DE1492114A1 - Verfahren zur Extraktion und Gewinnung in gereinigter Form von Polypetiden mit Kallikrein- und trypsinhemmender Wirkung aus tierischen Organen - Google Patents

Description

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PICKTER GEDKOlI VSGYiSZE'il .GYÄR R.T-. : in Budapest λ (Ungarn)

Verfahren aur Extraktion und Gewinnung in gereinigter Form >on Polypeptiden mit Jcallikreia- und 1»ypetahemmeader Wirkung, aus tierischen Organen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur sauren Extraktion und Gewinnung in gereinigter Form von Polypeptiden mit kallikrein- und tryi>ainhemrnendear Wirkung (weiters: aktive Polypeptide) aus tierischen Organen, vorzugsweise Lunge, Leber, Pankreas, Parotiedrüsen, Niere, Submaxillardruaen, Milz, Magen, Darm und Muskeln«

Bs ist bekannt, dass die erwähnten tierischen Organe aktive Polypeptide enthalten. Die in reiner Form

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hergestellten aktiven lolypeptide können therapeu tisch aur Behandlung von Pankreatitie, ferner für profilaktische Zwecke bei Bauchoporationen vorteilhaft verwendet werden,

Bs sind boreits aahlrelche Verfahren zur Extraktion und Reinigung dieser aktiven Polypeptide aus tierischen Organen bekannt. So beschreibt a,B. H» Kraut (Hoppe-Seylcr'ß Z. für phyaiol» Chom. 192. 1 /1930/) ein Verfahren zur Extraktion dieser akti-

von Polypeptide aus Pankreas bzw. Parotisdrüeen, wo bei die Extraktion mit ..jrdflnntor Essigsäure durchgeführt und die erhaltene Substanz nach Neutralieetion mit Natronlauge durch alkoholische fraktionierung gereinigt wird, Gemäss der deutschen Patentschrift 950 959 ist ein /erfahren bekannt, nach *elchom die frischen Organe mit Aceton entfettet, dann mit saurem verdünntem Alkohol in der Wärme extrahiert, die Extrakte im Vakuum eingeengt und mit Aether ausgeschüttelt, au3 der wässrigen Phase die Polypeptide mit Alkohol, Aceton oder einem anderen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel gefällt, der Niederschlag in verdünnter Essigsäure gelöst, unwirksame Begleitstoffe durch Einstollung auf schwach alkalische !Reaktion entfernt und die aktiven Polypeptide erneut mit Alkohol, Aceton oder

einem anderen, mit V/sseor mischbaren organischen Lösungsmittel gefällt werden. Diese Methoden weisen

den Nachteil auf, dass bei der Neutralisation der aur

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Extraktion verwendeten Essigsäure im Extrakt eina grosee Menge Ton Notriumacetat entsteht, das den «eiteren Reinigungaschritt in grosaem Masse stö"-ron und deaeon Entfernung οinen besonderen Schritt beenepruchen würde. Bin weiterer Nachteil des Verfahrene nach der deutschen Patentschrift 950 959 beβtent darin, daaa das Verfahren in technischem Maastab durch die Verwerdung von Aethonol erschwert und vertouert wird. Denselben Nachteil weist das Vorfahren nroh der deutsohon Patonteeht«ift 1 084 43) auf; hier wird die Extraktion von tierischen Organen mit einem organischen, mit Wasser mischbaren LBsuncsmittsl, in der Anwesenheit von Saison odor Hydroxyden der Erdalkalimetalle oder von Alkolisalson durchgeführt« Die deutschen Patentschriften 1 014 283 und 1 011 576 beschreiben Verfahren, nach welchen dio Extraktion mit wässriger Triehlore88l£3äurc durchgeführt wird. Bei diesen Vorfahren kann die Trichloressigsäure nur durch Btroktion sit Aether entfernt werden, was in technischem Md se tab, .'.ra Pal Ie von Extrakten von mehreren-hundort Litern undurchführbar ist. Aus der deutschen Patentschrift 1 16Θ 605 ist ein Verfahren bekannt, nach welchem die Extraktion mit wässriger Perchlorsäure durchgeführt und der überschuss der Perchlorsäure in Form von Kalium- oder Anmoniurasals unter Kühlung auf O⁰C durchgeführt wird« Dio Abkühlung der Löaunccn von grossen Volumina ist

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schwierig und die Perchlorate können auch-unter solchen Umständen nicht befriedigend entfernt wer« den.

Die beschriebenen Bxtraktioneverfehren werden hauptsächlich mit Organen durchgeführt, die früher entfettet und getrocknet wurden; diese Vorbehandlung ist aber im Grossbetrieb sehr kostspielig«

Auch für die Gewinnung und Reinigung dieser aktiven Polypeptide aus den mit Hilfe der obenbe«* schriobonen Methoden erhaltenen Extrakten sind sohl·» reiche Methoden bekannt. So b ο schreibt a,B_# H₉ Kraut (Hoppe-Seyler's Z* phyeiol· Cham» ££2, 161 /1958/) ein Verfahren, nach welchem die aktiven Polypeptide aus dem wässrigen äthanolischen Extrakt der Parotiedrttsen nach Verdampfen des Aethanole mit iceton gefällt werden· Aus der deutschen Patenteöjirift 954 284 ist ein Verfahren bekannt« naoh welchem der grösste Teil der begleitenden Proteine aue dem wässrigen Orgonextrakt mit frichloressigeäure abgeschieden und dpnn die aktiven Polypeptide mit lO-fa· ehern Volumen Methanol gefällt werden·

Oeraäss der deutschen Patentschrift 950 werden die aktivon Polypeptide, nach Extraktion der Organe mit eaurem wässrigem Acthanol* Verdampfen des Aethanols und Extraktion mit Aether, mit einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel aus der wässrigen Phase gofällt« In der deutschen Patent*

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sohrlft 1 084 433 wcrdon die aktiven Polypeptide aus dem methanolischen Extrakt des Organe mit Aceton gefällt. Aus der deutschen Patentschrift 1 011 596 ist bekannt, dass die aktiven Polypeptide ' aus einer sauren, wässrigen Lösung mit Aceton aus·· gefällt werden können. Gemäss dor deutschen Patentschrift 1 014 288 worden die aktiven Polypeptide derart gewonnen, dass aus dem die Triohloressigeäure enthaltenden wässrigen Extrakt die Trichloroseig* säure mit ätherischer Extraktion entfernt und die aktiven Polypeptide dui>ch Fällung mit Ammoniumflulfat gereinigt und gewonnen werden. Nach der deutschen Patentschrift 1 181 859 werden die aktiven Polypeptide an einäm Kationenaustauscher im H »-Cyk*· lus gebunden und dann davon mit einer wässrigen Mineralsäure oder starken organischen Säure bei einem pH Wert unter 2,1 eluiert. Nach der Mothode von

N. Laskowsky (J, Biol. Chem. 2JJ8, 3274 /1963/) werden die aktiven Polypeptide mit Magnesiumsulfat hoher Reinheit und dann iriit Amraoniumsulfst gefällt, wonach der Extrakt mit einem Austauscher Amberlite IRC 50 oder Amberlite XB 64 in der Anwesenheit eines Phosphatpuffers vom pH Wert 6,8 chroma to grapni-öSPt · · wird.

Die industrielle Durchführung dieser Gawinnungsmethoden ist von mehreren Gesichtspunkten aus nachteilig. Die Fällung mit Aeühänol oder Aceton ist wogen der Verwendung von prassen Volumina der koet-

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spieligen und brennbarη Lösungsmittel nachteilig· Die Fällung mit A/ngoitSmnsulfat oder Magnesiumsulfat ist für die Gewinnung dor nach in groaaea Tolumina anwesenden Polypeptide ebenfalls nachteilig, weil zu deren Fällung die lusting mit den ga* nannten Salzen gesättigt werden nmsa. ißenäma «nee« ren Untersuchungen ist die Verwendung;der Kationenaus tauscher in H⁺-Oyklus aur Bindung der aktive« Polypeptide nachteilig, weil die Bindung sehon durch eine minimale Men^e von Salzen gestört wird« Ferner ist zur Bindung einer · sehr grosee*. Menge (etwa 10 % des Lösungev ο lumens) vom Ka. tionenans tauscher ιΛ-tig, d essen Rcgencrierunö* ein langwieriger Proaeee ist. Im Falle dor bekonnten Verfahren sind weder die .Ausbeuten noch dia Reinigung befriedigend. Unsere* Untersuchungen ^em&os sind die für die Reinigung van ähnlichen Substanzen allgemein verwendeten Methoden, so z^B. das Adsorbieren auf Aluminiuuioxyd- oder Kaiziumphosphat-Gel, für dia Gewinnung der aktiven Polypeptide aus tierischen Örgafaextrakten nicht geeignet« Durch diese Adsorbentien werden auch Ballastsubstait· zen in hoher Menge gebunden; dementsprechend ist die Reini'giing ΉΓοπ^ befriedigend, das Verfahren beansprucht eine grosse Mange an id sorbentien und Blnlerungsmittel und auch die Ausbeute ist unzulänclich,

Der Zweök der Erfindung ist. durch die Beseitigung der Nachteile 5er bekannten Methoden, ein Verfahren zu bieten, welches ermöglicht, einerseits

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aus verschiedenen tiorlechon Organen einen rohen Extrakt* welche dlo aktiven Polypeptide in au· frledtneteilender Mence und Reinheit enthält* *ft gewinnen, anderseits dio Polypeptide mit guter Ausbeute und befriedigender Reinheit, mit einer auoh induatriell leioht durchführbaren Methode tu erhalten«

QLe Erfindung ruht auf der Erkenntnis» daee bei der sauren Extraktion der aktiven Polypeptide eufl verschiedenen tierischen Organen, durch Bildung von bestimmten aehwex&uellohen Salien in dem aaoh der Extraktion erhaltenen Goraiaoh, das Anion der sur txtraktlon verwendeten Sliuro, das extrahierte Organrest, ferner die im Folie der bekannten Veiv fahren durch filtrieren oder Zentrifugieren nur adt (pposeen Schwierigkeiten entfernbares feinverteilt achwebenden Verunreinigungen in einem fiohrltt entfernt werden kennen und dadurch aus dem nach der Extraktion erhaltenen Gemisch in einem einzigen Abtrennuneaachrltt ein klarer, proktieeh eals· freier Battrakt erhalten werden kann·

ferner ruht dio Erfindung auf der BrkenntalB, daea die 'aktiven Polypeptide bei ο inera pH-Wert von

5 ble 7 an Adaorbentien von Silikot-fyp aus Organ» extrakten epesifiech gebunden und von den Adaorben-»

mit tlea unter einem pH-Wort von 3 mit Hilfe von/Vaeeer verdünnten polaren LBeuncsmltteln elulert werden können. Diese Erkenntnis let sehr überreichend, well

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die Proteine Und Polypeptide an Adsorbent!en ähnlichen Type ebon im Gegenteil, d.h. unter eine« pH-Wert von 3 gebunden und dif adsorbierten Proteine und Polypeptide bei einem pH-Wert über β mit tr&eirigen oder organischen Lösungsmitteln elulert werden können·

Die Erfindung ist oin Vorfahren zur sauren Bartraktion von Polypeptiden mit kallikrein~ und trypainhemraender Wirkung aus tierischen Organen» Vorzugsweise Lunge, Lober, Pankreas, Parotindxtaw Niere, Submaxi11ardrüseη, MiIz₁ Hagen, Darm und Muskeln, und zur Gewinnung dieser aktiven Polypep· tide in gereinigter Form aus dem derart erhalte· nen Extrakt. Erfindungsgemäss werden die zu eXtre» hierenden tierischen Organe 9erkl*inart Mnd fax» mit saurem Wasser extrahiert, wobei dca Wasser solche Sauce oder Sauren enthält, aus des¹ adgr <!·«· nen im pH Bereich von 4,5 bis 8,0 ein Salz gebildet werden kann, dessen Löslichkeit Eiprodukt bei Zimmertemperatur kleiner ist als 10 , wonach der Organextrakt jnit dem Oxyd und/oder Hydroxyd eines Metalle behandelt wird, dessen Kation mit der aur Extraktion verwendeten Säure ein Salz bildet, dee· sen Löslichkeitsprodukt bei Zimmertemperatur klei« ner ist als 10 * Dann werden das extrahierte Or» gen und der Salzniederschlag abgetrennt, aus dem Organextrakt werden die aktiven Polypeptide an einem Adsorbent von Silikat-Typ bei einem pH-Wert

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5 "bie 7 gebunden, clas Adsorbent wird abgetrennt, zur Entfernung eines Anteils der Verunreinigungen mit saurem Wasser gewaschen, dann werden die aktiven. Polypeptide mit einem mit eaurem Wasser von einem pH-Wert unter 3 verdünnten polaron organischen Lösungsmittel dluiert und das derart erhaltene saure Bluat wird in bekannter Weise weiter gereinigt» Die Weiterreinigung kann z.B. derart durchgeführt werden, dass ein Teil der Ballastsubstanzen durch Neutralisation ausgefällt wird, wonach dio in der Lösung gebliebenen aktiven Polypeptide mit einem organischen Lösungsmittel fraktioniert ausgefällt^ oder nach Entfernung des Lösungsmittelgehaltee das lluierungsmittels, durch Fraktionierung mit einem Salz gefällt, oder die in der Lösung gebliebenen aktiven Polypeptide mit Proteinfällungsmitteln versetzt werden·

Erfindungsgemäss geht man zweckmässig derart vor, dass Oxalsäure·, Schwefelsäure und/oder Phosphorsäure als Säuren vorwendet werden, die 'im pH Bereich von 4,5 bis ε,Ο ein Salz bilden, dessen Löslichkcitsprodukt bei Ziimaertomperatur kleiner ist als ΙΟ"*⁴.

Es i3t zweckmSüsig, Kalzium-, Bariuia- und/oder Strontiumoxyd oder -hydroxyd als das genann· te Oxyd oder Hydroxyd au verwenden. Mit diesem Metalloxyd und/odor -hydroxyd kann der Extrakt auch nach Entfernung des extrahierten Organs behandelt

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werden; doch 1st os zweckmKssig, die Behandlung mit diesem Metolloxyd uncl/oder -hydroxyd Tor der Entfernung des extrahierten Organs durchzuführen und don Niederschlag domentsprechend mit den extrahierten OrGQnQa zusammen zu trennen·

Der Extraktionsachritt des orfindungsgeinKssen Verfahrens weist zahlreiche Vorteile auf. Br bringt auch die Klärung eier Lösung hervor, weil gleichzeitig mit der Salzbildung auch die im BxtraJtt schwebenden, durch Zentrifugieren oder Filtrieren nur schwierig entfernbaren Verunreinigungen ausgefällt werden, und der auf Jieoe VYeise erhaltene Niederschlag leicht abgesetzt und das Sediment leicht zentrifugiert öler filtriert werden kann· Die erhaltene Lösung ist klar, weist einen minijaalen Salzgehalt auf und ist so ein geeignetes Anaganc;3material zur Weiterreinigung durch Adsorption, Ionenaustausch oder Fraktionieren mit einem Lösungsmittel. Bin weiterer Vorteil dos Extraktionsachrittes besteht darin, dase er im Grossbetrieb leicht durchgeführt werden kann '--vl die nötigen Materialien nicht kostspielig sind, /.Is ^!sorbentien von Silikat-Tjp können zwecksüssig mit Säure behandeltes Bentonit oder synthetische Zeolite verwendet werden. Die aktiven Polypeptide können vom Adsorbent vorzugsweise mit einem nieleren Alkohol oder Keton eluiert werden, welche mit V/asser von einem pH-Wert unter 3 auf eine Konzentreition von 30-90 %

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verdünnt würden.

Falle das Bluierungsmittel mit Schwefelsäure, Phosphorsäure uni/oder Oxalsäure angesäuert wird, ist ob zweckmhseic» die Neutralisation mit dem Oxyd oder Hydroxyl eines Metalls durchsufUhren, welches mit der zum Bluieren verwendeten Säure bei Zimmertemperatur ein schwer lösliches SaIa

bildet· In diosen Falle lot die nach der Neutralisation erhaltene, polypQpti(!haltißo !Äsung p*aktisoh aalsfrei, was vo.n Ge eicht spunk t 3er endgültigen Reinigung aus sehr vorteilhaft ist·

Voa den zahlreichen Vorteilen des ReI-nigun£8echrittes des erfialuncesemlieeen VerfsJisene wird folcendoe erwtlhnt. Unter den se^ebenen Umständen bindet das verwendete Adsorbent von Silikat-Typ die aktiven Folypoptido selektiv; dementsprechend ist nur eine kloine Menee on Adsorbent nötic und ein grosser Toil, mindestens 80 % der Ballastsubetanson, bleibt in der Mutterlauge. Die aktiven Folypopti-e können mit ^utor Ausbeute, in einem Volumen erhalte** worden, das 1/10 - 1/20 Teil des ureprUnclichcn Volumens bοtract. Das Verfahren sichert vorteilhafte Bolin^unscn für das als

s verwendete Ausfällen mit einem Lu-, weil die nktive Substans in einer Lösung anwesend ist, die verhcltnismässic viel orßanlschos LBsungsmlttcl, l.h. wenic Wasser enthält

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und dementsprechend die Men^e dos zur weiteren Ausfüllung nöticen orgnnischen Lösungsmittels ge· ring ist. Mit HiIfο des orfindunßSßemfieeen Adsorptionsverfahrene kann durchschnittlich eine 20-40-fache Reinigung erreicht werden.

Die kallikreinhemmcnde Wirkung (KIB) wurde nach Werle-Kaufmnnn-Boctsch (Hoppe-Seyler*e Z, t, physiol· Chcm_# JÜÄ, 52 /I960/) und die trypsin· hemmende Wirkung (TIS) noch Anson (J, Gen» Physiol., 2g« 79 /1939/) ßoip.essen.

Das erfinduncQcemösee Verfahren wird anhand der naohstehoxidcn Beispiele näher erläutert*

Beispiel 1

100 kg zerkleinerte Jttnderlunge wurden 2 Stunden lanc mit 30ü 1 einer 1 £-lgen wöaerißen Qxalaäure-Löeunj gerührt un.1 dann wurde der pH-Wert der Löeung unter Rühren mit Giner Suspension von felFiiimoxyd und Wasser von Verhältnis 1:10 auf 6,0 eingestellt. Nnchhor wird der Or^anrost in einer Absetz-Zentrifuco absetrennt. Die Aktivität der erhaltenen Lb'sunc betr^ :t 650 TIE und 170 000 000 KIB.

Der'erhaltenen Lösunc werden 3 kß Bleich» erde zugegeben. Die Löaunc wird 2 Stunden ßertlhrt und dann 3 Stunden absetzen gelassen. Der ^rosste Teil der lösung wird vom abgesetzten Adsorbent ab-Gesaußt. Das Adsorbent wird in einer Absetz-Zentrifuge ßotrennt, mit 10 1 V/asocr suspendiert und gewoschen und nachher wieder zentrifugiert* Dann wird

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das Adeoxfcont zum erstenmal mit 10 1, dann mit 5 1 70 Sfr-igem Aceton je eine Stunde gerührt, dos . mit HOl auf eine Normalität von N/5 Gestellt wurde. Das Bluat wird durch JPiltrierung getrennt· Der pH-Wert der vereinigten salasauren Acοton-Lösung wird mit 40 S&-iger Natronlauge auf 7 eingestellt, -das

gefällte Präaipitat filtriert und dann das Verhältnis WaeserjAceton durch Zugabe von 12 1 Aceton auf 1»5 eingestellt. Die Suspension wird über Nacht b«i 5⁰G stehen gelassen, dann wird das die aktiven Polypeptide enthaltende Präzipitat abfiltriert, daa

entfernt
Aceton mittels Lüftung/und schlieeelich das pitat in 2 1 Wasser gelöst. Die Aktivität der auf diese Weise erhaltenen Lösung beträgt 350 TIB (54 %

der Aktivität des ursprünglichen Organextrakte) und

89 000 000 KIBj Reinheitsgrad: 2,5 TIB/g Protein,

Beispiel 2

1 kg Rinderparotis wird mit 2,5 1 einer 0,5 S6-igen wässrigen Oxcl säure -Lösung bei Zimmertemperatur anderthalb Stunden gerührt. Der pH-Wort der Lösung wird unter Rül r&n durch Zugabe von gepät» tigter CaCOHjj-Lösung auf 6,0 eingestellt, und dann wird die Lösung zentrifugiert. Die Gesamtaktivität der derart erhaltenen klaren Lösung beträgt 2,0 TIB und 650 000 KIB; Aschengehalt der Lösung» 0,08 %\ Proteingehalt der Lösung: 4 mg/ml,

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Die Loounc wire! mit 1 Gew. % Bentonit eine Stunde bei Zimmertemperntür gerührt* Mach Absetzen des iidsorbenten wire! eier grösste Teil der ttberschwimmenden Lösung abgesaugt, das Adsorbent filtriert und mit wenig Wasser gevaschen. Danach werden die aktiven Polypeptide mit 200 al einer 50 %-igen, rait HCl auf eine Normalität von M/l eingestellten ,Aethanol-Lösung in 2 Portionen eluiert. Das Eluat wird mit einer 4N ttthanolieehen Kött-Lösung neutralisiert, wonach das ausgeschiedene Prä—

zipitat, daa einen Teil der Verunreinigungen enthält, filtriert und daa Methanol aus der neutralen Lösung im Vakuum ab el es ti liiert wird. Die wässrige Lösung enthält 0,95 TIE und 300 000 KE; Reinheitsgrad: 4,0 TIE/g,

Beispiel 3

10 kg iünderlun^e werden mit 30 1 einer mit Phosphorsäure auf pH 2,0 eingestellten wässrigen Lösung bei Zimmpertempcrntur gerührt. Dann wird das Gemisch auf 7O⁰C erwärmt, der Orsanrest warja mit Hilfe einer Pilterprcsse entfernt, die Lösung durch Zugabe von einer ccaättigten Ca(OH)₂-Lösung auf einen pH-Wert von 5,3 eincosiellt und dae aue«· geschiedene Präzipitat absetzen gelaasen. Der grösste Teil dor klaren Lösung wird abgesaugt und der abgesetzte Teil zentrifugiert. Die derart erhaltene Lösung enthält insgesamt 17 000 000 KEB und 59 TU« Der Extrakt wird durch eine SHuIe fIiessen

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gelassen, die 500 c Dccoloo Y in H⁺-CyklUB enthHlt· Die Säule wird mit wenig Wasser Gewaschen· Dann werden die Gebundenen Polypeptide mit Hilfe einer 50 St-ißen wässrigen .üothanol-Lösunc, -dessen Normalität mit HCl cuf N/5 eingeteilt wurde, langsam eluiert· Der vereinicten sauren alkoholischen Lösung wird 3-fechcs Volumen Aceton au^OGobon. Das abgeschiedene Präsipitot wird am nächsten Tag getrennt und In 400 ml Wasser golöst« Die Lösung enthält 31 KK und 9 000 000 KIE mit eine* Beinhalte» grad »on 1,5 TIB/e-.

Boiepiel 4 .

10 k£ fein zerkleinerte Rinderpankroae werden 2 Stunden mit 30 1 einer N/10 h^SO^LUsung boi Zimmertemperatur £erUhrt, Dann wird eine gesättigte BaCOH)₂-Löeuac zu ;esetzt, bis der pH-Wert der LBBung 5,3 erreicht· Der Orsanrest, das BaSO^- -Prfislpltat und <*.le nusrof fill ten Proteine wort'3 η durch Zentrifugieren entfernt. Die erhnltone klare LtSsunc enthält 4 800 0OC KIE und 19 TIB.

Dann werden 225 ζ Bleicherde dem Extrakt zugegeben und das Gomiach wird 2 Stunden Gerührt· Nach vorheriger Absetzung wird der crösste Teil der LtfsunG, die schon keine aktiven Polypeptide enthält, abgesaugt, die Bleicherde wird filtriert und mit 1 Liter einer N/100 H₂SO^-LOSUn;- Gewaschen« Dann werden die oktiven Polypeptide mit insgesamt 1500 ml einer 70 %-i£on Ifethnnol-Lösun^, deren Nox*

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malität mit HgSO^ auf N/5 eingestellt wurde, in 3 Portionen eluiert. Das vereinigte Bluat wird durch Zugabe von einem CaO-Wasser Gamisch von eignem Verhältnis 1:10 auf pH 7 eingestellt· Dee ß&*

fällte Kai ζ iumsulphn t und <Ue gefällten Verunreinigungen werden filtriert* Der klaren Lösung wird 4-faches Volumen /.ceton zugoceben. Das Präzipitat wird am nächsten Tee filtriert und/180 ml Wasser Celöst. Die Lösung enthält insgesamt 12 TIB und 3 000 000 KIB, mit einem Reinheitsgrad von Protein.

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE

   1, Verfahren zur sauren Extraktion und Gewinnung in gereinigter Form von Polypeptiden mit kallikrein- und trypsin-hemmender Wirkung otie tierischen Organen, dadurch gekennzeichnet ,< dass die zu extrahierenden tierischen Or» gone aerkloinert und dann mit saurem Wasser extrahiert worden, wobei das Wasser solche Säure oder Säuren enthält, aus der oder denen im pH-Bereich von 4,5 bia 8,0 ein Salz gebildet werden kann, dessen Löslichkeitsprodukt bei Zimmertemperatur kleiner ist als 10 , wonach der Organextrakt mit dem Oxyd und/oder Hydroxyd eines Metalle beherv deIt wird, dessen Kntion mit der zur Extraktion verwendeten Säure ein Salz bildet, dessen Löslichkeitsprodukt bei Zimmertemperatur kleiner ist

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   als 10 , wonach da# extrahierte Organ und der Salzniederschlag abgetrennt, aus dem Organextrakt die aktiven Polypeptide an einem Adsorbent von Silikat-Typ bei einem pH-Viert von 5 bis 7 gebun-

   und den, das Adsorbent abgetrennt ,/mit saurem Wasser gewaschen wird, dann die aktiven Polypeptide mit einem mit saurem Wasser von einem pH-Wert unter 3 Verdünnten polaren organischen Lösungsmittel eluiort werden und das derart erhaltene saure Eluat in bekannter Weise weiter gereinigt wird,

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   2, Verfahren nach Anspruch 1, dodurch gekennzeichnet, dass Oxalsäure, Schwefelsäure und/oder Phosphorsäure als Säuren varwexidet werden» die im pH-Bereich von 4,5 bis 8,0 ein SeIz bilden, dessen Löslichkeitsprodukt bei Zimmerteejwratur

   JL

   kleiner ist als 10 .

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, clsss Kalzium-, Barium- und/oder Strontium-»oxyd oder -hydroxyc! als das Oxyd oder Hydroxyd eines Metalls, Jessen Kation mit aer »up Extraktion verwendeten Säure ein Salz bildet, dessen LÖ8uri£Sprodukt bei Zirrimertenipeiwtur kleiner iet

   -4
   10 ■> verwendet werden·

   4, Verfahren noch einom de* vorhertgon Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Opganextrakt vor der Entfernung des extrnhierton Organs

   mit dem Genannten Metnlloxyc¹. und/oder Metollhya behandelt und das ausgefeilte Pröaipitat mit dem extrahierten Orcan zuoanimen getrennt wird.

   5, Verfahren noch einem 3er vorhericen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mit Säure behandeltes Bentonit o.'er synthetische Zeoliten als Adsorbentien von Silikat-Typ verwendet werden,

   6, Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch ceKormzcichnet, dass die aktiven Polypeptide mit einem niederen Alkohol oder Keto.n eluiert vverlen, welche mit .Vassor von einem pH-Wert unter 3 auf eine Konzentration von 30-90 % verdünnt wurden·

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   t% Verfahren nnch einem der vorherigen Ansprüchef dadurch Gekennzeichnet, dose das Bluierunssmittel mit Oxalsäure» Schwefelsäure und/oder

   Phosphorsäure angesäuert und nach Bluieren die Säure in Form eines schwor löslichen Sn lags ontfemt wird.

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