeder Versuch, ihre Vermehrung durch bakteriostatische Mittel
oder durch sorgfältige Kontrolle der Reaktionsbedingungen während der Autolyse zu
verhindern, führt gleichzeitig zu einer Verringerung der Heparinausbeute. Offensichtlich
sind die
Bakterien für eine maximale Heparinausbeute wesentlich.
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Versuche, die Autolyse und den damit verbundenen unangenehmen Geruch
auszuschalten, sind bisher unbefriedigend verlaufen, da die Reaktionsbedingungen
dann so kritisch sind, daß meist nur eine mittelmäßige Heparinausbeute erhalten
wird. Charles und Mitarbeiter geben z. B. an, daß zur Vermeidung der Autolysestufe
eine sofortige Extraktion des Gewebes mit Natriumhydroxyd und Ammoniumsulfat angewendet
werden kann, daß dieses Verfahren jedoch zu geringeren Heparinausbeuten führt als
bei Anwendung der Autolyse.
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In der USA.-Patentschrift 2623 001, die ein Verfahren zur Gewinnung
von Heparin aus tierischem Gewebe ohne Autolyse zum Gegenstand hat - das Heparin
wird hier, um eine Denaturierung des Proteins zu vermeiden, unter milden Bedingungen
aus dem wasserlöslichen Protein-Heparin-Komplex ausgefällt -, ist besonders hervorgehoben,
daß die Reaktionsbedingungen kritisch sind, wenn eine Denaturierung des Proteins
vermieden werden soll.
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Das denaturierte Protein kann nur enzymatisch entfernt
werden.
Die Ausbeute an Heparin in diesem Verfahren ist nur mittelmäßig.
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In dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2587924 wird ebenfalls die
Autolysestufe ausgeschaltet. Hier wird das Gewebe zerhackt, mit Wasser vermischt,
erhitzt, das überschüssige Wasser entfernt und das Gewebe einer eiweißspaltenden
Fermentbehandlung unterworfen. Dabei ist besonders darauf hingewiesen, daß während
der Fermentbehandlung optimale Temperaturbedingungen erforderlich sind, um den Abbau
des Proteins zu erreichen und die Wirkung der Bakterien, d. h. die Geruchsentwicklung
zu unterdrücken.
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Außerdem sind große Mengen eiweißspaltender Fermente erforderlich.
Die Heparinausbeuten liegen durchschnittlich nur bei etwa 7000 Einheiten je Pfund
frischem Gewebe, im Vergleich zu 12000 Einheiten Heparin je 500 g frischem Gewebe
oder 60000 Einheiten Heparin je 500 g entfettetem Gewebe, wie es erfindungsgemäß
eingesetzt wird.
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Es wurde nun gefunden, daß man Heparin unter Vermeidung der Autolyse
wie auch der enzymatischen Aufschlußstufe aus tierischem Gewebe erhalten kann, wenn
man entfettetes tierisches Gewebe einem Extraktions- und Fällverfahren unterwirft,
wie es etwa beim Verfahren der deutschen Patentschrift 950594 auf den durch Autolyse
erhaltenen Heparin-Protein-Komplex angewandt wird. Dieses Verfahren läßt sich schneller
und mit besseren Ausbeuten durchführen als die bekannten Verfahren.
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Erfindungsgemäß wird zerkleinertes, entwässertes und entfettetes,
nicht autolysiertes Gewebe bei einem pE-Wert von etwa 7 bis 10 und 20 bis 600 C
mit wäßrigen Alkali- oder Erdalkalisalzlösungen extrahiert. Der so erhaltene, von
Feststoffen freie Extrakt wird auf einen pl-Wert von unter 4 angesäuert, worauf
die Proteine ausfallen. Aus der nach dem Abfiltrieren der Proteine verbleibenden
Flüssigkeit wird dann durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels
bei schwach saurem p, das Heparin ausgeschieden. Für die Extraktion eignen sich
z. B. die Zitrate, Halogenide, Acetate, Sulfate und Thiocyanate der Alkalimetalle
und des Ammoniums, ferner die Halogenide, Acetate und Citrate der Erdalkalimetalle.
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Die Salzkonzentration muß mindestens 1 Mol je Liter eines Alkalisalzes
oder t/2 Mol je Liter eines Erdalkalisalzes betragen. Vorzugsweise wird Natriumchlorid
in einer Konzentration von wenigstens etwa 60 g je Liter, vorteilhaft von etwa 100
bis 150 g je Liter verwendet.
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Die Extraktionstemperatur liegt zweckmäßig zwischen etwa 20 und 600
C. Niedrigere Temperaturen bis zu etwa 0° C und höhere Temperaturen bis zu etwa
1000 C können gegebenenfalls angewendet werden.
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Der Chemismus des erfindungsgemäßen Verfahrens ist nicht genau bekannt.
Man nimmt jedoch an, daß bei den bisher angewandten Verfahren das Fett in der Zellmembran
des frischen oder gefrorenen Gewebes das Extraktionsmedium daran hinderte, schnell
mit dem nativen Protein-Heparin-Komplex in Kontakt zu kommen. Die bekannten Verfahren
wendeten daher vielfach zu drastische Mittel an, z. B. eine zu starke alkalische
Lösung, die das natürliche Protein denaturierte und damit seine Abtrennung erschwerte.
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Die aus den Zellen entfernten Fettstoffe hinterlassen offensichtlich
ein Netzwerk, das die Extraktion des Heparins und des Proteins in dissoziierter
Form
durch die Salzlösung ermöglicht. Vermutlich tritt im Protein-Heparin-Komplex
das Anion des verwendeten Salzes an die Stelle des Heparins, so daß letzteres leicht
isoliert werden kann, und zwar durch Ausfällung des Proteins aus dem Salzextrakt
durch Ansäuem, Abtrennen des Proteins durch Zentrifugieren oder Filtrieren und Gewinnen
des teilweise gereinigten Heparins aus dem Filtrat durch Zugabe eines mit Wasser
mischbaren organischen Lösungsmittels z. B. eines Alkohols oder von Aceton bei schwach
saurem p11.
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Für die Ausfällung des Proteins wird in an sich bekannter Weise eine
starke Säure, wie Schwefelsäure, Salzsäure oder Trichloressigsäure verwendet.
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Andere Säuren sind ebenfalls geeignet, sofern sie den pH-Wert auf
den erforderlichen Wert von unter 4, vorzugsweise von etwa 2,5, herabzusetzen vermögen.
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In den Fällen, in denen das verwendete Salz, z. B.
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Natriumsulfat, im organischen Fällmittel nicht gut löslich ist, ist
es zur Vermeidung einer Verunreinigung des ausgefällten Heparins zweckmäßig, das
Filtrat vor der Ausfällung zu dialysieren. Das Salz als Verunreinigung enthaltende
Heparin kann gegebenenfalls auch durch nochmaliges Lösen in Wasser, Dialysieren
der Lösung und erneutes Ausfällen mit Alkohol oder Aceton auf einen höheren Reinheitsgrad
gebracht werden.
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Um nicht mit allzu großen Flüssigkeitsmengen arbeiten zu müssen und
die Menge an organischem Fällmittel geringer zu halten, kann das oben beschriebene
Verfahren auch abgewandelt werden. Zu diesem Zweck wird der Salzextrakt des entfetteten
Gewebes zur Entfernung des Salzes dialysiert und das Dialysat auf einen pH-Wert
von mindestens 2,5 angesäuert, worauf der Protein-Heparin-Komplex ausfällt. Dieser
wird dann in der gleichen Weise wie das entfettete Tiergewebe zur Entfernung des
Proteins bei PH von etwa 7 bis 10 in einem jedoch wesentlich kleineren Volumen Wasser
mit mindestens 1 Mol Alkali- oder t/2 Mol Erdalkalisalz je Liter behandelt, das
Gemisch zum Ausfällen des Proteins auf einen p,-Wert von etwa 2,5 angesäuert und
das Heparin aus der proteinfreien Lösung durch Zugabe von Methyl- oder Athylalkohol
oder eines anderen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels ausgefällt.
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Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann man den Salzextrakt nach der Entfernung des Proteins durch Ansäuern und Filtrieren
bei schwach saurem p, mit einem von einer Fettsäure abgeleiteten Amin, wie Oktylamin,
Dodecylamin od. dgl. versetzen, worauf ein Amin-Heparin-Salz ausgefällt wird. Das
Heparin wird aus diesem Salz gewonnen, indem man es in Wasser vom p,i etwa 10 aufschlämmt,
um das Salz zu dissoziieren, filtriert und zur Ausfällung des Heparins dem Filtrat
bei schwach saurem p1, Alkohol oder Aceton zufügt. Mit diesem Verfahren wird ebenfalls
die Handhabung sehr großer Flüssigkeitsmengen umgangen.
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Beispiel 1 0,450 kg gemahlenes, entwässertes Lungengewebe wurden
3 Stunden unterverringertem Druck bei 1000 C getrocknet und dann zur Entfettung
des Gewebes 4 Stunden mit 3,5 1 Chloroform unter Rückfluß erhitzt. Der Chloroformextrakt
wurde filtriert und das
Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei
670 C entfernt.
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Das erhaltene entfettete Gewebe wurde mit 5 l 12°/oiger Natriumchloridlösung
aufgeschlämmt. Der pll-Wert der Aufschlämmung wurde mit 100/oiger Natriumhydroxydlösung
auf 8 eingestellt. Darauf wurde 1 Stunde bei 25° C gerührt und dann 30 Minuten bei
1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert.
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Dieses Verfahren wurde noch zweimal wiederholt.
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Die drei erhaltenen Extrakte wurden vereinigt.
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Der p,1-Wert der vereinigten Extrakte wurde mit konzentrierter Salzsäure
auf 2,5 herabgesetzt und das ausgefällte Protein durch lstündiges Zentrifugieren
bei 1500 Umdrehungen je Minute entfernt. Die klare Lösung wurde mit 100/obiger Natriumhydroxydlösung
auf pol 6,0 eingestellt. Dann wurden langsam unter Rühren 2 Volumteile Athylalkohol
zugesetzt. Nachdem das ausgefällte Heparin 8 Stunden gestanden hatte, wurde es abzentrifugiert.
Zur weiteren Reinigung kann es in 800 ccm Wasser gelöst und nach dem Einstellen
des pH-Wertes der Lösung mit Natriumhydroxyd auf 10 durch Zugabe von 2Volumteilen
Alkohol erneut ausgefällt werden. Das Fällprodukt wurde wiederum 8 Stunden stehengelassen
und die überstehende Flüssigkeit dann verworfen. Es wurde nacheinander mit 670/obigem
Alkohol, 950/oigem Alkohol und Aceton gewaschen und bei 650 C unter vermindertem
Druck getrocknet. Man erhielt 6,9 g Produkt mit einer Heparinwirksamkeit von 12
USP-Einheiten je Milligramm. Zur Erhöhung seines Heparingehaltes kann es weiteren
Reinigungsstufen, z. B. einer Dialyse usw. unterworfen werden.
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Beispiel 2 0,450 kg entwässerte und entfettete Rinderlunge, die nach
dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten worden war, wurden zweimal bei
einem pH-Wert von 8 mit je 5 1 120/oiger Natriumchloridlösung extrahiert. Jede Extraktion
wurde 2 Stunden lang bei 30° C durchgeführt. Die vereinigten Extrakte wurden dann
10 Stunden gegen fließendes Leitungswasser dialysiert und darauf mit Salzsäure auf
einen pll-Wert von 2,5 eingestellt. Der ausgefällte Protein-Heparin-Komplex wurde
abzentrifugiert und in 500 ccm Wasser, dessen pH-Wert mit Natriumhydroxyd auf 10
eingestellt wurde, gelöst. Der Lösung wurden 50 g Natriumchlorid zugesetzt und dann
der p-Wert durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure unter schnellem Rühren auf
2,5 herabgesetzt. Das ausgefällte Protein wurde abzentrifugiert und der p,-Wert
der überstehenden Lösung mit Natriumhydroxyd auf 6,8 eingestellt. Zur Ausfällung
des Heparins wurden dann unter schnellem Rühren 2 Volumteile Äthylalkohol zugegeben
und das Gemisch 8 Stunden bei 250 C stehengelassen. Die überstehende Flüssigkeit
wurde abdekantiert, das Fällprodukt mit Aceton gewaschen und getrocknet. Das so
erhaltene Produkt hatte eine Heparinwirksamkeit von 50 USP-Einheiten je Milligramm.
Insgesamt wurden 84000 USP-Einheiten erhalten.
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Beispiel 3 45 kg feingemahlene, entwässerte und entfettete Rinderlunge
wurden in 5601 10 n-Natriumhydroxydlösung, die 10 °/o Natriumchlorid enthielt, aufgeschlämmt.
Die Lösung wurde auf 500 C erwärmt, 1 Stunde gerührt und 8 Stunden stehengelassen.
Dann wurden 9 kg Filtrierhilfe zugefügt und die Auf-
schlämmung über eine Platten-
und Rahmenpresse filtriert. Der Filterkuchen wurde in 190 1 frischer Salzlösung
erneut aufgeschlämmt und die Aufschlämmung filtriert. Die beiden Filtrate wurden
vereinigt. Den vereinigten Filtraten wurden 4,5 kg Filtrierhilfe zugesetzt. Dann
setzte man den pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 2,5 herab. Das Gemisch wurde
sofort filtriert. Der proteinhalüge Filterkuchen wurde mit 75,6 l 120/oiger Natriumchloridlösung,
die mit Salzsäure auf p, 2,5 eingestellt war, gewaschen.
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Der pn-Wert des mit dem Waschwasser vereinigten Filtrates wurde dann
mit Natriumhydroxyd auf 5,5 erhöht, worauf man 30 1 einer 10'/oigen Lösung von Octylamin-Hydrochlorid
unter schnellem Rühren zufügte. Nachdem das Gemisch 8 Stunden stehengelassen worden
war, wurde es nach Zugabe von 4,5 kg Filtrierhilfe filtriert.
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Der Filterkuchen wurde in heißem Wasser aufgeschlämmt und der pH-Wert
mit Natriumhydroxyd auf 10 eingestellt. Nach 2stündigem Rühren wurde filtriert und
der Filterkuchen mit heißem Wasser bei PH 10 gewaschen. Die Waschwässer wurden mit
dem Hauptfiltrat vereinigt.
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Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 5,5 wurden dem Gemisch 2 Volumteile
Äthylalkohol zugefügt.
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Nach 8stündigem Stehen wurde die überstehende Flüssigkeit abdekantiert
und das heparinhaltige Fällprodukt mit Äthylalkohol und mit Aceton gewaschen. Anschließend
wurde unter vermindertem Druck bei 600 C getrocknet. Die Heparinwirksamkeit betrug
67 USP-Einheiten je Milligramm Ausbeute 93 g.
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Beispiel 4 100 g entwässertes und entfettetes Zwölffingerdarmgewebe
wurden bei 30 bis 420 C in 1100 ccm 120/oiger wäßriger Natriumchloridlösung aufgeschlämmt.
Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde mit 250/obiger wäßriger Natriumhydroxydlösung
auf 8,5 eingestellt. Dann wurde etwa 10 Stunden gerührt, 30 g Diatomeenerde zugefügt
und die Aufschlämmung durch einen Büchner-Trichter filtriert. Das Fällprodukt wurde
1 Stunde lang in 550 ccm frischer, 120/oiger wäßriger Natriumchloridlösung erneut
aufgeschlämmt und die Aufschlämmung filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt, 10
g Diatomeenerde zugefügt und das Gemisch mit 31°/oiger Salzsäure auf PH 2,5 angesäuert.
Dann wurde sofort durch einen Büchner-Trichter vom ausgefällten Protein filtriert.
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Der pH-Wert des Filtrates wurde mit 250/oiger wäßriger Natriumhydroxydlösung
auf 6,0 eingestellt.
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Dann wurde Oktylaminhydrochloridlösung zugegeben (entsprechend 6,6
g Octylamin). Das Gemisch wurde 10 Stunden bei 250 C stehengelassen, 10 g Diatomeenerde
zugefügt und das Gemisch durch einen Büchner-Trichter filtriert. Der Filterkuchen
wurde in 50 ccm Wasser aufgeschlämmt, der pH-Wert mit 250/obiger wäßriger Natriumhydroxydlösung
auf 11,5 eingestellt, 2 Stunden stehengelassen und die Aufschlämmung durch einen
Büchner-Trichter filtriert. Der p-Wert des Filtrates wurde mit 310/oiger Salzsäure
auf 5,5 eingestellt und die Lösung auf 50 C gekühlt. Dann wurde zur Ausfällung des
Heparins das gleiche Volumen Aceton zugefügt und das Gemisch 48 Stunden in der Kälte
stehengelassen. Die überstehende wäßrige Acetonlösung wurde abdekantiert, das Fällprodukt
mit frischem Aceton gewaschen, filtriert und
bei 600 C im Vakuum
getrocknet. Ausbeute 310 mg mit einer Heparinwirksamkeit von 65 USP-Einheiten je
Milligramm. Das entspricht etwa 93 000 USP-Einheiten je 500 g eingesetztem Gewebe.