PL162607B1 - Sposób wydzielania heparyny z roztworów wodnych PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wydzielania heparyny z roztworów wodnych lub solankowych uzyskanych ze sluzu organów zwierzecych, na drodze sorpcji heparyny z tych roztworów na zywicach jonowymiennych a nastepnie desorpcji za pomoca stezonych roztworów soli i wytracanie heparyny z eluatu alkoholem alifatycznym, znamienny tym, ze roztwór wodno-solankowy zawierajacy heparyne doprowadza sie do zawartosci soli nie wiekszej niz 9%, zakwasza sie do pH roztworu ponizej 5, korzystnie ponizej 3, po czym otrzymany roztwór kontaktuje sie ze slabo zasadowym wymieniaczem jonowym z zablokowana grupa funkcyjna kwasem mineralnym, zasorbowana na jonicie heparyne desorbuje sie i wydziela z eluatu w znany sposób. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wydzielania heparyny z wodnych lub solankowych roztworów uzyskanych przez ekstrakcję tej substancji ze śluzu znajdującego się w organach zwierzęcych, głównie w płucach i jelitach wołowych lub wieprzowych.

Heparyna jest mieszaniną wielosiarczanów mukopolisacharydów o średniej masie cząsteczkowej około 16000. Cechą charakterystyczną heparyny jest obecność siarki, która może występować jako ugrupowanie sulfonoamidowe lub jako ester kwasu siarkowego. Heparyna znajduje szerokie zastosowanie w lecznictwie jako preparat hamujący krzepliwość krwi. Wytwarzanie heparyny składa się w zasadzie z dwóch etapów produkcyjnych. Pierwszym etapem jest wydobycie heparyny z organów zwierzęcych i przeprowadzenie jej do roztworu wodnego. Istnieją różne modyfikacje tych metod. Ogólnie polegają one na krótszym lub dłuższym moczeniu świeżych lub mrożonych organów zwierzęcych w wodnych roztworach soli. Przeważnie stosowany jest roztwór chlorku sodowego w różnych stężeniach, często z dodatkiem innych soli, np. z chlorkiem wapniowym, najczęściej w środowisku alkalicznym. Ekstrakcja heparyny przeprowadzana jest w różnej temperaturze i w różnym czasie.

Drugi etap polega na wydzielaniu heparyny z roztworu w formie surowego produktu suchego. Ten etap produkcji jest najtrudniejszy, ponieważ heparyna znajduje się w ekstrakcie wodnym w bardzo małym stężeniu, najczęściej 1-2 mg/cm3. Przy tak małym stężeniu osiągnięcie dużej wydajności wydzielania jest bardzo trudne. Większość stosowanych obecnie metod wydzielania w skali przemysłowej polega na wytrącaniu heparyny z ekstraktu w postaci nierozpuszczalnych związków kompleksowych, które odsącza się od roztworu i przerabia dalej różnymi metodami. Najczęściej stosowana metoda polega na tym, że płuca lub śluz jelitowy, wołowy lub wieprzowy ekstrahuje się 20% wodnym roztworem chlorku sodowego z dodatkiem około 0,5% chlorku wapniowego i 0,5% wodorotlenku sodowego. Ekstrakcję prowadzi się w temperaturze 60’C, następnie krótko ogrzewa się do 90°C, co powoduje wytrącenie białka, po czym roztwór odsącza się. Przesącz zakwasza się do pH 2 i ponownie sączy się. Uzyskany ekstrakt, zawierający przeciętnie około 80 j/cm3 heparyny, rozcieńcza się czterokrotnie ciepłą wodą i dodaje wyliczoną ilość bromku laurylopirydyniowego (patent polski nr 61 042), który tworzy z heparyną nierozpuszczalny osad. Osad odsącza się i powtórnie rozpuszcza się w nie162 607 wielkiej ilości stężonego roztworu NaCl. Dalej prowadzi się odbarwianie i odpirogenianie, a następnie wytrąca się heparynę metanolem. Ostatecznie uzyskuje się heparynę z wydajnością około 70% tej ilości, która znajdowała się w ekstrakcie. Główną wadą tej i innych podobnych metod jest duża ilość operacji oraz znaczna strata heparyny w kolejno przeprowadzanych operacjach .

Z polskiego opisu patentowego nr 10B 607 i opisu dodatkowego patentu nr 117 279 znany jest sposób otrzymywania heparyny z surowca jakim jest laka solna, powstająca wtedy gdy jelita zwierzęce pozbawione uprzednio śluzu jelitowego wprowadza się do roztworów soli kuchennej lub posypuje się solą kuchenną. Lakę solną ewentualnie rozcieńcza się wodą i kontaktuje z jonitem średnio zasadowym w formie chlorkowej. Desorpcję heparyny z jonitu prowadzi się roztworem soli kuchennej (około 11,6%) a następnie z eluatu ekstrahuje heparynę za pomocą metanolu.

Z opisu patentowego RFN nr 1 253 868 znany jest sposób wydzielania heparyny z błony śluzowej z roztworu wodno-solankkwweg, zwłaszcza) cciorku amoooweeg, przez kontaktowanie roztworu z żywicą joowoymienną przy pH 7-9, następnie desorpcję heparyny wodnym kowtwokeo soli o stężeniu oUoao 11-20%. Z uzyskanych rowtwokóo leparyowowsswlnych wytrąca się heparynę za pomocą alkoholu. Nieoczekiwanie okazało się, że można uzyskać heparynę z wydajnością do 98% i o aktywności średnio 150 j/mg ze śluzu znajdującego się w organach zwierzęcych, głównie w płucach i jelitach, uww:t^n^^o jako odpad o dużym zwnkeczwyzwzweku. Sposób ten polega na zastosowaniu metody seleUtywnej sor-pcji heparyny z Γk-Zwo-kó woOdozh lub oolαnUowych na słabo zasadowych oyoieniazwazh jwnowycl z wabaokowaną grupą funkcyjną kwasem mineralnym.

Stoiekdzokw, że skuteczność sorpcji ^arznyy z owt0wkuu mleZy w ddżż^ sZowPku od stężenia soli w kowtwwrwe wodnym, kwasowości rwwtworw i rodzaju sorbeota. Skuteczność zorpzji osO-ji wraz ze ozrostlo stężenia soli. Jednakże spadek skutezwowśzi kie jest wprost propwrcjonaanz do wzrostu stężenia ooli. Największą skuteczność sorpcji heparyny stwierdzono z czystej wody, następnie w miarę wzrostu stężenia soli skuteczność spada nieznszzoil aż do osiągnięcia stężenia około 9%. Wówczas spadek skuteczności jest gosatwwoy. Przy stężeniu wkwaw 20% swkpcJs heparyny praktycznie oie występuje.

Podobnii stwilrnwwnw zależność od kossowwści roztooku. Skuteczność oorpzei spada w miarę podwyższania się pH kwwtwwru. Sorpcja przebiega osJkokwyztnilj przy niskim pH a wyraźnie spada powyżej pH 7. Do owrpcei heparyny nadają się przede wszystkim słabo alkaliczni wymieniscwl jokowl w formie wαbaokowαoej kwasem οιοι^Οοζο. Aoiooitz silnii i średnio zasadowe sorbują gorzej a ponadto występują duże trudności przy desorpcji heparyny.

Sposobem według wynalazku roztwór ownow-solsokwoy doprowadza się do zawartości soli nie większej niż 9% oraz koryguje pH kowtowku poniżej 5, korzystnie poniżej 3, po czym otrzymany roztwór kontaktuje się ze słabo zasadowym wzoiloisczeo jonowym z zsblwkowsoą grupą funkcyjną kwasem mineralnym. Zsoorbwwsoą heparynę nezokbuje się z ewoitu w znany sposób za pomocą oonolgw ztęywolgw rwztooku soOi. Pr-zlz swkpzji i dlzwkpzji korzystnie jest resaiwoosć w układzie koluoowwzo, w jednej lub w dwóch kolumnach wyplaoioozzl jooitlo i poaązzoozzl zwlrlgwoo. Można też kontaktować wyjściowy roztwór heparyny z soiooitlo w zbiorniku z oilzzsdaeo. Po proclzil desorpcji z uzyskanych stężonych iiusIów hlpskzowoo-zoasokwwych oznzills się heparynę w znany sposób. Korwzztoil eluaty rwwzilńzwa się dou-zztlrws krotną ilością alkwhwlu alifatycznego a wytrąconą heparynę przemywa i suszy.

Sposób według wynalazku jest bardzo pkwztz i efektywny, gdyż uzyskuje się dzięki niemu z odpadu ponad stokrotne zalężenie rwwto-kóo heparyny, z których wytrąca się oαezwęśs ciej sól swnwoą heparyny w postaci stałej substancji o dość oyswkilj cwzztwści.

162 607

Przykład I. W przykładzie użyto wodny roztwór heparyny uzyskany przez ekstrakcję wołowego śluzu jelitowego wodnym roztworem soli o zawartości około 20% NaCl i 0,5% CaCL·,. Po przeprowadzeniu ekstrakcji roztwór zakwaszono i odsączono wydzielony osad.

^L j

Otrzymany roztwór zawierał 21% chlorku sodowego, 0,6% chlorku wapniowego, 110 j/cm heparyny oraz niezidentyfikowane zanieczyszczenia organiczne i nieorganiczne, które przeszły do roztworu w trakcie ekstrakcji. Roztwór ten rozcieńczono wodą do zawartości około 7% soli oraz zakwaszono do pH około 0,8; zawierał on wówczas 36 j/cm⁵ heparyny. Tak przygotowany roztwór przepuszczano przez układ dwóch kolumn pracujących szeregowo wypełnionych słabo zasadowym wymieniaczem jonowym typu żelazowego w formie chlorkowej, o nazwie handlowej Amberlit IRA-68. Roztwór dozowano od góry na kolumnę pracującą jako pierwsza w szeregu. Wyciek z kolumny pierwszej kierowany był na górę kolumny drugiej a wyciek z kolumny drugiej, pozbawiony całkowicie heparyny, traktowany był jako odpad. Roztwór przepuszczano przez kolumny z prędkością 20 objętości na objętość sorbentu w jednej kolumnie na godzinę (obj/ /obj/h). Roztwór przepuszczano tak długo, aż w wycieku po kolumnie pierwszej stwierdzono obecność heparyny w ilości 20 j/cm3. Ogółem przez kolumny przepuszczono 1100 objętości roztworu licząc na objętość sorbentu w jednej kolumnie. Następnie kolumnę pracującą jako pierwsza odłączono i poddano procesowi desorpcji w celu odzyskania zasorbowanej heparyny. Desorpcję heparyny przeprowadzano przepuszczając przez kolumnę, pracującą jako pierwsza, 20% wodny roztwór chlorku sodowego o pH 5,3. Roztwór przepuszczano od góry kolumny. Po odebraniu około 0,5 objętości wycieku, licząc na objętość sorbentu w kolumnie, rozpoczęto odbierać frakcję główną. Po odebraniu 4,5 objętości wycieku, proces desorpcji przerwano. 5orbent przemyto czystą wodą, przygotowując w ten sposób do następnego cyklu sorpcji. Uzyskano około 4,5 objętości eluatu o zawartości około 20% NaCl i około 5000 j/cm⁵ heparyny. Uzyskano więc około 140-krotne zatężenie w stosunku do użytego roztworu wyjściowego. Uzyskany eluat rozcieńczono metanolem w stosunku 1:1, przy ciągłym mieszaniu. Wytrącił się biały, krystaliczny osad soli sodowej heparyny, który po przemyciu metanolem i wysuszeniu posiadał aktywność 147 jednostek na miligram (147 j/mg). Jest to bardzo duża czystość preparatu.

W przykładzie uzyskano wydajność wydzielania 96,5% w stosunku do ilości heparyny w roztworze wyjściowym.

Przykład II. W przykładzie użyto ten sam roztwór heparyny i postępowano jak w przykładzie I z tą różnicą, że roztwór wyjściowy rozcieńczono wodą do zawartości około 4,5% soli oraz zakwaszono stężonym kwasem siarkowym do pH 1,5. Ilość heparyny w roztworze wynosiła wówczas około 27 j/cm⁵. Roztwór ten przepuszczano przez kolumny w sposób identyczny jak w przykładzie I. Obsadzenie kolumny pracującej jako pierwsza osiągnięto po przepuszczeniu 1600 objętości roztworu. Desorpcję heparyny oraz jej wydzielanie z eluatów przeprowadzono identycznie jak w przykładzie I uzyskując podobne wyniki.

Przykład III . W przykładzie użyto ekstrakt wodny heparyny zawierający 8% (NH^^SO^ 6% NaCl oraz 0,4% CaCl₂. Ekstrakt zawierał 125 j/cm5 heparyny, który rozcieńczono wodą w stosunku 1:4. Następnie roztwór zakwaszono kwasem siarkowym do pH 1,5. Uzyskany roztwór przepuszczano przez kolumny podobnie jak w przykładzie I z tą różnicą, że kolumny te wypełnione były słabo zasadowym anionitem w formie siarczanowej o strukturze makroporowatej, o nazwie handlowej Wofatyt AD-41. Po przepuszczeniu przez kolumny 900 objętości roztworu stwierdzono przebicie kolumny pracującej jako pierwsza. Desorpcję heparyny przeprowadzano podobnie jak w przykładzie I z tą różnicą, że zamiast 20% roztworu wodnego NaCl, stosowano 15% roztwór Na2SO. . Dla uzyskania pełnej desorpcji przepuszczono 5,5 objętości i 4 5 eluenta. Uzyskano eluat zawierający około 4000 j/cm heparyny. Heparynę krystaliczną wydzielano przez rozcieńczenie eluatu alkoholem etylowym w stosunku 1:2. Po wysuszeniu uzyskano preparat o aktywności 152 j/mg z wydajnością 95,6%.

162 607

Przykład IV. W przykładzie użyto ekstrakt wodny heparyny taki sam jak w przy kładzie I. Roztwór ten rozcieńczono wodą do zawartości około 7% soli i zakwaszono kwasem siarkowym, podobnie jak w przykładzie I, do pH 0,E. Roztwór ten wlano do mieszalnika z mieszadłem mechanicznym i następnie wsypano Amberlit IRA-68 w formie siarczanowej w ilości 1 dcm⁵ jonitu na 15 dcm⁵ roztworu. Uruchomiono mieszadło i ciecz z sorbentem mieszano w ciągu 5 minut, po czym sorbent odsączono. Do przesączonego roztworu wsypano ponownie taką samą porcję sorbentu i po wymieszaniu również odsączono. W przesączu drugim stwierdzono zaledwie śladowe ilości heparyny. Sorbent odsączony po pierwszym mieszaniu poddano desorpcji heparyny a sorbent z drugiego mieszania użyto, bez desorpcji, do sorpcji heparyny w następnej partii cieczy. Desorpcję heparyny z sorbentu po pierwszym mieszaniu przeprowadzono wlewając 25% wodny roztwór chlorku sodowego o pH 8 w takiej ilości aby uzyskać całkowite zalanie.sorbentu. Sorbent zalany roztworem solanki przetrzymywano przez 6 godzin, po czym ciecz odsączono. Pozostały po odsączeniu sorbent zalano powtórnie roztworem solanki i znów przetrzymywano przez około 6 godzin. Solankę z drugiego sączenia użyto jako pierwszą porcję przy następnej desorpcji. Sorbent po dwukrotnym przemyciu solanką nie zawierał praktycznie heparyny i został użyty do kolejnego cyklu sorpcji. Solanka po pierwszej desorp cji zawierała heparynę w ilości 50-krotnie większej niż w roztworze wyjściowym. Z roztworu tego wytrącono heparynę alkoholem metylowym w sposób podobny jak w przykładzie I. Uzyskano preparat o aktywności 118 j/mg z wydajnością 95,25.

Przykład V. W przykładzie użyto ekstrakt wodny heparyny taki jak w przykładzie 1. Roztwór rozcieńczono wodą do zawartości 8% chlorku sodu i zakwaszono kwasem solnym do pH 4,5. Uzyskany roztwór przepuszczano przez kolumny zawierające sorbent żelazowy w formie chlorkowej o nazwie Amberlit IRA-68 w sposób identyczny jak w przykładzie I. Dalej postępowano podczas sorpcji i desorpcji jak w przykładzie I. Uzyskano wydajność wydzielania 95,1% w stosunku do ilości heparyny w roztworze wyjściowym. Aktywność preparatu wynosiła 147 j/mg.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wydzielania heparyny z roztworów wodnych lub solankowych uzyskanych ze śluzu organów zwierzęcych, na drodze sorpcji heparyny z tych roztworów na żywicach jonowymiennych a następnie desorpcji za pomocą stężonych roztworów soli i wytrącanie heparyny z eluatu alkoholem alifatycznym, znamienny tym, że roztwór wodno-solankowy zawierający heparynę doprowadza się do zawartości soli nie większej niż 9%, zakwasza się do pH roztworu poniżej 5, korzystnie poniżej 3, po czym otrzymany roztwór kontaktuje się ze słabo zasadowym wymieniaczem jonowym z zablokowaną grupą funkcyjną kwasem mineralnym, zasorbowaną na jonicie heparynę desorbuje się i wydziela z eluatu w znany sposób.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces sorpcji i desorpcji prowadzi się w jednej łub w dwóch kolumnach wypełnionych jonitem i połączonych szeregowo.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, 2e wyjściowy roztwór heparyny skorygowany do zawartości soli poniżej 9% i pH poniżej 5, miesza się z jonitem, następnie odsącza jonit zawierający heparynę i przemywa wodnym, stężonym roztworem soli, po czym z przesączu uzyskuje heparynę w znany sposób.