DK163063B - Anvendelse af tarm-saltlage til fremstilling af heparin med hoej renhedsgrad - Google Patents

Description

i

DK 163063 B

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af tarm-saltlage til fremstilling af heparin med høj renhedsgrad.

Inden for medicinen har der længe stået et naturligt forekom-5 mende antikoaguleringsmiddel til rådighed i form af heparin, som også inden for den moderne medicin ligesom tidligere er uundværligt og får en stadig større anvendelse.

Inden for de sidste år er en række fremgangsmåder blevet 10 kendt, som alle har til formål at isolere det aktive stof heparin på stadig mere skånende måde udfra heparinholdige dyriske væv, såsom lunge, lever og i nyere tid først og fremmest fra tarmslim (Hucosa) hos svin, kvæg og får (GB-PS 754.885, DE-PS 1.228.241, US-PS 3.058.884, DE-PS 1.253.868). Sådanne 15 råstoffer har på grund af deres lette fordærvelighed den ulempe, at de har en begrænset lagringstid, som ganske vist kan forlænges ved hjælp af fysning, hvilket imidlertid foruden en yderligere teknisk indsats også fører til væsentlige omkostningsforøgelser. Ved oparbejdningen stilles såvel driftsperso-20 nalet som beboere i de tilgrænsende omgivelser ikke sjældent over for uantagelige problemer som følge af de dermed forbundne lugtgener.

I DE-PS 1.253.868 beskrives udvindingen af heparin sammenfat-25 tende for nogle sædvanlige fremgangsmåder. Ifølge disse bringer man det dyriske væv i berøring med en varm, vandig saltopløsning på begyndelsestrinet med henblik på at frigøre he-parinet fra cellerne. Heparinmængden i det derved fremkomne medium er yderst ringe.

30

Det har nu vist sig, at den saltlage, som fremkommer på slagterier og i tarmafslimningsvirksomheder, indeholder heparin.

Denne saltlage dannes, når man ved stuetemperatur lægger dyretarme, som forinden er blevet befriet for tarmslim, i kog-35 saltopløsninger med molær mætningsmængde kogsalt til konservering og afvanding.

DK 163063B

2

Det må derfor under hensyn til DE-PS 1.253.868 betegnes som overraskende, at den ved indlægning af dyriske tarme i kogsaltopløsning dannede saltlage indeholder større mængder heparin. Det kunne ikke forventes, at denne heparin foreligger næ-5 sten fuldstændig fri for kemisk beslægtede biprodukter, så at saltlage, som hidtil kun kendes som miljøforurenende affaldsprodukt, repræsenterer en hidtil ukendt råstofkilde for den som følge af råstofmangel allerede meget knappe heparin. På grund af den vidtgående udeblivelse af forureninger kan opar-10 bejdningen til råheparin foretages særlig skånende, og de ifølge teknikkens hidtidige stade kendte omstændelige isolationsmetoder bortfalder dermed (se US-PS 3.451.996 og GB-PS 1.221.784). Man opnår til slut hepari nkval iteter, som langt fra opnås i de på markedet til rådighed stående heparinpræpa-15 rater. De ifølge kendte oparbejdningsmetoder udfra ifølge opfindelsen benyttet tarm-saltlage som råstof isolerede råhepa-riner foreligger allerede i en sådan renhed, at den efterfølgende rensning fører til hepariner med langt over 200 USP-enheder/mg. De hidtil i handelen gående heparinpræparater har 20 i reglen heparin-kvaliteter på 150 USP-enheder/mg, i nogle få tilfælde også 155 USP-enheder/mg. Med en USP-enhed/mg forstår man den specifikke aktivitet, som opnås ved U.S.P.prøven, med hvilken hæmningen af dannelsen af småklumper af konserveret fåreplasma måles. En USP-enhed svarer til ca. 1,1 internatio-25 nåle enheder (IE). Da aktivitetsværdierne for de i handelen gående heparinpræparater på trods af talrige fremgangsmådeforbedringer stadigvæk er utilfredsstillende, foreskriver eksempelvis USP, at heparinpræparater (fra tarmslim) mindst skal indeholde 140 USP-enheder. Kun i laboratoriet er det hidtil 30 lykkedes L. W. Kananagh og L. B. Jaques [Arzneimittelforschung (Drug Res.) 24, nr. 12, 1942 (1974)] at isolere heparin ved hjælp af gentagen krystallisation som bariumsalt med maksimalt 175 USP-E/mg. 1

Til konservering og afvanding af dyretarme egner sig kogsaltopløsninger, hvis indhold af kogsalt andrager den molære mætningsmængde. Ved molær mætningsmængde forstår

DK 163063 B

3 man den molære mængde, som en koncentreret vandig opløsning ved stuetemperatur indeholder af opløst kogsalt på et slagteri. (En koncentreret vandig kogsaltopløsning er ca. 26,4%).

5 i reglen behandles de afslimede dyretarme i fra 2 timer til 3 dage med kogsaltopløsninger, som angivet i kravet. For det meste er behandlingen af dyretarmene imidlertid afsluttet efter 3-24 timer. Efter fjernelse af de konserverede og afvandede dyretarme fra kogsaltopløsningen opnår man en tarm-saltlage, der har et overraskende højt indhold af heparin.

Ved anvendelsen ifølge opfindelsen af sådanne tarm-saltlager som råstof lykkes det også i teknisk målestok at isolere heparin i en renhed, så at den næsten foreligger som farveløst ma-teriale. Alle hidtil udfra andre råstoffer opnåelige råhepari-ner skal derimod først affarves ved hjælp af omstændelige og tabgivende metoder (US-PS 3.179.566).

Tarm-saltlage er yderligere et lagringsegnet, næsten lugtløst 20 råstof, som under langvarig lagring ikke udsættes for kvalitetstab. Dermed bortfalder kemiske og andre konserveringsmetoder .

Opfindelsen angår således anvendelsen af tarm-saltlage, der er 2 S

blevet opnået ved nedlægning af for tarmslim befriede dyretarme i kogsaltopløsninger med molær mætningsmængde kogsalt ved rumtemperatur på et slagteri, til fremstilling af heparin med høj renhedsgrad.

30 Eksempel 1 600 1 saltlage opnået på den i kravet anførte måde blev i et 1500 1 røreværk ved stuetemperatur under omrøring i løbet af en halv time tilsat 600 1 methanol. Der blev efteromrørt i 35 samme tid, hvorefter blandingen henstod i ca. 1 time.

Derefter blev den uklare ovenstående væske dekanteret over i en anden beholder, og man lod de dannede saltkager bliver til-

DK 163063 B

4 bage. Den opnåede suspension lod man henstå i 2 dage. Derpå blev der atter dekanteret, den ovenstående væske blev bortkastet, og bundfaldet blev isoleret ved hjælp af centrifugering. Efter tørring i vakuum opnåede man 1,44 kg af et produkt, som 5 har ca. 10 USP-enheder/mg. Det består endnu for ca. 45% vedkommende af kogsalt. En aliquot af den således opnåede råhepa-rin svarende til ca. 425.000 USP-E eller 42,5 g blev ekstraheret tre gange, hver gang med 200 ml 2 M kogsaltopløsning, idet der blev om rørt i en time ved 60® C. De forenede ekstrakter 10 blev fortyndet med vand, indtil opløsningen indeholdt ca. 0,9 mol/1 chloridioner. Der blev nu tilsat 200 ml af en anionbyt-ter ("Lewatit® CA 9249") i chloridformen, og man omrørte i en time. Derpå blev der frasuget og eftervasket med ca. 200 ml 0,9 molær kogsaltopløsning. Ionbytteren blev derpå i 5 timer 15 omrørt med 2 molær kogsaltopløsning ved 40®C og derpå frasuget og eftervasket med 2 molær kogsaltopløsning. Elueringsopløs-ningen blev forenet med vaskeopløsningen og fældet med et 1,5 gange så stort volumen methanol. Bundfaldet blev centrifugeret fra, eftervasket først med ca. 50 ml vand-methanol (1 + 1,5 20 volumendele) og derpå med ca. 50 ml methanol, samt tørret.

Man opnåede 198 g Na-heparinat med 195 USP-enheder pr. mg.

15,5 g af et på den ovenfor beskrevne måde opnået Na-hepari-25 nat med ca, 200 USP-enheder pr. mg blev opløst i 200 ml 2 molær kogsaltopløsning. Opløsningen blev suget gennem et filtreringsapparat, og resten blev vasket først med 30 ml 2 molær kogsaltopløsning og derefter med ca. 250 ml helt afsaltet vand. De forenede opløsninger blev derpå indstillet på en 30 chloridmolaritet på 0,9 med helt afsaltet vand. Derefter blev som ovenfor anført rensningen med en liter "Lewatit® CA 9249" gentaget.

Den forenede eluerings- og vaskeopløsning blev videreforarbej-35 det som ovenfor anført. Efter vaskning og tørring af det udfældede materiale opnåede man 11,2 g natriumheparinat, som havde en aktivitet på 251 USP-enheder pr. mg.

DK 163063 B

5

Eksempel 2 I lighed med det i britisk patentskrift nr. 754.885 anførte blev 3 liter saltlage opnået på den i kravet anførte måde under omrøring syrnet med eddikesyre til pH 3,1-3,2 (ca. 50 ml).

5 Efter nogle timer blev der dekanteret, og resten blev centrifugeret. Det udfældede materiale blev bortkastet, og de forenede opløsninger blev neutraliseret med natronlud.

Under omrøring tilsattes langsomt det samme volumen methanol.

10 Efter 45 minutter blev der dekanteret fra udfældet kogsalt. Denne suspension lod man henstå i flere timer, dekanterede den ovenstående væske fra og centrifugerede resten. Det udfældede materiale blev tørret i vakuum. Man opnåede 3,43 g med 21 USP-enheder/mg. En aliquot af den således opnåede råheparin sva-15 rende til ca. 425.000 USP-E eller 20,2 g blev renset analogt med det i eksempel 1 anførte. Man opnåede 10,65 g natriumhepa-rinat med en aktivitet på 262 USP-enheder pr. mg.

Eksempel 3 20 3 1 saltlage opnået på den i kravet anførte måde blev fortyndet med 12 1 vand til en chloridmolaritet på ca. 0,85 M. Derpå tilsattes 50 g kiselgur samt en opløsning af 6 g benzethonium-chlorid («"Hyamin 1622", Rohm & Haas) i 100 ml vand. Efter 25 nogle timer blev der dekanteret, og resten blev frasuget. Efter vaskning med vand blev det endnu fugtige bundfald ekstraheret tre gange i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge tysk patentskrift nr. 1.228.241, hver gang med 200 ml 2 molær kogsaltopløsning. De forenede ekstrakter blev fældet med 2 30 volumendele methanol. Det isolerede og tørrede bundfald vejede 465 mg og havde en aktivitet på 155 USP-enheder/mg.

Eksempel 4 35 30 liter saltlage opnået på den i kravet anførte måde blev

fortyndet med 120 1 vand til en chloridmolaritet på ca. 0,85 M

DK 163063 B

6 (se DE-PS 1.156.938). Derpå syrnedes med eddikesyre (ca. 50 ml) til pH 3,2. Efter nogle timer havde en 'udfældning afsat sig, hvilken udfældning blev fracentrifugeret efter fradekan-tering af den klare ovenstående væske. Efter tørring opnåede man 111 g råheparin med 6,5 USP-enheder/mg. En aliquot af den 5 således opnåede råheparin svarende til 425.000 USP-enheder eller 65,6 g blev til at begynde med renset. Efter det første rensningstrin over ionbytter opnåede man 196 g Na-heparinat med 198 USP-E pr. mg.

10 15 g af et på den ovenfor beskrevne måde opnået natriumhepari-nat med ca. 200 USP-enheder pr. mg blev opløs i 200 ml 2 normal calciumchloridopløsning. Opløsningen blev suget gennem et filtreringsapparat, og resten blev først vasket med 30 ml 2 normal calciumchloridopløsning og derpå med ca. 250 ml fuldstændig afsaltet vand. De forenede opløsninger blev derpå indstillet på en chloridmolaritet på 0,9 med fuldstændig afsaltet vand. Derefter blev der som ovenfor anført omrørt med en liter "Lewatit® CA 9249”. Elueringen og eftervaskningen blev gennem-20 ført med 2 normal calciumchloridopløsning i stedet for kog saltopløsning.

Den forenede eluerings- og vaskeopløsning blev videreforarbej-det som ovenfor anført. Efter vaskning og tørring af det ud-25 fældede materiale opnåede man 10,7 g calciumheparinat, der havde en aktivitet på 260 USP-enheder pr. mg.

Eksempel 5 30 10 1 saltlage opnået på den i kravet anførte måde blev fortyn det til en chloridmolaritet på ca. 0,85 med 40 liter vand. Denne opløsning blev pumpet gennem et filter via en ionbytter-søjle med en diameter på 26 mm og en længde på 380 mm (ca. 3 1 iter/time). Der blev benyttet en middelbasisk, makroporøs an-32 ionbytterharpiks i CT-formen ("Lewatit® CA 9249"). Der kan også anvendes andre ionbytterharpikser, såsom den i tysk patentskrift nr. 1.253.868 beskrevne "Dowex® 1-X-l".

Claims (1)

1. DK 163063 B Til slut blev harpiksen fjernet fra søjlen, vasket med 500 ml 0,9 molær kogsaltopløsning samt elueret med 400 ml 2 molær kogsaltopløsning i 5 timer ved 40*C under omrøring. Denne opløsning blev fældet med 1,5 volumendele methanol. Det isolerede og tørrede bundfald vejede 1,2 g og indeholdt 149 USP-enhe-5 der/mg. Patentkrav. 10 ____________________ Anvendelsen af tarm-saltlage, som er opnået ved nedlægning af for tarmslim befriede dyretarme i kogsaltopløsninger med molær mætningsmængde kogsalt ved stuetemperatur på et slagteri, til fremstilling af heparin med høj renhedsgrad. 20 25 1 35