DE1467773A1

DE1467773A1 - Polypeptid und Verfahren zur Herstellung desselben

Info

Publication number: DE1467773A1
Application number: DE19621467773
Authority: DE
Inventors: Bornstein Dr Joseph
Original assignee: BORNSTEIN DR JOSEPH
Current assignee: BORNSTEIN DR JOSEPH
Priority date: 1961-07-06
Filing date: 1962-06-29
Publication date: 1968-12-19
Also published as: US3201382A; GB974910A; FR3078M

Description

Beschreibung Polypeptid und Verfahren zur Herstellung desselben.
FUr diese Anmeldung wird die Priorität vom 6. Juli 1961 aus der USA-Patentanmeldung Serial No. 122 103 in Anspruch genommen.
Die Erfindung betrifft ein neues Polypeptid und ein Verfahren zur Herstellung desselben. Insbesondere bezieht sie sich auf ein einzigartiges, biochemisch aktives Polypeptid und ein Verfahren zur Herstellung dieses Produktes aus menschlichen oder tierischen Wuchshormonen und Präparaten, die solche Hormone enthalten.
Zweck der Brfindung ist die Schaffung eines neuen biochemisch aktiven Polypeptides. Ein weiterer Erfindungszweck ist die Schaffung von Verfahren zur Herstellung und Isolierung dieses aktiven Polypeptides.
Es wurde gefunden, dass tierische oder menschliche Wuchshormone sich in saurer Lösung zu einem Polypeptid hydrolysieren lassen, welches einzigartige biochemische Eigenschaften besitzt. Das erfindungsgemässe Verfahren kann durchgeführt werden, indem man entweder von gereinigten Präparaten von tierischem oder menschlichem Wuchshormon oder von anderen Präparaten ausgeht, die diese Wuchshormone enthalten, wie Hypophysendrüsen oder aus Hypophysendrüsen gewonnenen Fraktionen. So kann man tierische Sypophysendrüsen oder den in Aceton unlöslichen Teil von tierischen Eypoptysendrusen als Ausgangsstoffe für das erfindungsgemasse Verfahren einsetzen. Ebenso können andere unreine Konzentrate von Hypophysendrüsen oder stärker gereinigte Präparate, die das Wuchshormon enthalten, zur Herstellung des aktiven Polypeptids gemäss der Erfindung verwendet werden.
Zur Durchführung der Säurehydrolyse der die Wuchshormone enthaltenden Präparate werden diese Ausgangsstoffe bei pH-Werten zwischen etwa 1, 5 und 2, 5 hinreichend lange der Säurehydrolyse unterworfen, um eine teilweise Hydrolyse des Wuchshormons unter Bildung des gewünschten biochemisch aktiven Polypeptids herbeizuführen. Am einfachsten wird das Verfahren durchgeführt, indem man das Ausgangsgut für das Wuchshormon in enge Berührung mit Salzsäure bei einem pH-Wert zwischen 1, 5 und 2, 5 in einem wässrigen Lösungsmittel bringt. Es wurde gefunden, dass dieses Verfahren sich leicht in einem Extraktionslösungsmittel durchf³hren lõsst, welches aus 4 Raumteilen Äthanol, 0, 4 Raumteilen n-Butanol, 0, 4 Raumteilen Toluol und 1, 0 Raumteil Wasser besteht. Unter diesen Bedingungen der Säurehydrolyse ist das biochemisch aktive Polypeptid in dem Lösungsmittelgemisch unlöslich und lässt sich leicht durch Filtrieren gewinnen.
Das bei der Säurehydrolyse erzeugte aktive Polypeptid wird aus dem getrockneten Rückstand gewonnen, indem man diesen mit 0, 1-molarer Essigsäure extrahiert, den Essigsäureextrakt der Ultrafiltration unterwirft, das Ultrafiltrat durch ein in der Wasserstoffionenform befindliches Kationenaustauschharz hindurchleitet, un die Verunreinigungen daraus zu entfernen, die nicht-adsorbierten Stoffe durch Auswaschen der Ionenaustauscherolonne mit Wasser gewinnt, das aktive Produkt durch Zusatz eines Gemisches aus Äthanol und Äthyläther zu dem aus der Austauscherkolonne gewonnenen Eluat ausfällt, den Niederschlag gewinnt, den getrockneten Niederschlag in wenig Wasser lost, die Wasserstoffionenkonzentration dieser Lösung mit Ammoniak auf einen pH-Wert von etwa 8, 5 einstellt,diidabeientstehenden Niederschlag abfiltriert, eine genügende Menge eines Gemisches aus Äthanol und Athyläther zusetzt, um das gewünschte Polypeptid auszufällen, und den Niederschlag gewinnt und trocknet.
Die Verfahren zur Herstellung des biologisch aktiven Polypeptides und seiner Isolierung sind in den nachstehenden Beispielen erläutert.
Beispiel 1 Hypophysendrüsen von Schafen werden schnell mit 10 Raumteilen Aceton je Raumteil Drüsen vermischt, und das Unlösliche wird abfiltriert. Der Filterkuchen wird wieder in 10 Raumteilen Aceton suspendiert, 1 Stunde stark geruhrt und dann filtriert.
Hierauf wird der Kuchen mit einem Gemisch aus gleichen Raumteilen Äthanol und Äther gewaschen und an der Luft getrocknet.' 100 g des auf diese Weise erhaltenen getrockneten Schafshypophysendrüsenpulvers werden in 150 ml Extraktionslösungsmittel (4 Raumteile Äthanol, 0, 4 Raumteile n-Butanol, 0, 4 Raumteile schwefelfreies Toluol und 1'Raumteil Wasser) suspendiert und geruhrt. Die Suspension wird mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und 1 Stunde weiter gerdhrt.
Dann wird sie filtriert und der Rückstand wieder in 150 ml des gleichen Extraktionslosungsmittels suspendiert, der pH-Wert auf 2 eingestellt und die Suspension 1 Stunde gerührt. Die Suspension wird nochmals filtriert und das Extraktionsverfahren noch zweimal mit je 150 ml Extraktionslosungsmittel wiederholt. Die schliesslich erhaltenen filtrierten Feststoffe werden in wenig Extraktionslosungsmittel suspendiert, und der Brei wird 5 Stunden bei 37° C bebrütet. Der bebrdtete Brei wird unter vermindertem Druck getrocknet, um die letzten Spuren der Losungsmittel zu entfernen.
Der trockene Kuchen wird gepulvert und 30 Minuten mit 100 ml 0, 1-molarer Essigsäure extrahiert. Der Extrakt wird durch Filtrieren gewonnen. Der Filterkuchen wird mit weiteren 100 ml 0, 1-molarer Essigsäure ausgewaschen.
Die vereinigten Essigsdureextrakte werden dann in einem grossen Ultrafilter nach Graber bei einem Druck von 3, 16 kg/crn durch Cellophan filtriert, wobei man 180 ml Ultrafiltrat gewinnt.
Das Ultrafiltrat wird durch eine 40 cm lange, 5 cm weite Kolonne gegossen, die ein Kationenaustauschharz ("Amberlite IRC 120", ein mit 8 % Divinylbenzol vernetztes sulfoniertes Polystyrolharz) in der Wasserstoffionenform enthält. Das nicht adsorbierte Material wird durch Auswaschen der Kolonne mit Wasser gewonnen.
Die 300 ml des wässrigen Eluates. werden mit 10 Raumteilen eines trockenen Gemisches aus gleichen Raumteilen ~thanol und ~thylõther gemischt, worauf ein lederfarbenes Produkt ausfõllt.
Das Gemisch wird 16 Stunden auf 4° C gehalten, worauf der Niederschlag abzentrifugiert und unter vermindertem Druck getrocknet wird.
Das getrocknetelederfarbeneProdukt wird in der Mindestmenge an Wasser (etwa 20 ml) gelöst, mit verdunntem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8, 5 eingestellt und 16 Stunden bei 4° c stehen gelassen. Dann wird der Niederschlag auf einem groben Glasfrittenfilter abfiltriert.
Das Filtrat (16 ml) wird mit 10 Raumteilen eines trockenen Gemisches aus gleichen Raumteilen. ~thanol und Äthyläther versetzt und das Gemisch 16 Stunden stehen gelassen. Der weisse Niederschlag wird abzentrifugiert und getrocknet. Man erhõlt 23, 8 mg aktives Peptid.
Beispiel 2 1 g von Schafen gewonnenes Wuchshormon wird in 20 ml 0, 005-molarer Salzsäure geldst und die Lösung mit 110 ml Extraktionslösungsmittel (4 Raumteile Äthanol, 0, 4 Raumteile n-Butanol, 0, 4 Raumteile schwefelfreies Toluol und 1 Raumteil Wasser) versetzt. Dann wird der pH-Wert mit Salzsäure auf 2 eingestellt und das Gemisch 5 Stunden bei 24° C gerührt. Nach ; 20 Minuten beginnt die Bildung eines feinen Niederschlages, und nach etwa 5 Stunden scheint die Ausfällung vollständig zu sein.
Der Niederschlag wird abzentrifügiert, in der geringstmöglichen Menge an Extraktionalösungsmittel wieder suspendiert, auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und 5 Stunden bei 370 C bebrütet. Dann wird das überschüssige Extraktionslosungsmittel abzentrifugiert und der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet.
Der getrocknete Niederschlag wird in 25 ml 0, -molarer Essigssure gelöst und bei einem Druck von 3, 16 kg/cm2 durch Cellophan ultrafiltriert.
Das Ultrafiltrat wird durch eine mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Kationenaustauschharz beschickte Kolonne gegossen und das nicht adsorbierte Material durch Auswaschen mit Wasser gewonnen.
75 ml der so aus der Ionenaustauschkolonne erhaltenen wassrigen Lösung werden mit 10-Raumteilen eines Gemisches aus gleichen Raumteilen Äthanol und Athyläther versetzt, und das Gemisch wird 16 Stunden auf 4° 0 gehalten. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und unter vermindertem Druck getrocknet.
Der getrocknete Niederschlag wird in 2 ml Wasser gelöst, der pH-Wert mit Ammoniak auf 8, 5-eingestellt und die Löæung 16 Stunden bei 4° C aufbewahrt. Der Niederschlag wird'dann abzentrifugiert und verworfen.
Die überstehende Flüssigkeit, deren Volumen 1, 6 ml beträgt, wird mit 10 Raumteilen eines Gemisches aus gleichen Raumteilen Äthanol und ~thylõther versetzt und die L~sung dann 16 Stunden auf 4° C gehalten. Der erhaltene niederschlag,der aus dem biochemisch aktiven Polypeptid besteht, t, wird abzentrifugiert und getrocknet. Man erhält 14, 6 mg aktives Teptid in Form eines weissen Pulvers.
Das gemäss den vorstehenden Beispielen gewonnene biochemisch aktive Polypeptid ist durch die folgernden Eigenschaften ekennzeichnet : 1. Es ist ein elektrophoretisch homogenes Produkt mit einem Molekulargewicht zwischen 6600 und 8000.
2. Wenn es an stabilisierten erwachsenen (plateaued) weiblichen Ratten getestet wird, wirkt dieses erfindungsgemõss hergestellte Polypeptid als wachstumsfördernöesMittel.ZurDurchführung dieses Testes wurden Ratten in drei Gruppen zu je 8 Tieren eingeteilt. Der ersten Gruppe wurden 6 Tage lang tõglich 0,5 mg aktives Polypeptid dargereicht. Der zweitem Gruppe wordem 6 Tage lang täglich 0, ,5 mg des durch Wõrmeeinwirkung inaktivierten Polypeptids dargereicht. Der letzten Gruppe wurde 6 Tage lang täglich 1 ml Salzlosung dargereicht.AlleGruppen rupp en wurden tõglich gewogen. Nur diejenige Gruppe, an diedasaktive Polypeptid verabfolgt wurde (d. h. die erste Grappe) seigle eine Grdssen-und Gewichtszunahme.
3. Das aktibe Polypeptid erzeugt eine tibiale Epiphysenreaktion bei der Hypophysektomie unterworfenen weiblichen Ratten, @ untersucht nach in der Literatur beschriebehen Standardverfahren.
4. Das Polypeptid verursacht ausserdem die Oxydation von Glucose durch verschiedenesGewebe, was gemäss den von Bornstein und Hartman in "Nature", 176 176 (1955), Seite 788 beschriebenen Verfahren festgestellt wird.
5. Es beschleunigt die Einlagerung von C14-Aminosõuren in das Protein von Geweben, bestimmt nach den Verfahren von Manchester und Young, Biochemical Journal, 72 (1959), Seite 136.
6. Es beschleunigt die Verwertung Von Gluoose durch den Muskel.
7. Es beschleunigt die Glucoaeaufnahme durch das Rattendiaphragma, festgestellt nach dem Verfahren von Park und Mitarbeitern, Journal of Biological Chemistry, 195 (1952), Seite 197.
Das neue Peptid gemäss der Erfindung ist eine wertvolle, biochemisch aktive Verbindung, die zum Vergleich mit anderen biochemischen Stoffen verwendet werden kann. Ausserdem wirkt dieses Polypeptid, wie oben erwvahnt, als wachstumsf~rderndes Mittel für Tiere.

Claims

Patentansprüche Patentanspr³che 1. Aktives Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es elektrophoretisch homogen ist, ein Molekulargewicht zwischen etwa 6600 und 8000 aufweist, bei stabilisierten erwachsenen weiblichen Ratten Wachstum erzeugt, bei der Hypophysektomie unterworfenen weiblichen Ratten eine tibiale Epiphysenreaktion hervorbringt, die Verwertung von Glucose durch den Muskel beschleunigt, die Oxydation von C14-Glucose durch das Fettpolster beschleunigt und die Geschwindigkeit der Einlagerung von C14-Aminosäuren in das Muskelprotein und in das Protein des Nebenhodenfettpolsters beschleunigt.
2. Verfahren zur Herstellung eines biochemisch aktiven Polypeptides, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Wuohshormon der Säurehydrolyse bei einem pH-Wert zwischen etwa # 5 und 2, 5 unterwirft.
3. Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines biochemisch aktiven Polypeptides, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Wuchshormon der Sõurehydrolyse bei einem pH-Wert zwischen etwa 1, 5 und 2,5 in einem aus 4 Raumteilen Äthanol, 0, 4 Raumteilen Butanol, 0,4 Raumteilen Toluol und 1 Raumteil Wasser bestehenden Bxtraktionslösungsmittel unterwirft, die unlöslichen Anteile aus dem Extraktionslösungsmittel gewinnt und trocknet, die getrockneten unldslichen Anteile mit 0, 1-molarer Essigsäure extrahiert, die Essigsäureextrakte durch ein Ultrafilter filtriert, das Ultrafiltrat durch ein in der Wasserstoffionenform befindliches Kationenaustauschharz leitet, das nicht adsorbierte Material durch Auswaschen mit Wasser gewinnt, zu dieser wässrigen Lösung ein Gemisch aus Äthanol und Äthyläther in ausreichender Menge zusetzt, um das aktive Polypeptid auszufällen, den Niederschlag gewinnt und trocknet, den getrockneten Niederschlag in Wasser löst, den pH-Wert der Lösung mit Ammoniak auf 8, 5 einstellt, die Lösung filtriert, zu der filtrierten Lösung g ein Gemisch aus Äthanol und Äther zusetzt und den sich dabei bildenden Niederschlag von aktivem Polypeptid gewinnt und trocknet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff ein tierisches Wuohshormon verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man man als Ausgangsstoff mit Aceton extrahierte tierische Typophyaendrusen verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff menschliches Wuchshormon verwendet.
7. Verfahren zur Herstellung eines biochemisch aktiven Polypeptides, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Wuchshormon bei einem pH-Wert zwischen etwa 1, 5 und 2, 5 für eine ausreichende Zeitdauer der Säurehydrolyse e unterwirft, um eine teilweise Hydrolyse das Wuchshormons herbeizuf³hren.