DE3010972C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mindestens 120 IE/cm³ Heparin und daneben nur wenig Fette und sonstige Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Auszügen, insbesondere Organauszügen, konstanter Zusammensetzung durch mit einem wäßrigen Medium im Gegenstrom vorgenommene Extraktion von festen heparinhaltigen Rohstoffen.

Es ist bekannt, daß das Aufarbeiten von heparinhaltigen tierischen Organen zur Gewinung des Heparines ein komplizierter und mit hohem Aufwand verbundener Vorgang, der mehrere Extraktionsstufen verschiedener Zweckbestimmung umfaßt, ist. Der Extraktionsvorgang ist eigentlich von der Art des Sammelns und Konservierens der heparinhaltigen Organe nicht zu trennen, da diese Arbeitsgänge die technische beziehungsweise industrielle Durchführbarkeit und die Ausbeute des Extraktionsverfahrens entscheidend beeinflussen. Die Extraktionsstufen bei der Gewinnung von Heparin erfordern viel Zeit, und auch ihre Reproduzierbarkeit ist unsicher. Deswegen sind, wie sowohl das Fachschrifttum als auch das Patentschrifttum zeigen, zahlreiche Versuche gemacht worden, den die Wirksamkeit und die Wirtschaftlichkeit der ganzen Heparinherstellung bestimmenden Extraktionsvorgang zu verbessern. Ziel der Extraktion ist es offensichtlich, den nach dem Sammeln und Lagern der verschiedenen Organrohstoffe in diesen noch vorhandenes Heparin möglichst vollständig herauszulösen, wobei das Verfahren den Wirkstoff nicht schädigen, keine Zersetzung herbeiführen soll. Ein weiteres Ziel ist es, aus der im Extraktionsverfahren erhaltenen wäßrigen Heparinlösung in wenigen Stufen Heparin der im Arzneimittelbuch festgelegten Qualität in guter Ausbeute herzustellen. Dazu ist es erforderlich, daß die Heparinextraktionsbrühe möglichst wenig mit die Reinigung erschwerenden heparinoiden fiebererzeugenden beziehungsweise pyrogenen Farb- und Polypeptidsubstanzen verunreinigt ist. Zur Erreichung einer möglichst selektiven Extraktion des Heparines ist zu berücksichtigen, daß die im Organauszug vorliegenden sonstigen Bestandteile (Fette, Lipoide, Eiweiße, Peptide und anorganische Salze) die Isolierbarkeit des Heparines verschlechtern, die Ausbeute verringern und verfahrenstechnische beziehungsweise technologische Probleme verursachen und wegen ihrer Gegenwart das Endprodukt nicht immer von sämtlichen Begleitstoffen völlig gereinigt werden kann. Von den genannten Zielen können mit den bekannten Rohstofftypen und Extraktionsverfahren nicht immer alle optimal verwirklicht werden.

Bei der Extraktion heparinhaltiger tierischer Organe werden in der Praxis 3 verschiedene Gruppen von Verfahren, die im folgenden kurz beschrieben werden, angewandt.

Der prinzipielle Aufbau der ersten Gruppe von Extraktionsverfahren stimmt mit dem von Charles und Scott (J. Biol. Chem. 102 [1933], 425) vorgeschlagenen Verfahren überein. Charakteristisch für diese Gruppe von Verfahren ist es, daß zur Extraktion, zum Zellenaufschluß der zerkleinerten, meistens tiefgekühlten heparinhaltigen Organe auch die eigenen hydrolysierenden Enzyme der überlebenden Gewebe genutzt werden (Autolyse). Das Material wird längere Zeit autolysiert, dann werden zur Vervollständigung der Extraktion schwach alkalische Salzlösungen zugesetzt, und das Gemisch wird zum Sieden erhitzt. Verfahren auf der Grundlage der Autolyse sind zum Beispiel in den US-Patentschriften 25 71 679 und 27 97 184 beschrieben. Kombinationen der Autolyse mit weiteren Extraktionsstufen bilden die Gegenstände der US-Patentschriften 28 84 358 und 30 16 331.

Die Nachteile der auf die Autolyse gegründeten Extraktionsverfahren sind in der HU-PS 1 48 776 und in der US-Patentschrift 25 87 924 beschrieben. Die Nachteile sind, wie experimentelle Erfahrungen zeigen, auf mehrere Gründe zurückzuführen:

• A) Auch wenn angenommen wird, daß sich während der Extraktion zwischen der Extraktionslösung und den zu extrahierenden Organen ein Gleichgewichtszustand einstellt, muß wegen des hohen Wassergehaltes der Organe mit einem beträchtlichen Heparinverlust gerechnet werden. Mit dem Entfernen des extrahierten Organes aus dem System wird zwangsläufig auch Flüssigkeit (Heparinlösung) aus dem System entfernt. Da der Autolysegrad nicht an allen Stellen der gleiche ist, stellt sich der Gleichgewichtszustand zwischen der Extraktionsflüssigkeit und dem Organ nicht überall ein, das heißt, daß die tatsächlichen Verluste noch größer sind.
• B) Während der der Autolyse vorangehenden Lagerung und während der Autolyse vermehren sich die das Heparin schädigenden Mikroorganismen, was zu einer Verminderung der Ausbeute führt und auch in sonstigen Hinsichten (Fiebererzeugung [Pyrogenität] und Toxizität) nachteilig ist.
• C) Eines der Hauptprobleme der Autolyseverfahren ergibt sich aus dem Sammeln der Organe, und hierauf ist die unsichere Zusammensetzung des erhaltenen Auszuges zurückzuführen. Wegen der großen Volumina sind in dieser Phase der Aufarbeitung auch große Vorrichtungen erforderlich. Technisch beziehungsweise industriell durchführbar ist das Verfahren nur dann, wenn das Volumen bis zur Erzielung eines 1 bis 10 Gew.-% Heparin enthaltenden Zwischenproduktes verringert werden kann. Wegen der Schwankungen in der Zusammensetzung schwankt auch die Qualität des erhaltenen Produktes, eine wirtschaftliche Aufarbeitung ist nur schwer möglich.

Das Wesen der zweiten Gruppe von Extraktionsverfahren besteht darin, daß der Wirkstoffgehalt der heparinhaltigen Organe nur mittels Chemikalien aufgeschlossen und als Heparin oder Heparin/Eiweiß-Komplex in Lösung gebracht wird. Derartige Verfahren sind zum Beispiel in den HU-Patentschriften 1 48 776 und 1 49 339, der GB-Patentschrift 9 92 201 und den US-Patentschriften 26 23 001, 30 58 884 und 32 62 854 beschrieben. Auch bei dieser Gruppe von Verfahren ist es nachteilig, daß die einen hohen Wassergehalt aufweisenden Organrückstände aus dem System entfernt werden müssen, wobei je nach dem organischen Trockensubstanzgehalt des Extraktionsrückstandes Heparinverluste von 20 bis 40 Gew.-% auftreten (siehe das Beispiel 1 der HU-Patentschrift 1 48 776 sowie die GB-Patentschrift 9 92 201). Auch bei dieser Gruppe von Verfahren verursachen die Zusammensetzungsschwankungen Unzulänglichkeiten beziehungsweise Unannehmlichkeiten, wie schwankende Auszugszusammensetzungen und die mangelnde Reproduzierbarkeit der folgenden Aufarbeitungsstufen. Wegen dieser Schwierigkeiten wird zum Beispiel gemäß der US-Patentschrift 26 23 001 nach dem Aufschluß mit einem großen Volumen eine langwierige Dialyse vorgenommen. Im Verfahren gemäß der US-Patentschrift 22 62 854 besteht der Zwang, in den mit den größten Volumina vorgenommenen Phasen der Extraktion organische Lösungsmittel einzusetzen.

Bei den beiden beschriebenen Gruppen von Verfahren, den autolytischen Verfahren und den nur mit chemischem Aufschluß arbeitenden Verfahren, ist es demnach nachteilig, daß bei der Extraktion, die im allgemeinen wegen der Konsistenz der üblichen Rohstoffe nur eine 1- oder 2-stufige Gleichstromextraktion sein kann, im Endergebnis an Heparin recht arme, im Durchschnitt nur 10 bis 20 IE/cm³, das heißt etwa 0,01 Gew.-% Heparin und neben diesem viele Begleit- und Störstoffe enthaltende Lösungen erhalten werden. Anschaulich ausgedrückt ist es so, daß, um 1000 MIE (6,5 kg) Heparin in Lösung zu bringen, die Extraktion mit einem Volumen von 50 000 bis 100 000 l vorgenommen werden muß und der Heparinverlust mindestens 20 Gew.-% beträgt.

Bei der dritten Gruppe von Extraktionsverfahren werden die heparinhaltigen Organe zwecks Verminderung der Heparinverluste und Vermeidung der bei der Vorautolyse auftretenden Unsicherheiten nicht nur mit Chemikalien behandelt, sondern auch noch einer bis zur völligen oder fast völligen Auflösung führenden langwierigen und intensiven Proteolyse unterworfen, indem Enzyme, wie Trypsin, Pankreaseextrakt, Papain beziehungsweise Elastase, in das System eingebracht werden. Derartige Verfahren sind zum Beispiel in der HU-Patentschrift 1 47 323 und den US-Patentschriften 25 87 924, 29 89 438 und 38 17 831 beschrieben, während die US-Patentschriften 28 84 358 und 30 16 331 auf die Kombination von Autolyse und enzymatischer Proteolyse eingehen. Trotz der vorhandenen Vorteile wird doch die Wirtschaftlichkeit dieser Verfahren von dem mit den für die spezifische Menge der Organe erforderlichen proteolytischen Enzymen verbundenen Aufwand empfindlich berührt und es dadurch auch kompliziert. Auf 2 kg heparinhaltige Organe bezogen muß zum Beispiel bei einem der genannten Verfahren eine Menge von 1,5 bis 3 kg Pankreas beziehungsweise Pankreasrückstand zugesetzt werden.

Bei Verringerung der spezifischen Enzymmenge werden die Proteolyse und der Filtriervorgang außerordentlich langwierig. Beim Verfahren nach der US-Patentschrift 38 17 831 dauert die mit Pepsin vorgenommene Proteolyse 24 Stunden und die mit Pankreatin vorgenommene Proteolyse beziehungsweise Autolyse 15 Stunden und anschließend wird 1mal grob filtriert und nach 24 Stunden ultrafiltriert. Besonders nachteilig ist es, daß infolge des Zeitaufwandes bei den einzelnen Stufen die Infektionsgefahr durch Bakterien sich erhöht und durch die Gegenwart der mit den Enzymen eingebrachten abbauend wirkenden und die Glukosidbindungen des Heparines zersetzenden Enzyme der Heparinverlust vergrößert wird.

Infolge der völligen oder fast völligen Proteolyse gelangen auch die Begleitstoffe des Heparines, zum Beispiel Mucopolysaccharide, Nucleinsäurederivate, Farbstoffe, Fette und Lipoide, in Lösung und stören die schnelle und wirksame Aufarbeitung beträchtlich. Gemäß dem Beispiel 3 der US-Patentschrift 38 17 831 kommt in der Lösung B nach der Beendigung der Proteolyse und der Grobfiltration auf einen Heparingehalt von 0,027 Gew.-% ein Gesamttrockensubstanzgehalt von 10,35 Gew.-%, der also um 3 Größenordnungen höher ist. Aus diesem Grund bereitet auch die Ableitung der wirkstofffreien aufgearbeiteten Lösung in die Kanalisation Umweltschutzprobleme. Das Produkt der mit Proteolyse arbeitenden Verfahren ist eine außerordentlich verdünnte Lösung (6 bis 45 IE/cm³ entsprechend 0,004 bis 0,03 Gew.-% Heparin); in konzentrierteren Lösungen kann wegen der auftretenden Substrathemmung beziehungsweise Substratinhibition keine Proteolyse vorgenommen werden.

Der längste und komplizierteste Abschnitt des gesamten Herstellungsverfahrens ist das Herauslösen des Heparines aus den tierischen Organen und die gut reproduzierbar durchführbare Verminderung des Volumens der erhaltenen Lösung. Die Extraktion erfordert wegen der Proteolyse und der in mehreren Stufen durchgeführten physikalisch-chemischen Maßnahmen viel Zeit und ist mit hohem Aufwand verbunden, weil wegen der sehr geringen Wirkstoffkonzentrationen Vorrichtungen mit großen Volumina angelegt und betrieben werden müssen. Bei der Extraktion mit Chemikalien beziehungsweise proteolytischen Enzymen fallen die Kosten dieser Stoffe sehr ins Gewicht. Die Reproduktion ist unsicher, da infolge der verschiedenen Sammel- und Lagerungsbedingungen der Wirkstoffgehalt innerhalb weiter Grenzen schwankt. Nachteilig ist ferner, daß die Aufarbeitbarkeit der in um mehrere Größenordnungen größeren Mengen vorhandenen Verunreinigungen ungünstig beeinflußt wird.

Die bei der Heparinherstellung üblichen Organsammelverfahren ermöglichen es demnach nicht, den nach der Lagerung noch verbliebenen Heparingehalt ohne nennenswerten Verlust in Form von reinem Heparin zu gewinnen. Die Extraktionsverfahren mußten der Qualität des Ausgangsmateriales angepaßt werden; dessen schwankende Qualität erfordert es, in den Extraktionsvorgang Arbeitsgänge, welche die Selektivität vermindern, die Kompliziertheit jedoch erhöhen, einzuschalten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Behebung der Nachteile des Standes der Technik ein Verfahren zur Herstellung von Heparin enthaltenden Auszügen, insbesondere Organauszügen, durch Extraktion von heparinhaltigen Rohstoffen unter Verwendung eines wäßrigen Mediums mit einem Gehalt an einem Salz, welches einfacher ist, mit einer kürzeren Durchlaufzeit und mit geringeren Volumina durchgeführt werden kann, damit auch wirtschaftlicher ist, insbesondere mit einem geringeren Energie-, Chemikalien- und Arbeitskräfteaufwand verbunden ist, und eine bessere Selektivität hat, so daß ein Auszug, dessen Zusammensetzung konstant ist, der wenig störende Verunreinigungen enthält und dessen Wirkstoffkonzentration extrem hoch (mindestens 120 IE/cm³) ist, erhalten wird, zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren des Patentanspruchs 1 gelöst.

Wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren ist der Einsatz eines 90 bis 95 Gew.-% Trockensubstanz enthaltenden heparinreichen, amorphen, körnigen und formbeständigen Rohmaterials mit einer hohen spezifischen Oberfläche als heparinreiches Ausgangsmaterial und dessen Behandlung im Gegenstrom mit einer wäßrigen Lösung eines Salzes.

Die DE-PS 9 50 594 beschreibt die Extraktion von üblichen heparinhaltigen Ausgangsmaterialien mit salzhaltigen Lösungen, auf das erfindungsgemäß eingesetzte spezifische heparinhaltige Ausgangsmaterial findet sich kein Hinweis in dieser Literaturstelle. Das in der DE-OS 26 60 052 beschriebene Verfahren zur Herstellung von Heparin beruht auf der Feststellung, daß in Schlachthöfen und Darmschleimereien anfallende Salzlake Heparin enthält, die als Ausgangsmaterial zur Durchführung des in dieser Literaturstelle beschriebenen Verfahrens eingesetzt wird. Wie aus diesen Salzlaken das Heparin gewonnen wird, wird nicht angegeben. Demgemäß geht das erfindungsgemäße Verfahren von einem anderen Ausgangsmaterial aus als dieses bekannte Verfahren.

Vorteilhaft wird die Gegenstromextraktion bei 20 bis 80°C durchgeführt.

Es ist auch vorteilhaft, die Gegenstromextraktion bei einem Elektrolytgehalt (Salzgehalt) von 1,5 bis 12,0 Gew.-% durchzuführen.

Ferner wird vorteilhaft die Gegenstromextraktion bei einem pH-Wert von 8 bis 12,8 beziehungsweise in einer 0,25 bis 1,0 n, insbesondere 0,5 bis 1,0 n, Alkalilauge durchgeführt. Die Temperatur, die Elektrolytkonzentration und der pH-Wert werden zweckmäßig während des gesamten Extraktionsvorganges auf einem konstanten Wert gehalten.

Vorzugsweise wird während der Extraktion das Verhältnis der Extraktionsflüssigkeit (Salzlösung) zum zu extrahierenden Material auf einen einem zu erzeugenden Auszug mit einem Heparingehalt von mindestens 150 IE/cm³, insbesondere 150 bis 300 IE/cm³, entsprechenden Wert eingestellt. Dazu ist es zweckmäßig, das Verhältnis der Extraktionsflüssigkeit zur Trockensubstanz auf 3,5 : 1 bis 7 : 1, insbesondere 4 : 1 bis 6 : 1, ganz besonders etwa 5 : 1, zu halten.

Als Salze beziehungsweise Elektrolyte können beliebige gegenüber Heparin inerte Salze, vorzugsweise Natriumchlorid, verwendet werden. Zum Einstellen des pH-Wertes können 1- oder mehrwertige Laugen, zweckmäßig Natriumhydroxyd oder sonstige bei der Heparinextraktion übliche Laugen, eingesetzt werden. Als heparinhaltiger Rohstoff wird zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein 90 bis 95 Gew.-% Trockensubstanz enthaltendes heparinreiches, amorphes, körniges, formbeständiges Rohmaterial mit hoher Oberfläche verwendet, das erhalten wird durch Lagern von, gegebenenfalls zerkleinerten, heparinhaltigen tierischen Organen in einem wäßrigen Medium während 0,5 bis 15 Stunden bei 10 bis 50°C, Fällen eines wasserunlöslichen Heparin/Eiweiß-Komplexes aus der vorbehandelten Suspension bei 75 bis 100°C, Aggregation desselben durch weiteres Erhitzen auf diese Temperatur, Abtrennen des ausgeflockten Niederschlages und Trocknen, zweckmäßig bei weniger als 100°C, zu einem krümeligen Produkt bis zur Erreichung eines Trockensubstanzgehaltes von 90 bis 95 Gew.-%. Das heparinreiche Rohmaterial enthält um 5 bis 35 Gew.-% mehr Heparin, bezogen auf die Trockensubstanz, als jedes natürliche Ausgangsmaterial. Vorteilhaft werden als heparinhaltige tierische Organe solche, welche zu einer Stückgröße von 4 bis 6 mm zerkleinert sind, verwendet. Es ist auch vorteilhaft, die tierischen Organe in Form einer wäßrigen Suspension mit einem Trockensubstanzgehalt von 1,5 bis 17 Gew.-% einzusetzen. Vorzugsweise werden die als Ausgangsmaterial verwendeten tierischen Organe in den meisten Fällen mit Wasser mit einer Temperatur von 18 bis 50°C, insbesondere 36 bis 42°C, verdünt. Es ist auch bevorzugt, die Vorbehandlung 2 bis 6 Stunden, insbesondere 4 bis 6 Stunden, bei 30 bis 50°C durchzuführen. Nach einer Ausführungsform der Herstellung des genannten Ausgangsmateriales des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Erhitzen der vorbehandelten Suspension auf 75 bis 100°C in der Weise durchgeführt, daß sie in einem kontinuierlichen System in kurzer Zeit auf diese Temperatur gebracht wird und bei dieser Temperatur 2 bis 15 Minuten, insbesondere 2 bis 8 Minuten, wärmebehandelt wird. Gemäß einer Alternative zur letzteren wird das Erhitzen der vorbehandelten Suspension auf 75 bis 100°C in der Weise durchgeführt, daß diskontinuierlich gearbeitet wird sowie die Suspension in der kürzestmöglichen Zeit auf die Temperatur von 75 bis 100°C gebracht und bei dieser Temperatur mindestens 15 Minuten wärmebehandelt wird. Vorzugsweise wird die Abtrennung des gefällten Heparin/Eiweiß-Komplexes in einer mit der Schwerkraft arbeitenden mechanischen Trennvorrichtung mit einem Trockensubstanzgehalt von etwa 20 bis 25 Gew.-% durchgeführt, wobei das inaktive Filtrat verworfen wird. Es ist auch bevorzugt, als mechanische Trennvorrichtung eine solche mit sich ständig erneuernder Filterfläche und insbesondere mit geschlossenem Dampfraum, zu verwenden. Vorteilhaft wird die Trocknung kontinuierlich durchgeführt. Vorteilhaft können auch einzelne Stufen diskontinuierlich durchgeführt werden.

In der DE-OS 30 11 062 wird ein erfindungsgemäß verwendbares heparinreiches Trockenkonzentrat beschrieben.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Gegenstromextraktion diskontinuierlich bis zur Erschöpfung durchgeführt.

Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Gegenstromextraktion kontinuierlich, vorzugsweise in einer in Zellen unterteilten U-Extraktionsvorrichtung, insbesondere unter Anwendung von Vibrationen oder anders ausgedrückt in einer pulsierenden U-Extraktionsvorrichtung, durchgeführt. Eine solche U-Extraktionsvorrichtung ist in der HU-Patentschrift 1 59 977 beschrieben. Sie ist also nicht nur zur Extraktion von Heilpflanzen, sondern auch zur erfindungsgemäßen Herstellung von wäßrigen Heparinextrakten mit hohem Wirkstoffgehalt gut geeignet. Die Extraktionsvorgänge in dieser Vorrichtung sind wie folgt: Sprühvoraufschluß im Gleichstrom, Sprühaufschluß im Gleichstrom, Vorextraktion durch Herabtropfen im Gleichstrom, dann Vibrationstränkungsextraktion im Gegenstrom und schließlich Nachextraktion durch Herabtropfen im Gegenstrom. Diese Vorrichtung ist aus Zellen aufgebaut, und zwischen den einzelnen Zellen ist die Neigung der wäßrigen Auszüge, zurückzufließen und sich zu vermischen, stark gehemmt. Durch die Vibration wird das dem jeweiligen Augenblick zugehörige Extraktionsgleichgewicht wesentlich schneller erreicht. Dies hat den Vorteil, daß sowohl die auf das zu extrahierende Material bezogene Flüssigkeitsmenge als auch die Dauer der Extraktion und die Extraktionsweglänge bedeutend vermindert werden können.

Vorteilhaft wird die Gegenstromextraktion in einer einzigen Vorrichtung durchgeführt.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind zusammengefaßt wie folgt:

• a) Bei den üblichen 1- oder 2-stufigen Gleichstromextraktionsverfahren zur Extraktion von Heparin ist es erforderlich, die Temperatur und den pH-Wert einem Programm entsprechend zu ändern beziehungsweise Chemikalien zuzusetzen. Die erfindungsgemäße Gegenstromextraktion kann dagegen in einer einzigen Vorrichtung in einem für das jeweilige System optimal gewählten wäßrig-alkalischen Medium als einfaches Herauslösen verwirklicht werden. Die Verfahrensbedingungen brauchen nicht geändert und Chemikalien brauchen nicht zugesetzt zu werden.
• b) Bei der Gegenstromextraktion wird bei kurzer Verfahrensdauer ein praktisch fettfreier Auszug konstanter Zusammensetzung, der mindestens 5- bis 10-mal so konzentriert ist wie die mit üblichen Extraktionen erhaltenen Auszüge, in guter Ausbeute erhalten. Dies ist darauf zurückzuführen, daß das Verhältnis von Heparin zu Begleitstoffen wesentlich günstiger ist.
• c) Die Durchführung der Gegenstromextraktion ist nicht an bestimmte Chemikalien gebunden. Es können immer die jeweils am besten zugänglichen Chemikalien verwendet werden.
• d) Der Volumenbedarf der Gegenstromextraktion beträgt ¼ bis ¹/₁₀ des Volumenbedarfes der bekannten Verfahren. Der Heparinauszug fällt gleichmäßig, konzentriert und in geringem Volumen an. Die Volumenkapazität der Vorrichtungen kann verringert und ihr Ausnutzungsgrad erhöht werden.
• e) Durch die Verringerung des Volumens wird eine beträchtliche Energie- und Arbeitseinsparung erzielt und es werden auch weniger Chemikalien benötigt.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß erfindungsgemäß durch Extraktion im Gegenstrom einen extrem hohen Heparingehalt aufweisende Auszüge konstanter Zusammensetzung hergestellt werden können und dabei der Zeitaufwand gering ist und die Volumina klein und daher die zu verwendenden Vorrichtungen einfach sind.

Bei Verwendung der in der HU-Patentschrift 1 59 977 beschriebenen U-Extraktionsvorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und beim Extrahieren bei 50°C mit einer Extraktionslösung aus einer 0,5 bis 1,0 n Alkalilauge mit einem Natriumchloridgehalt von mindestens 5% bei einer Verweilzeit von 30 Minuten in der Extraktionsvorrichtung und bei Einstellung des Verhältnisses der Extraktionsflüssigkeit zum getrockneten Organkonzentrat auf etwa 5 : 1 wird der Wirkstoff praktisch quantitativ extrahiert. Das Organkonzentrat quillt durch die Wasseraufnahme etwas auf, bewahrt jedoch seinen formbeständigen, körnigen Charakter und seine ausgezeichnete Filtrierbarkeit auch bei hohen Laugenkonzentrationen. Eine Erhöhung der Laugenkonzentration wirkt sich praktisch nicht auf die Menge des herausgelösten Feststoffes aus, und auch die Menge der in Lösung gehenden Peptide und Eiweiße ist praktisch unverändert. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß in den die Hauptmenge des Trockenkonzentrates ausmachenden Eiweißen beim Trocknen irreversible Denaturationsvorgänge ablaufen.

Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels sowie der Vergleichsbeispiele A, B und C näher erläutert.

Beispiel a) Herstellung des Ausgangsmaterials

Es wurden 5,0 Kilogramm gemäß dem Beispiel der DE-OS 30 11 062 hergestelltes heparinhaltiges Rohmaterial in 10 gleiche Teile geteilt. Diese Portionen von je 0,5 kg wurden den Vorschriften der diskontinuierlichen Extraktion im Gegenstrom entsprechend in 5 Extraktionsstufen aufgearbeitet. Die einzelnen Extraktionsstufen wurden wie folgt durchgeführt.

Die erste Portion des getrockneten Organkonzentrates wurde mit einer 40°C warmen 0,25 n Natronlauge mit einem Gehalt an 6 Gew.-% Natriumchlorid zu 3,2 l Extraktionsgemisch angesetzt. Nach 20 Minuten wurde der Auszug mittels Vakuums durch ein Drahtsieb (Büchner-Trichter) filtriert. Die Filterfläche war ein Metallnetz mit Maschenweiten von 0,6 mm. Die erste Extraktionsbrühe wurde gesammelt und es wurde ihr Volumen gemessen und ihre Heparinaktivität bestimmt.

Der auf dem Drahtsieb verbliebene nasse Organrückstand wurde erneut mit einer 40°C warmen 0,25 n Natronlauge mit einem Gehalt an 6 Gew.-% Kochsalz vermischt, wobei wieder ein Extraktionsvolumen von 3,2 l eingestellt wurde. Die zweite Extraktion der bereits 1mal extrahierten Organmasse wurde in der oben beschriebenen Weise durchgeführt. Das bei der zweiten Extraktion der ersten Portion des Organkonzentrates angefallene Filtrat wurde mit der zweiten Portion des getrockneten Konzentrates vermischt. Das Extraktionsvolumen wurde wieder auf 3,2 l eingestellt.

Die folgenden Stufen waren sinngemäß die gleichen. Im Endergebnis wurde eine diskontinuierliche Gegenstromextraktion in 5 Stufen durchgeführt. Das Extraktionsvolumen betrug immer 3,2 l, und die Temperatur war stets 40°C.

Das Volumen und die Heparinaktivität der gesammelten Auszüge sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Tabelle

Wie die Daten der obigen Tabelle zeigen, konnten aus 5,0 kg des 90,4 Gew.-% Trockensubstanz enthaltenden als Ausgangsmaterial verwendeten Rohstoffes durch diskontinuierliche Extraktion in 5 Stufen 2,599 MIE Heparin gewonnen werden. Wie die einzelnen Stufen bei der Extraktion der zehnten Portion zeigen, war die Extraktion erschöpfend. Die Ausbeute war praktisch gleich der im folgenden Beispiel 2 (98,3% derselben).

Die Herstellung des als Ausgangsmaterial verwendeten heparinhaltigen Rohmateriales ist wie folgt durchgeführt worden:

Es wurde eine an einer Darmreinigungsmaschine angefallene einen Trockensubstanzgehalt von durchschnittlich 6,3 Gew.-% aufweisende Dünndarmschleimhaut mit einer Förderpumpe in einem isolierten Rohrabschnitt in Strömung gehalten. In der Vorrichtung wurde die Verweilzeit auf 1,5 Stunden und die Temperatur auf 41°C eingestellt.

Die auf diese Weise autolysierte Suspension wurde mit Hilfe der in der DE-OS 30 11 025 beschriebenen Vorrichtung kontinuierlich aufgearbeitet. Im Schnellerhitzer der Vorrichtung wurde die Suspension durch unmittelbares Einleiten von Dampf auf 90°C erwärmt und dann in einem der Vorrichtung zugehörigen wärmeisolierten spiralförmigen Rohrabschnitt bei schwacher Strömung 7,5 Minuten lang wärmebehandelt. Die koagulierenden Teilchen wurden mittels einer Austragspirale entfernt und auf einer Filtertrommel abgetrennt. Durch deren Austragspirale wurde der heparinhaltige Rohstoff kontinuierlich aus der Filtereinheit entfernt.

Das abgetrennte Produkt wurde über ein Dosiersystem in eine mit den Filtern in Verbindung stehende Trockenvorrichtung eingespeist. Die Trockenvorrichtung hatte die Form eines liegenden Zylinders, war innen mit Rührplatten beziehungsweise -blättern und Rollen ausgerüstet und wurde von außen mit Dampf und von innen mit heißer Luft geheizt. Die heiße Luft wurde in einem speziellen Lufterhitzer, in welchem aus der Umgebung angesaugte Luft durch Dampfheizung auf 142°C erhitzt wurde, erzeugt. Die Temperatur der austretenden feuchten Luft wurde auf 82 bis 88°C eingestellt.

Der Ausgangsstoff wurde mit einer Geschwindigkeit von 600 l/Stunde in die Vorrichtung eingespeist. Nach 6 Stunden langem Betrieb waren 178 kg fast fettfreies Produkt mit einer Mikroorganismenzahl von 10² bis 10³/g und einem Trockensubstanzgehalt von 90,4 Gew.-% hergestellt. Mindestens 80 Gew.-% des Produktes fielen in den Korngrößenbereich von 1,6 bis 0,2 mm. Das Produkt war bei Raumtemperatur unbegrenzt lagerbar.

b) Durchführung des Extraktionsverfahrens

Der unter der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise a) hergestellte Ausgangsstoff wurde in einer U-Extraktionsvorrichtung gemäß der HU-Patentschrift 1 59 977 im Gegenstrom kontinuierlich extrahiert.

Das getrocknete Rohmaterial wurde der Vorrichtung kontinuierlich mit einer Zuführschnecke zugeführt. Aus einem über der Zuführschnecke angebrachten Sprühkopf wurde das doppelte Volumen einer 70°C warmen 0,55 n Natronlauge mit einem Natriumchloridgehalt von 6 Gew.-% zugesetzt. Das Material hatte in der Zuführschnecke eine Verweilzeit von 10 Minuten.

Im Gegenstrom zum in den einzelnen Zellen der U-Extraktionsvorrichtung befindlichen gequollenen Material wurde eine 0,1 n Natronlauge mit einem Gehalt an 6 Gew.-% Kochsalz geführt. Während der kontinuierlichen Gegenstromextraktion wurde eine Temperatur von 50°C aufrechterhalten. Zur Verbesserung des Stoffaustausches wurde der am Boden der U-Extraktionsvorrichtung befindliche Vibrator eingeschaltet.

Das Volumen des kontinuierlich angefallenen hellstrohgelben, fast völlig klaren Auszuges wurde mit einem Rotameter gemessen. Die Heparinkonzentration wurde durch ½-stündliche Probenahme bestimmt.

Der Heparingehalt des Auszuges wurde ebenfalls kontinuierlich gefällt, und der erhaltene Niederschlag wurde mittels eines Trommelfilters abgetrennt.

Die verwendete Vorrichtung hatte eine Kapazität von 10 kg Trockenkonzentrat je Stunde, und die Verweilzeit betrug 35 Minuten. In 10-stündigem Betrieb wurden 210 l Auszug mit einer durchschnittlichen Heparinaktivität von 252 IE/cm³ gewonnen. Auf 100 kg 90,4 Gew.-% Trockensubstanz enthaltendes Ausgangsmaterial bezogen war das eine Ausbeute von 52,9 MIE.

Der extrahierte nasse Rückstand wurde auf seine Heparinaktivität untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Gegenstromextraktion mit Verlusten von weniger als 2 Gew.-% durchgeführt werden konnte.

Der Rückstand war infolge seines hohen Eiweißgehaltes als Viehfutter geeignet.

Vergleichsbeispiel A

Es wurde dasselbe, gemäß Beispiel der DE-OS 30 11 062 hergestellte heparinhaltige Ausgangsmaterial wie im vorstehenden Beispiel unter a) in an sich bekannter Weise autolysiert und in Gegenwart von Toluol mit Elektrolytlösung extrahiert.

31,5 kg dieses Rohmaterials wurden zusammen mit 100 kg 18 Gew.-% Trockensubstanz enthaltendem feingemahlenem Schweinedarm, 450 l Wasser und 150 l einer 10%igen Ammoniumsulfatlösung in einem Duplikator kräftig gerührt. Nach dem Verrühren wurde das Gemisch auf 38°C erwärmt. Dann wurde unter Rühren der pH-Wert mit einer 40%igen Natronlauge auf 8,8 bis 9,2 eingestellt. Um schädlichen mikrobiologischen Vorgängen vorzubeugen, wurden dem Gemisch 3 l Toluol zugesetzt.

Nach dem Zusatz von Enzymen wurde bei 38°C 36 Stunden lang proteolysiert beziehungsweise autolysiert, wobei das Gemisch von Zeit zu Zeit aufgerührt wurde. Der pH-Wert wurde alle 6 Stunden kontrolliert und erforderlichenfalls durch Zugabe einer 40%igen Natronlauge korrigiert.

Nach 36 Stunden langer Proteolyse beziehungsweise Autolyse wurde der pH-Wert mit einer 18%igen Salzsäure auf 7,3 bis 7,7 eingestellt und das Gemisch aufgekocht. Nach 10 Minuten langem Erhitzen zum Sieden wurden die koagulierten Teile auf einem Filtersieb abgetrennt. Das Filtrat wurde durch bei 60°C erfolgendes Durchleiten durch eine tellerförmige Fett-Trennvorrichtung mit vertikaler Achse, in welcher sich die wäßrige Phase und die Fettphase mit verschiedenen spezifischen Gewichten voneinander trennen, fettfrei gemacht.

Es wurden 638 l dunkelbraune Extraktbrühe, deren Heparinkonzentration 18,1 IE/cm³ betrug, was einer Gesamtmenge von 11,54 MIE Heparin entspricht, erhalten. Dies war eine Ausbeute von nur 70,4%, bezogen auf die im Beispiel 2.

Vergleichsbeispiel B

Es wurde ein dem in Vergleichsbeispiel A verwendeten heparinhaltigen Ausgangsmaterial entsprechendes heparinhaltiges Trockenkonzentrat in der in der US-Patentschrift 38 17 831 beschriebenen Weise extrahiert. 40 kg Rohmaterial wurden in einem Duplikator mit 400 l Wasser gründlich verrührt. Der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf 2,7 eingestellt, und das Gemisch wurde auf 38°C erhitzt. Es wurde eine Pepsinmenge, die 10 kg Schweinemagenschleimhaut entsprach, zugesetzt, und danach wurde der pH-Wert erneut auf 2,7 eingestellt. Unter ständigem Rühren wurde 20 Stunden lang proteolysiert, und die Temperatur wurde auf 37 bis 39°C gehalten.

Nach 20 Stunden langer Proteolyse wurde der pH-Wert mit einer 40%igen Natronlauge auf 8,0 eingestellt, und dem Gemisch wurden bei 37°C 20 l aktiviertes Pankreasgemisch zugesetzt. Die zweite Proteolyse dauerte 10 Stunden. Der pH-Wert wurde alle 2 Stunden kontrolliert und erforderlichenfalls mit Natronlauge erneut auf 8 eingestellt. Die Temperatur wurde auf 37°C gehalten. Nach der zweiten Proteolyse wurde das Gemisch zum Sieden erhitzt und dann durch ein Filtersieb filtriert. Es wurden 417 l eines braunen Filtrates mit einer Heparinkonzentration von 32,0 IE/cm³, was einem Gesamtheparingehalt von 13,34 MIE entspricht, erhalten. Dies war eine Ausbeute von nur 64,2%, bezogen auf die im Beispiel.

Vergleichsbeispiel C

Es wurde ein dem im Vergleichsbeispiel A verwendeten heparinhaltigen Ausgangsmaterial entsprechendes getrocknetes heparinhaltiges Ausgangsmaterial gemäß der HU-Patentschrift 1 48 776 aufgearbeitet. Es wurden 14,2 kg Rohmaterial in einem Duplikator mit 195 l Wasser gründlich vermischt. Dann wurden 6,5 kg Kochsalz zugesetzt, und der pH-Wert wurde mit einer 40%igen Natronlauge auf 10 eingestellt. Unter gleichmäßigem Rühren wurde das Gemisch mit Dampf auf 65°C erwärmt und bei dieser Temperatur mit Wasserstoffperoxyd behandelt. Dazu wurden vorangehend 250 cm³ 40%iges Wasserstoffperoxyd mit Wasser auf ein Volumen von 4 l verdünnt, und 1 l dieser verdünnten Lösung wurde dem Gemisch zugesetzt. Die verbliebenen 3 l wurden unter Aufrechterhalten der Temperatur von 65°C innerhalb 30 Minuten gleichmäßig zugegeben. Nach der Peroxydbehandlung wurde das Gemisch bei der gleichen Temperatur noch 1 Stunde lang gerührt und dann mit 600 g Ammoniumchlorid versetzt, wodurch sich ein pH-Wert von 8,7 einstellte. Mit dem Heizmantel des Duplikators wurde das Gemisch zum Sieden gebracht, und es wurde 5 Minuten lang zum Sieden erhitzt, worauf der Rührer abgeschaltet wurde. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang absetzen gelassen. Die über den abgesetzten extrahierten Organrückständen überstehende hellgelbe völlig durchsichtige Flüssigkeit wurde durch einen an der Seite des Apparates befindlichen Stutzen dekantiert. Nach dem Dekantieren wurde das im Apparat verbliebene Gemisch aus Organrückständen und Flüssigkeit aufgerührt und dann durch ein Filtersieb mit einer Maschenweite von 0,8 mm filtriert.

Die vereinigten Auszüge hatten ein Volumen von 168 l und eine Heparinkonzentration von 32,4 IE/cm³, was einer Gesamtmenge von 5,44 MIE Heparin entspricht. Das war eine Ausbeute von nur 73,7%, bezogen auf die im Beispiel.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von mindestens 120 IE/cm³ Heparin und daneben nur wenig Fette und sonstige Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Auszügen, insbesondere Organauszügen, konstanter Zusammensetzung durch Extrahieren von heparinhaltigen Rohstoffen bei 20 bis 80°C unter Verwendung von wäßrigen Lösungen von Salzen mit einem Salzgehalt von 1,5 bis 12,0 Gew.-% bei einem pH-Wert von 8 bis 12,8, dadurch gekennzeichnet, daß man als heparinhaltigen Rohstoff ein 90 bis 95 Gew.-% Trockensubstanz enthaltendes heparinreiches, amorphes, körniges, formbeständiges Rohmaterial mit hoher spezifischer Oberfläche einsetzt, das erhältlich ist durch Lagern von heparinhaltigen tierischen Organen in einem wäßrigen Medium während 0,5 bis 15 Stunden bei 10 bis 50°C, Fällen eines wasserunlöslichen Heparin/Eiweiß-Komplexes aus der vorbehandelten Suspension bei 75 bis 100°C, Aggregation desselben durch weiteres Erhitzen auf diese Temperatur, Abtrennen des ausgeflockten Niederschlages und Trocknen zu einem krümeligen Produkt bis zur Erreichung eines Trockensubstanzgehaltes von 90 bis 95 Gew.-%, und dessen Extraktion mit der wäßrigen Lösung eines Salzes im Gegenstrom.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herstellung des heparinreichen Rohmaterials eingesetzten tierischen Organe zerkleinert werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Extraktion das Verhältnis der Extraktionsflüssigkeit zum zu extrahierenden Material auf einen einem zu erzeugenden Auszug mit einem Heparingehalt von mindestens 150 IE/cm³ entsprechenden Wert einstellt.