DE60223020T2

DE60223020T2 - Leber x rezeptoragonisten

Info

Publication number: DE60223020T2
Application number: DE60223020T
Authority: DE
Inventors: Shutsung Chicago LIAO; Ching Chicago SONG
Original assignee: University of Chicago
Current assignee: University of Chicago
Priority date: 2001-05-03
Filing date: 2002-05-02
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2022-05-03
Also published as: PT1392713E; DK1392713T3; JP4309661B2; US20020193357A1; DE60223020D1; EP1392713A2; WO2002090375A2; JP2005507855A; EP1392713A4; CN100360550C; ATE375994T1; WO2002090375A8; CA2446314A1; EP1392713B1; ES2296928T3; CA2446314C; US7012069B2; CN1585777A; WO2002090375A3

Description

Die hierin beschriebene Arbeit wurde unterstützt vom „National Institute of Health" (CA-58073 und DK-41670). Die US-Regierung hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
Liver-X-Rezeptoren (LXRs), Bestandteile der Obergruppe der Nuklearrezeptoren, beinhalten den LXRα-Rezeptor und den ubiquitären Rezeptor (UR, auch LXRβ genannt). Sie transaktivieren Genexpressionen. Einige Cholesterin-Homöostasie-verwandte Gene sind als LXR-Direkt-Empfänger erkannt worden, z. B. diejenigen, die verschlüsselt stehen für Cholesterin-Abflusstransporter ATP-Bindekassette 1 ABCA1 und ABCG1, Cholesterin 7α-Hydroxylase (die begrenzte Enzym-Menge für Gallensäuresynthese aus Cholesterin), Cholesterin-Ester-Transferprotein (CETP), das Lipoprotein Apolipoprotein E (ApoE) und Sterol-regulierendes Element-bindendes Protein 1c (SREBP-1 c). Vgl., z. B., in der Literatur B. Schwartz et al., Biochem. Biophys. Rs. Commun., 2000, 274: 794-802; Laffitte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98(2): 507-512; und Repa et al. Genes Dev., 2000, 14: 2819-30.
Die Regulierung dieser Gene durch LXR-Rezeptoren bestimmen den Cholesterin-Rücktransport und dessen Beseitigung, was eine direkte Wirkung hat auf die Bildung von Lipiden und faserförmigen Bestandteilen, Expression von ApoE-Gen und Aktivierung von Nuklear-Faktoren Kappa-B und AP1. Anhäufungen von Lipiden und faserförmigen Bestandteilen in Arterien bewirken Arteriosklerose, der eigentliche Grund für verschiedene Krankheiten wie Herzerkrankung und Schlaganfall. Ein Mangel an ApoE-Gen-Expression wurde in Verbindung mit Krankheiten wie der Alzheimer-Erkrankung entdeckt. Die Aktivierung der Nuklear-Faktoren Kappa-B und AP-1 steuert das menschliche Immunsystem und steigert dessen entzündungshemmende Fähigkeiten.
Janowsky et al. beschreibt in in der Literatur Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1999,96: 266-271 dass Cholesten-Verbindungen eine Doppelbindung zwischen den Positionen 5 und 6 in ihrer Steroid-Struktur aufweisen.
WO 00/66611 A1 offenbart Steroid-Derivate, die eine spezifische Seitenkette in Position 17 aufweisen. Die offenbarten Steroid-Verbindungen schließen sowohl Cholan-als auch Cholesten-Grundformen ein und die Seitenkette in Position 17 kann von einer großen Vielfalt von Alkyl- und Alkenylresten besetzt werden, die zumindestens eine heteroatomartige Funktionsweise haben. Die Steroid-Derivate in WO 00/66611 A1 modulieren die Transkriptionsaktivitäten mittels Bindung der Rezeptoren UR oder LXRa, und können somit angewendet werden, um Symptome zu behandeln, die durch solche Nuclear-Rezeptoren beeinflusst werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung neuartiger Steroid-Verbindungen, die als LXR-Agonisten funktionieren.
Ein Aspekt dieser Erfindung beruht auf den chemischen Verbindungen der Formel (1):
Die unabhängigen Reste R₁, R₂, R₃, R₄, R_4', R₅, R₆, R₇, R₁₁, R₁₂, R₁₅, R₁₆ und R₁₇ sind ein Wasserstoffatom, Halogenatom, Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Oxo-, Sulfonsäure- oder Alkylrest und gegebenenfalls über die Gruppen -NH-, -N(Alkyl)-, -O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -O-SO₂-, -SO₂-O-, -SO₃-O-, -CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-NR'- oder -NR'-CO- verbunden,
die unabhängigen Reste R₈, R₉, R₁₀, R₁₃ und R₁₄ sind ein Wasserstoffatom, Halogenatom, Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxyalkyl-, Alkoxy-, Hydroxyl- oder Aminorest;
n die Zahl 0, 1 oder 2 ist;
A ist ein Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylenrest,
X und Y, unabhängig voneinander, ein Haloalkylrest sind, und
Z bedeutet -OR', -SR', -NR'R'', -N(OR')R'' oder -N(SR')R'',
wobei R' ein Wasserstoffatom, Alkyl- oder ein Haloalkylrest und R" ein Alkyl- oder Haloalkylrest sind.
Die vorerwähnten Begriffe „alkyl", der Prefix „alk" (wie z. B. in „Alkoxy") und der Suffix „-alkyl" (wie z. B. in Hydroxyalkyl) beziehen sich auf alle geradlinige oder verzweigte C1-18.
Die oben beschriebenen chemischen Verbindungen beinhalten auch, falls anwendbar, deren Salze und Pro-Pharmaka. Solche Salze können sich z. B. bilden zwischen einem positiv geladenen Substituent in einer Verbindung dieser Erfindung (z. B. Amino) und einem Anion. Geeignete Anionen beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, Chloride, Bromide, Iodide, Sulfate, Nitrate, Phosphate, Citrate, Methansulfonate, Trifluoracetate und Acetate. Außerdem kann ein negativ geladener Substituent in einer Verbindung dieser Erfindung ein Salz mit einem Kation bilden (z. B. Carboxylat).
Geeignete Kationen beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, Natrium-Ionen, Kalium-Ionen, Magnesium-Ionen, Kalzium-Ionen und ein Ammonium-Kation wie ein Tetramethylammonium-Ion. Beispiele von Pro-Pharmaka beinhalten Ester und andere pharmazeutisch akzeptierte Derivate, die bei Verabreichung an eine Versuchsperson geeignet sind, vorerwähnte Steroid-Verbindungen zur Verfügung zu stellen.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung beruht auf einer pharmazeutischen Zusammensetzung einschließlich einer wirksamen Menge einer Verbindung dieser Erfindung und einem phamazeutisch akzeptablen Träger. Die chemischen Verbindungen dieser Erfindung können in der Tat angewendet werden, um Krankheiten wie Herzkrankheit und Schlaganfall, Alzheimer und Entzündungsymptome zu behandeln, die durch LXR beeinflusst werden. Somit gibt es auch im Rahmen dieser Erfindung ein Verfahren, eine chemische Verbindung dieser Erfindung anzuwenden, eine der vorerwähnten Krankheiten zu behandeln sowie ein weiteres Verfahren, ein Medikament herzustellen, das für die Behandlung einer der soeben genannten Krankheiten verwendet wird.
Einzelheiten verschiedener chemischer Verbindungen dieser Erfindung sind in der unten stehenden Beschreibung dargelegt. Weitere Merkmale, Ziele und Vorteile dieser Erfindung sind aus der Beschreibung und den Patentansprüchen ersichtlich.
Detaillierte Beschreibung dieser Erfindung
Chemische Verbindungen dieser Erfindung können synthetisch hergestellt werden durch in der Technik an sich bekannte Methoden unter Verwendung eines geeigneten Steroides als Ausgangsmaterial. Genauer gesagt besitzt ein solches Steroid einen Substituenten an C-17 [der Kohlenstoff, an dem R17 angefügt wird], siehe oben genannte Formel (I), der modifiziert werden kann, indem er Bestandteile enthält, die definiert werden durch X, Y und Z [ebenfalls aus oben genannter Formel (I) ersichtlich]. Beispiele beinhalten Cholsäure, Dehydrocholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäure, Ursodesoxycholsäure, Hydrocholsäure, Hydrodesoxycholsäure und Cholansäure. Sie sind entweder im Handel erhältlich oder können synthetisch hergestellt werden durch Verfahren, die z. B. in der Literatur Roda et al., F. Lipid Res., 1994, 35: 2268-2279 und Roda et al., Dig. Dis. Sci. 1987, 34: 24S-35S beschrieben sind.
Eine chemische Verbindung dieser Erfindung mit einem amidhaltigen Substituenten an C-17 (d. h. X und Y zusammen bedeuten =O und Z ist ein Aminrest), kann hergestellt werden durch Reaktion eines Steroides mit einem carboxylhaltigen Substituenten an C-17 mit einer aminohaltigen Verbindung (wie Dimethylamin, Anilin, Glycin und Phenylalanin). Ähnlich kann eine erfindungsgemäße Verbindung mit einem esterhaltigen Substituenten an C-17 (d. h. X und Y zusammen bedeuten =O und Z ist ein Alkoxyrest), hergestellt werden durch Reaktion eines Steroides mit einem carboxylhaltigen Substituenten an C-17 mit einer hydroxylhaltigen Verbindung (wie Ethanol und Isopropanol). Die amid- oder esterbildende Reaktion kann in jedem geeigneten Lösungsmittel stattfinden. Wenn die Reaktion in einer wässrigen Lösung stattfindet, ist eine Isolierung des Steroid-Produktes für in-vitro- oder in-vivo-screening-Assays nicht erforderlich.
Eine erfindungsgemäße Verbindung mit einem carbonylhaltigen Substituenten an C-17 (d. h. X und Y zusammen bedeuten =O) kann umgewandelt werden, z. B. in eine thiocarbonylhaltige Verbindung dieser Erfindung (d. h. X und Y zusammen bedeuten =S) und zwar durch Reaktion mit Schwefelwasserstoff oder in eine aminohaltige Verbindung dieser Erfindung (d. h. X und Y bedeuten = NR) durch Reaktion mit Hydrazin, wie in der Literatur Janssen et al. (Ed.), Organosulfur Chemistry; Wiley: New York, 1967, 219-240 und Patai et al. (Ed.), The chemistry of the Carbon-Nitrogen Double Bond; Wiley: New York, 1970, 64-83 bzw. 465-504 beschrieben.
Substituenten in Ringatomen ausser an C-17, können, falls erforderlich, durch in der Technik an sich bekannte Verfahren weiter modifiziert werden. Bspw. kann ein hydroxylhaltiger Substituent an C3 in einen Ester-Substituenten umgewandelt werden durch Reaktion mit einer Säure wie z. B. Essigsäure.
Aufgrund der Einfachheit der Reaktion kann diese automatisiert werden. Isolierung und Mengenbestimmung des Produktes können durchgeführt werden mittels Dünnschicht-Chromatographie, Hoch-Druck-Flüssigkeitschromatographie, Gaschromatographie, Kapillar-Elektrophorese oder sonstige analytische und präparative Verfahren.
Eine chemische Verbindung, die keine Karbonyl, Thiokarbonyl oder Imino-Gruppe im C-17-Substituent aufweist, kann auch durch in der Technik an sich bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann das 3α,24-Dihydroxy-24,24-di(trifluormethyl)-5β-Cholan anhand des folgenden Schemas hergestellt werden:
Wie in obigem Schema dargestellt, reagiert Cholansäure zuerst mit Methanol in Gegenwart einer Säure, um deren Methyl-Ester zu produzieren, der anschließend eine Reaktion mit tert-Butyldimethylsilyl-Chlorid (TBDMSCI) eingeht, um die 3β-Hydroxyl-Gruppe zu schützen. Der geschützte Methyl-Ester wird dann umgewandelt in ein Aldehyd durch Reaktion mit Di(Isobutyryl)Aluminiumhydrid, das anschließend umgewandelt wird in Alkohol, α-substituiert durch Trifluormethyl, durch Reaktion mit Trimethyl(trifluoromethyl)Silan. Der Alkohol unterzieht sich dann einer Dess-Martin-Reaktion, um in ein Keton umgewandelt zu werden, wie in der Literatur Dess et al., J. Org. Chem. 1983, 38: 4155 beschrieben. Das Keton wird wiederum behandelt mit Trimethyl(trifluoromethyl)Silan, um Alkohol zu produzieren, α-substituiert durch 2 Trifluoromethyl-Gruppen. Zum Schluss wird der disubstituierte Alkohol von dem Schutzsubstituenten befreit durch Umsetzung mit Tetrabutylammoniumfluorid (TRAF), um das 3α, 24-Dihydroxy-24,24-di(trifluoromethyl)-5β-Cholan zu erhalten.
Eine wirksame Menge einer Verbindung derart präpariert, kann mit einem pharmazeutisch akzpetablen Träger formuliert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden, bevor diese Substanz für eine Behandlung von Krankheiten wie Arteriosklerose, Apo-E-Mangel oder eine entzündliche Krankheit verabreicht wird. „Eine wirksame Menge" ist die Menge in der chemischen Zusammensetzung, die benötigt wird, um einen therapeutischen Effekt bei den zu behandelnden Versuchspersonen zu erzielen. Die Wechselwirkung der Dosierungen bei Tieren und Menschen (basierend auf mg/m² Körperoberfläche) wird in der Literatur Freireich et al., cancer Chemother. Rep. 1966, 50,219 beschrieben. Der Bereich der Körperoberfläche wird in etwa bestimmt durch Körpergrösse und Körpergewicht des Patienten, wie z. B. in der Literatur Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537 beschrieben. Wirksame Dosierungen, wie sie dem Stand der Technik nach bekannt und fachmännisch angewendet werden, variieren auch je nach Verabreichungsart, nach Verwendung des Arzneimittelträgers und der optionalen zusätzlichen Verwendung mit anderen therapeutischen Behandlungen. Beispiele von pharmazeutisch akzeptablen Trägern beinhalten kolloidales Siliziumdioxid, Magnesium-Stearat, Zellulose, Natriumlaurylsulfat und D&C Yellow # 10.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann parenteral verabreicht werden, z. B. topisch, intraperitoneal und intravenös. Beispiele von parenteralen Dosierungsformen beinhalten eine aktive chemische Verbindung aufgelöst in einer Phosphat-Pufferlösung oder sind anderen pharmazeutisch akzeptablen Trägern beigemischt. Mittel zur Solubilisierung wie Cyclodextrine oder andere Mittel zur Solubilisierung, die man in der Technik bereits kennt, können auch der pharmazeutischen Zusammensetzung beigefügt werden.
Ein in-vitro-Versuch kann durchgeführt werden, um eine chemische Zusammensetzung dieser Erfindung vorher auf ihre Wirksamkeit hin zu screenen, die LX-Rezeptoren zu unterstützen und folglich eine Krankheit, die von LX-Rezeptoren beeinflusst wird, zu behandeln. Beispielsweise werden Nierenzellen transfiziert durch ein Luciferase-Reportergen (das einen menschlichen C-fos Minimal-Promoter enthält) und einen LX-Rezeptor. Nachdem die transfizierten Zellen mittels einer noch zu testenden chemischen Verbindung inkubiert werden, wird die Luciferase-Aktivität gemessen um den Transaktivierungsgrad der Reporter-Gene zu bestimmen.
Verbindungen, die die Wirksamkeit im Vorversuch zeigen, können weiter ausgewertet werden in einem Tierversuch mittels einer Methode, die dem Stand der Technik entspricht. Eine Mischung kann zum Beispiel oral an Mäuse verabreicht werden, die einseitig mit cholesterinhaltiger Nahrung gefüttert wurden. Die Wirksamkeit der Mischung kann bestimmt werden, indem die Cholesterin-Gehalte in verschiedenen Gewebeteilen von behandelten und unbehandelten Mäusen verglichen werden.
Ohne weitere Differenzierung ist es dem Fachmann möglich, basierend auf der vorliegenden Beschreibung, die hier erläuterte Erfindung in vollem Umfang umsetzen. Alle hierin zitierten Veröffentlichungen werden hiermit unter Bezug auf ihre Vollständigkeit einbezogen. Die folgenden speziellen Beispiele, die Synthese-Vorschriften und biologischen Testmethoden verschiedener Verbindungen dieser Erfindung beschreiben, sind daher eher als Veranschaulichung anzusehen, ohne sie in irgend einer Weise darauf zu beschränken.
Beispiel 1:
Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung dieser Erfindung
Ein 3α,6α, 24-Trihydroxy-24,24-di(trifluoromethyl)-5β-Cholan [Verbindung (1)] wurde synthetisch hergestellt mittels der oben beschriebenen Methode.
Ein 3α,6α,Dihydroxy-5β-Cholansäure-N-Methyl-N-Methoxy-24-Amid [Verbindung (2)], ein 2,2,2-Trifluoroethyl-3α,6α-Dihydroxy-5β-Cholansäure 24-Amid [che-mische Verbindung (3)], ein 24-Cholestenamid [Verbindung (4)], ein N,N-Dimethyl-24-Cholestenamid [Verbindung (5)] und ein N-Methoxy-24-Cholestan-amid [Verbindung (6)] wurden nach folgender Methode synthetisch hergestellt:
Eine Steorid-24-Karbonsäure (Sigma, St. Louis, Missouri), ein Amin, ein Diethylcyanophosphonat (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) und ein Triethylamin wurden gelöst in Dimethylformamid. Die Lösung wurde bei 20–70°C 12–16 Stunden lang gerührt, mit Eis abgeschreckt und dann mit Ethylacetat extrahiert. Der aus dieser Lösung gewonnene Ethylacetat-Extrakt wurde nach und nach mit einer 1.0 N HCl-Lösung und einer 1.0 N NaOH-Lösung gewaschen und anschließend mittels eines Natriumsulfatanhydrids getrocknet. Das Rohprodukt erhielt man nach Entfernung des Ethylacetats und Aufreinigung, falls erforderlich, durch Anwendung der Standard-Silizium-Chromatographie.
Beispiel 2:
Reportergen-Transaktivierungs-Versuch
Human-embryonale Nierenzellen 293 wurden gezüchtet in einer Kulturschale mit 48 Behältern bei 10⁵-Zellen pro Behälter in einem nach Dulbecco modifizierten Eagle's Nährmedium (DMEM), das mit 10 %igem Rinderfötenserum angereichert wurde. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen transfiziert mittels einer Kalzium-Phosphat-Kopräzipitations-Methode mit 250 ng eines pGL3/UREluc Reportergens, das aus 3 Kopien von AGGTCAagccAGGTCA bestand und verschmolzen wurde mit Nukleotiden –56 bis +109 des Human c-Fos Promotors vor dem Leuchtkäfer-Luciferase-Gen in der plasmidbasierenden pGL3 (Promega, Madison WI), 40 ng pSG5/hRXRα, 40 ng pSG5/rUR oder CMX/hLXRα, 10 ng pSG5/hGrip1, 0.4 ng CMV/R-luc (Transfektionsagenz, Promega) und 250 ng Träger DNA pro Behälter. Nach weiterer 12–24-stündiger Inkubation wurden die Zellen in einer salzhaltigen Phosphat-Puffersubstanz gewaschen und dann erneut mit Nährmedium (DMEM) versehen, das mit einem 4 %igem delipidisiertem Rinderfötenserum angereichert wurde. Eine Ethanol-Lösung, die eine zu testende Verbindung enthält, z. B. die Verbindungen (2) oder (3) wurde 2-fach der DMEM-Zellkultur zugefügt mit der Endkonzentration der Verbindung von 1 bis 10 μM und der Ethanol-Endkonzentration von 0,2 %. Nach weiterer 24–48 stündiger Inkubation wurden die Zellen gesammelt und die Luciferase-Aktivität mit einem handelsüblichen Reagens (Promega Dual luciferase IL) durch ein monochromatisches Luminometer (Becton Dickenson, Mountain View, CA) gemessen.
Die Ergebnisse zeigen, dass beide Verbindungen (2) und (3) potente Agonisten für die LXRα- und UR-Rezeptoren sind.
Beispiel 3:
Wirkung auf Diät-induzierte hypercholesterolämische Mäuse
2 Gruppen von 3 Monate alten Albino-Mäusen, die nicht aus der Schweiz stammen (Harlan, Indianapolis, Indiana), d. h. eine Kontrollgruppe und eine Behandlungsgruppe wurden 7 Tage lang mit einer Nahrung gefüttert, (Harlan Teklad 7001), (Harlan, Indianapolis, Indiana), die mit 1 % Cholesterin angereichert wurde. Die Kontrollgruppe erhielt Trinkwasser, das 0,25 % Hdroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPCD, Acros Organic, Somerville, New Yersey) enthielt, während die Behandlungsgruppe Trinkwasser bekam, das sowohl 0,25 % HPCD als auch die Verbindung (2) (0,125, 0,25 und 0,5 g/L) enthielt. Die Mäuse hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Der Wasserverbrauch zwischen den beiden Gruppen machte eine Differenz von weniger als 10 % aus.
Blut wurde entnommen von Mäusen mit 4-h Nahrungskarenz. Die Höhe des Cholesterin- und Triglyceridwertes im Serum wurde enzymatisch mit einem handelsüblichen Verfahren gemessen (Sigma, St. Louis, MO). Hochverdichtetes Lipoprotein-Cholesterin wurde isoliert und enzymatisch quantifiziert nach Methoden, die in der Literatur Warnick et al., Clin. Chem. 1982, 28: 1379-88 beschrieben sind. Leber-Cholesterin und Triglyceride wurden isoliert und quantifiziert nach Methoden, wie sie in der Literatur Bligh et al., Canadian J. Biochem. Physiol. 1959, 37: 911-918 beschrieben sind. Fäkale Gallensäuren wurden reduziert mit einem Natrium-Borhydrid und dann extrahiert und quantifiziert nach Methoden, die in der Literatur Turley et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 1996, 27: 71-79 beschrieben sind. Gallensäuren wurden quantifiziert mit einem handelsüblichen Verfahren (Sigma, St. Louis, MO).
Die Ergebnisse zeigen, dass die cholesterinhaltige Nahrung den zirkulierenden Cholesterinwert nicht veränderte, jedoch den Leber-Cholesterinwert bei Mäusen anhob. Die Verabreichung der Verbindung (2) verhinderte, dass die Leber-Cholesterin-Werte anstiegen und beschleunigte die Cholesterinausscheidung durch den Anstieg von fäkaler Gallensäureabsonderung. Die Höhe des Triglycerides im Serum und in der Leber wurde durch die Verabreichung der Verbindung (2) nicht beeinflusst.
Eine männliche Maus C57BL/6J (Jackson Laborstory, Bar Harbor, ME), die empfänglich für die Entstehung von Arteriosklerose war, wurde für die gleiche Studie verwendet. Die Serum-Cholesterin-Höhe wurde in einer dosierungsabhängigen Anwendung der Verbindung (2) verringert, wohingegen die Höhe des Triglycerids im Serum während des gesamten Versuchszeitraumes nicht wesentlich anstieg.
Beispiel 4:
Wirkung auf Diät-induzierte hypercholesterolämische Hamster
Die Gallensäure und zirkulierenden Cholesterin-Profile von Hamstern, jedoch nicht von Ratten oder Mäusen, sind den menschlichen ähnlich. Ergänzend dazu die Feststellung, dass der Hauptcholesterinträger im Serum bei Menschen und Hamstern ein Lipoprotein mit niedriger Dichte ist verglichen mit dem hochverdichteten Lipoprotein bei Ratten und Mäusen. Versuche mit Hamstern wurden deshalb durchgeführt, um den Effekt der Verbindung (2) auf die Cholesterin- und Triglyceride-Profile zu bewerten.
Die Verbindung (2) wurde 2 Wochen lang an Hamster oral verabreicht, die gefüttert worden sind mit einer normalen Nahrung und einer Dosis von 200 mg/kg/Tag. Die Höhe der Cholesterin- und Triglycerid-Werte im Serum bei Hamstern änderte sich nicht. Andererseits, wenn die Verbindung (2) an Hamstern verabreicht wurde, die mit einer 1%-Cholesterinangereicherten Nahrung gefüttert wurden, verhinderte dies einen Anstieg des Serum-Cholesterins oder des Cholesterylestergehaltes in der Leber. Der Gehalt des Triglycerid-Wertes im Serum bei Hamstern, die mit der Verbindung (2) gefüttert worden sind, war signifikant höher als der bei Hamstern, die mit einem Plazebo behandelt wurden. Deren Gehalt war jedoch ungefähr der gleiche wie der in der Kontrollgruppe festgestellte Gehalt, wo mit einer normalen Nahrung gefüttert wurde und der im normalen Rahmen lag, wie in Literatur Trautwein et al., Corp. Biochem. Physiol. A Mol. Integ. Physiol. 1999, 124: 93-103 beschrieben. Die Verminderung des Triglyceridwertes bei Hamstern innerhalb der mit einem Plazebo behandelten Gruppe wurde vermutlich ausgelöst durch eine massive Ansammlung von Cholesteryl-Estern in der Leber.
Beispiel 5:
Wirkung auf Diät-induzierte hypercholesterolämische Ratten
Ein Tierversuch wurde mittels der in Beispiel 4 beschriebenen Methode geführt mit der Ausnahme, dass die Verbindung (3) an 3 Monate alten, männlichen Harlan Sprague-Dawley-Versuchsratten (Harlan, Indianapolis, Indiana) verabreicht worden ist anstatt der chemischen Verbindung (2) bei Hamstern. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die chemische Verbindung (3) als auch die Verbindung (2) einen hypo-cholesterolämischen Effekt haben.
Beispiel 6:
In-Vitro-Studie der Wirkung auf die ApoE-Gen-Expressionen
(1) In Rattenastrozyten
Astrozytenkulturen wurden aus einer Hirnrinde von 1–2 Tage alten neonatalen Harlan Sprague-Dawley-Ratten präpariert (Harlan, Indianapolis, Indiana) mittels einer Methode, wie sie in der Literatur LaDu et al., J. Biol. Chem., 2000, 275 (43): 33974-80 beschrieben ist. Die Astrozyten wuchsen zu 90%iger Konfluenz heran, bevor die Experimente überhaupt durchgeführt worden sind. Der Kulturmedium wurde zu einem α-minimalen Nährmedium mit Zusätzen von N2 (Life Technologies, Inc. Gaithersburg, Maryland) geändert, zu denen die chemische Verbindung (2) (0,1 bis 1 μM/L) dreifach zugefügt worden ist. Nach einer 48–72 ständigen Inkubation wurde ein klimatisierter Nährboden aufgesammelt und mit einem SDS-Ladepuffer gemischt. Zelllysate wurden im ,in-situ'-Verfahren hergestellt durch hinzufügen eines SDS-Ladepuffers zu den Nährkulturen.
,Westernblot'-Analysen wurden durchgeführt wie in der Literatur von LaDu et al, supra beschrieben. Zelllysate und präparierte Träger wurden auf ein 4–20%iges gradientes SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel aufgetragen und nach der Elektrophorese auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membrane wurde kurz mit Aminoschwarz gefärbt und in destilliertem Wasser entfärbt. Nachdem die Protein-Farbmuster gescannt wurden, wurden die Membranen blockiert mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung mit 0,2 % Tween 20 Gehalt und 1 % fettfreiem Milchpulver. Der ApoE-Gehalt wurde nachgewiesen mit Hilfe von Antiratten-ApoE-Polyklonalen-Antikörpern, von Meerrettichperoxidase konjugierten Ziegen Anti-Kaninchen IgG, einem chemieluminiszentem Substrat (Pierce, Rockford, IL) und Röntgenfilmen.
Verglichen mit der Behandlung mit Plazebos ergab die Verabreichung der Verbindung (2) einen Anstieg des Apo-E-Gehaltes sowohl im Zellmedium als auch im Lysat.
(2) In menschlichen THP-1-Zellen
THP-1-Zellen (ATCC, Manassas, VA), eine human-monozyklische Zelllinie wurde in einem In-Vitro-Versuch verwendet mittels einer Methode wie sie im Beispiel 6 beschrieben worden ist. Genauer gesagt wurden diese Zellen in einem RPMI1640-Träger mit 10% igem Rinderfötenserum aufrechterhalten und dann vor der Verwendung 24 Stunden lang aktiviert durch Behandlung mit PMA. Der Träger wurde danach ersetzt durch einen serumfreien Cellgro^TM Komplettträger (Mediatech, Fisher Scientific, Pittsburgh, USA). Eine Ethanol-Lösung mit der Verbindung (2) (0,1–1 μM/L) wurde dann dem Zellträger zugefügt. Die Zellen wurden für weitere 48–72 Stunden inkubiert und anschliessend geerntet. Der ApoE-Gehalt in den Zellen wurde durch die oben beschriebene Methode bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verabreichung der Verbindung (2) auch einen Anstieg des Gehaltes sowohl von abgesondertem als auch von zellgebundenem ApoE bewirkt.
Beispiel 7:
Tierversuch auf ApoE-Gen-Expression
20 viermonatige männliche C57BL/6J Mäuse (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) wurden 8 Wochen lang mit einer normalen Nahrung gefüttert (Harlan 7001, Harlan, Idianapolis, Indiana), die mit 1,25 % Cholesterin, 0,5 % Cholsäure und 15 % Maisöl angereichert war. 3 Gruppen mit jeweils 5 Mäusen bekamen Trinkwasser, das mit 0,25 % HPCD und der Verbindung (2) in verschiedenen Konzentrationen versetzt, so dass sie Dosierungen von 25, 50 und 100 mg/kg Körpergewicht/Tag erhielten. Die 4. Gruppe bekam keine Verbindung (2). Am Ende der 8 Wochen wurden die Mäuse getötet und deren Hirne gesammelt. ApoE mRNA wurde aus gesammelten Hirnen einer jeden Gruppe, unter Verwendung eines phenolhaltigen Reagens (Trizol^TM-Reagens, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland), isoliert. Die mRNA-Analyse wurde durchgeführt mittels ,Northern Blot Analysis' zwecks Bestimmung des Grades der ApoE-Gen-Expression.
Die Ergebnisse zeigen, dass mehr ApoE mRNA in der behandelten Gruppe als in der Plazebo-Gruppe gefunden wurde. Durch die Behandlung mit der Verbindung (2) erniedrigte sich der zirkulierende Gesamt-Cholesterin-Gehalt und unterdrückte die Cholesterin-Anhäufung in der Leber.
Beispiel 8:
Tierversuch auf ApoE-Gen-Expression
20 LDL-Rezeptor-Null-Gen-Mäuse wurden 2 Wochen lang mit einer atherogenen Diät gefüttert (15 % Fett, 0,2 % Cholesterin), in 4 Gruppen mit jeweils 5 Mäusen unterteilt, mit Dosierungen von 0 (Kontrolle), 25, 50 und 100 mg/kg Körpergewicht/Tag der Verbindung (2). Die Verbindung (2) wurde in deren Trinkwasser aufgelöst, das auch 0,25 % HPCD enthielt. Am Ende der 2 Wochen wurden die Mäuse getötet und verschiedene Gewebeteile (z. B. Leber, Gehirn und Darm) wurden gesammelt. Diese wurden anhand der in Beispiel 7 beschriebenen Methode analysiert.
Die Ergebnisse zeigen, dass die behandelten Gruppen einen Gesamt-Cholesterin-Gehalt von 700 mg/dL und die Kontrollgruppe einen Gehalt von 1400 mg/dL hatten. Der Anteil von Apo-E mRNA in den Hirnen der behandelten Mäuse war 4–5 mal höher als der in der Kontrollgruppe. Die ,in-situ'-Hybridisierung mittels einer Anti-ApoE-Probe wies mehr mRNA in den Hirnen der behandelten Mäuse auf als in denen der unbehandelten Mäuse, vor allem im Bereich des Hippocampus und des cerebralen Cortex.
Beispiel 9:
Tierversuch auf antiinflammatorische Wirkung
Dieser Versuch wurde nach einer Methode durchgeführt wie in der Literatur Tonelli et al., Endocrinology 1965, 77: 625-634 beschrieben. Eine Crotonölmischung wurde präpariert mit 1 % Crotonöl, 25 % Pyridin, 60 % Ethylether, 5 % Wasser und der zu testenden Verbindung, d. h. Verbindungen (4) und (6). Eine männliche Albino-Maus Harlan, die nicht aus der Schweiz stammt, wurde verwendet (Indianapolis, Indiana).
Das rechte Ohr einer jeden Maus wurde mit 100 mL Crotonölmischung an beiden Seiten behandelt. 6 Stunden später wurden die Ohren abgeschnitten und deren Gewicht wurde ermittelt. Es wurde festgestellt, dass die Gewichtszunahme der Ohren, die mit der Verbindung (4) oder (6) behandelt wurden, deutlich niedriger war als die der Ohren, die nur mit Crotonöl behandelt wurden. Aus diesem Grunde sind diese Verbindungen effektive antiinflammatorische Agenzien.
Weitere Ausführungen
Mehrere Ausführungen dieser Erfindung sind beschrieben worden. Dessen ungeachtet gilt als vereinbart, dass verschiedene Änderungen gemacht werden können, ohne von der Intention und vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Folglich liegen weitere Ausführungen innerhalb des Umfanges der folgenden Ansprüche.

Claims

Chemische Verbindung der Formel (I):
in der die unabhängigen Reste R₁, R₂, R₃, R₄, R_4', R₅, R₆, R₇, R₁₁, R₁₂, R₁₅, R₁₆ und R₁₇ ein Wasserstoffatom, Halogenatom, ein Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Oxo-, Sulfonsäure- oder Alkylrest sind und gegebenenfalls über die Gruppen -NH-, -N(Alkyl)-, -O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -O-SO₂-, -SO₂-O-, -SO₃-O-, -CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-NR'- oder -NR'-CO- verbunden sind, die unabhängigen Reste R₈, R₉, R₁₀, R₁₃ und R₁₄ ein Wasserstoffatom, Halogenatom, ein Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxyalkyl-, Alkoxy-, Hydroxyl- oder Aminorest sind; n die Zahl 0, 1 oder 2 ist; A ist ein Alkylen-, Alkenyl- oder Alkinylrest, X und Y, unabhängig voneinander, ein Haloalkylrest sind, und Z bedeutet -OR', -SR', -NR'R'', -N(OR')R'' oder -N(SR')R'', wobei R' ein Wasserstoffatom, Alkylatom oder ein Haloalkylrest und R'' ein Alkyl- oder Haloalkylrest sind.
Chemische Verbindung nach Anspruch 1, in der die unabhängigen Reste R₅ und R₆ ein Wasserstoffatom, ein Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxy- oder Aminorest sind.
Chemische Verbindung nach Anspruch 2, in der R₅ ein Wasserstoffatom und R₆ ein Hydroxyrest ist.
Chemische Verbindung nach Anspruch 1, in der die unabhängigen Reste R₁, R₂, R₃, R₄, R_4', R₇, R₈, R₉, R₁₁, R₁₂, R₁₄, R₁₅, R₁₆ und R₁₇ ein Wasserstoffatom, Halogenatom, ein Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxyl- oder Aminorest sind, die unabhängigen Reste R₁₀ und R₁₃ ein Wasserstoffatom_, ein Alkyl- oder Haloalkylrest sind; n die Zahl 0 ist und A einen Alkylenrest darstellt.
Chemische Verbindung nach Anspruch 4, in der die unabhängigen Reste R₁, R₂, R₄, R_4', R₇, R₈, R₉, R₁₁, R₁₂, R₁₄, R₁₅, R₁₆ und R₁₇ ein Wasserstoffatom, R₃ ein Hydroxyrest und die unabhängigen Reste R₁₀ und R₁₃ ein Alkylrest sind.
Chemische Verbindung nach Anspruch 1, in der die Reste R₃ und R₆ ein Hydroxyrest ist, einer der Reste X, Y, oder Z einen -OR'-Rest darstellen und die beiden anderen Haloalkylreste sind, wobei R' ein Wasserstoffatom ist.
Chemische Verbindung nach Anspruch 6, in der R₅ ein Wasserstoffatom, ein Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxy-, oder Aminorest sind.
Chemische Verbindung nach Anspruch 7, in der R₅ ein Wasserstoffatom ist.
Chemische Verbindung nach Anspruch 6, in der die unabhängigen Reste R₁, R₂, R₄, R_4', R₇, R₈, R₉, R₁₁, R₁₂, R₁₄, R₁₅, R₁₆ und R₁₇ ein Wassserstoffatom, ein Halogenatom, ein Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxy-, oder Aminorest sind, die unabhängigen Reste R₁₀ and R₁₃ ein Wasserstoffatom, ein Alkyl- oder Haloalkylrest sind; n die Zahl 0 ist und A einen Alkylenrest darstellt.
Chemische Verbindung nach Anspruch 9, in der die unabhängigen Reste R₁, R₂, R₄, R_4', R₇, R₈, R₉, R₁₁, R₁₂, R₁₄, R₁₅, R₁₆ und R₁₇ ein Wasserstoffatom sind und die unabhängigen Reste R₁₀ and R₁₃ ein Alkylrest sind.
Chemische Verbindung nach Anspruch 1, in der die Verbindung folgende Formel aufweist:
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine wirksame Menge einer Verbindung folgender Formel:
in der die unabhängigen Reste R₁, R₂, R₄, R_4', R₇, R₈, R₉, R₁₁, R₁₂, R₁₄, R₁₅, R₁₆ und R₁₇ ein Wasserstoffatom, Halogenatom, ein Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl-, Oxo-, Sulfonsäure- oder Alkylrest sind und gegebenenfalls über die Gruppen -NH-, -N(Alkyl)-, -O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -O-SO₂-, -SO₂-O-, -SO₃-O-, -CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-NA'- oder -NR'-CO- verbunden sind, die unabhängigen Reste R₈, R₉, R₁₀, R₁₃, und R₁₄ ein Wassserstoffatom, Halogenatom, ein Alkyl-, Haloalkyl-, Hydroxyalkyl-, Alkoxy-, Hydroxyl- oder Aminoreste sind; n die Zahl 0, 1 oder 2 ist; A ein Alkylen-, Alkenyl-, oder Alkinylrest ist; X und Y, unabhängig voneinander, ein Haloalkylrest sind; und Z bedeutet -OR', -SR', -NR'R'', -N(OR')R'', oder -N(SR')R'', wobei R' ein Wasserstoffatom, ein Alkyl-, oder Haloalkylrest sind; und R" ein Alkyl- oder Haloalkylrest ist und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, enthaltend eine wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 6 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung Anspruch 12, in der die Verbindung folgende Formel aufweist: