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Verfahren zur Gewinnung von Fermenten aus Pankreasdrüsen Die vorliegende
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer Reihe therapeutisch wertvoller
Produkte aus Pankreasdrüsen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, die von Fett befreiten
und zu Brei zerkleinerten Pankreasdrüsen zunächst mit Äther 3 bis 6 Stunden unter
diskontinuierlicher leichter Bewegung zwecks Freimachung der Fermente aus dem Zeliverband
einer Exolyse zu unterwerfen, den lipidhaltigen Ather abzutrennen und aus dem Pankreassaft
die Fermente fraktioniert mit steigenden Mengen (NH4)2S O4 auszufällen und schonend
zu trocknen.
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Es sind bereits Verfahren zur Extraktion enzymatischer Produkte aus
Pankreasdrüsen bekanntgeworden, die sich von dem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch
grundsätzlich und insbesondere dadurch unterscheiden, daß bei ihnen keine Exolyse
der Fermente, wie sie erfindungsgemäß erzielt wird, stattfindet. So ist beispielsweise
in der deutschen Patentschrift 742 719 ein Verfahren zur gleichzeitigen Gewinnung
des Blutzucker senkenden Hormons und fermentwirksamer Präparate aus tierischem Pankreas
beschrieben, bei welchem Pankreas zunächst getrocknet und entfettet wird. Die gemäß
dieser Patentschrift zur Entfettung durchgeführte Behandlung mit Petroläther ist
von der erfindungsgemäßen Äther behandlung in der Wirkung völlig verschieden. Bei
einem Versuch, den Ather im erfindungsgemäßen Verfahren durch Petroläther zu ersetzen,
wurde festgestellt, daß bei Anwendung des letzteren Verbindungen erhalten wurden,
die Proteine mit geringem Molekulargewicht (Histone, Protamine) enthielten. Da Histone
toxische Verbindungen sind, verhalten die sich so hergestellten Verbindungen im
Organismus ganz anders als die erfindungsgemäß erhältlichen. Es wird angenommen.
daß dieses von Äther verschiedene Verhalten des Petroläthers auf dessen hohem Lösungsvermögen
beruht, wodurch nicht nur die Membran zerstört wird, sondern auch eine tiefgreifende
Einwirkung auf die innerhalb der Zellen vorhandenen Substanzen erfolgt. Petroläther
löst die Lipide, die sich im Innern des Pankreasplasmas befinden, und zerstört außerdem
die zwischen gewissen Proteinen vorhandenen Lipidbindungen.
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Dies dürfte der Grund sein, weshalb bei Verwendung von Petroläther
keine intakten Proteine erhalten werden können.
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Der erfindungsgemäß verwendete Ather bewirkt dagegen ein Zerreißen
der Membran ohne zersetzende Zerstörung, was zu einer Exolyse führt. Hierbei wirkt
der Äther nicht auf die Protoplasmaproteine die durch diese Exolyse aus den Zellen
in Freiheit gesetzt werden. Diese bleiben vielmehr intakt und können anschließend
in diesem Zustand, d. h. unter
völliger Erhaltung ihres enzymatischen Vermögens,
abgetrennt werden.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Pankreasdrüsen
frisch verarbeitet, d. h. praktisch innerhalb von 2 Stunden nach der Schlachtung
des Tieres. Wenn die Drüsen jedoch sofort auf Eis gelegt und bei etwa 0 bis 20 C
gehalten werden, kann die Verarbeitung aufgeschoben werden, z. B. bis zu 48 Stunden
nach der Schlachtung.
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Die Pankreasdrüse wird dabei zunächst sorgfältig von Fett befreit;
diese Maßnahme bezweckt, die Lösung von Fetten durch Äther zu verhindern, was einen
unnützen Verbrauch von letzterem zur Folge hätte. Die Entfernung des Fetts kann
z. B. mit einem Messer ausgeführt werden.
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Die Drüse wird dann sehr fein zu einem Brei mit einer mittleren Teilchengröße
von der Größenordnung von 1 bis 2 mm zerkleinert. Diese Vorkehrung ist wichtig.
damit die Ätherbehandlung eine vollständige Exolyse ergibt.
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Zur Ätherbehandlung wird etwa 11 Äther pro 2 kg Pankreasbrei verwendet.
Dieses Verhältnis kann jedoch in weiten Grenzen variieren, da es besonders vom histologischen
Zustand des Pankreas zum Zeitpunkt der Schlachtung (Futter, Verdauung) abhängt.
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Das obengenannte Verhältnis ist jedoch in der Regel ausreichend, d.
h., es gewährleistet eine vollständige Exolyse der Enzyme ohne einen zu großen Überschuß
an Äther.
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Die Ätherbehandlung geschieht unter angemessener Bewegung und vorzugsweise
intermittierend in Perioden von 10 bis 20 Minuten Bewegung, gefolgt
von
10 bis 20 Nlinuten Ruhe während etwa 3 bis 6 Stunden.
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Zweckmäßig kann dies in einer Art Butterfaß in Form einer um- eine
Transversalachse rotierenden kleinen Tonne bewerkstelligt werden, in welcher Hilfsmittel
wie ein festes Gitter angebracht sind, die sich zur Zerkleinerung aller Agglomerate
eignen, wenn das Faß sich dreht.
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Während dieser Phase des Verfahrens lösen sich die Enzyme langsam
von den Zellen los (Exolyse).
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Man trennt hierauf den Äther ab, der die Lipide enthält, welche selbst
von Interesse sind. Durch Destillation kann man dann diese Lipide isolieren und
andererseits den lither zurückgewinnnen, der wieder eingesetzt werden kann.
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Der Hauptrückstand wird in eine Zentrifuge oder einen äquivalenten
Separator gebracht, die zur Trennung der drei Phasen, nämlich a) den Überschuß an
Äther, der die Lipide enthält, die, wie oben erwähnt, wiedergewinnbar sind, b) den
Pankreassaft und c) den Brei, geeignet sind.
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Wie bereits erwähnt, ist es wichtig, während aller dieser Arbeitsgänge
die zu behandelnden Produkte bei einer Temperatur zwischen etwa 15 und 250 C, vorzugsweise
bei etwa ls bis 220 C, zu halten.
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Die Ausbeute an Pankreassaft beträgt 3 bis 3,5 1 pro 12 kg verarbeitetem
Pankreas.
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Der Arbeitsgang der aufeinanderfolgenden Ammonsulfatfällungen gemäß
der Erfindung kann in folgender Weise ausgeführt werden: Man löst Ammonsulfat in
dem Pankreassaft in einem Mengenverhältnis von etwa 20 gil, wodurch eine Fällung
erhalten wird, die man abfiltriert.
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Man löst in dem Filtrat erneut etwa 20 g/l Ammonsulfat, wodurch eine
zweite Fällung erhalten wird, die man ebenfalls abfiltriert.
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Der gleiche Arbeitsgang wird in gleicher Weise bis zur Sättigung
wiederholt, d. h. bis das Ammonsulfat sich nicht mehr löst, praktisch etwa 25mal.
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Alle diese Arbeitsgänge werden vorzugsweise zwischen 15 und 250 C
und vorteilhaft bei etwa 200 C ausgeführt.
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Die erhaltenen einzelnen Fällungen besitzen alle enzymatische Eigenschaften;
sie können durch ihre enzymatische Wirksamkeit gekennzeichnet werden.
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Sie sind untereinander verschieden, und jedes besitzt therapeutischen
Wert.
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Gemäß der Erfindung werden diese Fällungen oder Fraktionen unterhalb
von 500 C, vorzugsweise im Vakuum, entwässert und in pulverisierter Form verwendet.
Die Endprodukte müssen sorgfältig vor Feuchtigkeit geschützt aufbewahrt werden.
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Zur Ausführung der Erfindung kann man Apparaturen verschiedener Art
verwenden.
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Vorteilhaft wird man jedoch die folgenden Apparate benutzen: a) zur
Ätherbehandlung eine kleine zylindrische Tonne, deren Höhe gleich ihrem Durchmesser
ist und
an deren Deckel ein Gitter aus ililetallstäben angebracht ist, das gegen
den Innenraum der kleineren Tonne gerichtet ist und sich auf zwei Drittel ihrer
Höhe erstreckt. Diese kleine Tonne wird in eine intermittierende (s. weiter oben)
Rotationsbewegung um eine Transversalachse (senkrecht zur Achse der kleinen Tonne)
mit einer Geschwindigkeit von 25 bis 28 Umdr./Min. versetzt. b) für die mechanische
Trennung der Brei-Flüssigkeits-Phasen ein Scheibenseparator des im Handel unter
dem Warenzeichen Alfa-Laval bekannten Typs oder eine Becherzentrifuge des im Handel
unter dem Namen )>Jouan« bekannten Typs.
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Diese Apparaturen arbeiten- unter direkter Trennung der drei Phasen
(Äther, Saft, Brei). Man kann sie entweder kontinuierlich bis zu einer Verstopfung
beschicken oder mit aufeinanderfolgenden Mengen entsprechend der Kapazität der Apparatur
arbeiten.
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Das oben beschriebene Verfahren ist besonders gut anwendbar bei Schweinepankreas,
der die Trennung von Produkten gestattet, die um so mehr Interesse besitzen, da
das Schwein ein Omnivor ist (Herbivor, in zweiter Linie Carnivor). Es versteht sich
von selbst, daß das Verfahren sich auch auf Pankreas anderer Tierarten anwenden
läßt, daß jedoch die Reihen der erhaltenen Produkte nicht unbedingt identisch oder
selbst vergleichbar sein werden.