PL117279B3 - Process for preparing heparin of high purity - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia heparyny o wysokim stopniu czystosci z solnych roztworów tkanek zwierzecych, w którym lake sol¬ na z jelit rozciencza sie woda w stosunku laka sol¬ na : woda równym od 1:3 do 1 : 10, a nastepnie z zawierajacego heparyne rozcienczonego roztworu oddziela sie heparyne, wedlug patentu glównego nr 108607.Dzieki heparynie medycyna od dawna dysponu¬ je naturalnym srodkiem antykoagulacyjnym, który równiez w medycynie nowoczesnej jest niezbedny i znajduje coraz szersze zastosowanie.W ostatnich latach opisano szereg metod maja¬ cych za cel wyodrebnienie heparyny w coraz to bardziej oszczedniejszy sposób z zawierajacych he¬ paryne tkanek zwierzecych, takich jak pluca, wa¬ troba, a w ostatnim okresie czasu glównie sluzów¬ ka jelit (Mucosa — blona sluzowa) swin, bydla i owiec (brytyjski opis patentowy nr 754885, opis pa¬ tentowy RFN nr 1228241, opis patentowy St. Zjedn.Am. nr 3058884, opis patentowy RFN nr 1253868).Surowce te ze wzgledu na latwosc psucia sie wy¬ kazuja wade, 'ograniczonej mozliwosci skladowania, które mozna wprawdzie przedluzyc przez zamraza¬ nie, co jednak prowadzi do zwiekszenia nakladów technicznych i podwyzsza koszty.Zarówno personel jak i okoliczni mieszkancy sa czesto narazani na dzialanie odoru wydzielajacego sie podczas takiej obróbki.W opisie patentowym RFN nr 1253868 opisano 2 zbiorcze znane metody uzyskiwania heparyny. We¬ dlug znanych metod tkanke zwierzeca miesza sie w stadium poczatkowym z goracym roztworem wo¬ dnym soli w celu rozpuszczenia heparyny znajduja- 5 cej sie w komórkach. Ilosc heparyny w powstaja¬ cym srodowisku jest jednak bardzo mala.Stwierdzono, ze laka solna, uzyskiwana w rzez¬ niach i zakladach przerabiajacych sluzówke zawie¬ ra heparyne. Ta laka solna powstaje wtedy, gdy io jelita zwierzece, uprzednio pozbawione sluzu jeli¬ towego, w celu konserwacji wprowadza sie do roz¬ tworów soli kuchennej.Sposób otrzymywania heparyny o wysokim stop¬ niu czystosci polega wedlug wynalazku na tym, ze !5 w postepowaniu wedlug patentu glównego nr 108607 jako material wyjsciowy stosuje sie lake solna z jelit, powstala przez wprowadzenie do roztworu so¬ li kuchennej w temperaturze 0—30°C jelit zwierze¬ cych, pozbawionych sluzu jelitowego. •T 20 Niespodziewane jest w porównaniu z opisem pa¬ tentowym RFN nr 1253868, ze laka solna, powstaja¬ ca przez samo wprowadzenie jelit zwierzecych do roztworu soli kuchennej zawiera wieksze ilosci he¬ paryny. Nieoczekiwane jest równiez to, ze hepary- 25 na ta jest prawie calkowicie wolna od chemicznie zblizonych produktów ubocznych, tak wiec laka sol¬ na znana dotychczas tylko jako produkt odpadkowy zanieczyszczajacy srodowisko stanowi nowe zródlo" surowcowe heparyny. so; Dzieki prawie calkowitemu brakowi zanieczysz- 117 2793 117 279 4 czen mozna obróbke do surowej heparyny prowa¬ dzic w warunkach szczególnie lagodnych, przy czym zbedne staja sie znane dotychczas uciazliwe meto¬ dy wyodrebniania (patrz opis patentowy St. Zjedn.Am. nr 3451996 i brytyjski opis patentowy nr 1221784). Uzyskuje sie ostatecznie heparyne o ta¬ kiej jakosci, której nie , mozna uzyskac w dostep¬ nych na rynku preparatach heparyny.Uzyskiwana sposobem wedlug wynalazku suro¬ wa heparyna wyodrebniana z laki solnej jelit jako surowca, wykazuje juz taiki stopien czystosci, ze po nastepnym oczyszczeniu otrzymuje sie heparyne o ponad 2l00 jednostek USP/mg. Znajdujace sie o- becnie w handlu preparaty heparyny maja z reguly jakosc heparyny odpowiadajaca 150 jednostkom USP/mg, w nielicznych przypadkach 155 jednost¬ kom USP/mg.Pod pojeciem jednostki USP/mg rozumie sie spe¬ cyficzna aktywnosc wynikajaca z U.S.P. assay, za pomoca której mierzy sie hamowanie tworzenia klaczków w konserwowanej plazmie owczej. Jedna jednostka USP odpowiada okolo 1,1 jednostkom miedzynarodowym (UJ).Ze wzgledu na to, ze aktywnosc znajdujacych sie w handlu preparatów heparyny pomimo licznych metod ulepszajacych jest nadal niezadowalajaca wymaga sie, by preparaty heparyny (z sluzówki jelitowej) zawieraly co najmniej 140 jednostek USP. Dotychczas jedynie w laboratorium udalo sie L.W. Kananagh'owi i L.B. Jaques'owi |Arzneimittel- -forschung (Drug Res.) 24, nr 12, 1942 (1974)1 wyod¬ rebnic heparyne w postaci soli barowej o maksy¬ malnie 175 jednostkach USP/mg droga kilkakrot¬ nej krystalizacji.Do konserwacji i odwodnienia jelit zwierzecych nadaja sie zwlaszcza roztwory soli kuchennej, w których zawartosc soli kuchennej wynosi od 0,5 mo¬ la do ilosci moli roztworu nasyconego. Zwlaszcza korzystne sa roztwory soli kuchennej, w których zawartosc soli kuchennej wynosi 3 mola do ilosci moli roztworu nasyconego.Pod pojeciem ilosci moli roztworu nasyconego ro¬ zumie sie ilosc moli rozpuszczonej soli kuchennej, która zawiera stezony wodny roztwór w tempera¬ turze pokojowej, stosowany w rzezni (stezenie roz¬ tworu soli kuchennej wynosi okolo 26,4%).Zwykle jelita zwierzece, pozbawione sluzu jeli¬ towego, obrabia sie roztworem soli kuchennej w cia¬ gu od 2 godzin do 3 dni. Najczesciej obróbke jelit zwierzecych konczy sie juz po 3—24 godzinach. Po usunieciu konserwowanych i odwodnionych jelit zwierzecych z roztworu soli kuchennej otrzymuje sie lake solna z jelit o nieoczekiwanie wysokiej za¬ wartosci heparyny.Stosujac w sposobie wedlug wynalazku lake sol¬ na z jelit jako. surowiec udalo sie wyodrebnic he¬ paryne na skale techniczna o takim stopniu czy¬ stosci, ze wystepuje ona w postaci prawie bezbar¬ wnej substancji. Wszystkie rodzaje surowej hepary¬ ny uzyskiwane dotychczas z innych surowców na¬ lezalo natomiast odbarwiac droga uciazliwych me¬ tod, powodujacych straty (opis patentowy St. Zjedn.Am. nr 3179566).Laka solna z jelit stanowi poza tym surowiec zdolny do skladowania, prawie bez zapachu, w któ¬ rym nie zachodzi pogorszenie jakosci wskutek dluz¬ szego skladowania. Dzieki temu zbedne staja sie chemiczne i inne metody konserwowania.Podane nizej przyklady objasniaja blizej sposób 5 wedlug wynalazku.Przyklad I. 600 litrów laki solnej w mieszal¬ niku o pojemnosci 1500 litrów zadaje sie w tempe¬ raturze pokojowej, mieszajac, w ciagu pól godziny 600 litrami metanolu. Miesza sie dalej jeszcze w ciagu takiego samego czasu, po czym mieszanine pozostawia sie na okres okolo 1 godziny.Nastepnie dekantuje sie metna ciecz znad osadu do innego naczynia, a wytracony placek solny po¬ zostawia sie. Uzyskana zawiesine pozestawia sie na okres 2 dni.Nastepnie ponownie dekantuje sie, ciecz znad osadu odrzuca sie, a osad wyodrebnia sie droga od¬ wirowywania. Po wysuszeniu pod obnizonym cis¬ nieniem otrzymuje sie 1,44 kg produktu o okolo 10 jednostkach USP/mg. Produkt ten w okolo 45% skla¬ da sie jeszcze z soli kuchennej. Ilosc tak otrzyma¬ nej surowej heparyny odpowiadajaca okolo 425 000 jednostkom USP lub 42,5 g ekstrahuje sie trzykro¬ tnie porcjami po 200 ml 2-molowego roztworu soli kuchennej, przy czym kazdorazowo miesza sie w ciagu 1 godziny w temperaturze 60°C. Polaczone wyciagi rozciencza sie woda az do momentu, w którym roztwór zawiera okolo 0,9 mola/litr jonów chlorkowych.Nastepnie dodaje sie 200 ml wymieniacza aniono¬ wego (Lewatit CA 9249) w postaci chlorkowej i miesza sie w ciagu 1 godziny.Nastepnie odsysa sie i przemywa okolo 200 ml 0,9 molowego roztworu soli kuchennej. Wymieniacz jonowy miesza sie nastepnie w ciagu 5 godzin z 2-molowym roztworem soli kuchennej w tempera¬ turze 40°C, po czym odsysa sie i przemywa 2-mo¬ lowym roztworem soli kuchennej.Roztwór z eluowania laczy sie z roztworem z przemywania i wytraca za pomoca 1,5 objetosci me¬ tanolu. Osad odwirowuje sie, przemywa najpierw ukladem woda-metanol w ilosci 50 ml (l-s-1,5 czesci objetosciowych), a nastepnie metanolem w ilosci okolo 50 ml i suszy. Otrzymuje sie 198 g hepary- nianu sodu o 195 jednostkach USP/mg. 15,5 heparynianu sodu otrzymanego wyzej opisa¬ nym sposobem, o okolo 200 jednostkach USP/mg rozpuszcza sie w 200 ml 2-molowego roztworu so¬ li kuchennej. Roztwór odsysa sie przez nucze, a po¬ zostalosc przemywa najpierw w 3 ml 2-molowego roztworu soli kuchennej, a nastepnie okolo 250 ml calkowicie odmineralizowanej wody. Polaczone roz¬ twory doprowadza sie nastepnie za pomoca calko¬ wicie odmineralizowanej wody do molowosci chlor¬ kowej 0,9.Nastepne powtarza sie jak wyzej oczyszczanie za pomoca 1 litra Dewatitu CA 9249. Polaczone roz¬ twory po eluowaniu i po przemywaniu poddaje sie obróbce w wyzej opisany sposób. Po przemyciu i wysuszeniu osadu otrzymuje sie 11,2 g hepary¬ nianu sodu o aktywnosci 251 jednostek USP/mg.Przyklad II. Postepujac podobnie do brytyj¬ skiego opisu patentowego nr 754885 zakwasza sie 3 litry laki solnej, mieszajac, kwasem octowym do wartosci pH 3,1—3,2 (okolo 50 ml). Po uplywie kil- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60117 279 5 6 ku godzin dekantuje sie, a pozostalosc odwirowuje.Osad odrzuca sie, a polaczone roztwory zobojetnia sie lugiem sodowym.Nastepnie mieszajac zadaje sie powoli taka sama objetosc metanolu. Po uplywie 45 minut dekantuje sie znad wytraconej soli kuchennej. Zawiesine te pozostawia sie w ciagu kilku godzin, po czym de¬ kantuje ciecz znad osadu, a pozostalosc odwirowu¬ je sie. Osad suszy sie pod obnizonym cisnieniem.Otrzymuje sie 3,43 g produktu o 21 jednostkach USP/mg. Ilosc tak otrzymanej surowej heparyny odpowiadajaca 425 000 jednostkom USP lub 20,2 g oczyszcza sie analogicznie jak w przykladzie I.Otrzymuje sie 10,65 g heparynianu sodu o aktyw¬ nosci 262 jednostek USP/mg.Przyklad III. 3 litry laki solnej rozciencza sie 12 litrami wody do uzyskania molowosci chlorkowej okolo 0,85 moli.Nastepnie dodaje sie 50 g ziemi okrzemkowej oraz roztwór 6 g chlorku bezetoniowego o nazwie han¬ dlowej Hyamina 1622 (firmy Rohm Haas) w 100 ml wody. Po uplywie kilku godzin dekantuje sie, a po¬ zostalosc odsysa. Po przemyciu woda jeszcze wilgo¬ tny osad ekstrahuje sie trzykrotnie porcjami po 200 ml 2-molowego roztworu soli kuchennej wedlug opisu patentowego RFN nr 1228241.Z polaczonych wyciagów wytraca sie osad za po¬ moca 2 czesci objetosciowych metanolu. Osad wy¬ odrebnia sie i suszy, otrzymujac 465 mg produktu o aktywnosci 155 jednostek USP/mg.Przyklad IV. 30 litrów laki solnej rozciencza sie 120 litrami wody do uzyskania molowosci chlor¬ kowej okolo 0,85 moli (porównaj opis patentowy RFN nr 1156938).Nastepnie zakwasza sie kwasem octowym (okolo 50 ml) do wartosci pH 3,2. Po uplywie kilku godzin wytraca sie osad, który po zdekantowaniu klarowa¬ nej cieczy znad osadu odwirowuje sie. Po wysu¬ szeniu otrzymuje sie 111 g surowej heparyny o 6,5 jednostkach USP/mg.Ilosc tak otrzymanej surowej heparyny odpowia¬ dajaca okolo 425 000 jednostkom USP lub 65,5 g oczyszcza sie najpierw analogicznie jak w przykla¬ dzie I. Po pierwszym stopniu oczyszczania nad wy¬ mieniaczem jonowym otrzymuje sie 196 g hepary¬ nianu sodu o 198 jednostkach USP/mg. 15 g heparynianu sodu otrzymanego wyzej opisa¬ nym -sposobem, o okolo 200' jednostkach USP/mg rozpuszcza sie w 200 ml 2-molowego roztworu chlor¬ ku wapniowego. Roztwór odsysa sie przez nucze, a pozostalosc przemywa sie najpierw 30 ml 2-mo¬ lowego roztworu chlorku wapniowego, a nastepnie okolo 250 ml calkowicie odmineralizowanej wody.Polaczone roztwory doprowadza sie nastepnie za po- 5 moca calkowicie odmineralizowanej wody do mo¬ lowosci chlorkowej 0,9.Nastepnie jak wyzej miesza sie z 1 litrem Lewa- titu CA 9249. Eluowanie i przemywanie przeprowa¬ dza sie 2-normalnym roztworem chlorku wapniowe- !0 wego zamiast roztworem soli kuchennej.Polaczone roztwory po eluowaniu i po przemy¬ waniu poddaje sie obróbce w wyzej opisany gposób.Osad przemywa sie i suszy, otrzymujac 10,7 g he¬ parynianu wapnia o aktywnosci 260 jednostek 15 USP/mg.Przyklad V. 10 litrów laki solnej rozciencza sie 40 litrami wody doprowadzajac do molowosci chlorkowej okolo 0,85 mola. Roztwór ten przepom¬ powuje sie przez filtr na kolumne z wymieniaczem 20 jonowym, przy czym kolumna ma srednice 26 mm i dlugosc 380 mm (szybkosc przeplywu okolo 3 li¬ try/godzine). Jako wymieniacz jonowy stosuje sie zywice anionowowymienna makroporowata, o sre¬ dniej zasadowosci, w postaci Cl~ (o nazwie handlo- 25 wej Lewatit CA 9249). Mozna równiez stosowac inne zywice anionowymienne, takie jak np. opisa¬ ny w opisie patentowym RFN nr 1253968 produkt o nazwie handlowej Dowex 1-X-1.Nastepnie zywice usuwa sie z kolumny, dwukro- 30 tnie przemywa porcjami po 500 ml 0,9-molowego roztworu soli kuchennej i eluuje mieszajac za po¬ moca 400 ml 2-molowego roztworu soli kuchennej w ciagu 5 godzin w temperaturze 40°C. Z roztwo¬ ru tego wytraca sie osad za pomoca 1,5 czesci obje- 35 tosciowych metanolu. Po wyodrebnieniu i wysu¬ szeniu osadu otrzymuje sie 1,2 g produktu o 149 jednostkach USP/mg.Zastrzezenie patentowe 40 Sposób otrzymywania heparyny o wysokim stop¬ niu czystosci z solnych roztworów tkanek zwierze¬ cych, w którym lake solna z jelit rozciencza sie wo¬ da w stosunku laka solna : woda równym od 1:3 do 1 : 10, a nastepnie z zawierajacego heparyne roz- 45 cienczonego roztworu oddziela sie heparyne, we¬ dlug patentu glównego nr 108607, znamienny tym, ze jako material wyjsciowy stosuje sie lake solna z jelit, powstala przez wprowadzenie do roztworu soli kuchennej w temperaturze 0—30°C jelit zwie- 50 rzecych, pozbawionych sluzu jelitowego. PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe 40 Sposób otrzymywania heparyny o wysokim stop¬ niu czystosci z solnych roztworów tkanek zwierze¬ cych, w którym lake solna z jelit rozciencza sie wo¬ da w stosunku laka solna : woda równym od 1:3 do 1 : 10, a nastepnie z zawierajacego heparyne roz- 45 cienczonego roztworu oddziela sie heparyne, we¬ dlug patentu glównego nr 108607, znamienny tym, ze jako material wyjsciowy stosuje sie lake solna z jelit, powstala przez wprowadzenie do roztworu soli kuchennej w temperaturze 0—30°C jelit zwie- 50 rzecych, pozbawionych sluzu jelitowego. PL PL PL PL