DE2400931C2

DE2400931C2 -

Info

Publication number: DE2400931C2
Application number: DE2400931A
Authority: DE
Inventors: Derek Harold Richard Prof. London Gb Barton; Robert Henry Cambridge Mass. Us Hesse; Ezzio Garran Au Rizzardo
Original assignee: RESEARCH INSTITUTE FOR MEDICINE AND CHEMISTRY Inc CAMBRIDGE MASS US
Current assignee: RESEARCH INSTITUTE FOR MEDICINE AND CHEMISTRY Inc CAMBRIDGE MASS US
Priority date: 1973-01-10
Filing date: 1974-01-09
Publication date: 1987-10-29
Also published as: DK158786B; NL187010B; AR213608A1; SG68389G; AU6434974A; JPS51110554A; JPS50100216A; DK158786C; FR2213053A1; MY104375A; JPS50100045A; JPS581116B2; CA1055011A; IE40496B1; CH603571A5; IE40496L; HK98589A; JPS5854160B2; GB1463985A; JPS5745740B2

Description

Die Erfindung betrifft 1α-Hydroxy-vitamin-D₃, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung.

In dem älteren Patent DE 22 59 661 ist eine Synthese einer Substanz beschrieben, von der gesagt wird, daß sie 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ ist, die jedoch eine Aktivität bei der Heilung von Rachitits zeigt, die nur leicht besser ist als diejenige von Vitamin-D₃, während die Mobilisierung von Calcium im Knochengerüst, um das Serumcalcium zu erhöhen, niedriger ist als diejenige von Vitamin-D₃. Es wird von dieser Substanz gesagt, daß sie "Vitamin-D-ähnliche Wirksamkeit" aufweist.

Erfindungsgemäß wurde reines kristallines 1α-Hydroxy-vitamin-D₃, das weiter unten charakterisiert ist, hergestellt, und es wurde überraschenderweise gefunden, daß seine Aktivität sehr viel höher ist als diejenige von Vitamin-D₃, beispielsweise zehnmal oder noch höher und daß es gegen viele Vitamin-D-resistente Krankheiten wirksam ist. Weiterhin ist es schnell wirkend und seine biologische Wirksamkeit ist rasch beendet, so daß die bisher auftretenden Probleme der Vitamintoxizität durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanz im wesentlichen vermieden werden.

Erfindungsgemäß wird die Verbindung 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ geschaffen, mit dem Schmelzpunkt beim Umkristallisieren aus Ether/Pentan von 128 bis 129°C bei einer Erwärmungsgeschwindigkeit von 1°C pro 25 Sekunden und dem Verhältnis λ 264 nm/λ 229 nm von 1,87±10%.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von 1α-Hydroxy-vitamin-D₃, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 1α-Hydroxy- oder 1α,2α-Epoxy-cholesta-4,6-dien-3-on oder ein 1α-Hydroxyl-geschütztes Derivat davon mit Lithium, Natrium, Kalium oder Calcium in Ammoniak oder einem flüssigen Alkylamin in Anwesenheit eines Ammonium- oder Aminsalzes und in Gegenwart eines inerten organischen Lösungsmittels reduziert, das gebildete 1α-Hydroxy- cholesterin oder eine 1α-Hydroxyl-geschützte Form davon in 1α,3β-Dihydroxy-cholesta-5,7-dien durch Dehydrierung überführt, das Dien bestrahlt und das erhaltene 1α-Hydroxy-prävitamin-D₃ durch Erwärmen in das 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ überführt.

Bei der Synthese von 1α-Hydroxy-cholesterin gab es bisher eine Reihe von Schwierigkeiten, da es im allgemeinen erforderlich ist, die 1α-Hydroxylgruppe durch eine Art Michael-Addition in das Δ ^1,2,-3-Ketosteroid einzuführen. Die nachfolgende Bildung der gewünschten 5,6-Doppelbindung ist schwierig, da die 1α-Hydroxylgruppe, die in β-Stellung zu einer Carbonylgruppe steht, eliminiert werden kann, und außerdem ist es schwierig, die 3-Ketogruppe zu der 3β-Hydroxy- gruppe mit hoher Stereospezifität unter Verwendung bekannter Verfahren zu reduzieren.

Ein Syntheseweg für 1α-Hydroxycholesterol wird von Pelc und Kodicek (J. Chem. Soc., 1970 [C], 1624) beschrieben. Bei diesem Verfahren wird 6β-Hydroxy-5α-cholest-1-en-3-on epoxidiert, das erhaltene Produkt wird zu dem 1,2-Epoxy-3β-hydroxy-derivat unter Verwendung von Natriumborhydrid reduziert, dann wird die 6β-Hydroxylgruppe eliminiert, wobei man das entsprechende Δ ^5,6-Steroid erhält. Reduktion mit Lithium-aluminiumhydrid gibt das 1α,3β- Diol. Das bei diesem Verfahren erhaltene Produkt zeigt jedoch nicht die erwarteten physikalischen Eigenschaften. So wird die optische Drehung als [a]_D = 0±1° (in MeOH) angegeben, wohingegen Δ ^5,6-Sterole üblicherweise durch eine mäßig negative spezifische Drehung, typischerweise von ungefähr -30°C, charakterisiert sind. Die gefundenen Analysewerte von C, 76,2; H 11,1% stimmen ebenfalls nicht mit den für C₂₇H₄₆O₂ · 0,5 H₂O (C 78,8; H 11,5%) berechneten Werten überein, und die Struktur dieses Produktes erscheint daher zweifelhaft. Eine mögliche Fehlerquelle ist die Vorhydrid-Reduktion der 3-Ketogruppe, bei der man zusätzlich zu dem gewünschten 3β-ol eine beachtliche Menge an 3α-ol erhält.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß 1α-Hydroxy- und 1α,2α-Epoxy-steroid-4,6-dien-3-one direkt zu den entsprechenden 1α,3β-Dihydroxy-steroid-5-enen reduziert werden können. Diese Reaktion ist u. a. in dem ausgeschiedenen Deutschen Patent 24 63 203 beschrieben. Unter diesen Bedienungen werden die hochoxidierten Ausgangsmaterialien aufeinanderfolgend zu dem gewünschten Produkt reduziert, ohne daß eine wesentliche Isomerisierung der Doppelbindungen auftritt oder ohne daß Substituenten, die in β-Stellung zu der Carbonylgruppe in 3-Stellung vorhanden sind, eliminiert werden.

Als Reduktionsmittel werden Lithium, Calcium, Natrium und Kalium, vorzugsweise Lithium und flüssiges Ammoniak oder flüssige primäre, sekundäre und tertiäre Alkylamine, beipsielsweise primäre niedrige Alkylamine, wie Methylamin oder Äthylamin, Di-(niedrig-alkyl)-amine, wie Dimethylamin oder Diäthylamin, und Tri-(niedrig-Alkyl)-amine, wie Triäthylamin verwendet. Ein besonders bevorzugtes Reduktionsmittel ist Lithium und flüssiges Ammoniak.

Bei der Umsetzung werden, Ammonium- oder Aminsalze, beispielsweise die Salze, die sich von Mineralsäuren ableiten, wie die Halogenide, beispielsweise Fluorid oder Chlorid, Nitrat oder Sulfat als Protonenquelle verwendet.

Die Reduktion wird in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie einem cyclischen Äther, beispielsweise Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder in einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, wie Hexan, durchgeführt. Es kann von Vorteil sein, Feuchtigkeit und/oder Sauerstoff aus dem Reaktionssystem auszuschließen. Wird ein Lösungsmittel verwendet, so wird die Reduktion zweckdienlich bei einer Temperatur zwischen dem Gefrierpunkt des Lösungsmittelsystems und 100°C, vorteilhafterweise in der Kälte, durchgeführt.

Um die Reaktionsteilnehmer miteinander zu vermischen, kann man verschiedene Arten der Zugabe wählen. Beispielsweise kann man eine Lösung des Steroids in einem oder in mehreren Teilen zu einer Lösung des Alkalimetalls in flüssigem Ammoniak oder einem flüssigen Amin geben und anschließend die Protonenquelle auf einmal oder in mehreren Teilen zufügen. Alternativ kann man, wobei man verbesserte Ausbeuten erhält und/oder das reduzierte Steroid leichter isolieren kann, wenn man als Protonenquelle festes Ammoniumchlorid verwendet, dieses zu Beginn einer Lösung des als Ausgangsmaterial verwendeten Steroidmaterials zufügen, und dann kann man das Reduktionsmittel, nämlich das Alkalimetall/ flüssiges Ammoniak oder flüssiges Amin in Teilen zugeben.

Es ist im allgemeinen bevorzugt, in den als Ausgangsmaterialien verwendeten Steroiden die 1α-Hydroxygruppen beispielsweise mit einer abspaltbaren Schutzgruppe zu schützen, da die Reduktion eines Steroids, welches eine freie 1α-Hydroxygruppe enthält, die Bildung eines Δ ^6,7-Steroids, bedingt durch einen inneren Protonen- Übergang, ergeben kann. Geeignete Schutzgruppen umfassen Silylgruppen, beispielsweise Tri-(niedrig-alkyl)-silylgruppen, wie Trimetylsilyl; solche Schutzgruppen können beispielsweise durch Umsetzung des 1α-Hydroxy-steroids mit einem geeigneten Hexa-(niedrig-alkyl)-disilazan eingeführt werden.

Das erhaltene 1α-Hydroxy-cholesterin wird in das entsprechende 1α,3β-Dihydroxy-steroid-5,7-dien durch Dehydrierung, beispielsweise nach bekannten Verfahren wie Bromierung in der 7-Stellung, beispielsweise unter Verwendung eines N-Bromamids, Imids oder Hydantoins, wie N-Bromsuccinimid, N-Bromphthalimid oder Dibromdimethylhydantoin als Bromierungsmittel, anschließende Dehydrobromierung, beispielsweise unter Verwendung eines Amids, wie Dimethylacetamid, in Anwesenheit eines Erdalkalimetall-carbonats überführt werden. Alternativ kann die Dehydrobromierung durch Behandlung mit Trimethylphosphit oder einer Base, wie Collidin, Pyridin oder Diazabicyclooctan, induziert werden.

Die 7,8-Doppelbindung kann ebenfalls unter Verwendung des von Daubin et al beschriebenen Verfahrens eingeführt werden, beispielsweise durch Oxidation des 1α-Hydroxy-cholesterins zu dem entsprechenden Cholest-5-en-7-on unter Verwendung von Chromtrioxid als Oxidationsmittel, vorteilhafterweise unter Verwendung eines Chromtrioxid/Pyridin-Komplexes, Anschließend wird dieses Keton mit einem Sulfonyl-hydrazin, bevorzugt einem aromatischen Sulfonyl-hydrazin, wie p-Tosylhydrazin, umgesetzt, wobei man das entsprechende 7-Sulfonyl-hydrazon erhält, welches dann Wolff-Kishner-Reduktionsbedingungen, beispielsweise unter Verwendung eines Alkalimetall-Alkoholats, wie Natrium-t-butylat, und eines Alkalimetallhydrids, wie Natriumhydrid, unterworfen wird, wobei man das gewünschte Cholesta-5,7-dien erhält.

Es kann vorteilhaft sein, die 1α- und 3β-Hydroxygruppen zu schützen, beispielsweise durch Acylierung mit beispielsweise einem Dibenzoat, um unerwünschte Nebenreaktionen während der Reaktionsreihenfolge, die zur Einführung der 7,8-Doppelbindung erforderlich ist, zu vermeiden.

Die Bestrahlung des 1α,3β-Dihydroxycholesta-5,7-diens oder eines Acylats davon erfolgt vorzugsweise mit nahem ultravioletten Licht, beispielsweise mit einer Wellenlänge von 275-300 nm und führt zur Bildung des 1α-hydroxylierten Prävitamins D₃, das durch Erwärmen isomerisiert wird. Die Isomerisierung kann beispielsweise durch Erhitzen in einem Alkohol- oder Kohlenwasserstofflösungsmittel durchgeführt werden. Die Acylgruppen in den Acylaten des Prävitamins und Vitamins, die oben erwähnt sind, umfassen Acetyl und Benzoyl. Die Verwendung der Acylate beim Isomerisierungsschritt hält die Bildung von oxidierten Nebenprodukten auf einem Minimum.

Die Ausgangsmaterialien für die reduktive Anfangsstufe des erfindungsgemäßen Mehrstufenverfahrens können nach irgendeinem geeigneten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Oxidation von Cholesterin, beispielsweise unter Verwendung eines Chinol/Chinon-Oxidationsmittels, wie Dichlordicyanochinon, und anschließender Behandlung mit einem Peroxid, beispielsweise Wasserstoffperoxid, zusammen mit einer Base, beispielsweise Natriumhydroxid, geeigneterweise in einem wäßrigen alkoholischen Medium, wobei man ein 1α,2α-Epoxid erhält, welches gewünschtenfalls in die entsprechende 1α-Hydroxy-Verbindung durch Reduktion beispielsweise unter Verwendung von Zink und einer Säure, wie Essigsäure, überführt werden kann.

Das 1α-Hydroxy-Vitamin-D₃ besitzt wichtige prophylaktische und therapeutische Verwendungen bei der Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten, wie Rachitis und Knochenerweichung, und sind von besonderem Wert bei der Behandlung von Krankheiten, die auf Vitamin D ansprechen, wie Hypoparathyroidismus, Hypophosphataemie, Hypocalcaemie und/oder andere verwandte Knochenkrankheiten, für Nierenkrankheiten oder Nierenversagen, und für hypocalcaeminsche Tetanie. Die überlegene Aktivität des 1α-Hydroxy-Vitamins-D₃, verglichen mit bekannten Vitamin-D-Verbindungen, bedeutet, daß die 1α-Hydroxy-Verbindung bei der Behandlung von Krankheiten von Wert ist, wie bei Rachitis, die gegenüber Vitamin D resistent ist, Nieren-Osteodystrophie, Fettstuhl, Gallenzirrhose und andere Funktionsstörungen bei der Absorption, für Osteoporose, sekundäre Hypocalcaemie und/oder Knochenkrankheiten, die durch mangelhafte Funktion der Leber, Nieren oder des ganzen intestinalen Traktes hervorgerufen werden, und für sekundäre Hypocalcaemie oder Knochenkrankheiten, die bei der Behandlung mit Dilantin, Barbituraten, wie Phenylbarbiton, und verwandten Arzneimitteln, auftreten und die gegenüber bekannten Verbindungen, wie Vitamin D₃, unempfindlich sind.

Im allgemeinen kann 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ parenteral zusammen mit injizierbaren flüssigen Trägern, wie mit sterilem pyrogenfreiem Wasser, sterilem peroxidfreiem Äthyloleat, dehydratisiertem Alkohol, Propylenglykol oder einer dehydratisierten Alkohol/Propylenglykol-Mischung verabreicht werden. Solche Mittel können intravenös, intraperitonal oder intramuskulär injiziert werden. Injizierbare Mittel werden bevorzugt in Dosis-Einheitsformen hergestellt, beispielsweise in Ampullen.

Im Hinblick auf die Empfindlichkeit von 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ gegenüber Oxidation ist es im allgemeinen bevorzugt, daß pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen diese Materialien enthalten sind, mindestens eine Spur eines Antioxidans, wie Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hydrochinon enthalten.

Vollkommen überraschend wurde außerdem gefunden, daß 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ eine beachtliche Aktivität bei der oralen Verabreichung zeigt.

Dies ist im Hinblick auf die früheren Veröffentlichungen, die sich auf 1α,25-Dihydroxy-vitamin-D₃ beziehen, besonders überraschend, da in diesen Veröffentlichungen angegeben wurde, daß orale Dosen des Dihydroxy-vitamins eine sehr niedrige Aktivität besitzen (beispielsweise bestimmt durch antirachitische Aktivitätsmessungen an der Ratte), und daß die parenterale Verabreichung des Dihydroxy-vitamins erforderlich ist, um die günstigen therapeutischen Ergebnisse zu erreichen. Man würde üblicherweise erwarten, daß 1α-Hydroxy-vitamin- D-Verbindungen ein analoges Allgemeinverhalten zu dem entsprechenden Dihydroxy-vitamin aufweisen, im Hinblick auf die Ähnlichkeit in der Art der biologischen Aktivität der Verbindungen in anderen Hinsichten.

In der folgenden Tabelle sind die Wirkungen bei oraler Verabreichung von 1a-Hydroxy-vitamin-D₃ (0,1 µg/kg via eine gastritische Intubation) auf die Calcium- und Phosphorserumspiegel bei Ratten, denen die Nebenschilddrüse/ Schilddrüse entfernt wurde (männliche Charles River Ratten, die jeweils 80 bis 100 g wiegen, jede Gruppe enthält 6 Ratten), angegeben. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ bei der oralen Verabreichung eine gute Aktivität zeigt, was durch einen Anstieg im Serum-Calciumspiegel im Vergleich mit den nicht-behandelten Kontrolltieren erkennbar ist.

Dagegen ist oral verabreichtes 1α,25-Dihydroxy-vitamin-D₃ relativ inaktiv und ergibt keine wesentlichen Änderungen in dem Serum- Calciumgehalt, verglichen mit den Kontrollproben. Aus der Tabelle ist ebenfalls ersichtlich, daß die metabolischen Änderungen, die durch 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ induziert werden, eine relativ kurze Dauer haben, während der Serum-Calciumgehalt bei mit 1α- Hydroxy-vitamin-D₃ behandelten Ratten innerhalb 24 Stunden nach Verabreichung des Vitamins fast den der Kontrollratten erreicht. Dies bestätigt, daß 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ aus dem System schnell ausgeschieden wird und so keine unerwünschten Nebenwirkungen, nämlich Vitamin-Vergiftung, ergibt.

Tabelle 1

Wirkungen von oral verabreichtem 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ auf die Serum-Calcium- und Phosphorgehalte bei Ratten mit entfernter Nebenschilddrüse/entfernter Schilddrüse

Die orale Aktivität und die dadurch bedingte leichte Verabreichung von 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ bewirkt, daß diese Verbindung einen beachtlichen therapeutischen Wert bei vielen Anwendungen besitzt und daß die Verwendbarkeit dieser Verbindung, verglichen mit bekannten parenteral verabreichbaren 1α,25-Dihydroxy-vitamin-D- Derivaten, wesentlich größer ist.

1α-Hydroxy-vitamin-D₃ kann prophylaktisch zur Vorbeugung von Vitamin-D-Mangelkrankheiten durch Verabreichung von Dosierungen im Bereich von 0,1 bis 2,0 µg verwendet werden.

1α-Hydroxy-vitamin-D₃ kann auch prophylaktisch als Nahrungsmittel- oder Futterzusatzstoffe oder als Bestandteile von Nahrungsmittel- und Futterzusatzstoffen, beispielsweise zusammen mit anderen Vitaminen, verwendet werden. Ein Beispiel einer solchen Anwendung besteht in der Anreicherung von Milch, indem man 0,1 bis 0,5 µg 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ pro Liter Milch zufügt, wobei diese Milch einen prophylaktischen Wert bei der Vorbeugung von Krankheiten, wie Rachitis, Knochenerweichung usw., besitzt.

In ähnlicherweise Weise kann 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ in oral verabreichbaren pharmazeutischen Mitteln verwendet werden und bei vielen Anwendungen eingesetzt werden, beispielsweise bei der Behandlung von irgendwelchen der oben erwähnten, auf Vitamin D ansprechenden Krankheiten oder alternativ bei irgendwelchen Krankheiten, die bei dem üblichen Vitamin D nicht ansprechen, wo jedoch 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ anspricht, insbesondere bei lang dauernden Behandlungen von Krankheiten, wie Osteoporose, und bei prophylaktischen Anwendungen, wie in Vitamin- und Multivitamin-Präparaten.

Die oral verabreichbaren Mittel, die die neue 1α-Hydroxy-Verbindung enthalten, können gewünschtenfalls einen oder mehrere physiologisch verträgliche Träger und/oder Arzneimittel-Verdünnungsstoffe enthalten, und sie können in flüssiger oder fester Form vorliegen. Die Zusammensetzungen können in irgendeiner geeigneten Form vorliegen, beispielsweise als Tabletten, beschichtete Tabletten, Kapseln, Lutschbonbons, wäßrige oder ölige Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupe, Elixiere und als Trockenprodukte, die für die Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten flüssigen Träger vor der Verwendung geeignet sind. Die Zusammensetzungen zur Behandlung von Vitamin-D-Mangelkrankheiten werden bevorzugt in Dosiseinheitsform hergestellt, wobei jede Einheit vorteilhafterweise 0,2 bis 20 µg, vorzugsweise 0,5 bis 5 µg an 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ enthält. Die Dosis an 1α-Hydroxy-vitamin-D₃, die für die Behandlung von erwachsenen Menschen verwendet wird, beispielsweise zur Behandlung von Vitamin-D- resistenter Hypocalcaemie und/oder Knochenkrankheiten, wird typischerweise in dem Bereich von 0,2 bis 20 µg pro Tag liegen; die Verabreichung an Menschen ist vorzugsweise oral, wobei ein Bereich von 1 bis 5 µg 1a-Hydroxy-vitamin-D₃ bevorzugt ist. Zur prophylaktischen Behandlung von Rachitis bei Menschen ist die tägliche Dosis vorzugsweise 0,1 bis 1,0 µg 1α-Hydroxy-vitamin-D₃.

Tabletten und Kapseln, welche 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ enthalten, können gewünschtenfalls übliche Bestandteile enthalten wie Bindemittel, beispielsweise Sirup, Gummiarabicum, Gelatine, Sorbit, Tragacanth oder Polyvinyl-pyrrolidon; Füllstoffe, beispielsweise Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Gleitmittel, beispielsweise Magnesiumstearat, Talk, Polyäthylenglykol oder Siliciumdioxid; Desintegrationsmittel, beispielsweise Kartoffelstärke; oder annehmbare Benetzungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat.

Tabletten können nach gut bekannten Verfahren überzogen sein.

Flüssige 1α-Hydroxy-vitamin-D₃-Zusammensetzungen können bekannte Zusatzstoffe, wie Suspensionsmittel, beispielsweise Sorbitsirup Methylcellulose, Glukose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxymethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte genießbare Fette, Emulgiermittel, beispielsweise Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Gummiarabicum; nicht-wäßrige Trägerstoffe, beispielsweise genießbare Öle, wie beispielsweise pflanzliche Öle, wie Erdnußöl, Mandelöl, fraktioniertes Kokosnußöl, Fischleberöle, ölige Ester wie Polysorbat 80, Propylenglykol oder Äthylalkohol; und Konservierungsmittel, beispielsweise Methyl oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure, enthalten. Flüssige Zusammensetzungen sind geeigneterweise eingekapselt in beispielsweise Gelatine, wobei man ein Produkt in Dosis-Einheitsform erhält. Die Konzentration an 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ in solchen flüssigen Zusammensetzungen kann beispielsweise im Bereich von 2,0 µg/ml bis 4,0 µg/ml liegen.

Die Zusammensetzungen die die erfindungsgemäße Substanz enthalten, können andere therapeutisch wertvolle Bestandteile, wie Calciumsalze (beispielsweise das Lactat, Natriumlactat, Phosphat, Glukonat oder Hypophosphit) und/oder Salze von anderen wesentlichen Spurenelementen, wie Magnesium, Mangan, Eisen, Kupfer, Zink und Jod und/oder andere Vitamine, wie Vitamin A, Vitamin B₁, Vitamin B₂, Nikotinamid, Pantothensäure oder deren Salze, beispielsweise das Calciumsalz, Vitamin B₆, Vitamin B₁₂-Folsäure, Vitamin C und Vitamin E, enthalten. Multivitamin-Präparate, die 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ enthalten, können auf analoge Weise zu solchen Vitaminpräparaten formuliert werden, bei denen übliche 1-Hydrogen-vitamin-D- Verbindungen verwendet werden.

Die Aktivität von 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ macht die Verbindung für die rektale Verabreichung geeignet, und pharmazeutische Zusammensetzungen für diesen Zweck enthaltenen, eine wirksame Dosis von 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ zusammen mit bekannten Suppositorien-Grundstoffen, wie Kakaobutter, oder einem anderen Glycerid.

Wie oben erwähnt, kann es von Vorteil sein, den genannten Zusammensetzungen oder Mitteln Antioxidantien, wie beispielsweise Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hydrochinon einzuverleiben, um ihre Lagerungsstabilität zu verbessern.

Anwendungen in der Veterinärmedizin für 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ umfassen die Vorbeugung der Hypocalcaemie bei Haustieren, beispielsweise bei Tieren auf dem Bauernhof, wie Rindern insbesondere Kühen, zum oder nahe beim Gebären. 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ ist in dieser Hinsicht von besonderem Wert, da die hohe Aktivität und die niedrige Toxizität dieser Verbindung die prophylaktische Verabreichung in niedrigen Dosen während einer bestimmten Zeit z. B. bei einer Tierherde ermöglicht, einschl. von Tieren, die keine Hypocalcaemie-Vorgeschichte besitzen. Dies steht im Gegensatz zu der Verwendung bekannter Vitamin-D-Verbindungen auf diesem Gebiet, da es im Hinblick auf die höheren Dosen, die bei Verbindungen wie Vitamin-D₃ erforderlich sind, übliche Praxis ist, u. a. aus wirtschaftlichen Gründen, die Vitamine nur Tieren zu verabreichen, die eine Vorgeschichte von Hypocalcaemie aufweisen.

Es wurde weiterhin gefunden, daß die Verabreichung von wirksamen Dosen von 1α-Hydroxy-vitamin-D₃, bei legendem Geflügel den Vorteil besitzt, daß das Auftreten von Eiern mit weicher Schale, die von dem Geflügel gelegt werden, verhindert wird, und eine solche Verwendung, z. B. in Form von Geflügelfutterzusammensetzungen, die 1α-Hydroxy-vitamin-D₃, mit einem Gehalt von 0,2 bis 12 Mikrogramm zweckmäßig 1 bis 8 Mikrogramm, des Vitamins pro kg Futter, enthalten, ist ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius aufgeführt.

Beispiel 1 a) Cholesta-1,4,6-trien-3-on

Cholesterol (19,3 g) und Dichlordicyanochinon (38 g) in trockenem Dioxan (500 ml) wurden am Rückfluß 22 Stunden erwärmt. Die Mischung wurde dann abgekühlt, filtriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Chromatographie des Rückstandes an Aluminiumoxid und Elution mit Benzol/Hexan und anschließende Elution mit Benzol ergab das Trion als schwach gefärbtes Öl (11,5 g), das sich beim Stehen verfestigte. Die physikalischen Eigenschaften dieses Materials waren richtig.

b) 1α,2α-Epoxycholesta-4,6-dien-3-on

Das Trion von a) (1 g) in Äthanol (50 ml) wird bei 0° mit einer 10%-igen wäßrigen Natriumhydroxidlösung (0,25 ml) und mit 30%-igem wäßrigen H₂O₂ (2,5 ml) behandelt. Die Mischung wird bei 5° über Nacht gelagert, dann wird das entstehende Epoxid abfiltriert, mit wäßrigem Alkohol gewaschen und getrocknet, wobei man die Titelverbindung (0,86 mg) erhält. Umkristallisation aus Äthanol ergibt farblose Nadeln, Fp 107-109°.

c) 1α,3β-Dihydroxycholest-5-en

Zu einer gerührten Lösung aus Lithiummetall (0,2 g) in flüssigem Ammoniak (80 ml) und trockenem Tetrahydrofuran (50 ml), welches Ammoniumchlorid (0,5 g) enthält, fügt man eine deoxigenierte Lösung des Epoxids von b) (4,3 g) in trockenem Tetrahydrofuran (25 ml) tropfenweise. Nachdem die blaue Farbe verschwunden war, wurde die Zugabe des Steroids beendigt, und weiteres Lithium (0,2 g) und Ammoniumchlorid (1 g) wurden zugegeben, und dann gab man weitere Epoxidlösung hinzu. Diese Reihenfolge wurde wiederholt, bis das gesamte Steroid zugefügt war. Zu diesem Zeitpunkt fügte man ein weiteres Stück Lithium (0,2 g, insgesamt 0,8 g) hinzu und gab ebenfalls zusätzliches Ammoniumchlorid (gesamt 8 g) zur Reaktionsmischung. Die Hauptmenge des Ammoniaks konnte dann verdampfen, und die restliche Mischung wurde auf Eiswasser gegossen und mit Chloroform extrahiert. Konzentration des Chloroforms ergab einen braunen Gummi, der an Aluminiumoxid (160 g) chromatographiert wurde. Elution mit Äthylacetat/Benzol ergab 1α,3b-Diol als glasartiges Material, welches bei der Zugabe von Äthanol schnell kristallisierte. Umkristallisation aus wäßrigem Äthanol ergab die Titelverbindung (1,7 g), Fp 161,5-163°C.

Analyse: C₂₇H₄₆O₂
ber.:C 80,54 H 11,52% gef.:C 80,40 H 11,39%

d) 1α-Hydroxycholesta-4,6-dien-3-on

Das Epoxydion von b) (130 mg) in Äthanol (10 ml) wurde mit Zinkstaub (1 g) unter Rühren behandelt. Danach gab man 3 Tropfen Essigsäure hinzu. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampf. Chromatographie an Silicagel ergab das Cholesta-1,4,6-trien-3-on, welches wiedergewonnen und recyclisiert wurde. Danach erhielt man die Titelverbindung λ _max 3600, 3400, 1675, 1625 und 1590 cm^-1; δ 6,15 (2 Protonen, s, H6, H7), 5,73 (1 Proton Singulett H4), δ 4,15 (1 Proton, enges Multiplett, H1).

e) 1α,3β-Dihydroxycholest-5-en

Das Hydroxydion von d) (0,6 g) wurde in seinen Trimethylsilyläther durch Behandlung einer Lösung in Tetrahydrofuran (2 ml) und Pyridin (2 ml) mit Hexamethyldisilazan (1,5 ml) und Trimethylchlorsilan (0,6 ml) überführt. Der rohe Trimethylsilyläther wurde in Tetrahydrofuran (10 ml) gelöst und die Lösung wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung aus Lithiummetall (ungefähr 200 mg) in flüssigem Ammoniak (20 ml) gegeben. Nach einigen Minuten wurde Ammoniumchlorid (2 g) zugegeben, und die Lösung wurde gerührt. Ein weiterer Teil an Lithiummetall (ungefähr 100 mg) wurden zugegeben. Die Lösung wurde wieder gerührt. Ein weiterer Teil an Ammoniumchlorid wurde dann zugegeben, und die Mischung wurde in kaltes Wasser gegossen. Das Produkt wurde durch Extraktion in Äther und Methylenchlorid extrahiert und anschließend säulenchromatographiert, wobei man die Titelverbindung erhielt, die aus Äthanol kristallisiert bei 158 bis 161°C schmolz.

Nach der Umkristallisation betrug der Fp 161,5 bis 163°C. [α]_D (CHCl₃)-38°. Dieses Material war mit dem Produkt von Beispiel 1c identisch, und bei der Hydrierung erhielt man eine Probe von 1α,3b-Dihydroxy-5α-cholestan, welche in jeder Hinsicht mit einer authentischen Probe identisch war.

f) 1α,3β-Dibenzoyloxycholest-5-en

1a,3β-Dihydroxycholest-5-en (1,2 g) von e) wurde in Pyridin (10 ml), welches Dimethylaminopyridin (20 mg) enthielt, mit Benzoylchlorid (5 ml) behandelt. Nach dem Lagern der Reaktionsmischung über Nacht wurde die Reaktionsmischung in Wasser gegossen, das Produkt mit Äther extrahiert, mit verdünnter wäßriger Chlorwasserstoffsäure, gesättigter Bicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Eindampfen des Ätherteils ergab das Dibenzoat (1,6 g), Fp 147-150°. Umkristallisation aus Äthanol ergab ein Produkt mit einem Fp 151-153°. [α]_D+24°.

Analyse: C₄₁H₅₄O₄
ber.:C 80,61 H 8,91% gef.:C 80,43 H 8,74%

g) 1α,3β-Dibenzoyloxycholesta-5,7-dien

Eine Lösung des Dibenzoats, welches in f) beschrieben wird (0,58 g) in Hexan (10 ml) wird mit Dibromdimethylhydantoin (0,15 g) behandelt und am Rückfluß während 25 Minuten erwärmt. Nach dem Abkühlen wird die Mischung filtriert und das Filtrat konzentriert, wobei man ein schwachgefärbtes Öl erhält. Das Öl wird in trockenem Xylol (3 ml) gelöst und tropfenweise zu einer am Rückfluß siedenden Lösung aus Trimethylphosphit (0,4 ml) in Xylol (5 ml) zugegeben. Das Erwärmen am Rückfluß wird weitere 1,75 Std. fortgeführt, danach werden die Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt und der Rückstand aus Aceton/Methanol kristallisiert, wobei man die Titelverbindung erhält. Nach der Umkristallisation aus Äthanol/Aceton besitzt das Produkt einen Fp von 161-162°. [a]_D-8°.

Analyse: C₄₁H₅₂O₄
ber.:C 80,88 H 8,61% gef.:C 80,69 H 8,66%

h) 1α,3b-Dihydroxycholesta-5,7-dien

Das Dibenzoat von g), (300 mg), gelöst in Äthanol (30 ml) und Wasser (0,5 ml), welches KOH (0,6 mg) enthält, wird bei 80°C unter Argon während 0,5 Std. gelagert. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und mit Wasser verdünnt und mit Äther extrahiert. Eindampfen des Ätherextrakts ergibt die Titelverbindung als kristallinen Feststoff. Umkristallisation aus Methanol ergibt ein Produkt vom Fp 155-158°. g _max (Äthanol) 263 (7700); 272 (11 000); 282 (11 900); 295 (7000) nm.

i) 1α-Hydroxy-vitamin-D₃

Das Produkt von h) (95 mg) in deoxygeniertem Äther (200 ml) wird während 12 Minuten unter Verwendung einer 200 Watt Hanovia-Lampe, die von einer filtrierten Lösung aus Toluol (24 ml) und CS₂ (4 ml) pro Liter Methanol umgeben ist, bestrahlt. Die kalte Lösung wird in einen Kolben überführt, der mit Argon gefüllt ist, und der Äther wird bei 0° entfernt. Der Rückstand wird in deoxygeniertem absolutem Alkohol (8 ml) gelöst und 1,5 Std. am Rückfluß erwärmt. Biologische Versuche, die an Küken mit Vitamin D-Mangel durchgeführt werden, zeigen, daß das 1α-Hydroxy-vitamin-D₃, das gebildet wurde (λ _max 264 [19 000]), durch einen sehr schnellen Beginn der physiologischen Aktivität (weniger als 3 Std.) charakterisiert ist, der zuvor nur für das natürliche Produkt, das als 1α,25-Dihydroxy-vitamin-D₂ vorläufig bezeichnet wurde, beobachtet wurde.

Beispiel 2 a) 1α-Hydroxy-prävitamin-D₃-diacetat

50 mg 1α,3β-Diacetoxycholesta-5,7-dien (Fp 119-119°) hergestellt durch Umsetzung von 1α,3β-Dihydroxycholesta-5,7-dien mit Essigsäure-anhydrid unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie es in Beispiel 1f) beschrieben ist, wird 11 Minuten in deoxygeniertem Äther (200 ml) bestrahlt. Das UV-Spektrum der Mischung zeigt die gewünschte Zunahme in der Absorption im Bereich von 220-268 nm und eine Erniedrigung im Bereich von 268-295 nm. An Silicagel (CHCl₃) ist es im wesentlichen homogen, es trennt sich jedoch in zwei saubere Flecken an 1%-igem AgNO₃-Silicagel-Chloroform, wobei der niedrigere Fleck dem Ausgangsmaterial in seinem R_f-Wert entspricht. Das wenigere polare Material (ungefähr 20 mg) besitzt eine breite UV-Absorptionsbande mit einem "flachen" Maximum um 262-272 nm (kleine Schulter bei 282 und 295 nm) und einem Minimum bei 234 nm. Dieses Material enthält rohes Prävitamin.

b) 1α-Hydroxy-Vitamin-D₃-diacetat

Die Hauptmenge des rohen Prävitamins wird in deoxygeniertem Isooctan (10 ml) gelöst. Die Absorption bei 262 nm beträgt 0,39, wenn ein 30 µl Aliquot auf 3 ml verdünnt wird. Die Lösung wird dann auf ungefähr 75°C unter Argon während insgesamt 2,25 Std. erwärmt, wobei während dieser Zeit die Absorption bei 262-265 nm auf ein Maximum von 0,54 zunimmt ) für eine Lösung der gleichen Konzentration wie oben aufgeführt). Wie erwartet, nimmt die Absorption zuerst sehr schnell zu und wird dann langsamer, bis die Gleichgewichtsmischung erreicht wird.

Die im Gleichgewicht stehende Mischung war im wesentlichen sowohl an Silicagel als auch an 1%igem AgNO₃-Silicagel (entwickelt mit Chloroform) homogen.

c) 1α-Hydroxy-Vitamin-D₃

Ungefähr 12 mg der Mischung von b) werden in deoxygeniertem Methanol (1,0 ml) gelöst, die Lösung wird mit deoxygeniertem 1,5%igem methanolischem KOH (0,5 ml) behandelt und unter Argon bei Zimmertemperatur während 1,5 Std. gehalten. Verdünnung mit Wasser und Extraktion mit Äther ergibt die 1α,3β-Diole, die zwei sehr enge Hauptflecken an Silicagel (entwickelt mit 4% MeOH-CHCl₃) zeigen. Die weniger polare Fraktion (ungefähr 5 mg) zeigt eine breite Absorption im UV mit einem Maximum bei 264 nm und einem Minimum bei 228 nm. Dies war das 1α-Hydroxy-vitamin-D₃. Behandlung eines aliquoten Teils mit Jod in Hexan wie oben beschrieben ergibt eine Verlagerung des Maximums auf 270 nm, was durch die Umwandlung in 5,6-trans-Vitamin bedingt ist.

Die stärker polare Fraktion zeigt eine glatte Absorptionsbande im UV mit einem Maximum bei 260 nm und einem Minimum bei 235 nm. Dies war das Prävitamin. Behandlung dieser Verbindung mit Jod wie oben beschrieben ergibt ein komplexes UV-Spektrum mit Maxima bei 268, 276, 286, 298, 312 und 327 nm.

Beispiel 3 1a-Hydroxy-Prävitamin-D₃-diacetat

Bestrahlung von 135 mg 1α,3β-Diacetoxycholesta-5,7-dien, hergestellt wie in Beispiel 2a beschrieben, in deoxygeniertem Äther (200 ml) während 15 Minuten und Abtrennung der Produkte an 1%igem AgNO₃-Silicagel (CHCl₃) (präparative Dünnschichtchromatographie =t.l.c.) ergaben 68 mg des Ausgangsmaterials (stärker polare Fraktion) und das rohe Prävitamin (54 mg, weniger polare Fraktion).

b) 1α-Hydroxy-vitamin-D₃

Das so erhaltene Prävitamin wurde auf 75°C während 2 Stunden in deoxygeniertem Iso-octan (15 ml) unter Argon erwärmt.

Die entstehende Mischung aus Vitamin und Prävitamin wurde in Methanol (4 ml) gelöst und die Lösung wurde mit 1 ml 2,5%iger methanolischer KOH behandelt und bei Zimmertemperatur während 2 Stunden gehalten. Verdünnung mit Wasser und Extraktion mit Äther ergab die Vitamin- und Prävitamin-Diole, die an Silicagel (präparative t.l.c.) getrennt wurden. 8%iges MeOHCHCl₃, wobei man 13 mg Vitamin (R_f 0,35) und 8 mg Prävitamin (R_f 0,31) erhielt. Umkristallisation des Vitamins aus Äther-Pentan ergab feine farblose Nadeln, Fp 132-133° (Erwärmungsgeschwindigkeit 1°/4 Sek.) Fp 128-129° (Erwärmungsgeschwindigkeit 1°/25 Sek.). UV (Äther) λ _max 264 nm (20 200), λ _min 229 nm (10 800). Es besteht 9% Unsicherheit in den Extinktionswerten, aber das Verhältnis λ _max/λ _min beträgt 1,87±10%.

(Äther: C∼0,3%) +26°±2°.

ν _max (CHCl₃) 3700, 3500, 1600-1650, 1040 cm^-1. NMR (d₆ Aceton) H₆+H₇ AB Quartett bei 6,20 (scheinbar J=11,5 Hz). H₁₉ zwei enge 1-Proton-Multipletts bei δ 4,92 und δ 5,37 ppm. Das Prävitamin (λ _max 260 nm und λ _min 232 nm) (11 mg aus zwei getrennten Bestrahlungen) wurde in deoxygeniertem Iso-octan (8 ml) gelöst und bei 75° während 1,5 Std. erwärmt. Isolierung durch präparative Dünnschichtchromatographie wie zuvor ergab 4,6 mg des Vitamins. Die Zersetzung trat hier auf und praktisch kein Prävitamin bliebt zurück.

Analyse für 1α-Hydroxy-vitamin-D₃: C₂₇H₄₄O₂
ber.:C 80,9% H 11,07% gef.:C 80,6% H 11,04%

Beispiel 4 Oral verabreichbare 1α-Hydroxy-vitamin-D₃-Zusammensetzungen a) 1α-Hydroxy-vitamin-D₃-Kapseln

1α-Hydroxy-vitamin-D₃ wird in sterilem Erdnußöl mit niedrigem Peroxidgehalt, welche 0,1% Gew./Gew. butyliertes Hydroxyanisol als Antioxydans enthält, gelöst, wobei man eine Lösung mit einer Vitamin- Konzentration von 40 µg/ml herstellt. 1/4 ml Teile der entstehenden Lösung wurden in Gelatine nach bekannten Verfahren eingekapselt. Dosis: 1-2 Kapseln pro Tag.

Man stellt ebenfalls Kapseln aus Lösungen nach dem obigen Verfahren her, die 2,0 µg/ml und 4,0 µg/ml an 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ enthalten.

b) Tri-vitamin-Präparation

Tabletten, die die folgenden Bestandteile enthielten, wurden nach bekannten Verfahren hergestellt:

Vitamin A4000 u.s.p. Einheiten Vitamin C75 mg 1α-Hydroxy-vitamin-D₃0,2-1 µg

Die Präparation kann gegebenenfalls ebenfalls 1 mg Fluor in Form eines physiologisch verträglichen Fluoridsalzes enthalten.

Dosis: 1 Tablette pro Tag.

c) Deca-vitamin-Präparation (für Erwachsene)

Tabletten, die die folgenden Bestandteile enthalten, werden nach bekannten Verfahren hergestellt:

Vitamin A25 000 u.s.p. Einheiten Vitamin B₁10 mg Vitamin B₂10 mg Vitamin B₆5 mg Vitamin B₁₂5 µg Vitamin C200 mg 1α-Hydroxy-vitamin-D₃0,2-1 µg Vitamin E15 I.U. Calcium-pantothenat20 mg Nicotinamid100 mg

Die Tabletten können gegebenenfalls 1 mg Fluor als physiologisch verträgliches Fluoridsalz und/oder einen Mineralkomplex enthalten, der die folgenden Elemente in Form von physiologisch verträglichen Salzen enthält:

Kupfer2 mg Jod0,15 mg Eisen12 mg Magnesium65 mg Mangan1 mg Zink1,5 mg

Dosis: 1 Tablette pro Tag.

d) Deca-vitamin-Präparation (für Säuglinge und für Kinder)

Vitamin A5 000 u.s.p. Einheiten Vitamin B₁5 mg Vitamin B₂5 mg Vitamin B₆2 mg Vitamin B₁₂10 µg Vitamin C100 mg 1α-Hydroxy-vitamin-D₃0,1-1 µg Calcium-pantothenat3 mg Nicotinamid30 mg

Die Tabletten können ebenfalls ein physiologisch verträgliches Fluoridsalz oder einen Mineralkomplex in den oben bei c) angegebenen Mengen enthalten.

Dosis: 1 Tablette pro Tag.

e) Geflügelfutterzusammensetzung

40 Mikrogramm 1-α-Hydroxy-vitamin-D₃ werden in 100-500 ml Äthanol gelöst und die resultierende Lösung wird mit 2 kg gemahlenem Kalkstein aufgeschlemmt. Das Äthanol wird anschließend unter Rühren der Aufschlemmung unter vermindertem Druck entfernt und der resultierende vitaminhaltige Feststoff wird in einer Menge von 20 g pro kg Futter zu Geflügelfutter zugesetzt.

Claims

1. 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ mit dem Schmelzpunkt beim Umkristallisieren aus Ether/Pentan von 128 bis 129°C bei einer Erwärmungsgeschwindigkeit von 1°C pro 25 Sekunden und dem Verhältnis λ 264 nm/λ 229 nm von 1,87±10%.

2. Verfahren zur Herstellung von 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 1a-Hydroxy- oder 1α,2α-Epoxy-cholesta-4,6-dien-3-on oder ein 1α-Hydroxyl-geschütztes Derivat davon mit Lithium, Natrium, Kalium oder Calcium in Ammoniak oder einem flüssigen Alkylamin in Anwesenheit eines Ammonium- oder Aminsalzes und in Gegenwart eines inerten organischen Lösungsmittels reduziert, das gebildete 1α-Hydroxy-cholesterin oder eine 1α,3β-Hydroxyl-geschützte Form davon in 1α,3β-Dihydroxy-cholesta-5,7-dien durch Dehydrierung überführt, das Dien bestrahlt und das erhaltene 1α-Hydroxy-prävitamin-D₃ durch Erwärmen in das 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ überführt.

3. Verwendung einer wirksamen Dosis eines 1α-Hydroxy-vitamin-D₃ gemäß Anspruch 1 zur Behandlung oder Prophylaxe von Vitamin-D- Mangelkrankheiten einschließlich Vitamin-D-resistenter Krankheiten.

4. Verwendung gemäß Anspruch 3 in Form von Dosierungseinheiten, enthaltend 0,1 bis 2 µg des 1α-Hydroxy-vitamins-D₃ zur Prophylaxe gegen Vitamin-D-Mangelkrankheiten.

5. Verwendung gemäß Anspruch 3 in Form von Dosiseinheiten, enthaltend 0,2 bis 20 µg oder 0,5 bis 5 µg des 1α-Hydroxy- vitamins-D₃ zur Behandlung von Vitamin-D-Mangelkrankheiten.

6. Verwendung einer wirksamen Dosis eines 1α-Hydroxy-vitamins-D₃ gemäß Anspruch 1 zur Vorbeugung der Bildung von Eiern mit weicher Schale bei Hausgeflügel.