CN108484719A

CN108484719A - 硫酸酯化十二指肠糖肽制备方法

Info

Publication number: CN108484719A
Application number: CN201810054175.9A
Authority: CN
Inventors: 余蓉; 李逊; 郑永祥; 魏慧梅
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2018-09-04

Abstract

硫酸酯化十二指肠糖肽制备方法。硫酸糖肽的制备方法，以糖肽成分为原料与磺化剂经酯化反应生成硫酸糖肽，反应体系中以氨基磺酸为磺化剂，先将糖肽溶解于甲酰胺溶剂，然后加入氨基磺酸固体并混匀，体系进行酯化反应。该方法条件温和、操作简便，不需要使用有毒试剂吡啶，减少环境污染，且后续处理方法简单，同时可以得到酯化率较高的硫酸酯化产物。

Description

硫酸酯化十二指肠糖肽制备方法

技术领域

本发明涉及硫酸糖肽的制备方法。

背景技术

多糖是生物体内一类重要的大分子物质，具有调节机体免疫的作用，特别在抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗氧化等方面具有良好的活性。糖肽是多糖类物质的糖基与蛋白/多肽链的氨基以共价键相连而形成的化合物。研究发现，通过化学反应人为引入某些基团，如多糖硫酸酯化、乙酰化、甲基化等结构修饰均能够显著增加或增强多糖的生物活性。

十二指肠糖肽从多种蛋白酶水解猪的十二指肠粘蛋白的水解产物中提取制得，经硫酸酯化反应得到硫酸糖肽。硫酸糖肽被证实具有刺激碳酸氢盐分泌、减少胃黏膜腐蚀、促进黏膜生长因子生成，以及影响细胞循环、调控细胞增殖相关的蛋白表达的药理作用，因此可作为抑制胃蛋白酶活性和胃粘膜溃疡的强保护剂，从而治疗胃溃疡、十二指肠溃疡和胃炎。

硫酸糖肽作为一种经过硫酸酯化而得到的多糖肽物质，其制备研究的重点在于其硫酸酯化工艺方法。但是目前对于糖肽硫酸酯化工艺的研究较少，往往集中在对多糖类的化学修饰范畴。经过硫酸酯化后的多糖即为硫酸酯多糖，硫酸根和糖羟基化学反应后结合成共价键，与1位糖羟基成键后被称为硫酸糖苷键。

目前对于硫酸糖肽的制备工艺，多是借鉴多糖类物质的硫酸酯化方法，以糖肽原料和相应的酯化剂反应，一般多糖硫酸酯化采用氯磺酸为磺化剂，糖肽溶解于吡啶进行硫酸酯化，反应条件温度控制在0℃以下低温进行，得到硫酸酯化粗品后，再加入碱中和成盐，通过除杂后处理得到最终产品。酯化反应的关键在于酯化率，以含硫量为标准判定，主要工艺条件在于酯化时间、反应温度、糖肽和溶剂的比例、糖肽和酯化剂的比例等。其中，目前最常用的方法，按照酯化剂和溶剂类型分为氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-二甲基甲酰胺法、三氧化硫-吡啶法等。

已有研究报道，硫酸糖肽的药理学作用关键在于亚硫基，而硫酸糖肽中的硫就是以亚硫基的形式存在的，因此硫酸糖肽的硫酸酯化程度越高，产品的药效越强（Mirelli Eet. “preliminary clinical research on a new anti-ulcer drug”,《Clin. Ter.》1979May 31; 89(4):165- 71），即可用含硫量作为硫酸酯化产物的关键质量标准。

已有专利报道，采用氯磺酸-吡啶法，可得到硫酸糖肽酯化产物，但酯化率只有14.8%（何启富，余蓉，张革等。硫酸糖肽的制备方法，CN 101851285 B[P]。2012。）。该工艺中，溶剂吡啶溶解度高但毒性强，工业化生产时不利于环境保护并存在一定安全隐患，且酯化率不高，操作工艺复杂，需要严格控制反应温度（不高于6℃），增加了经济成本。

发明内容

针对上述情况，本发明将提供了新的硫酸糖肽制备方法。相对于现有方法，本发明的制备方法反应操作简单，后处理工艺便捷，且经济、环保，酯化率比报道的方法更高，酯化产物含硫量可提升到20%以上。

在一些实施方案中，本发明的硫酸糖肽制备方法，采用糖肽为原料，以氨基磺酸为磺化剂，经过酯化反应后生成得到。反应过程：先在常温下将糖肽溶解于甲酰胺溶剂中，然后加入氨基磺酸固体进行酯化反应。所说的糖肽成分为原料，可以直接从猪十二指肠或者胃粘膜提取得到，也可以采用市售的肠多糖产品为原料；采用前者为原料的优点是产物酯化率较高；采用后者为原料，因其含有药用辅料，该产物酯化率可能较低。

在一些实施方案中，本发明制备方法的反应条件为温度 80℃，时间 7 h，糖肽质量和甲酰胺体积之比 1:7，糖肽和氨基磺酸质量比 1:5，此条件下酯化率最高。

在一些实施方案中，本发明提供方法，其用于制备硫酸糖肽，所述方法以糖肽成分为原料在室温下与磺化剂或酯化剂生成硫酸糖肽，其特征在于，在室温下将糖肽原料溶解在溶剂中，加入磺化剂或酯化剂经过酯化反应生成硫酸糖肽。

在一些实施方案中，所述溶剂为有机溶剂。

在一些实施方案中，所述溶剂为酰胺类溶剂。

在一些实施方案中，所述溶剂为甲酰胺或乙酰胺。

在一些实施方案中，所述磺化剂为氨基磺酸或氯磺酸。

在一些实施方案中，所述磺化剂为氨基磺酸。

在一些实施方案中，所述酯化反应在50~150℃的温度下进行，优选在70~100℃的温度下进行，更优选所述酯化反应在75~85 ℃的温度下进行，也可以在50、60、65、70、75、78、80、82、85、90、95、100、110、120、130、140、150℃下进行。

在一些实施方案中，糖肽质量和溶剂体积之比为1:3 ~ 1:30，优选地，糖肽质量和溶剂体积之比为1:7 ~ 1:10。

在一些实施方案中，糖肽和磺化剂质量比1:1 ~ 1:20，优选地，糖肽和磺化剂质量比1:3 ~ 1:6。

在一些实施方案中，先在室温下将糖肽溶解于甲酰胺溶剂，然后将氨基磺酸加入甲酰胺-糖肽混合体系进行酯化反应。

在一些实施方案中，在酯化反应完成后，向反应体系中加入碱中和成盐之后，加入水溶性有机溶剂使产物充分沉淀并收集，采用加入水溶解、加入有机溶剂沉淀的方法去除水溶性杂质，浓缩产物，重复此水溶、沉淀操作，对产物纯化。

在一些实施方案中，所述有机溶剂为乙醇。

在一些实施方案中，所述浓缩产物在0℃水浴搅拌下进行。

在一些实施方案中，向反应体系中加入碱调pH至10。

在一些实施方案中，所述方法还包括在向反应体系中加入碱之前，先加入氧化剂对混合产物进行氧化。

在一些实施方案中，所述氧化剂为H₂O₂。

试验结果表明，甲酰胺对十二指肠糖肽的溶解效果极佳，在N,N-二甲基酰胺中溶解度低，本发明上述糖肽和酯化试剂的酯化反应，在甲酰胺溶剂中反应结果最佳，只需要在室温条件下将糖肽原料完全溶解于甲酰胺，再加入氨基磺酸固体，调节至最佳反应温度水浴静置，是固体在溶剂中充分溶解，保证糖肽分子和酯化剂的充分接触是酯化反应的前提，可以显著提高酯化率。

酯化反应完成后，加入碱中和成盐，然后低温下冷却沉淀，经过多次水溶解、乙醇沉淀的操作，可以有效去除水溶性杂质，通过加入过氧化氢对产物氧化，调节pH至10，然后根据氨气的释放判断反应结束，经过3次以上的水溶、醇沉过程即可有效去除杂质。

以下通过实施例的具体方式对本发明的上述内容做进一步说明，但不应将此理解本发明上述主题的范围仅限于以下实例，在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围之内。

具体实施方式

实施例1

1、原料的溶解：将5 g十二指肠糖肽在常温下溶解于35 mL甲酰胺中，用磁力搅拌器搅拌至糖肽完全融化，成均一液体。

2、酯化反应：在上述体系中加入25 g的氨基磺酸固体，在80℃水浴中反应7h。

3、终止反应：向反应体系中加入NaOH至pH为7，混匀同时加入4倍体积的乙醇，4℃条件下静置。

4、分级醇沉：将静置后的混合液用G-3漏斗过滤，收集沉淀置于50℃干燥箱。用10倍体积的蒸馏水溶解，调pH至7，再加4倍体积乙醇，4℃沉淀6h以上，离心分离沉淀。重复3次。

5、氧化除氨：将干燥后的沉淀加约10倍体积的水溶解，再加总体积5%的H₂O₂，氧化3h，加入NaCl至终浓度为1% (m/v)，用NaOH调pH至10，加少量Na₂CO₃，维持pH 10。60℃水浴搅拌除氨气。用湿润试纸检测除氨效果。

6、沉淀：待滤纸不变色，加入乙醇至终浓度为70%（V/V）。4℃静置3h。抽滤，收集沉淀，加入9倍体积的水和0.7倍质量的氯化钠，调pH至6~7。加入乙醇至终浓度为75%（V/V）。

7、洗涤干燥：抽滤，收集沉淀，加3倍体积的乙醇搅拌0.5h，浸泡3h。抽滤，收集沉淀，50℃烘干。

8、采用灼烧法检测硫的含量。首先将酯化产物在酸性条件下水解，游离出硫酸根离子，再引入钡离子生成BaSO₄沉淀，通过灼烧前后质量变化换算为硫元素质量，从而比较不同方法的酯化率，操作方法参照文献。硫含量的计算公式为：S(%) = (M/m) × 0.1373×100（M：硫酸钡的质量；m：硫酸糖肽的质量；0.1373：硫磺的原子量与硫酸钡的分子量之百分比）。

按照上述方法测定，按照本发明方法获得的硫酸糖肽产物中硫含量可达20.5%。

实施例2

1、原料的溶解：将5 g十二指肠糖肽在室温下溶解于35 mL甲酰胺中，用磁力搅拌器搅拌至糖肽完全融化，成均一液体。

2、酯化反应：在上述体系中加入30 g的氨基磺酸固体，在60℃水浴中反应4h。

4、分级醇沉：将静置后的混合液用G-3漏斗过滤，收集沉淀置于50℃干燥箱。用10倍体积的蒸馏水溶解，调pH至7，再加4倍体积的乙醇，4℃沉淀6h以上，离心分离沉淀。重复3次。

5、氧化除氨：将干燥后的沉淀加约10倍体积的水溶解，再加入总体积5%的H₂O₂，氧化3h，加入NaCl至终浓度为1% (m/v)，用NaOH调pH至10，加少量Na₂CO₃，维持pH 10。60℃水浴搅拌除氨气。用湿润试纸检测除氨效果。

8、采用灼烧法检测硫的含量。首先将酯化产物在酸性条件下水解，游离出硫酸根离子，再引入钡离子生成BaSO₄沉淀，通过灼烧前后质量变化换算为硫元素质量，从而比较不同方法的酯化率，操作方法参照文献^[6]。硫含量的计算公式为：S(%) = (M/m) × 0.1373×100（M：硫酸钡的质量；m：硫酸糖肽的质量；0.1373：硫磺的原子量与硫酸钡的分子量之百分比）。

按照上述方法测定，本发明产物中硫含量可达按照本发明方法获得的硫酸糖肽产物中硫含量可达19.38%。

Claims

1.方法，其用于制备硫酸糖肽，所述方法以糖肽成分为原料在室温下与磺化剂或酯化剂生成硫酸糖肽，其特征在于，在室温下将糖肽原料溶解在溶剂中，加入磺化剂或酯化剂经过酯化反应生成硫酸糖肽。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述溶剂为酰胺类溶剂。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述溶剂为甲酰胺。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述磺化剂为氨基磺酸或氯磺酸。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述酯化反应在50~150℃的温度下进行。

6.如权利要求1所述的方法，其中糖肽质量和溶剂体积之比为1:3~ 1:30。

7.如权利要求1所述的方法，其中糖肽和磺化剂质量比1:1 ~ 1:20。

8.如权利要求1所述的方法，先在室温下将糖肽溶解于甲酰胺溶剂，然后将氨基磺酸加入甲酰胺-糖肽混合体系进行酯化反应。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征是酯化反应完成后，向反应体系中加入碱中和成盐之后，加入水溶性有机溶剂使产物充分沉淀并收集，采用加入水溶解、加入有机溶剂沉淀的方法去除水溶性杂质，浓缩产物，重复此水溶、沉淀操作，对产物纯化。

10.如权利要求9所述的方法，所述方法还包括在向反应体系中加入碱之前，先加入氧化剂对混合产物进行氧化，其中所述氧化剂为H₂O₂。