DE1443474C

DE1443474C - PGE tief 2, PGE tief 3, deren Methyl ester, PGF tief 2 alpha, dessen Methylester und Methylesteriacetat

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Publication number: DE1443474C
Authority: DE
Inventors: Der Anmelder Ist
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Publication date: 1971-04-15

Description

Gegenstand der Erfindung sind

PGE₂ = 7-[3</-Hydroxy-2-(3-hydroxy-l-octenyl)-5-oxocycIopentyl]-5-heptensäure, PGEj = 7-[3(<-Hydroxy-2-(3-hydroxy-l,5-qctadienyl)-5-oxocyclopentyl]-5-heptensäure,deren Methylester, PGF₂ j, = 7-[3«-Hydroxy-2-(3-hydroxy-l-qctenyl)-5u-hydroxycyclopentyl]-5-heptensäiire, deren

Methylester und Methylestertriacetat. ■■-..· ,.■....-.-...

PGE₂, PGE₃ und PGF₂J können durch die allgemeine Formel HOOC(CH₂)₃ — CH = CH — CH₂ — HC CH — CH = CH

Y=C

CH-OH CH — CH₂ — CH — CH — CH₂ — CtIT₃ OH

/
CH,

dargestellt werden, in der Y Sauerstoff oder.die Gruppe H, H-OH bedeutet, wobei die Kohlenstoffatome 5 und 6 des Octylrestes, wenn Y Sauerstoff ist, durch eine Einfach- oder Doppelbindung miteinander verbunden sind. Bedeutet Y = H, «-OH, so sind die Kohlenstoffatome 5 und 6 des Octylrestes durch eine Einfachbindung miteinander verbunden.

Die neuen Verbindungen sind pharmakologisch wirksam. Sie regen die glatte Muskulatur an und beeinflussen den Blutdruck. ■ . ·

Hinsichtlich der stimulierenden Wirkung auf die glatte Muskulatur mit PGF₂, im Vergleich zu PGF₁₁ am Zwölffingerdarm des Kaninchens und am Meerschweinchendarm durchgeführte Versuche führten zu den folgenden Werten. Sie geben die Wirksamkeit in bezug auf PGE₁ = 100, ausgedrückt als Bereich zwischen zwei Standardkonzentrationen (die eine ■ geringe bzw. submaximale stimulierende Wirkung verursachen) an und zeigen die Überlegenheit des PGF₂₁.

PGF₁₁
PGF₂₁

Zwölffingerdarm
des Kaninchens

Π 000, 333
)-- 2000

Meerschweinchendarm (Ileum)

<:ioo> so

<'500> 100

40

Ebenfalls überlegen ist die blutdruckerhöhende Wirkung des PGF₂₁. Zur Erzielung der gleichen Blutdrucksteigerung ist bei intravenöser Verabreichung an Ratten von PGF₂, nur etwa ein Drittel (0,0032 mg/kg) der von PGF₁, benötigten Dosis (0,01 mg/kg) erforderlich.

Außerdem wurde festgestellt, daß PGF₂, hinsichtlich der Unterbrechung der Schwangerschaft bei Ratten lOinal so wirksam ist wie PGFi₁, wenn diese Verbindungen an drei aufeinanderfolgenden Tagen vom 4. bis 13. Tag nach dem Coitus subcutan verabreicht werden. .

Die Untersuchung von PGE₂ und PGE₃ in hezug auf PGE₁ ergab die folgenden Werte:

Biologische Wirksamkeit
PCiE = I

Meerschweinchen,
Ileum

Hamster, Colon ...

Kaninchen,
Jejunum

45

₅o

55

60

	56	PGK₂	0,23	PC	iK.,	(4)
1,	75	-fc 0,78 (6)	0,19	±		(3)
2,	50	± 1,50(4)	0,99	±	0,19(3)
1,	t 0,50 (3)	i.	0,14
		0,90

65 Biologische Wirksamkeit
PGE = 1

	PGE,	0,37	(3)	0,31	PGE₃	0,03	(2).
1,09		0,31	(4)	0,53	±	0,46	(3)
0,76	±		(D	0,23	±		(i)
0,91		0,00	(4)	0,34		0,03	(2)
1,00	±	0,08	(4)	0,43	±	0,16	(4)
0,93	±			±

Ratten, Uterus ....

Ratten, Gastroenemius .
Muskeldurchblutung ........

HintereGliedmaßen
der Katze, Hautdurchblutung ...

Kaninchen,
Blutdruck ..

Kaninchen, Eileiter

Die Zahlen in Klammern geben die Zahl der Werte an. aus denen die Durchschnittswerte ermittelt wurden.

Die obigen Daten zeigen, wie verschiedenartig die biologischen Spektren von PGE₁, PGE₂ und PGE₃ sind und daß PGE₂ auf verschiedenen Anwendungsgebieten eine stärkere Wirkung besitzt als PGE₁, d.h. selektiver wirkt. In überraschend ausgeprägter Weise kommt diese Selektivität der Wirkung beim PGE₃ zum Ausdruck, dessen Wirkung auf den Ratten-Uterus und Hamster-Colon verhältnismäßig schwach, aber auf den Kaninchen-Jejunum ebenso stark ist wie die Wirkung von PGE₁. Diese Selektivität ist für die Therapie zur Gewährleistung einer spezifischen gezielten Wirkung von besonderer Bedeutung.

Die Methylester von PGE₂, PGE₃ und PGF₂, sowie das Methylestertriacetat von PGF₂, besitzen dieselben Wirkungen wie die zugehörigen freien Säuren. .

Es ist bekannt, daß Rohprodukte aus Keimdrüsen oder Spermatozoon ζ. B. blutdruckerhöhende oder blutdrucksenkende Wirkung besitzen und die glatte Miiskulator anregen. Zum Beispiel würde 1906 von J a.p elli und S c ο ρ a (Arch. Ital. Bio!:, Bd. 45, 1906, S. 165) beobachtet, daß der Extrakt aus Hunde-, prostata ' bliitdruckerhöhciiclc. Wirkung hat. über eine blutdrucksenkende und die glatte Muskulatur anregende Wirkung dieser Extrakte wurde 1930 von K u r ι r ο k (Proc. Soc. Exp. Biol., N. Y., Bd. 28, 1930, S. 268), 1933 von G ο I d b I a 11 (Chem. e. Ind., Bd. 52,

1933, S. 1056) und 1931 bis 1936 von Euler (Arch. Exp. Path. Phannak., Bd. 175, 1934, S. 78; Bd. 181, 1936, S. 181; J. Physiol., Bd. 72, 1931, S. 74; Bd. 81,

1934, S. 102; Bd. 84, 1935, S. 21; Bd. 88, 1936, S. 213;

Klin. VVschr.. Bd. 14,1935,S. 1182) berichtet. Bezüglich eines als Prostaglandin bezeichneten Rohmaterials bemerkte v. E u 1 e r, daß es blutdrucksenkende und die glatte Muskulatur anregende Wirkung besitzt.

IrTjüngerer Zeit wurden aus Rohmaterialien, z.B. dem Eulerschen Prostaglandin oder direkt aus Keimdrüsen, z. B. Prostata und Spermatozoon, zwei verschiedene als PGE und PGF, neuerdings als PGE₁ und PGF_la bezeichnete Verbindungen in im wesentlichen reiner kristalliner Form isoliert (s. britische Patentschrift 851 827 und »Acta Chemica Scandinavia«, Bd. 14, 1960, S. 1693 bis 1705):

FGE = PGE₁ = 7-[3«-Hydroxy-2-(3-hydroxy-l-octenyl)-5-oxocyclopentyl]-heptansäure und PGF = PGF₁₁= 7-[3(i,5a-Dihydroxy-2-(3-hydroxy-l-octenyl)-cyclopentyl]-heptansäure.

Sie haben also die allgemeine Formel ■

HOOC(CH,)₆— HC -CH — CH = CH — CH — (CH₂J₄- CH₃

Y=C CHOH

·■ \ / ..
CH₁

in der Y=O oder H, «-OH bedeutet.

Die gleichen und verwandte Verbindungen wurden auch in anderen tierischen Geweben und Sekreten gefunden. Diese Verbindungen sind in den sie enthaltenden Materialien und in Rohextrakten von Antigenen und fiebererzeugenden Stoffen, z. B. Gewebefragmenten, Lipoiden, Zelltrümmern, artfremden Proteinen u. dgl., begleitet und eignen sich daher nicht für die parenterale Anwendung. Ihre Isolierung in einer von Antigenen und fiebererzeugenden Stoffen freien Form ermöglicht die Nutzbarmachung ihrer pharmakologischen Eigenschaften, ohne daß unerwünschte Nebenerscheinungen, auftreten.

Es wurde nun gefunden, daß auch andere Verbindungen als PGE₁ und PGF,j, nämlich Bisdehydro-PGE₁ (= PGE₂), Tetradehydro-PGE, (= PGE₃) und Bisdehydro-PGF₁₁ (= PGF₂₁) die glatte Muskulatur anregen und den Blutdruck beeinflussen, PGF₂J diese Wirkung jedoch in stärkerem Maße besitzt als PGF₁₇ und PGE₂ sowie PGE₃ selektiver wirken als PGE₁." Sie können in von Antigenen und fiebererzeugenden Stoffen freier Form aus tierischen Geweben gewonnen werden. Man geht hierzu von den rohen Säuren aus, die durch Extraktion lipoidhaltiger tierischer Gewebe mit lipophilen Lösungsmitteln erhalten werden, und unterwirft diese einer Fraktionierung durch mehrstufige Phasenumkehr-Trenhehromatographie. Hierzu werden die rohen Säuren (I) unter Verwendung von I g chromatographischen Trennmaterials je 50 bis 250 mg roher Säuren einer ersten Phasenumkchr-Trennchromatographie unterzogen, (2) die erhaltenen Fraktionen mit PGE₁- bzw. PGFtj-VVirksamkeit gesammelt, (3) die Materialien mit PGE₁- bzw. PGF₁₁-Wirksamkeit in einer Menge von nicht mehr als 25 mgje Gramm chromatographischen Trennmaterials mindestens einer weiteren Phasenumkehr-Trennchramatographie unterworfen, wobei bei jedem Phasenumkehrtrennchromatographieverfahren eine Lösung eines mit Wasser mischbaren Alkohols in Wasser im Verhältnis 3:5 bis 5:3 als bewegliche Phase und eine lipophile Lösung eines mit Wasser nicht mischbaren Alkanols in einem chlorierten Kohlenwasserstoff im Verhältnis 3 : 5 bis 5 : 3 als stationäre Phase verwendet wird, (4) die bei der weiteren chromatographischen Trennung erhaltenen Fraktionen mit PGE₁- bzw. PGF,-Wirksamkeit gesammelt und (5) aus diesen Fraktionen im wesentlichen von PGE₁ freies PGE, und/oder PGE₃ bzw. von PGF₁₁ freies PGF₂J gewonnen. Die auf diese Weise erhaltenen Verbindungen können anschließend in üblicher Weise OH

in die Methylester und PGF₂ \ auch in das Methylestertriacetat umgewandelt werden. Die vorstehend genannten Derivate von PGE₂, PGE₃ und PGF_2i besitzen die gleiche Wirkung wie die freien Säuren. Die Methylester können nach bekannten Verfahren

hergestellt werden, z. B. durch Umsetzung mit Diazomethan.

Das Triacetat erhält man in üblicher Weise durch Umsetzung von PGF₂j-Methylester mit Essigsäureanhydrid oder -halogenid, vorteilhaft in Gegenwärt

yx eines Säure bindenden Mittels, wie Pyridin oder Trimethylamin, in Gegenwart oder Abwesenheit eines inerten Lösungsmittels, wie Dioxan oder Methylenchlorid. Die Reaktionstemperatur wird vorzugsweise niedrig gehalten, z. B. zwischen etwa 10 und etwa 40° C.

Die rohen Verbindungen können durch überführung in die Methylester und das vorstehend genannte Methylestertriacetat und Regenerierung der Carboxylgruppe bzw. der alkoholischen Hydroxylgruppen gereinigt werden. PGE₂ und PGE₃ enthalten eine /f-ständige Hydroxycyclopentanon- und eine Allylalkoholgruppe, während PGF₂₀, nur eine Allylalkoholgruppe aufweist. Die genannten Gruppen sind gegen niedere wie hohe pH-Werte außerordentlich empfindlich. Ihre Isolierung erfordert daher milde, die Gruppen nicht beeinträchtigende Bedingungen.

Für die Gewinnung der als Ausgangsmaterial dienenden rohen Säuren eignet sich eine Vielzahl natürlicher tierischer Stoffe. Besonders vorteilhaft sind an Lipoiden reiche Materialien, wie Lunge, Leber, Niere, Zwölffingerdarm, Knochenmark, Rükkenmark, Fischmehl und Hühnerfleischabfälle, ferner Spermatozoon und Prostata von vielen Tieren, wie Fischen, Vögeln und Säugetieren, z. B. Hühnern, Schweinen, Schafen, Rindern und auch vom Menschen. Die Herstellung der als Ausgangsmaterial benötigten rohen Säuren erfolgt durch Extrahieren, Konzentrieren, Fraktionieren usw. in Gegenwart von Puffersubstanzen unter milden Bedingungen, die extreme pH-Werte und Temperaturen vermeiden. Vorzugsweise extrahiert man das die aktiven Bestandteile enthaltende Rohmaterial, um die aktiven Bestandteile von den Zelltrümmern, dem Gewebe und soweit wie möglich von inerten unlöslichen Stoffen zu trennen,

worauf man die aktiven sauren Bestandteile durch Kontakt mit einem säureaffinen Material, wie wäßrige Pufferlösungen oder Anionenaustauscherharzen vom Extrakt trennt.

Die Extraktion erfolgt vorteilhaft in zwei Stufen, wobei das Rohmaterial zuerst mit einem mit Wasser mischbaren Alkanol, z. B. Methanol, Äthanol oder Isopropanol, extrahiert und das extrahierte Material dann in ein mit Wasser nicht mischbares Hlophiles Lösungsmittel übergeführt wird. Dies erreicht man dadurch, daß man den Alkanolextrakt zu einer im wesentlichen wäßrigen Aufschlämmung einengt und die erhaltene wäßrige Lösung mit dem mit Wasser nicht mischbaren lipophilen Lösungsmittel extrahiert. Für diesen Zweck geeignete, mit Wasser nicht mischbare lipophile Lösungsmittel sind unter anderem chlorierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Methylenchlorid, Chloroform und Äthylendichlorid; niedere Fettsäureester, ζ. B. Äthylacetat und Amylacetat; höhere Alkanole, z. B. mit Wasser nicht mischbare Butanole, Pentanole, Hexanole und Oktanole; mit Wasser nicht mischbare niedere Alkanone, z. B. Methylisobutylketon; Äther, z. B. Dimcthyläther, Di.äthyläther, Methylisobutylather;aromatische Kohlenwasserstoffe, z. B. Benzol oder Toluol. Gegebenenfalls kann das Rohmaterial direkt mit den mit Wasser nicht mischbaren lipophilen Lösungsmitteln extrahiert werden.

Die auf diese Weise erhaltenen unreinen Extrakte werden dann zur Isolierung'der Carbonsäuren behandelt. Die rohen Extrakte sind im allgemeinen durch unerwünschte Fette, Fettsäuren und andere Stoffe verunreinigt. Diese Verunreinigungen werden durch einmalige oder mehrmalige Verteilung zwischen einer lipophilen Phase, z. B. den in der Extraktionsstufe erhaltenen Lösungen in lipophilen Lösungsmitteln und wäßrigen gepufferten alkalischen Lösungen, ζ. Β. wäßrigen Phosphat-, Bicarbonät- und Tris-(hydroxymethylamino)-methanlösungen. abgetrennt. Es kann jede wäßrige, auf einen pH-Wert von 8 bis 9 gepufferte Lösung verwendet werden. Die lipophile Phase wird mit der gepufferten wäßrigen Phase extrahiert. Die gepufferte wäßrige Phase wird dann auf einen pH-Wert von etwa 3 bis 4 angesäuert. Darauf wird eine nochmalige Verteilung in das gleiche oder ein anderes lipophiles Lösungsmittel bewirkt. Durch geeignete Wahl des Puffer-pH-Wertes und des lipophilen Lösungsmittels werden wirksame Verteilungskoeffizienten erzielt. Gegebenenfalls kann die Verteilung zwischen dem Puffer und der lipophilen Phase durch Gegenstromverteilung erfolgen. Bei ausreichend vielen Übertragungen, besonders mit wenig polaren lipophilen Lösungsmitteln, z. B. Äther bei niedrigen pH-Werten, z. B. einem pH-Wert von etwa 8, werden die Säuren vom PGE,-Typ in der lipophilen Phase angereichert, während sich die Säuren vom PGF,-Typ im Puffer konzentrieren. Es ist jedoch nicht notwendig und gewöhnlich auch nicht erwünscht, die Verbindungen vom PGE_i: und PGF₁-Typ in dieser Stufe voneinander zu trennen. Es sollen lediglich alle pharmakologisch wirksamen Säurekomponenten in die letzte Pufferphase extrahiert und dann in ein flüchtiges Lösungsmittel, z. B. Äther, übertragen werden, aus dem die rohen Säuren durch Eindampfen im Vakuum gewonnen werden können.

Der übergang der wirksamen Säuren von einer Phase in die andere kann durch quantitative In-vitro-Versuche bezüglich der muskelstimulierenden Wirkung (von Euler, Archiv für Physiologie, Bd.77, 1937, S. 96 bis 99) verfolgt werden. Der Gesamtgehalt an Fettsäuren läßt sich durch Mikrotitration mit verdünntem Alkali feststellen. Die Säuren vom PGE₁-Typ (Cyclopentanone) können von den Säuren vom PGF_rTyp (Cyclopentanole) leicht durch die charakteristische Carbonylabsorption im infraroten Bereich bei 1730 cm"¹ und durch die nach Behandlung mit Alkali auftretende Ultraviolettabsorption bei 280 τημ unterschieden werden.

Die aktiven Säuren können aus den rohen Extrakten auch durch Adsorption auf Anionenaustauscherharze und nachfolgende Elution gewonnen werden. In diesem Fall kann die übertragung in ein mit Wasser

ίο nicht mischbares Lösungsmittel wegfallen, und der mit einem mit Wasser mischbaren Alkanol erhaltene Extrakt kann direkt auf den Ionenaustauscher aufgebracht werden. Geeignete Anionenaustauscherharze sind durch Chlormethylierung von Polystyrolharzen,

die gegebenenfalls mit Divinylbenzol vernetzt sind, erhältlich (vgl. Kunin, »Ion Exchange Resins«, 1958, S. 88 und 97). Die absorbierten Säuren können mit Lösungsmitteln für die Säuren, z. B. mit den oben aufgezählten Lösungsmitteln, eluiert und mit Chlorwasserstoffsäure oder Ammoniumchlorid auf einen pH-Wert von 3 bis 4 angesäuert werden. Hierfür können auch wäßrige Lösungen von mit Wasser mischbaren Alkanolen und Ammoniumchlorid, z. B. eine 50%igc Lösung von Ammoniumchlorid in 70prozentigem wäßrigem Methanol, verwendet werden.

Die nach dem einen oder anderen Verfahren aus den rohen Extrakten als Ausgangsmaterial gewonnenen rohen Säuren werden dann durch mehrstufige Phasenumkehr-Trennchromatographie fraktioniert. Gegebenenfalls kann eine übertragung von einem stark unpolaren Lösungsmittel, z. B. Petroläther oder einem ähnlichen Kohlenwasserstofflösungsmittel, in ein hydrophiles Lösungsmittel, vorteilhaft eine wäßrige Lösung eines mit Wasser mischbaren Alkanols, zwischengeschaltet werden, um eine Abtrennung der

• stärker unpolaren Verunreinigungen zu bewirken. Bei der Extraktion der unpolaren Lösungsmittellösung mit einer wäßrigen alkoholischen Lösung verbleiben die stärker unpolaren Bestandteile im unpolaren Lösungsmittel.

Bei der mehrstufigen Phasenumkehr-Trennchromatographie wird die Säule in der ersten Stufe stark beladen, um eine rohe Trennung der gewünschten aktiven Säuren von den mehr oder weniger'polaren Bestandteilen zu erreichen. In der nachfolgenden Stufe werden die aktiven Fraktionen aus der ersten Stufe in wesentlich geringerer Konzentration auf die Trennsäule aufgebracht, um eine wirksamere Trennung in die Einzelbestandteile zu erreichen. In der ersten Stufe können 50 bis 250 mg rohe Säure je Gramm chromatographischen Trennmaterials eingeführt werden, während nachfolgend nicht mehr als etwa 25 mg Säure je Gramm Trennmaterial verwendet werden sollten. Geeignet für die chromatographischen

• 55 Trennsäulen sind hydrophober Diatomit (mit Chlormethylsilan behandeltes Kieselgur) oder feinteiligcs Tieftemperatur-Polyäthylen. Letzteres wird vorzugsweise in der ersten Stufe verwendet. Es kann jede als Filterhilfe verwendete Diatomeenerde mit Chlormethylsilan hydrophob gemacht werden. Die gut fließenden Typen sind besonders geeignet. Gegebenenfalls können die Zwischenfraktionen zum Auskristallisieren der, Verbindungen von PGE,^:Typ behandelt werden, bevor weiter fraktioniert wird. Als stationäre Phase bei der Phasenumkehrtrennchromatpgraphie dient ein lipophiles Gemisch aus mit Wasser nicht mischbaren Alkanolen und chlorierten Kohlenwasserstoffen in einem Verhältnis Von etwa 3:5 bis 5:3,

als bewegliche Phase eine Lösung eines mit Wasser mischbaren Alkanols in Wasser im Verhältnis von etwa 3 :5 bis 5 :3. Der hydrophobe Träger zeigt somit Affinität zur stationären Phase, nicht aber zur beweglichen Phase. Dementsprechend werden die stärker polaren Bestandteile in der beweglichen Phase und die weniger polaren Bestandteile in der stationären Phase angereichert. Man mischt die beweglichen und die stationären Lösungsmittel und läßt sich ein Gleichgewicht einstellen, wobei sich zwei Phasen bilden. Die stationäre Phase wird dann auf die Säule gegeben. Darauf .fügt man die Beschickung zu, vorzugsweise gelöst oder vermischt mit einer kleinen Menge einer der Phasen, vorzugsweise der beweglichen Phase. Darauf wird die Säule mit der beweglichen Phase eluiert.

Verwendet man ein Lösungsmittelsystem aus einem mit Wasser mischbaren Alkanol und Wasser im Verhältnis 9:10 bis 10:9 und einem mit Wasser nicht mischbaren Alkanol und Chloroform im Verhältnis 9:10 bis 10:9, so kann durch zweistufige Phasenumkehr-Trennchromatographie unter Anwendung der oben angegebenen Beschickungsbedingungen eine wirksame Auftrennung der Säuren erreicht werden. Bei der Elution wird die Verteilung der Bestandteile durch In-vitro-Analysen, Mikrotitrationen, papierchromatographische oder andere Untersuchungsmethoden verfolgt. Die gewünschten Fraktionen werden dann zur Gewinnung des Einzelbestandteils aufgefangen.

Das erfindungsgemäß erhältliche PGE₂, PGE₃ und PGF₂₀₁, deren Methylester und das PGF₂₀,-Methylestertriacetat können zusammen mit geeigneten Trägern oral, parenteral oder örtlich angewandt werden. Als Träger eignen sich inerte Substanzen, wie Wasser, Gelatine, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, pflanzliche öle, Behzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Träger. Die Präparate können in Form von Tabletten, Kapseln, Pillen, Zäpfchen, Suppositorien, Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen verarbeitet sein. Gegegebenfalls können sie sterilisiert sein und/oder Hilfsstoffe enthalten, wie Konservierungsmittel, , Stabilisierungsmittel, Netz- oder Emulgiermittel, Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks oder Puffersubstanzen. Sie können auch andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten, z. B. antibakterielle und diuretische Stoffe.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich alle Prozentsätze und Verhältnisse auf das Volumen.

Beispiel 1

Zur Herstellung der als Ausgangsmaterial verwendeten rohen Säuren wurde gefriergetrocknete Schaf-.prostata in einer Fleischhackmaschine zerkleinert. Die trockenen Drüsen (12 kg) wurden in destilliertem Wasser suspendiert, wobei je Kilogramm getrockneter Drüsen 41 verwendet wurden. Nach 15 Minuten wurden 121 95%iges Äthanol zugefügt. Die zerkleinerten Drüsen wurden etwa 1 Stunde mit einem mechanischen Rührwerk gerührt und dann über Nacht stehengelassen. Die überstehende klare Äthanollösung wurde abdekantiert und der unlösliche Rückstand durch ein Tuch filtriert. Die überstehende Flüssigkeit und das Filtrat wurden vereinigt und im Vakuum auf etwa V20 des ursprünglichen Volumens, d. h.

auf etwa 3 1 eingedampft. Dieser Rohextrakt wurde mit etwa 31 Äther extrahiert. Die wäßrige Phase wurde auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert, mit 3 1 Äther und dann noch zweimal mit je 1,51 Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden sechsmal mit einem Viertel ihres Volumens oder etwa 2,251 eines 0,2molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 8 extrahiert. Während der ersten Extraktion mußte der pH-Wert des Puffers mit 2n-Natriumcarbonat auf 8 eingestellt werden. Die vereinigten Pufferextrakte wurden mit 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und mit dem gleichen Volumen, d. h. etwa 13,51 Äther und dann noch dreimal mit je 7 1 Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden vereinigt und mit kleinen Mengen Wasser gewaschen, bis sie frei von Chloridionen waren, wobei die Waschwässer jedesmal durch eine zweite Ätherphase geführt wurden. Der Äther wurde im Vakuum abgedampft, worauf ein fester Rückstand zurückblieb.

Zur Isolierung des PGE₂ und des PGE₃ wurde der auf diese Weise erhaltene Rohextrakt auf eine Trennsäule gebracht, wobei man als bewegliche Phase 50%ig^es wäßriges Methanol und als stationäre Phase ein 50:50-Gemisch aus Isooctanol und Chloroform verwendete. Die Trennsäule bestand aus feinteiligem Tieftemperatur-Polyäthylen. Auf 100 g davon wurden 6 g Rohextrakt und 67 ecm der stationären Phase gegeben. Darauf wurde die Säule mit 2200 ecm der beweglichen Phase entwickelt. Maximale physiologische Wirksamkeit wurde bei etwa 1500 ecm beobachtet. Die Fraktionen von 700 bis 2200 ecm wurden gesammelt. Die vereinigten Fraktionen wurden eingeengt, mit Äther extrahiert und der Ätherextrakt zur Trockne eingedampft. 250 mg dieses Extraktes wurden auf eine Säule aus 45 g hydrophobem Diatomit gebracht, die mit 40 ecm stationärer Phase (Isoamylacetat—Chloroform 1:1) gesättigt war, und mit 2200 ecm beweglicher Phase (35%iges wäßriges Methanol) entwickelt. Die maximale, durch Mikrotitration und physiologische Tests ermittelte Wirksamkeit trat bei den Fraktionen 400 bis 480 ecm auf mit einem Maximum bei etwa 440 ecm. Nach der Auskristallisation des PGE₁ aus den aktiven Fraktionen unter Verwendung von Äthylacetat als Kristallisierungslösungsmittel, wobei man bei den nicht leicht kristallisierenden Fraktionen eine Chromatographie einschaltete, wurden die Mutterlaugen zur Trockne eingedampft. 250 mg davon wurden auf eine Säule aus 45 g hydrophobem Diatomit gebracht, die mit 40 ecm stationärer Phase (Isooctanol zu Chloroform 1:1) gesättigt war, und mit 2200 ecm beweglicher Phase (47,5%iges wäßriges Methanol) entwickelt. Maximale Wirksamkeit, die durch Mikrotitration und physiologische Tests ermittelt wurde, zeigte sich bei etwa 910,1430 und 1840 ecm. In diesem und in den anderen Beispielen wurden die bewegliche und die stationäre Phase vor ihrer Anwendung, wie vorstehend angegeben, ins Gleichgewicht gebracht. Aus der 1840-ccm-Fraktion wurde PGEj, aus der 1430-ccm-Fraktion PGE₂ und aus der 910-ccm-Fraktion PGE₃ isoliert. Diese Fraktionen wurden eingeengt und mit Äther extrahiert. Durch Massenspektrographie stellte man fest, daß die neuen Verbindungen, PGE₂ und PGE₃, im wesentlichen reine Verbindungen waren. Auch durch Trenn-(nicht Phasenumkehr)-Chromatographie mit einem Äthylenchlorid zu Heptan zu Essigsäure zu Wasser (15:15:6:4)-Lösungsmittelsystem wurden im wesentlichen ideale

Kurven erhalten, d. h. Kurven, die für die im wesentlichen reinen Verbindungen typisch sind. PGE₂ schmilzt bei 68 bis 69° C. Die papierchromatographische Beweglichkeit des PGE₂ und PGE₃ in-bezug auf PGE₁ bei absteigender Papierchromatographie mit Äthylenchlorid—Heptan (1:1) als beweglicher Phase und 70%iger wäßriger Essigsäure als stationärer Phase beträgt PGE₁ = 1,00, PGE₂ = 0,90, PGE₃ = 0,76. PGE₃ wurde nicht in kristalliner Form erhalten.

Eine trockeneÄtherlösung von 2,8 Mikromol kristallinem PGE₂ bzw. PGE₃ wurde mit einem leichten Diazomethanüberschuß versetzt, der in Äther aus 4 Mikromol Nitrosomethylurethan hergestellt worden war. Das Reaktionsgemisch ließ man etwa 5 Minuten stehen und destillierte dann den Äther und das überschüssige Diazomethan bis zur Trockne ab. Man erhielt die kristallinen Methylester von PGE₂ und PGE₃. In der nachfolgenden Tabelle ist die massenspektrographische Analyse der beiden Ester im Vergleich zu derjenigen des Methylesters von PGE, wiedergegeben:

Maxima in den	(I)M	Massenspektra der Methylester	PGE₂	ran
	(2) M-18		(366) ■	PGE₃
(3) M-2X18		348	(364)
(2)-31		330	346
(3)-31		317	328
(2)-71		299 .	315
(3)-71		277	297
(2)-69		259
(3)-69
(2)-143 + 1 .			277
(3)-143 + 1			259
(2)-141 + 1
(3)-141 + 1
	190
	188
PGE₁
(368)
350
332
319
301
279
261



190

192

Beispiel 2

Die Herstellung der als Ausgangsmaterial verwendeten rohen Säuren erfolgte wie im Beispiel 1 angegeben mit der Abweichung, daß man, abgesehen von der letzten Extraktion, worauf zur Trockne eingedampft worden war, an Stelle von Äther Äthylacetat verwendete. Der getrocknete Rückstand wurde in Petroläther aufgenommen und dreimal mit dem gleichen Volumen 57%'gen wäßrigen Äthanols extrahiert. Der wäßrige Äthanolextrakt wurde zur Entfernung des Äthanols im Vakuum eingeengt. Die wäßrige Phase wurde mit Äther extrahiert und der Ätherextrakt zur Trockne eingedampft. Der auf diese Weise erhaltene Rohextrakt wurde dann auf eine Trennsäule gebracht, wobei man als bewegliche Phase 50%'ges wäßriges Methanol und als stationäre Phase ein 50: 50-Gemisch aus Isooctanol und Chloroform verwendete. Die Trennsäule bestand aus fein-35

teiligem Tieftemperatur-Polyäthylen. Auf 100 g dieses Materials wurden 7 g Rohextrakt und 67 ecm stationäre Phase aufgebracht. Die Säule wurde dann mit 2200 ecm beweglicher Phase entwickelt. Maximale physiologische Wirksamkeit wurde bei etwa 1500 ecm beobachtet. Die Fraktionen von 700 bis 2200 ecm wurden gesammelt. Die vereinigten Fraktionen wurden zu einer wäßrigen Phase eingeengt, mit Äther extrahiert und der Ätherextrakt zur Trockne ein-,o gedampft. ^

Durch Phasenumkehr-Chromatographie dieses Extraktes nach dem für die letzte Stufe des Beispiels 1 angegebenen Verfahren erhielt man im wesentlichen reines PGE₂ und PGE₃.

B e i s ρ i e 1 3

Bei Anwendung des im Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens und Verwendung der aus Schaflunge erhaltenen rohen Säuren wurde in der letzten Trennsäule eine maximale Wirksamkeit bei etwa 850 ecm festgestellt. Beim Eindampfen der Spitzenfraktionen zur Trockne erhielt man im wesentlichen reines PGF_2a. Die gleiche Verbindung wurde bei Verwendung von Schweinelunge erhalten. Die massenspektrographische Analyse ergab, daß die Verbindung im wesentlichen rein war. PGF_2a ist bei Raumtemperatur eine Flüssigkeit; [a]^? ₀ ⁵ = 27" (in Äthanol); Infrarot-Absorptionsmaximum bei 3350, 1.720, 1220, 1050 und 970 cm"¹. Nachfolgend ist die papierchromatographisehe Beweglichkeit des PGF₂₁₁ in bezug auf PGE₂, PGE₁ und PGF_la bei absteigender Papierchromatographie mit Äthylenchlorid—Heptan (1:1) als beweglicher Phase und 70%iger Essigsäure als stationärer Phase angegeben:

PGE₁ (1,00)

PGE₂ (0,90)

PGF₁₁ (0,64)

PGF_2a (0,60)

Die entsprechenden Daten Tür den nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhaltenen Methylester des PGF_2a und das durch Umsetzung des Esters mit Essigsäureanhydrid in Pyridin erhaltene Methylestertriacetat sind:

45

PGF₁
PGF

iß

2tt

Methylester

1,11
1,00
0,91

Methylcstertriacetat

1,14 1,00 0,99

Bedingungen: Entspannungsverdampfung: 220"C; Kolonnentemperatur: 200" C; Kolonnendruck:

1 kg/cm²; Kolonne 1,83 χ 5 mm, gefüllt mit 0,5% fluoriertem Alkylsilikonpolymerem auf zerkleinerter klassifizierter, mit 1 bis 2% Natriumcarbonat calcinierter Diatomeenerde entsprechend der Beschreibung von Vanden Heuvel,Haahti und Horning in Journ. Am. Chem. Soc, Bd. 83, 1961, S. 1513.

Verbindungen der allgemeinen Formel
HOOC(CH₂)₃—CH=CF1—CH₂—HC-

Y=C

Claims

Patentansprüche:

CH — CH = CH — CH — CH, — CH — CH — Cl I, — CH₃ CH-OH OH

/
CH₂

in der Y Sauerstoff oder die Gruppe H, «-OH bedeutet und die Kohlenstoffatome 5 und 6 des an den Cyclopentanring gebundenen 3-Hydroxyoctenylrestes, wenn Y Sauerstoff ist, durch eine Einfach- oder Doppelbindung und wenn Y=H, «-OH ist, durch eine Einfachbindung miteinander verbunden sind, deren Methylester und das Methy iestertriacetat der Verbindung der vorstehenden allgemeinen Formel mit Y = H, «-OH.