CN101851285B - 硫酸糖肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

硫酸糖肽的制备方法，以糖肽成分为原料与磺化剂经酯化反应生成，其中以氯磺酸为磺化剂，先在将氯磺酸与吡啶混合反应制备得到酯化试剂，然后再将糖肽成分与该酯化试剂混合进行酯化反应。该方法可以在无需苛刻的低温反应条件和繁杂的后续处理条件下，得到具有更好硫酸酯化效果的产品。

Description

硫酸糖肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种硫酸糖肽的制备方法。

背景技术

硫酸糖肽(sulglycotide)属于一种经硫酸酯化修饰后的多糖肽。其基本制备过程，是先经一系列的蛋白水解作用由猪十二指肠粘蛋白或者胃粘膜提取得到糖肽，再以硫酸酯基团修饰碳链后得到的硫酸酯多糖蛋白即硫酸糖肽，分子量约900,000～1,000,000D。因其能具有显著抑制胃蛋白酶，而不影响胃液量和胃液酸度的功效，目前医疗上已将其用于对胃、十二指肠溃疡和胃炎的治疗，是用于胃及胃粘膜溃疡治疗的有力的胃保护剂。现有的研究报道显示，作为一种细胞保护因子，硫酸糖肽在治疗溃疡中表现出来的有益作用包括刺激碳酸氢盐的分泌，阻止胃粘膜层的腐蚀，护胃粘膜生长因子免受幽门螺旋杆菌的降解，以及促进内源前列腺素分泌水平的增加。此外，硫酸糖肽像其他胃保护剂一样可以提升粘膜生长因子的功效，同时影响调控细胞循环过程并与细胞增殖相关的细胞循环调节蛋白的表达，其还可以减轻阿司匹林等刺激性较强的药物对胃粘膜的伤害。

硫酸糖肽作为一种经硫酸酯化而得到的多糖肽物质，其制备研究的重点在于硫酸酯化的方法。但目前对于糖肽的硫酸酯化研究很少，而对多糖的硫酸酯化研究则较多。经硫酸酯化后的多糖为硫酸酯多糖或称多糖硫酸酯，其结构是硫酸根与糖羟基化学结合成键，其中与糖1位羟基成键的称为硫酸糖苷键。目前对硫酸酯多糖的研究，涉及了包括从动、植物中提取的各种硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸衍生物及人工合成、半合成的各种硫酸多糖，如硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖、硫酸木聚糖、硫酸香菇多糖、岩藻依聚糖、卡拉胶硫酸软骨素等。目前已有文献报道的用于对多糖类化合物进行硫酸酯化反应，多以硫酸、发烟硫酸、硫磺酸或者三氧化硫、氯磺酸等作为提供硫酸根的磺化试剂，通过如氯磺酸-吡啶法、浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法以及氯磺酸甲酰胺法等不同类型的方法进行。其中以氯磺酸-吡啶法操作简便易行，重现性好，收率高，故文献多采用此种方法。

糖蛋白属于一类复合糖或缀合蛋白质，在蛋白酶的作用下，糖蛋白可水解为糖肽，糖肽(plycopeptide)是糖和肽共价键合的物质。由猪十二指肠或胃粘膜提取得到的糖肽中，一般含有40～50％己糖胺，27～31％己糖，4～6％氨基酸衍生物，13～18％氨基酸，以及大量游离的硫、磷、脲酸等，沸点为100～200℃。目前对硫酸糖肽的制备，多是借鉴对多糖的硫酸酯化方法，以糖肽原料与相应的磺化试剂进行硫酸酯化反应。例如，借鉴用于硫酸酯多糖制备的氯磺酸-吡啶方法，通常是在-40～0℃的低温条件下进行酯化反应，得到糖肽的硫化物，再用碱成盐后得到最终产品。该产品酯化反应的关键在于硫化程度，一般情况下多采用4～8小时的长时间反应。其中，目前常用方法可如氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-二甲基甲酰胺法、哌啶-N-磺酸-二甲亚砜法、三氧化硫-吡啶法等用于人工合成硫酸酯化多糖的方法，基本原理都是使糖肽结构中的多糖与相应的硫酸酯化试剂在一定的条件下反应，使得单糖残基上的某些羟基接上硫酸基团。其中以糖肽与氯磺酸在无水吡啶中进行酯化反应的效果为更好。反应结束后产品不溶于吡啶，可采用过滤手段得到产品，而其中的杂质的去除则通过透析或者采用离子交换树脂处理其水溶液，最后用氢氧化钠成盐，并可通过以丙酮、甲醇等适当溶剂沉淀的后续处理，得到最终产品并提高其硫化程度。

已有研究报道，硫酸糖肽的药效作用主要缘于其中的亚硫基，而硫酸糖肽中的S就是以亚硫基的形式存在的，因此硫酸糖肽中硫的含量即等同于亚硫酰基的含量，含量越高，即硫酸糖肽的硫酸酯化程度越高，产品的药效越强(Mirelli E et.“preliminary clinicalresearch on a new anti-ulcer drug”，《Clin Ter》1979 May 31；89(4)：365-71)。

但以上述的氯磺酸-吡啶法为例，目前对糖肽与氯磺酸在无水吡啶中进行酯化反应的操作，都采用的是将糖肽原料与氯磺酸及溶剂吡啶一并直接混合的方式进行反应。由于氯磺酸与吡啶的反应会产生大量的热，为避免因局部温度过高糖肽而使原料受到破坏，通常需将反应温度控制在十分苛刻的-15℃～-40℃低温条件下进行。但另一方面，作为反应溶剂的吡啶在此低温条件下也为固态，难以起到使反应原料充分分散和接触的作用，因而收进影响了硫酸糖肽产品的收率及其硫含量的提高，例如，目前方法制备得到的硫酸糖肽如果不经过后续繁杂的处理，其硫含量一般只有3～4％左右。

发明内容

针对上述情况，本发明将提供一种硫酸糖肽的制备方法，使其可以在无需苛刻的低温反应条件和繁杂的后续处理条件下，得到具有更好硫酸酯化效果的硫酸糖肽产品。

本发明的硫酸糖肽制备方法，采用的是以糖肽成分为原料和以氯磺酸为磺化剂，经酯化反应后生成得到。其中，先在不高于室温、特别是不高于6℃的条件下将氯磺酸加入吡啶充分混合反应制备得到酯化试剂，然后再将糖肽成分与该酯化试剂混合进行酯化反应。所说的糖肽成分为原料，可以为直接由猪十二指肠或者胃粘膜提取得到的糖肽，优点是其中的酯化有效成分含量较高。也可以采用由市售的肠多糖产品为原料，因其中可能添加有一定比例的医药产品中允许使用的常用辅料，因此酯化的有效成分含量可能会相对较低。

由于氯磺酸与吡啶的反应是一个大量释放热的反应，因此在上述第一步的酯化试剂制备时，降低温度不仅有利于反应的顺利进行，也有利于对反应的控制和提高操作的安全性。虽然尽量降低温度是更可取的，但试验结果显示，将反应温度控制在不高于室温，特别是不高于6℃的条件下，对多方面综合因素都是较为有利的。

本发明上述制备方法中所说的由糖肽成分与已制备得到的酯化试剂进行的酯化反应同样可以在50℃～80℃条件下进行，并且以70℃为佳。

本发明上述糖肽与酯化试剂的酯化反应，可以在吡啶或甲酰胺类溶剂等已有反应介质中进行。试验结果显示，其中采用甲酰胺类溶剂为佳，如甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-乙基甲酰胺等不同的甲酰胺类溶剂，其中特别优选的反应介质溶剂是以甲酰胺。一般情况下，可以采用先将糖肽成分溶于甲酰胺类溶剂中后，再与酯化试剂混合进行酯化反应。由于硫酸糖肽制备过程中的硫酸酯化反应能否进行得充分，取决于糖肽原料与酯化试剂间的充分分散和接触，大量的试验结果表明，甲酰胺类化合物是化学和热稳定性较好的优良有机溶剂，通过其使反应物的充分分散、溶解和对酯化试剂的络合，可以显著提高酯化反应速度和有利于酯化反应的充分进行。

上述的酯化反应完成后，可以按目前已有方式进行除杂、纯化等后续处理，例如，酯化反应完成后，冷却并加入碱中和成盐，向其水溶液中加入水溶性有机溶剂使产物充分沉淀并收集，以除去水溶性杂质。对水溶性杂质的去除可通过对产物的水溶液进行透析、离子交换树脂处理、超滤等方式进行。根据需要，这一水溶解-有机溶剂沉淀方式的除杂质纯化处理操作可以多次重复，以使产品纯化和提高其硫化程度。用于使产物由其水溶液中沉淀析出的所说水溶性有机溶剂，可以选择使用如C_1-3的醇、丙酮、DMF、THF、DMSO等常用的有机溶剂。加入所说有机溶剂前还可在不高于100℃条件下对水溶液进行适当浓缩试验显示，其中酯化反应完成后，冷却并加碱中和成盐时优选在pH6-8的中性条件下进行，所用的碱尤以常用且不会引入过多的杂质成分的NaOH最为优选。用有机溶剂进行纯化沉淀时的优选溶剂是乙醇。为能提高产品质量并保证收率，纯化处理时所用的溶解水量，一般以能使产物充分溶解为度即可。

由于本发明上述制备方法将现有方法中的全部原料一次同时投料混合进行的反应，改变为限制备酯化试剂后再与糖肽进行酯化反应的分步方式进行，从而避免了因氯磺酸与吡啶反应时产生的大量反应热可能对糖肽原料造成的破坏，并使酯化反应不再需要过于苛刻的低温条件，可以在温和条件下顺利进行和完成，工艺更为简单和易于工业化生产，特别是同时采用以甲酰胺类溶剂作为反应介质，更有利于得到硫酸酯化效果更为理想的产品。例如，由本发明方法制备得到的硫酸糖肽在未经后续提纯处理时的硫含量即可约为12～14％，远高于传统方法所得产品中的硫含量仅为3～4％的水平。

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1

1、酯化试剂的制备

将附有冷凝管、分液漏斗和搅拌装置的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入70ml无水吡啶并充分搅拌预冷，在控制温度不高于6℃条件下，用分液漏斗缓慢滴加14ml氯磺酸，得到淡黄色的酯化试剂

2、酯化反应

将3.5g市购的肠多糖(糖肽)产品原料用160ml无水甲酰胺充分搅拌溶解后，加入到上述的酯化试剂中，并迅速将反应装置移入65℃～75℃恒温水浴中，充分搅拌反应约5小时。反应结束后，将反应液移至冰盐浴中冷却，用4mol/L的NaOH溶液调节反应液pH至约为7。

3、后处理

向上述反应液中加入约3倍体积的工业乙醇充分搅拌分散后，经3000rpm离心5min得到沉淀。将沉淀以适量蒸馏水完全溶解后，按常规方式以流水透析24h(也可用超滤或以离子交换树脂处理)，去除水溶性杂志。除杂后的透析液于40℃～50℃下旋蒸减压浓缩后(以无沉淀析出为度)，再次加入约3倍体积乙醇使产物充分沉淀，经10000rpm离心得到沉淀，于40℃干燥箱中干燥24h后，得到最终产品。产品收率30～40％。

4、产品硫含量测定

精确秤取500mg硫酸糖肽产物粗品置50ml圆底玻璃烧瓶，加入6N盐酸10ml，冷凝回流三个小时，少量新沸蒸馏水冲洗回流冷凝管内壁，合并洗液，定性滤纸过滤溶液，用100ml新沸蒸馏水分四次清洗圆底烧瓶，洗液一并过滤，再以新沸蒸馏水冲洗滤纸至中性。95℃加热滤液，并加入50ml的0.1N氯化钡，振荡，定量滤纸过滤溶液，再将滤纸及沉淀一同放入已知皮重的坩埚上，灼烧直至恒重。称重后用下列公式计算硫含量：

S(％)＝(M/m)×0.1373×100

式中：M：点燃的硫酸钡的重量；m：硫酸糖肽的数量；

0.1373：硫原子量与硫酸钡的分子量之比。

以上述方法测定，按本发明上述方式多次试验所得产品中的硫含量为13～14％。

实施例2

1、酯化试剂的制备

将100mL无水吡啶加入附有冷凝管、滴液漏斗和搅拌装置的500mL三颈圆底烧瓶中，在氮气保护下，用冰盐浴冷却至低于0℃并维持在此条件下，用滴液漏斗缓慢滴入25mL氯磺酸，反应过程始终磁力搅拌，得到淡黄色固体酯化试剂。

2、酯化反应

称取3.5g酯化原料于160ml无水吡啶(或DMF等)，充分搅拌溶解作为酯化原料。将酯化原料加入到制备好的酯化试剂中，并迅速将反应装置移入75℃～80℃的超级恒温水浴锅中，不断搅拌反应7～8h。反应结束后，再度移至冰盐浴中冷却，然后用4mol/L的NaOH(或KOH)溶液调节反应液pH至中性。

3.后处理

向上述反应液中加入约3倍体积丙酮(或DMF)，充分搅拌后，用3000rpm离心5min得到沉淀。超滤后直接冻干得到最终产品，或也超滤后浓缩至5～10ml体积后，再加入乙醇(或丙酮、DMF等)充分搅拌后，用10000rpm离心得到沉淀后，于40℃干燥箱中干燥24h，烘干后经研磨得到最终产品。多次试验结果所得产品中的硫含量12～13％。

Claims (4)

1.硫酸糖肽的制备方法，以糖肽成分为原料与磺化剂经酯化反应生成，其特征是以氯磺酸为磺化剂，先在不高于6℃的条件下将氯磺酸加入吡啶充分混合反应制备得到酯化试剂，然后将糖肽成分溶于甲酰胺类溶剂中，再与该酯化试剂混合在甲酰胺溶剂中于65℃~80℃进行酯化反应，酯化反应完成后，冷却并加入碱于pH为6-8中和成盐后，加入水溶性有机溶剂使产物充分沉淀并收集，收集的沉淀以水溶解后除去水溶性杂质，在不高于100℃条件下浓缩后，重复以水溶性有机溶剂进行沉淀的纯化操作，得到纯化产物后，于40℃干燥。

2.如权利要求1所述的硫酸糖肽的制备方法，其特征是所说的糖肽成分与酯化试剂的酯化反应温度为70℃。

3.如权利要求1所述的硫酸糖肽的制备方法，其特征是将所说的酯化反应完成后用碱中和成盐时的pH为中性。

4.如权利要求1至3之一所述的硫酸糖肽的制备方法，其特征是对所收集的产物沉淀物以水溶解后除去水溶性杂质采用超滤或者透析方法。