DE2526981B2 - lalpha^Dihydroxycholecalciferol-Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Mittel - Google Patents

Description

(5-a)

HO

^rOH

Gegenstand der Erfindung sind neue 1*,24-Dihydroxycholecalciferole und ihre Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie pharmazeutische Mittel gemäß den Patentansprüchen.

Die neuen la^-Dihydroxycholeculciferole und DeH-vate davon werden durch die folgende Formel

OR,

enthält.

14. Pharmazeutisches Mittel für Warmblüter gemäß Anspruch 13, das oral oder durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion verabreichbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1<x-24(S)-und t«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel (5-a) und ein Trägermaterial enthält, das gegenüber Warmblütern nicht toxisch ist.

15. Pharmazeutisches Mittel, um den Calciummetabolismus von Warmblütern ;tu regulieren, nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem la-24(S)- und 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel (5-a) und ein für Warmblüter nichttoxisches Trägermaterial enthält.

16. Prophylaktisches oder therapeutisches pharmazeutisches Mittel für Vitamin-D-Mangelkrankheiten und verwandte Krankheiten nach einem der Ansprüche 13, 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1ä-24(S)- und l<x-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel (5-a) enthält.

17. Futtermittel für Haustiere und Geflügel, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,2 bis 20 μ£/Ι^ Futtermittel von mindestens einer der folgenden Verbindungen, nämlich lac-24(S)- und/oder 1«-24(R)-DihydroxycholecaleifeiOl, enthält.

18. Angereicherte Milch, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis l,(^g/I von mindestens einer der folgenden Verbindungen, nämlich 1«-24(S)- und/ oder !«^RJ-Dihydroxycholecalciferol, enthält.

R₁O

dargestellt, worin

Ri, R2 und R3 gleich oder unterschiedlich sein können und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überfülirbar ist, bedeuten.

Die allgemeine Formel (5) stellt allgemein 1«,24-(S)-Dihydroxycholecalciferol und seine Derivate (das als lac,24(S)-DHCC und seine Derivate bezeichnet werden) der folgenden Formel

OR.,

(5-1)

R₁O

dar, worin

Ri, R2 und R3 die gleiche Bedeutung wie oben gegeben besitzen, la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol und seine Derivate (das als 1«,24(R)-DHCC und seine Derivate bezeichnet werden) der folgenden Formel

OR₃

(5-2)

R₁O

Iu worin

Ri, Rj und R] die gleiche Bedeutung wie oben gegeben besitzen, und eine Mischung aus 1<%,24(S)-Epimer der Formel (5-1) und 1«,24(R)-Epimierder Formel(5-2).

In der vorliegenden Anmeldung wir wird die obige Mischung aus dem l«,24(S)-Epimer der Formel (5-1) und dem la,24{R)-Epimer der Formel (5-2) in beliebigem Verhältnis durch die folgende Formel

(5-3)

R₁O

ausgedrückt. In anderen Worten wird —OR3 in der 24-Stellung durch

dargestellt.

Die gleiche Darstellung wie in den obigen Formeln (5), (5-1) und (5-2) wird verwendet, um die Vorstufen für diese Verbindungen darzustellen.

Von den la^-Dihydroxycholecalciferolen und seinen Derivaten der Formel (5) besitzen 1«,24-Dihydroxycholecalciferole der Formel

OH

HO

(5-a)

OH

die nützlichsten pharmakologischen Wirkungen, wie die Anmelderin festgestellt hat.

Die 1«,24-Dihydroxycholecalciferole der Formel (5-a) bedeuten ebenfalls (i) la^SJ-Dihydroxycholecalciferol [l«,24(S)-DHCCl(ii)lai4<R)-Dihydroxycholecalciferol [Iä,24(R)-DHCC] und (iii) eine Mischung aus la,24(S)-DHCC und l<x,24(R)-DHCC (1«,24-DHCC epimere Mischung).

Wie im folgenden in ausführlichen Tierversuchen erläutert wird, zeigen das 1«,24(S)-DHCC allein, das 1«,24(R)-DHCC allein und Mischung davon eine sehr wertvolle pharmakologische Aktivität, um den Calcium-Metabolismus von Warmblütern zu regulieren, und sie

besitzen eine wesentlich niedrigere Toxizität (LDm) als la-Hydroxycholecalciferol (Ia-HCC), welches ein zu aktiven Formen des Vitamins Dj bekanntes Analoges: ist.

Das la-Hydroxycholecalciferol (Ia-HCC) wird durch die folgende Formel

HO

(B-I)

OH

dargestellt.

Soweit der Anmelderin bekannt ist, wurde über die la^-Dihydroxycholecalciferole noch nicht berichtet,

>■> die einzige Ausnahme ist eine Arbeit der Erfinder der vorliegenden Anmeldung in The Journal of Steroid Biochemisty, Band 5, Nr. 4, Juni 1974, Fourth International Congress on Hormonal Steroids, Mexico-City, 2. bis 7. Septemper 1974, Abstracts of Papers.

Presented (tatsächlich publiziert am 16. August 1974). In dieser Arbeit wird angegeben, daß 24-Hydroxycholeste· rin (24-HC) der folgenden Formel

OH

(B-2)

24,25-Dihydroxycholesterin (24,25-DHC) der folgenden Formel

OH

HO

OH

(B-3)

und deren la-Hydroxyclerivate in Vitamin-D-Derivate bo nach bekannten, üblichen Verfahren überführt werden können. Es sind jedoch nur die Verbindungen der Formeln (B-2) und (B-3). die damals in Vitamin-D-Derivate überführt werden konnten. Dementsprechend ist es seit dem obenerwähnten Kongreß in Mexico-City nur bekannt, daß die Umwandlung von la-Hydroxyderivaten der Formel (B-2) in Vitamin-D-Derivate noch untersucht wurde, und auf dem Kongreß wurde nicht über die Umwandlung der 1a-Hydrox*yderivate der

Formel (B-3) in Vitamin-DDerivate berichtet. Nach den damaligen Arbeiten der Anmelderin und ihren folgenden Untersuchungen war es nicht möglich, mit den Verfahren, die vor der Einreichung der vorliegenden Anmeldung bzw. vor dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung bekannt waren, Vitamin-D-Derivate des Cholecalciferol-Typs aus diesen Derivaten herzustellen, wie im folgenden näher erläutert wird. Der Anmelderin gelang es jetzt jedoch, eine Gruppe von neuen t«-24-Dihydroxycholecalciferolen und deren Derivaten der Formel (5} und bevorzugt der Formel (5-a) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das im folgenden näher erläutert wird, zu synthetisieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden in Einzelheiten beschrieben.

(1) Erste Reaktionsstufe

Erfindungsgemäß wird Ια-24-Dihydroxycholesterin (das als Ιλ-24-DHC bezeichnet wird) der folgenden Formel (2-a)

OH

OH

(2-a)

durch Umsetzung von l«,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on (das als la^oi-Epoxy bezeichnet wird) der folgenden Formel

mit einem Alkalimetall und einem Protondonor in Anwesenheit von flüssigem Ammoniak oder einem flüssigen Amin hergestellt.

Ιλ-24-DHC, das durch die Formel (2-a) dargestellt wird, bedeutet eine Mischung aus 1«-24(S)-Oihydroxycholesterin [1«-24(S)-DHv:] und 1«-24(R)-Oihydroxycholesterin [1«-24(R)-DHC] in beliebigen Ve rhältnissen, und gemäß dem Verfahren der ersten Stufe oben wird Ια-24-DHC als Mischung iius (S)-Epimer und (R)-Epimer erhalten.

Soweit der Anmelderin bekannt ist, sind 1 et-24-Epoxy der Formel (1) und l«-24-DHC der Formel (2 a) beides neue Verbindungen, die in <ler Literatur nicht beschrieben werden, sondern die erstmals von der Arimelderin synthetisiert wurden.

Das obige Ιλ-24-DHC kann in eine Gruppe von Ια-24-DHCC und seinen Derivaten der Formel (5), insbesondere der Formel (.'(-a), nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das näher erläutert wird, Überführt werden. Zusätzlich sind diese Verbindungen wertvolle Zwischenprodukte für andere Steriode, die physiologische Aktivitäten besitzen, beispielsweise Zwischenprodukte für die Synthese von lÄ-24,25-Trihydroxycholecalciferol, welches eine aktive Form von Vitamin D3 ist.

Beispiele von flüssigen Aminen, die bei der ersten -, Stufe verwendet werden können, sind primäre, sekundäre oder tertiäre Alkylamme wie Methylamin, Äthylamin, Diäthylamin oder Triäthylamin. Die Verwendung von flüssigem Ammoniak ist jedoch bevorzugt. Obgleich im Hinblick auf den flüssigen Ammoniak keine besondere Beschränkung besteht, ist es bevorzugt, ihn beispielsweise durch Destillation zu behandeln, um das Wasser daraus so weit wie möglich zu entfernen. Die geeignete Menge an flüssigem Ammoniak oder flüssigem Amin beträgt das 5- bis 500fache, insbesondere das !O- bis 200fache, bezogen auf das Gewicht des lÄ,2Ä-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-ons.

Beispiele von bevorzugten Alkalimetallen sind Lithium, Natrium und Kalium. Lithium ist besonders gut geeignet. Es wird eine überschüssige Menge an 21J Alkalimetall, bezogen auf das lÄ,2Ä-Epoxy der Formel (1), verwendet, beispielsweise das 5- bis 250fache (ausgedrückt als Atomäquivalent), insbesondere das 10-bis 200fache, bezogen auf die Menge an ΐΛ^Λ-Epoxy der Formel (1).

Bevorzugt wird ein inertes organisches Lösungsmittel für das 1«,2Ä-Epoxy der Formel (1) verwendet, damit die Umsetzung glatt verläuft. Beispiele bevorzugter Lösungsmittel sind die Äther wie Äthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan oder 1,2-Dimethoxyäthan, aliphatische Kohlenwasserstoffe: wie Ligroin, Pentan, Hexan, Cyclohexan oder Methylcyclohexan und Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Verbindungen.

Die Menge an organischem Lösungsmittel ist mindestens gleich, bezogen auf das Volumen des verwendeten flüssigen Ammoniaks, und beträgt bevorzugt das 1- bis 2fache, bezogen auf das Volumen des flüssigen Ammoniaks.

Geeignete Protonendonoren sind die Ammoniumsalze wie die Ammoniumsalze organischer Säuren und die Ammoniumsalze von anorganischen Säuren. Spezifische Beispiele der Ammoniumsalze sind Ammoniuinchlorid, Ammoniumbromid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumsulfat,

Ammonhimphosphat, Ammoniumhydrogenphosphat, Ammoniumace tat, Ammoniumformiat, Ammoniumberizoat,

Ammoniumbenzolsulfonat und Ammonium-p-itoluensulfat.

Vondiesensind dieAmmoniumsalze der anorganischen Säuren wie Ammoniumchlorid besonders bevorzugt. Die Menge an Ammoniumsalz ist mindestens äquimolar

zu dem verwendeten Alkalimetall, bevorzugt beträgt sie das bis zu 1 Omolarfache, bezogen auf das Letztere.

Niedrigere Alkohole wie Methanol, Äthanol oder tert.-Butylalkohol können ebenfalls als Protonendonobo ren verwendet werden.

Das Zugabeverfahren der Reaktionsreagentien ist bei der Durchführung der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens sehr wichtig, und vorteilhafterweise wird eines der folgenden drei Zugabeverfahren b5 ausgewählt.

(A) Das 1«,2Ä-Epoxy wird zu einer Mischung zugegeben, die flüssiges Ammoniak und Alkalimetall enthält, und dann wird das Ammoniumsalz zugefügt. Zur

Zeit ist es bevorzugter, das Ammoniumsalz nacheinander in zwei oder mehreren kleinen Teilen zuzufügen.

(B) Ein geringer Anteil (wünschenswerterweise weniger als das 0,7molfache, bezogen auf die Menge an verwendetem Alkalimetall) des Ammoniumsalzes wird zuvor zu einer Mischung, die das flüssige Ammoniak und das Alkalimetall enthält, zugegeben. Das 1«,2«-Epoxy wird zu diesem System zugefügt, und dann wird der Rest des Ammoniumsalzes zugegeben.

(C) Das l«,2a-Epoxy und das Ammoniumsalz werden gleichzeitig in kleinen Portionen zu einer Mischung zugegeben, die flüssiges Ammoniak und Alkalimetall enthält.

Von den obigen Verfahren ist das Verfahren (A) besonders bevorzugt.

Die Reaktionstemperatur beträgt üblicherweise von — 70⁰C bis zur Rückflußtemperatur des flüssigen Ammoniaks in dem Reaktionssystem.

Es ist vorteilhaft, daß, nachdem der gesamte Protonendonor zugegeben wird, die Umsetzung bis zum Rückfluß des flüssigen Ammoniaks weitergeführt wird, bis das im Überschuß verwendete Alkalimetall vollständig zersetzt ist. Somit ist es möglich, daß man das Endprodukt Ια-24-DHC in höherer Ausbeute erhält.

Ein Verfahren war früher bekannt, bei dem la^«-Epoxy-cholesta-4,6-dien-3-on der Formel

(B-4)

mit metallischem Lithium und Ammoniumchlorid in Anwesenheit von flüssigem Ammoniak umgesetzt wird, wobei lac-Hydroxycholesterin (Ia-HC)der Formel

OH

HO

(B-5)

gebildet wird, um la-Hydroxycholecalciferol (B-I) herzustellen (D.H. R. Barton et al., J. Am. Chem.Soc, 95,2748,1973).

Es wurde gefunden, daß das 1α,2α-Epoxy, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch eine Oxogruppe (■= 0) in der 24-Stellung substituiert ist, und erfindungsgemäß verläuft die Vier-Stufen-Reduktionsreaktion eines solchen 1<χ,2λ-Epoxys, d. h.

(1) die Reduktion der Carbonylgruppe in der 24-Stellung,

(2) Die Reduktion der 1«,2«-Epoxygruppe,

(3) die Reduktion des 4,6-Diens zu einem 5-En und

(4) die Reduktion der Carbonylgruppe in der 3-Stellung

glatt in einer einzigen Stufe, und wenn bevorzugte Bedingungen verwendet werden, kann das Ια-24-Dihydroxycholesterin (Ιλ-24-DHC) in hoher Ausbeute von 60 bis 75% synthetisiert werden. Die Tatsache, daß bei einer solchen Vier-Stufen-Reduktionsreaktion die Stufen (1) bis (4) glatt in einer einzigen Stufe ablaufen, wird in keiner Publikation beschrieben, und es wird angenommen, daß dies eine neue Reaktion ist, die ?um ersten Mal von der Anmelderin gefunden wurde.

(2) Herstellung von l«,2a-Epoxy

Das I*,2a-Epoxy der Formel(l),das als Ausgangsmaterial bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, kann leicht, beispielsweise durch das folgende Verfahren, hergestellt werden, wobei als Ausgangsmaterial Fucosterin der folgenden Formel

(Λ-Ι)

verwendet wird, das in großen Mengen in braunen Meeresalgen vorhanden ist Ein Beispiel dieses Verfahrens wird im folgenden näher erläutert.

Fucosterin wird mit Ozon bei niedrigen Temperaturen oxydiert, und das entstehende Ozonid wird mit einem Essigsäure/Zink-System reduziert, um 24-K.etocholesterin der folgenden Formel

(A-2)

in einer Ausbeute von ungefähr 60 bis 75% zu bilden. Das entstehende 24-K.etochoIesterin wird oxydiert, beispielsweise mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyanobenzochinon (DDQ) bei Rückflußbedingungen, beispielsweise unter Verwendung von Dioxan, wobei Cholesta-l,4,6-trien-3,24-dion der folgenden Formel

(A-3)

gebildet wird, und dann wird dieses Oxydationsprodukt bei Zimmertemperatur unter alkalischen Bedingungen (pH-Wert ungefähr 7,5 bis 9) unter Verwendung von Wasserstoffperoxid epoxydicrt.

Dieses Verfahren ermöglicht die Synthese von 1λ,2λ- Epoxy der Formel (1) in einer Ausbeute von

ungefähr 40 bis 55% aus dem 24-Ketocholesterin der Formel (A-2).

Das Cholesta-1,4,6-trien-3,24-dion der Formel (A-3) ist ebenfalls eine neue Verbindung, die zum ersten Mal von der Anmelderin synthetisiert wird.

Wenn ein niedriger Alkohol wie Methanoi als Lösungsmittel für die obige Epoxydierungsreaktion verwendet wird, scheidet sich das entstehende 1ä,2ä-Epoxy aus dem niedrigen Alkohollösungsmittel ab. Das ausgeschiedene Epoxy kann dann aus der Reaktionsmischung durch Filtration abgetrennt und direkt als Ausgangsmaterial bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.

(3) Abtrennung von (S)- und (R)-Epimeren
von Ιλ-24-DHC

Wie bereits angegeben, wird das Ιλ-24-DHC der Formel (2), das bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wird, als Mischung aus 1 ä-24(S)-DHC und la-24(R)-DHC erhalten.

Es wurde gefunden, daß erfindungsgemäß das (S)-Epimer und das (R)-Epimer glatt durch substituierte oder nichtsubstituierte Benzoylierung der Hydroxylgruppen in den 3- und 24-Stellungen des Ιλ-24-DHC abgetrennt werden können. Mit anderen Worten, in der 1-Stellung kann eine Hydroxylgruppe selbst vorhanden sein oder es kann eine mit einer Schutzgruppe geschützte Gruppe vorhanden sein, die in die Hydroxylgruppe überführbar ist, um die Trennung der (S)- und (R)-Epimeren zu bewirken.

Die substituierte oder nichtsubstituierle Benzoylierung der 3- und 24-Stellungen des Ια-24-DHC kann durchgeführt werden, indem man das Ιλ-24-DHC mit substituiertem oder unsubstituiertem Benzoylchlorid beispielsweise in einem inerten organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer organischen Base wie eines Säureakzeptors umsetzt. Diese Umsetzung ist üblicherweise als Schotten-Baumann-Reaktion bekannt. Eine organische Base wie ein Pyridin kann bei der obigen Umsetzung als inertes organisches Lösungsmittel verwendet werden, und in diesem Fall ist die Verwendung eines Säureakzeptors nicht besonders erforderlich.

Die substituierte oder unsubstituierte Benzoylierung der 3- und 24-Stellungen des Ιλ-24-DHC kann selektiv erreicht werden, indem man mit substituiertem oder unsubstituiertem Benzoylchlorid beispielsweise in einer Pyridinlösung bei niedriger Temperatur (z. B. — 5 bis 10⁰C) während einer geeigneten Zeit (z.B. 10 bis 24 Stunden) umsetzt. Die Hydroxylgruppe in der 1-Stellung kann acyliert werden, beispielsweise indem man ein Sterin, dessen Hydroxylgruppen in den 3- und 24-Stellungen geschützt sind, mit Acylchlorid in einer Pyridinlösung bei 0 bis 50⁰C umsetzt. Die Hydroxylgruppe in der 1-Stellung kann trimethylisiert werden, beispielsweise indem man ein Sterin, dessen Hydroxylgruppen in den 3- und 24-Stellungen geschützt sind, mit N-Trimethylsilyl-imidazol in einer Pyridinlösung bei hoher Temperatur (z. B. 50 bis 110° C) umsetzt.

Führt man die substituierte oder unsubstituierte Benzoylierung von Ια-24-DHC bei höheren Temperaturen, beispielsweise bei 15 bis 100⁰C, bevorzugt 30 bis 80⁰C, so können die 1-, 3- und 24-Stellungen des 1Ä-24-DHC in einer einzigen Stufe benzoyliert werden.

Beispiele von substituierten oder unsubstituierten Benzoylgruppen sind Benzoyl-, p-Brombenzoyl-, 2,4-Dibrombenzoyl-, p-Chlorbenzoyl- und p-Nitrobenzoylgruppen. Von diesen sind die Benzoyl- und p-Bromben-

zoylgruppen besonders bevorzugt.

In 1-Stellung von 1ä-24-DHC kann eine Hydroxylgruppe gebunden sein. Beispiele von Schutzgruppen dafür sind die obenerwähnten substituierten oder unsubstituierten Benzoylgruppen, Acylgruppen (organische Carbonsäurereste) oder Gruppen, die eine Ätherbindung ergeben. Beispiele solcher Acylgruppen sind Acetyl-, Propanoyl-, Bmanoyl-, Pentanoyl-, Caproyl-, Cyclohexanoyl-, Chloracetyl- und Bromacetylgruppen. Beispiele von Schutzgruppen, die Ätherbindungen mit den Hydroxylgruppen in der 1-Stellung ergeben können, sind eine terL-Butylgruppe, eine Benzylgruppe, eine Triarylgruppe wie eine Triphenylmethylgruppe, eine Tetrahydropyranylgruppe, eine Methoxymethylgruppe oder eine alkylsubstituierte Silylgruppe wie eine Trimethylsilylgruppe.

Die obigen Acylgruppen einschließlich der substituierten oder unsubstituierten Benzoylgruppen sind als Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen in der 1-Stellung bevorzugt.

Um das Ια-24-DHC in das (S)-Epimer und das (R)-Epimer zu trennen, wird das Ιλ-24-DHC der Formel (2-a) zuerst in ein Benzoylderivat von Ιλ-24-DHC, ausgedrückt durch die folgende Formel

OR₄"

OR

(2-b)

Ri'O

überführt, worin

R4" eine substituierte oder unsubstituierte Benzoylgruppeund

R5 ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, bedeuten.

Dieses Benzoylderivat wird dann der Chromatographie unterworfen, wobei ein Trägermaterial verwendet wird, das wenigstens Siliciumdioxid (S1O2) enthält, urn es

4¹) in das 1Ä-24(S)-Epimer und das lÄ-24(R)-Epimer zu trennen.

Diese Epimere sind ebenfalls neue Verbindungen, die von der Anmelderin zum ersten Mal synthesiert und erfolgreich getrennt wurden.

■jo Als Trägermaterial, das Siliciumoxid enthält, kann man beispielsweise verwenden: Silikagel, Kieselsäure, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Gel, Diatomeenerde oder Kaolin. Das Silikagel, die Kieselsäure und das Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Gel, die hauptsächlich

γ, Siliciumdioxid enthalten, sind besonders geeignet.

Die Chromatographie kann auf irgendeine geeignete Weise durchgeführt werden wie Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie. Um große Mengen zu trennen,

bo ist die Säulenchromatographie bevorzugt. Die Säulenchromatographie wird beispielsweise durchgeführt, indem man Silikagel als Trägermaterial und n-Hexan Benzol, Äthylacetat, Methylenchlorid oder Äther als Entwicklungslösungsmittel verwendet, um die Epimeren

b¹) in reiner Form zu erhalten. Unreine Fraktionen können wiederholt der Säulenchromatographie unterworfen werden oder fraktioniert kristallisiert werden, um geringe Mengen an Verunreinigungen zu entfernen.

809 526/3»

Die Entwicklungsgeschwindigkeit von lac-24(R)-DHC ist hoch, wohingegen die Entwicklungsgeschwindigkeit seines Benzoylderivates niedrig ist

(4) Zweite Reaktionsstufe (Synthese des
5,7- Dien- Derivats)

Erfindungsgemäß wird das Ια-24-DHC der Formel (2-a), das bei der Umsetzung der ersten Stufe erhalten wird, in ein geschütztes Derivat des 1«,3/?-24-Trihydroxycholesta-5,7-diens überführt, nachdem die Wasserstoffatome der Hydroxylgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen mit einer Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, geschützt wurden oder nachdem das Ια-24-DHC-benzoylderivat der Formel (2-b) in das 1*-24(S)-Epimer und das 1«-24(R)-Epimer getrennt wurde oder nachdem die Benzoylschutzgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen der Formel (2-a) in andere Schutzgruppen, die in Hydroxylgruppen überführbar sind, überführt wurden.

Erfindungsgemäß können mindestens ein geschütztes la,3)J-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien-Derivat und ein geschütztes l«30-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien-Derivat (diese werden im folgenden der Einfachheit halber als 5,7-Dien-Derivate bezeichnet) der Formel

und die Zersetzung der Hydroxylgruppen nicht verhindert werden, und die Ausbeute an den gewünschten 5,7-Dien-Derivaten wird sehr niedrig.

Die Schutzgruppe kann irgendeine Schutzgruppe sein, die in eine Hydroxylgruppe in den 1-, 3- und 24-Stellungen überführt werden kann, ohne daß das Cholesta-5,7-dien-Skelett nach der Umwandlung in das 5,7-Dien-Derivat zerstört wird. Beispiele solcher Schutzgruppen werden im folgenden angegeben.

ι ■>

>0

or,;

hergestellt werden, indem man mindestens ein geschütztes Derivat des 1«-24(S)-Dihydroxycholesterins und ein geschütztes Derivat des lÄ-24(R)-Dihydroxycholesterins der folgenden Formel

RIO

OR,

R4', R5' und Rt gleich oder unterschiedlich sind und je eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne Änderung der Struktur der folgenden Formel (3) mit einem allylischen Bromierungsmittel in einem inerten organischen Medium umsetzt und dann die Reaktionsmischung mit einem Dehydrobromierungsmittel behandelt.

Es ist wichtig, daß bei der zweiten Stufe der Herstellung der obigen 5,7-Dien-Derivate die Hydroxylgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen des Ιλ-24-DHC und seiner Epimeren der Formel (2) geschützt sind. Wenn die Umsetzung in der zweiten Stufe durchgeführt wird, ohne daß diese drei Hydroxylgruppen des Ιλ-24-DHC geschützt werden, können die Oxydation

(1) Acylgruppen:

Ci _ 12 aromatische oder aliphatische Carbonsäurereste oder deren nitro-, halogen- und alkoxy-substituierten Derivate, z. B. mit Acetyl-, Propanoyl-, Butanoyl·, Pentanoyl-, Capronyl-, Cyclohexanoyl-, Chloracetyl-, Bromacetyl-, Benzoyl-, p-Brombenzoyl-, p-Nitrobenzoyl-, Äthylbenzoyl- und Toluylgruppen. Von diesen sind die Acetyl-, Benzoyl- und Propanoylgruppen besonders bevorzugt.

(2) Gruppen, die mit Hydroxylgruppen Ätherbindungen ergeben

eine tert.-Butylgruppe, eine Benzylgruppe, eine Triarylmethylgruppe wie eine Triphenylmethyl-

2i gruppe, eine Tetrahydropyranylgruppe, eine

Methoxymethylgruppe und eine alkylsubstituierte Silylgruppe wie eine Trimethylsilylgruppe. Von den obigen Schutzgruppen sind die Acylgruppen (1) besonders bevorzugt, aber die vorliegende

jo Erfindung ist darauf keinesfalls beschränkt.

Das Bromierungsmittel für die Allyl-Stellung kann ·* I irgendeine Verbindung sein, die üblicherweise für die

Bromierung von Allylstellungen verwendet wird, r, beispielsweise kann man bevorzugt N-Bromsuccinimid, l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin und N-Bromcaprolactam verwenden. Üblicherweise beträgt die Menge an allylischem Bromierungsmittel das 1 — 2äquivalentfache, bezogen auf die Menge an 5-En der Formel (2). Bei der vorliegenden Erfindung findet zuerst eine Umsetzung zwischen dem Ιλ-24-DHC der Formel (2), bevorzugt einem geschützten Ιλ-24-DHC oder seinem geschützten Epimer, und dem allylischen Bromierungsmittel in einem inerten organischen Medium statt. Geeigneteres weise wird diese Umsetzung bei Zimmertemperatur bis 140⁰C durchgeführt

Das inerte organische Medium ist eines, welches mit dem Bromierungsmittel nicht reagiert. Vorteilhafter-(2) weise wird beispielsweise ein Kohlenwasserstoff oder

ein halogenierter Kohlenwasserstoff wie Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol, Brombenzol, Chlorbenzol, Nitrobenzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder 1,2-Dibromäthan verwendet. Man kann auch ein Ätherlösungsmittel wie Äthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylcellosolv oder Phenylcellosolv verwenden. Diese inerten organischen Lösungsmittel können entweder allein oder miteinander vermischt eingesetzt werden.

Die Umsetzung verläuft bei der obigen Temperatur. Gewünschtenfalls kann die Umsetzung unter Bestrahlung mit aktinischem Licht mit einer Wellenlänge durchgeführt werden, die den Infrarot- bis Ultraviolettstrahlen entspricht." In diesem Fall verläuft die Umsetzung bei einer Temperatur, die niedriger ist als Zimmertemperatur. Ein Radikalinitiator wie Azo-bisisobutyronitril, Benzoylperoxid oder Cyclohexyl-hydroperoxid kann eber falls in geringer Menge zugesetzt werden.

OH

HO

(B-5)

A₁O

(B-6)

Das Dehydrobromierungsmittel ist bevorzugt Trimethylphosphit, s-Collidin oder Diäthylanilin und diese Verbindungen können gemeinsam verwendet werden. Theoretisch verläuft die Umsetzung vollständig, wenn die Menge an Dehydrobromierungsmittel äquimolar zu dem bromierten Produkt ist, das man bei der vorhergehenden Bromierungsreaktion erhält; um geeignete Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten sicherzustellen, wird das Dehydrobromierungsmittel aber bevorzugt in einer Menge von mindestens dem ungefähr 2molfachen, bezogen auf die Menge an bromiertem Produkt, verwendet. Da das Dehydrobromierungsmittel ebenfalls als Reaktionsmedium wirkt, besteht für seine Menge keine besondere obere Grenze.

Im allgemeinen verläuft die Umsetzung sehr gut bei ι -, einer Temperatur von 80 bis 250⁰C, bevorzugt 120 bis 180⁰C. Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit von der Art des Dehydrobromierungsmittels, der Art des Reaktionslösungsmittels usw. Beispielsweise ist bei einer bevorzugten Ausführungsform, bei der die in Umsetzung unter Rückfluß in einem Xylol-s-Collidin-System durchgeführt wird, die Umsetzung innerhalb einer kurzen Zeit von ungefähr 20 Minuten beendigt.

Gegen Ende der Umsetzung wird das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert, wobei man ein r·, öliges, rohes 5,7-Dien-Derivat erhält.

(5) Dritte Reaktionsstufe (Reinigung des rohen
5,7-Dien-Derivats

Wie bereits oben angegeben, ist bereits ein Verfahren jo zur Herstellung von loc-Hydroxycholesterin (1«-HC) der Formel

durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen umgelagert werden, um es in das la,30-Diacetoxycholecalciferon (Vitamin-D-Derivat) der Formel

40

bekannt (D. H. R. B a r t ο η et al., J. Am. Chem. Soc, 95, 2748,1973).

Es ist weiterhin bekannt, daß das obige 1«-Hydroxycholesterin (Ia-HC) in
dien der Formel

A₁O

(B-I)

OA,

zu überführen.

Die Anmelderin hat daher versucht, das 5,7-Dien-Derivat der Formel

OR*

OR

R₄O¹

(3)

das bei der zweiten Stufe erhalten wird, durch direkte Bestrahlung mit ultraviolettem Licht nach dem für die Synthese von I«,3j3-Diacetoxycholecalciferol der Formel (B-I) bebannten Verfahren umzulagern, aber das gewünschte l«-24-Dihydroxycholecalciferol-Derivat der Formel

so

hl) R₄O

AcCHsCO- bedeutet, überführt werden kann, wobei t>-> R4, Rs und Re die gleiche Bedeutung wie oben angegeben die gleiche Umsetzung wie bei der zweiten Stufe der besitzen [Formel (2)], konnte nicht isoliert werden, vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, durchgeführt wird, und dieses Produkt kann dann thermisch

Die Anmelderin nimmt an, daß dies darauf zurückzuführen ist, daß das 5,7-Dien-Derivat der Formel (J)

unrein ist und vermutlich ein 4,6-Dien-Derivat der Formel

OR,,

R₄O

OR₅

(6) „,

enthält, worin

R4, Rs und Re die gleiche Bedeutung wie oben angegeben besitzen. Aufgrund dieser Annahme hat die Anmelderin versucht, das rohe, bei der zweiten Stufe wie oben gebildete und abgetrennte 5,7-Dien-Derivat zu reinigen, wobei eine bekannte Adsorptionsciiromatographie unter Verwendung von Siiikagel als Adsorptionsmittel, d. h. eine Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie, verwendet wurde. Es gelang jedoch mit keinem dieser chromatographischen Verfahren, das 4,6-Dien-Derivat der Formel (6) aus dem rohen 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) abzutrennen.

Ein Beispiel ist bekannt, bei dem die Chromatographie unter Verwendung von Silbernitrat für die Trennung und Reinigung von Acetoxycholesta-5,7-dienen (Tetrahedron Letters, Nr. 40, 4147, 1972 und DE-OS 24 OO 931) angewendet wurde.

Die Anmelderin hat daher daran gedacht, daß es möglich sein würde, die Silbernitrat-Chromatographie mit dem obigen rohen 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) durchzuführen, und hat versucht, das rohe 5,7-Dien-Derivat durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 2%igem Silbernitrat-Silikagel zu reinigen. Dieser Versuch mißlang, und das 4,6-Dien-Derivat konnte nicht abgetrennt werden.

Verschiedene weitere Untersuchungen von Reinigungsverfahren für das rohe 5,7-Dien-Derivat haben schließlich zu dem Ergebnis geführt, daß freies 5,7-Dien gut von dem freien 4,6-Dien und anderen Verunreinigungen abgetrennt werden kann, indem man ein chromatographisches Verfahren verwendet und die Schutzgruppe von dem rohen 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) abspaltet und es in 1«,3/?-Trihydroxycholesta-5,7-dien (das freie 5,7-Dien) der Formel

OH

OH

HO

(3-a)

überführt und in Berührung mit einem Trägermaterial bringt, das Siliciumdioxid enthält und daran nichtmetallisches Silber adsorbiert enthält.

Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren kann nicht nur mit dem rohen, geschützten 5,7-Dien-Derivat, das bei der zweiten Stufe erhalten wird, sondern ebenfalls mit dem 5,7-Dien-Derivat in 24(S)-Epimer-Form oder dem 5,7-Dien-Derivat in 24(R)-Epimer-Form

durchgeführt werden. Auf jeden Fall ist es wesentlich, daß eine rohe Verbindung dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren unterworfen wird, nachdem die Schutzgruppe in den 1 -, 3- und 24-Stellungen abgespalten wurde, um sie in das freie 5,7-Dien der Formel (3-a) zu überführen.

Geeignete Trägermaterialien, die Siliciumdioxid enthalten und daran adsorbiert nichtmetallisches Silber enthalten, sind Siiikagel und Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Gel, die Silbernitrat enthalten oder wobei Silbernitrat an diesen haftet. Das Siiikagel ist besonders vorteilhaft.

Solches Siiikagel wird beispielsweise hergestellt, indem man Silbernitrat in Wasser oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Acetonitril oder Alkoholen löst, die Lösung mit Siiikagel mischt und dann das Lösungsmittel aus der Mischung abdampft. Wenn es für die Säulenchromatographie verwendet wird, wird es gewünschtenfalls aktiviert und in eine Glassäule gefüllt. Wenn es für die Dünnschichtchroma-(ographie verwendet wird, wird ein geeignetes Fixiermittel wie Gips oder Stärke in das Siiikagel eingearbeitet, das auf obige Weise hergestellt wurde, und gewünschtenfalls wird ebenfalls ein fluoreszierendes Mittel zugegeben. Die Masse wird dann auf einer geeigneten Platte (Glas oder Polyesterfilm) in einer Dicke von 0,2 bis 2 mm ausgestrichen, fixiert und aktiviert.

Um eine Dünnschichtchromatographie-Platte, die nur aus Siiikagel besteht, mit Silbernitrat zu imprägnieren, wird die Platte in eine Lösung aus Silbernitrat in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Acetonitril oder ein Alkohol) in einer geeigneten Konzentration getaucht, getrocknet und dann aktiviert.

Die Menge an Silbernitrat, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, beträgt geeigneterweise 0,1 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Siiikagel, insbesondere bevorzugt 0,5 bis 10 Gew.-%. Wenn die Menge an Silbernitrat unter 0,1 Gew.-% oder über 20 Gew.-% liegt, wird die Trennfähigkeit schlecht. Im letzteren Fall wird das Silbernitrat verschwenderisch verwendet.

Beispiele von Entwicklungslösungsmitteln oder Eluierungslösungsmitteln, die für die Dünnschichtchromatographie oder die Säulenchromatographie verwendet werden können, sind organische Lösungsmittel wie Cyclohexan, η-Hexan, Benzol, Toluol, Chloroform, 1,2-Dichlormethan, 1,2-Dichloräthan, Aceton, Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Äthylacetat, Methanol, Äthanol und Propanol und Mischungen davon. Von diesen sind Mischungen aus niedrigsiedenden Lösungsmitteln wie η-Hexan, Benzol, Chloroform, Aceton, Äthylacetat oder Methanol besonders geeignet. Geeignete Mischverhältnisse können leicht experimentell bestimmt werden.

Die Entwicklungsverfahren, die Eluierung und die Bestimmung bzw. Feststellung können auf zufriedenstellende Weise entsprechend bekannten chromatographischen Verfahren durchgeführt werden.

Die Anmelderin hat bei der Anwendung dieses Reinigungsverfahrens gefunden, daß das rohe 5,7-Dien-Derivat, das bei der zweiten Stufe erhalten wird, das 4,6-Dien in einem Gewichtsverhältnis von ungefähr '/2 bis 1/4, bezogen auf das gereinigte 5,7-Dien, enthält. Eine so große Menge an 4,6-Dien kann von dem 5,7-Dien nach dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren abgetrennt und im wesentlichen vollständig entfernt werden.

Es wurde gefunden, daß dieses Reinigungsverfahren

es ermöglicht, das obige freie 5,7-Dien leicht in hoher Reinheit und Ausbeute herzustellen, wie im folgenden näher beschrieben wird. Dieses 5,7-Dien, entweder als solches oder nachdem mindestens eine der Hydroxylgruppen in seinen 1-, 3- und 24-Stcliungen mit der ί gleichen Schutzgruppe wie oben geschützt wurde, kann in ein Ια-24-Dihydroxycholecalciferol oder dessen geschützte Derivate durch Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung und Umlagerung (Isomerisierung) umgewandelt werden.

Es wird daher angenommen, daß das Reinigungsverfahren bei der dritten Stufe der vorliegenden Erfindung einen sehr hohen technischen Wert besitzt.

(6) Vierte Stufe (Synthese von _r>

1 «^-Cholecalciferol oder seinen geschützten Derivaten)

1 «^-Cholecalciferol oder seine Derivate, die durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon mit einer Schutzgruppe gebildet werden, und die durch die folgende Formel

OR,

(5)

R₁O

OR

(3-b)

5,7-dien oder die geschützten Derivate oder la,3/3-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder die geschützten Derivate oder eine Mischung davon in beliebigen Verhältnissen sein, und diese Verbindungen können in den la-24(S)-Typ, den la-24(!R)-Typ oder den gemischten Typ von Dihydroxycholecalciferol oder seinen geschützten Derivaten nach der vierten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens überführt werden.

Wenn Ri, R2 und/oder Rj in den Formeln (3-b) und (5) eine Schutzgruppe bedeuten, kann dies die gleiche Schutzgruppe sein, wie sie durch R4', R5' und und/oder Rb' in Formel (2) dargestellt wird. Das gereinigte 1a3/?-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien der Formel (3-a) kann in sein geschütztes Derivat nach dem gleichen Verfahren überführt werden, wie es oben für die Trennung des l«-24-DHC in die (S)- und (R)-Epimeren in Abschnitt (3) beschrieben wurde.

Bei der vierten Stufe der vorliegenden Erfindung ist jedoch die Verwendung eines gereinigten freien 5,7-Diens, in dem alle Gruppen Ri, R2 und R3 der Formel (3-b) Wasserstoffatome bedeuten, vorteilhafter als die Verwendung der geschützten Derivate. Da Ια-24-Dihydroxycholecalciferol der folgenden Formel

OH

R₁O

dargestellt werden, worin

Ri, R2 und R3 die gleiche Bedeutung wie bei Formel (3-b) --o besitzen, können erhalten werden, indem man mindestens ein freies 5,7-Dien, das bei der dritten Stufe gereinigt und abgetrennt wurde, oder die Derivate davon, die durch Schutz von mindestens einer der Hydroxylgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen des freien 5,7-Diens, ■ i ausgedrückt durch die folgende Formel

Ri, R2 und R] gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom ohne Änderung der Struktur der Formel (5) überführbar ist, bedeuten, in einem inerten organischen Lösungsmittel mit ultravioletten Strahlen bestrahlt und dann das entstehende Produkt isomerisiert.

Das freie 5,7-Dien oder seine geschützten Derivate der Formel (3-b) kann 1a,3/?-24(S)-Trihydroxycholesta- HO

(5-a)

OH

ein sog. Analoges der aktiven Formen von Vitamin D3 ist, ermöglicht die Verwendung von gereinigtem freiem 5,7-Dien der Formel (3-b) die direkte Herstellung von Analogen von der aktiven Form des Vitamins D3 der Formel (5-a). Wenn andererseits ein geschütztes Derivat der Formel (3-b) verwendet wird, sind zwei zusätzliche Stufen erforderlich, um die Hydroxylgruppen des gereinigten freien 5,7-Diens zu schützen und die Schutzgruppen des entstehenden geschützten 1«-24-Dihydroxycholecalciferols abzuspalten. Insbesondere treten bei der Abspaltung der Schutzgruppen eine Teilzersetzung oder eine Degenerierung von Ια-24-Dihydroxycholecalciferol auf.

Auch aus diesem Grund ist das Reinigungsverfahren in der dritten Stufe bei der vorliegenden Erfindung ein sehr vorteilhaftes Reinigungsverfahren.

Das gereinigte 5,7-Dien oder seine geschützten Derivate der Formel (3-b), bevorzugt gereinigtes freies 5,7-Dien, wird in das 1 «-24-Dihydroxycholecalciferol oder seine geschützten Derivate der Formel (5) oder (5-a) überführt, indem man das freie gereinigte 5,7-Dien oder sein geschütztes Derivat in einem inerten organischen Lösungsmittel zuerst mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Die ultravioletten Strahlen sind solche, von denen bekannt ist, daß sie Wellenlängen von ungefähr 200 bis 360 nm besitzen, und bei der vorliegenden Erfindung sind solche, die Wellenlängen von 260 bis 310 nm besitzen, besonders bevorzugt.

Beispiele von inerten organischen Lösungsmitteln, die

bei dieser Stufe verwendet werden können, sind Kohlenwasserstoffe und halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol, Brombenzol, Chlorbenzol, Nitrobenzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Cycloäthan oder 1,2-Dibrom- > äthan; Äther wie Diäthylather, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylcellosolv oder Phenylcellosolv; und Alkohole wie Methanol, Äthanol, Propanol, Hexanol oder Cyclohexanol. Benzol, Toluol, Diethylether, Methanol und Äthanol, entweder allein oder als Mischungen, ι ο werden bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet. Wird ein solches Lösungsmittel verwendet, so kann die nachfolgende lsomerisierungsreaktion, die noch beschrieben wird, in dem gleichen Lösungsmittel nach der ultravioletten Bestrahlung durchgeführt i> werden.

Die geeignete Temperatur für die ultraviolette Bestrahlung beträgt -20 bis 80⁰C, bevorzugt -10 bis 20⁰C. Bevorzugt wird die Bestrahlung in sauerstofffreier inerter Atmosphäre wie in Argon- oder Stickstoffatmo-Sphäre durchgeführt

Man nimmt an, daß als Folge der ultravioletten Bestrahlung die 9,10-Stellungen des la,30-24-Trihydroxycholesta-5,7-diens oder seines Derivats gespalten werden und das 1«-24-Dihydroxyprecholecalciferol-Derivat als Hauptprodukt gebildet wird.

Die Isomerisierung von Precholecalciferol ergibt das ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol der Formel (5) oder (5-a]L

Die Temperatur bei der lsomerisierungsreaktion ist für das Fortschreiten der Reaktion nicht besonders wichtig.

Das ΐΛ-24-Dihydroxyprecholecalciferol-Derivat und das ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol-Derivat zeigen einen bestimmten Gleichgewichtswert, der sich entsprechend der Temperatur ändert, und bei niedrigeren Temperaturen erhöhen sich die Anteile an der letzteren Verbindung. Offensichtlich werden jedoch bei niedrigeren Temperaturen die Umwandlungsgeschwindigkeiten zu der letzteren Verbindung langsamer. Die Temperatur -in kann daher in Abhängigkeit vom Gleichgewichtswert und der Umwandlungsgeschwindigkeit ausgewählt werden. In diesem Sinn ist die Temperatur nicht besonders wichtig für den Fortlauf der Umsetzung selbst.

Bei der tatsächlichen Versuchsdurchführung werden diese Punkte in Betracht gezogen und Isomerisierungstemperatüren von 10 bis 120° C, bevorzugt von 40 bis 100⁰C, werden verwendet.

Wünschenswerterweise wird die Isomerisierung *>o üblicherweise in einem inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt Wenn das gleiche bevorzugte Lösungsmittel wie oben beschrieben verwendet wird, kann es ebenfalls als Lösungsmittel für die lsomerisierungsreaktion dienen. «

Das ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol oder seine geschützten Derivate der Formel (5-a) oder (5) werden so gebildet.

Wenn die Schutzgruppe des geschützten Derivats von ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol eine Acylgruppe bo ist, kann sie durch Entacylierung abgespalten werden, wobei man ein Verfahren verwendet, das darin besteht, daß man in Alkalilösung eines Alkohols wie Methanol oder Äthanol zersetzt oder indem man reduktiv mit LJAIH4, beispielsweise in einem Lösungsmittel wie Äther, zersetzt Bevorzugt wird die Entacylierung bei einer Temperatur von -10° C bis 50° C durchgeführt.

Wenn die Schutzgruppe eine Ätherbindung mit der

Hydroxylgruppe bildet, kann ein Teil davon leicht durch Reduktion oder durch Behandlung mit einer Säure oder Alkali entfernt werden.

Das Abspalten der Schutzgruppen wird bevorzugt direkt mit der Reaktionsmischung, die man bei der vierten Stufe erhält, durchgeführt.

Das so gebildete ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol kann abgetrennt und durch Säulenchromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie, Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie oder Umkristallisation gereinigt werden. Man kann ebenfalls die Chromatographie verwenden, wobei man einen Träger verwendet, der Siliciumdioxid enthält, das daran adsorbiert nichtmetallisches Silber enthält, wie es oben für die Reinigung des rohen 5,7-Diens beschrieben wurde, beispielsweise kann man Silikagel, welches Silbernitrat enthält, verwenden. Ια-24-Dihydroxycholecalciferol höherer Reinheit kann isoliert werden, indem man zwei oder mehrere dieser Reinigungsverfahren kombiniert.

(7) Pharmakologische Aktivitäten der erfindungsgemäßen Produkte

Das Ια-24-Dihydroxycholecalciferol (Ια-24-DHCC) der Formel (5-a), das nach denn erfindungsgemäßen Verfahren wie oben beschrieben erhalten wird, insbesondere (i) 1«-24(S)-Dihydroxycholecalciferol, (ii) 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol oder (iii) eine Mischung der Dihydroxycholecalciferole (i) und (ii) in beliebigen Verhältnissen, ist eine neue Verbindung, die von der Anmelderin erfolgreich synthetisiert und isoliert wurde. Diese Verbindungen sind Vitamin-DB-Analoge mit überlegenen Aktivitäten, und ihre Toxizität ist niedrig.

Es ist bereits bekannt, daß Ια-25-Dihydroxycholecalciferol (1ä-25-DHCC) und lai-Hydroxycholecalcifero! (1(X-HCC) überlegene Aktivitäten als Analoge der aktiven Formen von Vitamin D3 besitzen. Kürzlich wurde gefunden, daß Ia-HCC eine sehr hohe Toxizität besitzt und daß seine Nebenwirkungen bei der kontinuierlichen Verabreichung Schwierigkeiten mit sich bringen. Für das aus der DT-OS 22 09 352 bekannte !«,25-DHCC stehen keine Toxizitätswerte zur Verfugung, jedoch ist aufgrund der Stoffwechselvorgänge davon auszugehen, daß seine Toxizität analog zu derjenigen von Ia-DHCC ist Gegenüber diesen bekannten Produkten besitzt das erfindungsgemäße l<x,24-DHCC den bedeutenden Vorteil einer wesentlich geringeren Toxizität, wodurch eine außerordentlich sichere Verabreichung möglich wird.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Toxizität des lix-HCC zu erniedrigen. l<x-24,25-Trihy· droxycholecalciferol (l«-24,25-THCC) scheint, wie in vivo festgestellt wurde, eine recht selektive, obgleich nicht so starke aktivierende Wirkung auf den intestinelen Calciumtransport zu besitzen. Wenn die epimere ΐΛ-24-DHCC-Mischung, l«-24(R)-DHCCund I«-24(S}· DHCC (diese werden allgemein als l«-24-DHCC bezeichnet, in vivo weiter metabolisiert werden, wird das Ια-24-DHCC vermutlich in das l«-24,25-THCC überführt. Dies läßt den Schluß zu, daß die Wirkung der epimeren Ια-24-DHCC-Mischung, l«-24(R)-DHCCund 1«-24(S)-DHCC selektiv sein kann. Das Ια-24-DHCC ist eine neue Verbindung, die in vivo noqh nicht festgestellt wurde, und man nimmt un, daß sie eine neue Aktivität aufweist.

Die Anmelderin hat Vergleichsversuche der Aktivitäten der erfindungsgernäßen neuen Verbindungen mit

Ια-HCC durchgeführt und gefunden, daß die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen, wie es aus den folgenden Beispielen hervorgeht, mindestens die gleiche Wirkung wie Ia-HCC beim intestinalen Calciumtransport besitzen, daß ihre W irkung auf die Knochenresorp- -. tion geringer ist als ungefähr ein Drittel der Wirkung von 1«-HCC und daß ihre LDw-Werte ungefähr ein Zehntel des Werts von Ia-HCC betragen. Es wurde insbesondere festgestellt, daß la-24(S)-DHCC eine etwas schwächere Wirkung auf die Aktivierung des ι ο intestinalen Calciumtransports besitzt als 1a-24(R)-DHCC, daß es aber fast keine Knochenresorption zeigt.

Dementsprechend kann das erfindungsgemäße Ια-24-DHCC als einzigartige Medizin mit verminderten Nebenwirkungen und hoher Sicherheit verwendet r, werden, verglichen mit bekannten Analogen von aktiven Formen des Vitamins D3, wenn die Verbindungen beispielsweise bei Krankheiten verabreicht werden, die durch abnormale Metabolisierung von Calcium induziert werden. Pharmukologische Versuche, die von der Anmelderin durchgeführt wurden, haben eindeutig gezeigt, daß verschiedene optimale pharmazeutische Präparationen hergestellt werden können, entsprechend unterschiedlichen Krankheitszuständen.

Bei der Regulierung des Calciummetabolismus von Warmblütern kann die wirksame Verabreichungsmenge zwischen 0,01 bis 10 μβ/Tag/kg Körpergewicht des Warmblüters liegen.

Pharmakologische Versuche ergaben, daß bevorzugt geeignete Dosen der obigen neuen aktivierten Vitamin-D₃-Derivate bei der klir.ischen Anwendung ungefähr 0,04 bis 0,4 μg (96,2 bis 962 ρ Mol)/kg Körpergewicht betragen.

Man nimmt an, daß die: Ιλ-24-DHCC-Verbindungen der Formel (5-a) auf verschiedenen klinischen und Veterinären Gebieten verwendet werden können und daß sie für die Behandlung des abnormalen Metabolismus von Calcium und Phosphor, verursacht durch Leberversagen, Nieren versagen, Versagen des gastrointestinalen Trakts und bei parathyroidem Versagen und verwandten Knochei (krankheiten verwendet werden können wie Vitamin-D-abhängige Rachitis, Nierenosteodystrophie, Hypopurathyridismus, Osteoporose, Knochenerweichung, Paijetsche Krankheit, Malabsorptionssyndrom, Hypocalcaicmie, die durch Leberzirrhose induziert wird, Hypocalcaemie, die durch Steatorrhoe induziert wird, Hypocalcaemie,die durch Vitamin-D-resistente Rachitis erzeugt wird. Es wird angenommen, daß diese Verbindungen sicherere Arzneimittel sind als die bekannten Ia-HCC und la-25-DHCC. Es ist ,0 ebenfalls möglich, ein Mittel zu verwenden, das mindestens eine der folgenden Verbindungen 1«-24(R)-DHCC und la-24(S)-DKCC zusammen rniit anderen Mitteln enthält, die den Calciummeiabolisitius regulieren. Beispielsweise können die Verbindungen bei der -,-, Behandlung von Pagetscher Krankheit zusammen mit Calcitonin verwendet werden.

Geeignete Verabreichungsrouten sind orale, buccale und parenterale (intramuükuläre, subkutane, intravenöse und rektale) Verabreichung. Dosislormcn sind «,o beispielsweise komprimierte Tabletten, beschichtete Tabletten, harte oder weiche, elastische Gclatinekapseln, Äthylalkohollösungcn, öllösungen und wäßrige Suspensionen.

Das Lösungsmittel für die Ollösungen kann ein μ pflanzliches öl wie Mais-, Baumwollsamen-, Cocosnuß-, Mandel- oder Erdnußöl sein, ein Fischleberöl oder ein öliger Ester wie Polysorbate 80.

Für die rektale Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen zu pharmazeutischen Mitteln verarbeitet werden, die einen Suppositorien-Grundstoff wie Kakaoöl oder andere Triglyceride enthalten. Um die Lagerbeständigkeit zu verlängern, enthalten die Mittel vorteilhafterweise ein Antioxydans wie Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hydrochinon.

Futtermittel für Haustiere können hergestellt werden, die das erfindungsgemäße lot-24-DHCC in einer Menge enthalten, so daß keine toxischen Wirkungen auftreten, um die Hypocalcaemie von Kühen zum Zeitpunkt des Kalbens oder nach dem Zeitpunkt des Kalbens zu verhindern oder um die Hypocalcaemie von Haustieren zu verhindern, die keine Hypocalcaemie-Vorgeschichte aufweisen. Werden diese Verbindungen Geflügel während der Legezeit verabreicht, so kann das Legen von weichschaligen Eiern vermieden werden. Dies ist ein weiteres Merkmal des erfindungsgemäßen la-24-DHCC.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Die Untersuchungsverfahren, die in diesen Beispielen verwendet werden, um die Eigenschaften der Endprodukte näher zu bestimmen, sind die folgenden.

Sofern nicht anders angegeben, werden die NMR-Spektren mit einem Varian-EM-360- oder JEOL-PS/ PFT-100-(Nippon Electronics Co, Ltd.)Gerät in Deuterochloroform (CDCI3) unter Verwendung von Tetramethylsilan als interner Standard bestimmt

Die Massenspektren und die Hochauflösungsmassenspektren werden unter Verwendung eines Shimadzu-LKB-9000-Geräts (Warenzeichen für ein Produkt von Shimazu Seisakusho Co, Ltd.) bestimmt

Die UV-Spektren werden mit einem Hitachi-EPS-3T-Gerät (Warenzeichen für ein Produkt der Hitachi Ltd.) unter Verwendung einer Äthanollösung gemessen.

Die Schmelzpunkte werden mit einem Mikroskop mit Heiztisch bestimmt, und die erhaltenen Werte werden nicht korrigiert.

Die absolute Konfiguration von 1 «-24-Dihydroxy -cholesterin wird folgendermaßen bestimmt:

Eine epimere Mischung aus 24,24-Epoxycholesterin-3-benzoat, d. h. eine Mischung aus

B,O

B₁ eine Benzoylgruppe bedeutet, wird unter Verwendung von Siiikagel als Carrier bzw. Träger chroma to graphiert, um die beiden Epimeren zu trennen und zu gewinnen. Beide Epimere werden mit Methanol behandelt, um ein 24-OH-Derivat und ein 25-OCH₃-Derivat zu bilden. Um die absolute Konfiguration der beiden Epimeren zu bestimmen, wird das modifizierte Horean-Verfahren verwendet, welches in Tetrahedron Letter 1, 15, 1975, beschrieben wird. Durch Reduktion der beiden Epimeren, deren absolute Konfiguration so bestimmt wurde mit einem AlC^-LiAI^-System, wird ein 24(R)-Hydroxyderivat aus dem 24(R),25-Epoxyderivat und ein 24(S)-Hydroxyderivat aus dem 24(S),25-Epoxiderivat erhalten. Da es bekannt ist daß das letztere S-Derivat polarer ist als das erstere R-Derivat wird angenommen, daß diese Tatsache ebenfalls für das Ια-24-Dihydroxycholesteringilt Dieses Ια-24-Dihydroxycholesterin wird in das Tribenzoat- oder Dibenzoat-Derivat überführt welches dann durch eine Silikagelsäule Chromatographien wird. Somit werden ein stärker polares Epimer in ein la-24(S)-Derivat und ein weniger polares Epimer in ein 1«-24(R)-Derivat überführt

Wenn in der vorliegenden Anmeldung kein besonderer Hinweis auf ein R-Derivat oder auf ein S-Derivat erfolgt beispielsweise wenn nur das Ιλ-24-DHCC erwähnt wird, so bedeutet dies eine äquimolare Mischung aus 1«-24(R)-DHCCund 1«-24(S)-DHCC.

r>

Beispiel 1 (A) Synthese des Ausgangsmaterials

lac,2«-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on wird nach den folgenden drei Stufen (1) bis (3) hergestellt.

(1) Synthese von 24-Ketocholesterin aus Fucosterin

Fucosterin (4,1g) wird in 100 ml Methylenchlorid gelöst und unter Kühlen der Lösung mit Trockeneis-Aceton auf ungefähr — 20°C wird das Fucosterin während 30 Minuten mit Ozon in einer Bildungsgeschwindigkeit von 0,86 g/h und in einer Konzentration von 17,2 g/m³ (O₂) oxydiert Nach der Umsetzung werden 8 g Zinkpulver und 200 ml Eisessig zugegeben und das entstehende Ozon id wird 24 Stunden reduktiv bei Zimmertemperatur zersetzt Das entstehende Zinkacetat wird dann durch Filtration abgetrennt und mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumcarbonat gewaschen. Die abgetrennte Methylenchloridphase wird gut mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Methylenchlorid wird bei vermindertem Druck abdestilliert und die entstehenden, farblosen Kristalle werden unter Virwendung -von Silikagel als Trägerstoff säulenchromatographiert (eluiert mit Benzol-n-Hexan-Lösungsmittelmischung), und man erhält 2,8 g 24-Ketocholesterin in einer Ausbeute von 703%.

(2) Synthese von 24-Ketocholesta-l,4,6-trien-3-on aus 24-Ketocholesterin

4,0 g 24-Ketocholesterin und 7,0 g 23-Dichlor-5,6-dicyanobenzochinon werden in 140 ml Dioxan gelöst, und die Lösung wird bei Rückflußtemperatur des Dioxans 27 Stunden gerührt. Nach der Umsetzung wird die h^r> Reaktionsmischung auf Zimmertemperatur abgekühlt. Das entstehende Hydrochinonderivat wird durch Filtration abgetrennt und mit 30 ml Dioxan gewaschen. Das Fiitrat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und das Dioxan wird bei vermindertem Druck abdestilliert wobei man eine schwarzbraune, ölige Verbindung erhält

Die ölige Verbindung wird durch Säulenchromatographie abgetrennt und gereinigt wozu man Aluminiumoxid als Trägermaterial verwendet (es wird mit einer Lösungsmittelmischung aus Methylenchlorid und Aceton eluiert), und man erhält 2,76 g 24-Ketocholestal,4,6-trien-3-on in Form von Kristallen. Bei der Analyse des Produktes erhält man die folgenden Ergebnisse:

NMR-Spektrum:

0.86(3 H,S,C-18-CH₃), 1,20(3H₁S₁C-^-CH₃), 1.15(6H₁D₁J = 10HZ.C-26.27-CH3), 5,95-6.10(3 H,M,C-4,6,7-H)₁ 6,29(1 H.dD.J = 11.15HZ.C-2-H), 7,10(1 H₁J = 11 Hz₁C-I-H); , Molekulargewicht (durch Gasmassenspektrum): 394(M+).

(3) Synthese von la^a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on aus 24- K e tocholesta-1,4,6-trien-3-on

2) 3,53 g 24-Ketocholesta-1,4,6-trien-3-on werden in einer Mischung aus 100 ml Methanol, 20 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Dioxan gelöst und 1,6 ml einer 5gew.-%igen Methanollösung von Natriumhydroxid und 5 ml 30%iges wäßriges Wasserstoffperoxid werden

jo zugegeben. Die Umsetzung wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Umsetzung wird eine geringe Menge Essigsäure zugegeben, um die Lösung auf einen pH-Wert von 7 zu neutralisieren. Die Reaktionsmischung wird dann

extrahiert, indem man Wasser und Äther zufügt Die Ätherphase wird gut mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet Der Äther wird bei vermindertem Druck abdestilliert man erhält 4,04 g eines hellgelben Feststoffs. Das feste Produkt wird unter Verwendung von Silikagel säulenchromatographiert (man eluiert mit einer Lösungsmittelmischung aus Benzol und Äther), und man erhält 2,52 g la^a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on, welches die folgenden Eigenschaften besitzt:

Fp.: 150bis 151.5⁰C

UV-Spektrum:

λ?,!!ϊ""" = 291 nm

Hochresolutionsmassenspektrum: gefunden = 410,2793 berechnet (M+) = 410,2821 (C₂₇H₃₈O₃)

NMR-Spektrum: (

() 3,43(1 H.dD.J =4 Hz, J = 1,5 Hz,C-2-H), 3,60(1 H₁D₁J =4 Hz₁C-I-H), 5,68(1 H₁D₁J = l,5Hz,C-4-H), 6.10(2 H₁ S,C-6,C-7-Hs).

(B) Synthese des erfindungsgemäßen 1 Λ-24-Dihydroxycholesterins (erste Stufe)

Flüssiger Ammoniak (1OmI)₁ der mit metallischem Natrium getrocknet wurde, wird in einen Dreihalskolben, der mit einem Tropftrichter und einem Trockeneiskühler ausgerüstet ist, eingeschlossen, wobei der Kolben mit einem Kühlmedium gekühlt wird, welches Aceton und Trockeneis enthält. Metallisches Lithium (150 mg) wird zu dem flüssigen Ammoniak gegeben, und man

rührt während 10 Minuten. Die Mischung wird in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst und 100 mg 1«,2«-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on werden tropfenweise im Verlauf von 10 Minuten zugefügt.

Nach der Zugabe wird der Kolben von dem Kühlmedium abgetrennt und 20 Minuten unter Rückfluß des Ammoniaks behandelt. Dann wird der Kolben wieder in das Kühlmedium eingetaucht und 1,5 g vollständig trockenes Ammoniumchloridpulver werden langsam im Verlauf von 2 Stunden zugegeben. Der Kolben wird aus dem Kühlmedium entnommen und die Umsetzung wird unter Rühren weitergeführt.

Man hört mit dem Rühren auf, wenn die blaue Farbe der Lösung vollständig verschwindet. Der Kühler wird aus dem Kolben entnommen und Stickstoffgas wird eingeleitet, um das Ammoniak zu entfernen.

Äthylacetat (60 ml) und 60 ml 1 n-Chlorwasserstoffsäure werden zu dem Rückstand zugegeben, um ihn der Verteilungsextraktion zu unterwerfen. Die abgekühlte Athylacetatphase wird gut mit Wasser gewaschen und getrocknet und anschließend wird das Äthylacetat bei vermindertem Druck abdcstilliert. Der Rückstand wird in 3 ml Äthylacetat gewaschen und durch eine Säule Chromatographien, die Silikagel als Trägermaterial enthält, wobei man ein liluicrungsmittel verwendet, das eine Mischung aus Benzol und Aceton enthält. Man erhält 61 mg gereinigtes Produkt mit den folgenden Eigenschaften:

NMR-Spektrum (in C₁D₅N)₁O(ppm):

0,70(3 H₁S, 18-CH,),0,99(3 H.S, 19-CHj),
3,28 (4 H, M, 24- H und Hydroxy H),
3,82(1 H₁ M₁10-H)₁4,00(1 H₁ M, 3«-H),
5,50(1 H,M,6-H)

Massenspektrum(vergl. F-"ig. 1):
418 (M¹), 400,382

Hochresolutionsmassenspektrum:
Gefunden: 418,3428
Berechnet M + (C₂₇H₄₁₁Oj) = 418,3449

Aus den obigen Eigenschaften kann das entstehende Produkt als Ια-24-Dihydroxycholesterin identifiziert werden.

Beispiel 2

Synthese von Ια-24-Dihydroxycholesterin
(erste Stufe)

Flüssiges Ammoniak (15 ml), welches mit metallischem Natrium getrocknet wird, wird in einen Dreihalskolben eingeschlossen, der mit einem Tropfirichter und einem Trockeneiskühler ausgerüstet ist, während man den Kolben mit einem Kühlmedium kühlt, das Aceton und Trockeneis enthält. Dann werden 400 mg metallisches Natrium zugegeben und man rührt 10 Minuten. Die Mischung wird dann in 18 ml Tetrahydrofuran gelöst und 100 mg la,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on werden tropfenweise im Verlauf von 10 Minuten zugefügt.'

Nach der Zugabe werden 1,8 g Ammoniumchloridpulver im Verlauf von 1 Stunde auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 zugegeben. Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt und 69 mg (Ausbeute 68%) eines Produktes, welches das gleiche NMR-Spektrum, Massenspektrum und Hochresolutionsmassenspektrum wie in Beispiel 1 zeigt, werden erhalten. Dieses Produkt wird als 1<x,2«-24-Dihydroxycholesterin identifiziert.

Beispiel 3

(A) Synthese von
ΐΛ-24-Dihydroxycholesterin-tribenzoal

1,25 g l«-24-Dihydroxycho!esterin werden mit 1,55 g Benzoylchlorid und 20 ml Pyridin vermischt und dann bei 40⁰C während eines Tages umgesetzt. Wasser (5 ml] wird zu der Reaktionsmischung gegeben und dann wird diese mit 50 ml Diäthyläthcr extrahiert. Die Ätherphase wird mit Säure und dann mit Alkali gewaschen, getrocknet und eingedampft, um den Äther zu entfernen; man erhält rohes 1a,3]3-24-Tribenzoyloxycholest-5-en.

(B) Trennung des 24(R)Dcrivals und 24(S)-Derivats
von l«,30-24-Tribcn7:oyloxycholest-5-cn

Eine n-Hexan-Lösung aus 1,58 g rohem l«,3ß-24-Tribenzoyioxycholest-5-en wird durch eine Säule chromatographiert, die 100 g Silikagel als Carrier enthält, um es in Fraktionen mit jeweils einem Volumen von 50inl zu teilen. Die Reinheit jeder dieser Fraktionen wird durch Hochdruck-Flüssigkcitschroinatographie bestimmt und die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und die Lösungsmittel wrrdeu abgedampft. Zwei Epimerc mit den folgenden N^R-Spektrcn werden erhalten. Das weniger polare Epimer (500 mg), das zu einem frühen Zeilpunkt cluiert wird, ist das 24(R)-Derival, und das stärker polare Epimcr (490 mg), das zu einem späteren Zeitpunkt gegen Ende eluierl wird, ist das 24(S)-Derivat.

NMR-Spektren von 1«,30-24(R)-Tribenzoyloxycholest-

0,65(3 H,S.C-18),0,92(3 H,S.C-21),
1,0l(6H,b,S,C-25,26), 1,20(3 H₁S₁C-19),
5,00(1 H,M,C-24),5,2O(1 H.M.C-3),
5,44(1 H, M, C-I), 5,70(1 H,M,C-6),
7,5 (9 H, M₁ Benzoyl), 8,1 (6 H₁M, Bcnzoyl)

NMR-Spektrum von 1a,3/?-24(S)-Tribenzoyloxycholesl-

0,63(3H₁S₁C-Ie)

Die anderen Spektrumswcrte sind die gleichen wie fürdas24(R)-Derivat.

Beispiel 4

(A) Synthese von 1«-24-Dihydroxycholesterindibenzoat

2,5 g 1«-24-Dihydroxycholesterin werden mit 2,10 g Benzoylchlorid und 40 ml Pyridin vermischt und die Mischung wird 1 Tag bei 20°C stehengelassen.

Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(A) behandelt, wobei man rohes la-Hydroxy-3/?-24-dibenzoyloxycholest-5-en erhält.

(B) Abtrennung des 24(R)-Derivats und des

24(S)-Derivats von l«-Hydroxy-3/J-24-dibenzoyl-

oxycholeiit-5-en

2,1 g rohes la-HydroxyOß^-dibenzoyloxycholest-5-en werden durch eine Säule Chromatographien, die 30 g Silikagel enthält, wobei man ein Eluierungslösungsmittej verwendet, das eine 200 :1-Mischung aus Benzol und Äthylacetat enthält, und in Fraktionen von jeweils 50 ml teilt. Jede der Fraktionen wird der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unterworfen, um ihre Reinheit zu bestimmen. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Lösungsmittel wird abdestilliert, wobei zwei Epimere mit den folgenden NMR-Spektrumswerten erhallen werden.

809 526/356

Das weniger polare Epimcr (500 mg, Fp. 168 bis I69°C) ist das 24(R)-Derivat und das stärker polare Epimer (600 mg, Fp. 139,5 bis 140,5⁰C) ist das 24(S)-Derivat.

NMR-Spektrum von 1tt-Hydroxy-3/?-24(R)-dibcnzoyloxycholest-5-en:

0,67(3 H,S,C-18),0,96(6 H,b,S,C-19,21)

1,00(6 H, D₁J = 6 Hz. C-25,26),

3,96(1 H₁M₁C-I),

5,06(1 H, M,C-24),5.36(1 H.M.C-3),

5,71 (I H,M,C-6),7,52(6 H, M, Benzoyl),

8,12(4H,M,Benzoyl)

NMR-Speklrum von IvHydroxy-3/i-24(S)-diben/oyloxycholesi-5-en:

0,70(3 H, S,C- 18)

Die anderen .Spektrumswerte sind gleich wie bei dein 24(S)-Derivat.

Beispiel 5
(A) Synthese von liX,3ji-24-Triacetoxycholest-5-en

300 mg Ια-24-Dihydroxycholesterin werden mit 40 ml Essigsäureanhydrid und 125 ml Pyridin 3 Stunden bei 95° C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(A) behandelt, wobei man rohes l«,3j3-24-Triacetoxycholest-5-en erhält. Das rohe Produkt wird durch eine Säule chromatographiert, die Silikagel als Carrier enthält, wobei man ein Eluierungslösungsmittel verwendet, das Benzol enthält, und man erhält 325 mg gereinigtes l<%,3/l-24-Triacetoxychoiest-5-en als öliges, gereinigtes Produkt mit dem folgenden NMR-Spektrum und Mässenspektrum:

NMR-Spektrum:

0,67 (3 H, S, C -18). 2,02 (9H₁S, 3-Acetyl),

4,8 (2 H, M, 3λ-und 24-H₂), 5,05(1 H, M, 1/3—H),

5,65(1 H,M,6-H)
Massenspektrum:

484 (M + -CHjCOOH), 424,364

(B) Synthese von l«,3/?-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

300 mg l«,3^-24-Triacetoxycholest-5-en werden mit 90 mg l,3-Dibrom-5,5-dimethyIhydantoin in 4,5 ml n-Hexan 15 Minuten unter Rückflußbedingungen umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und das entstehende 5,5-Dimethylhydantoin und das überschüssige l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert, man erhält 349 mg einer gelben, öligen Verbindung Xylol (2,5 ml) wird zu dieser Substanz zugegeben, wobei eine Lösung gebildet wird. Die entstehende Lösung wird tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung, die bei 165°C gehalten wird, aus 0,85 ml s-Collidin in 1,9 ml Xylol zugegeben und die Umsetzung wird dann weitere 10 Minuten durchgeführt. Nach der Umsetzung wird das Hydrobroniid des s-Collidins durch Filtration abgetrennt und das s-Collidin und Xylol werden bei vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in Diäthyläther gelöst. Die Ätherphase wird mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure und einer 5%igen wäßrigen Lösung aus Natriumbicarbonat und wiederholt mit Wasser gewaschen. Sie wird dann mit Aktivkohle behandelt und der Äther wird bei vermindertem Druck abgedampft, wobei man 310 mg einer gelben, öligen Verbindung erhält. Diese ölige Verbindung wird sorgfältig zweimal durch Säulenchromatographie (Eluierung mit Benzol) unter Verwendung von Kieselsäure Chromatographien, man erhält 69 mg (Ausbeute 23%) eines nichtkristallinen gereinigten Produktes. Aus den folgenden Spektrumswerten wird -, dieses Produkt als irx.SjJ-Triacetoxycholesta-SJ-dien identifiziert.

UV-Spektrum, λ,™; '(nm):

262,271,282,294

,„ NMR-Spektrum:

2,02 und 2,04(9 H₁S₁CH)COO-),

4.75(2 H, b, 3(X-und 24-H)₁

5,01(1 H,b. ljÜ-H).

5,35(1 H, D, J = 5,5 Hz. 6-oder 7-H),
,, 5,69(1 H.D.I = 5,5 Hz, 6- oder 7 -H)

Massenspektrum:

542 (M ♦). 514,482,422,362,249,204

Beispiele

Synthese von l.i;₁3/}-24-Triacetoxycholcsta-5,7-dien
(zweite Stufe)

150 mg l<x,3/3-24-Triacetoyycholesi-5-en werden mit

j-. 45 mg l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin in 3 ml n-Hexan 15 Minuten bei Rückflußbedingungen umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und die entstehenden Kristalle werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert,

jo wobei man eine gelbe, ölige Verbindung erhält. Zu dieser Verbindung gibt man 1,3 ml Xylol. Die entstehende Lösung wird tropfenweise im Verlauf von ungefähr 15 Minuten zu einer Lösung aus 0,25 ml Trimethylphosphit in 4 ml Xylol unter Rückflußbedingungen

r. zugefügt und die Umsetzung wird weitere 90 Minuten weitergeführt. Die Reaktionsmischung wird dann bei einer Temperatur unter 75°C konzentriert, und man erhält 148 mg ölige Verbindung. Diese Verbindung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(B) behandelt. Das

-κι Endprodukt zeigt die gleichen UV-, Massen- und NMR-Spektrumswerte wie das l«,3j3-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien, das in Beispiel 5(B) erhalten wurde.

Beispiel 7

Synthese von l«,3j3-24-Tribenzoyloxy-cholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

200 mg l,x,3/i-24-Tribenzoyloxy-cholest-5-en, das auf

in gleiche Weise wie in Beispiel 5(A) beschrieben hergestellt wurde, werden 15 Minuten unter Rückfluß zusammen mit 55 mg N-Bromsuccinimid in 15 ml Tetrachlorkohlenstoff erwärmt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und die entstehenden Kristalle werden

r, durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird konzentriert und 5 ml Xylol werden zu dem Rückstand zugegeben, wobei eine Lösung gebildet wird.

Die entstehende Lösung wird tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung aus 0,2 ml

w) Trimethylphosphit in 4 ml Xylol unter Rückfluß gegeben, und die Mischung wird weitere 90 Minuten am Rückfluß erwärmt.

Die Reaktionsmischung wird dann bei einer Temperatur unter 75°C konzentriert und der Rückstand wird

h) sorgfältig zweimal durch eine Säule chromatographiert, die Kieselsäure enthält, wobei man Benzol als Eluierungsmittel verwendet. Man erhält 50 mg (Ausbeute 25%) eines gereinigten, nichtkristallinen Produktes.

Dieses Produkt zeigt die folgenden Spektren und wird als l«,3ji-24-Tribenzoyloxychole.sta-5,7-dien identifiziert.

UV-Spektrum, λ ,J₁','!;'""¹ (nm):
231,262,271,282,294

NMR-Spektrum:

4,95(2 H,b.3ft-H und 24-H)₁
5,32(2 H.b, IjJ-H und 6- oder 7-H).
5,72(1 H₁D₁J =b Hz,b- oder7-11)₁
7,49 und 8,02(15 H, M, aromatischer H)

Massenspeklrum:

728(M >),bi&,b2U,b0t>, 484. 3b2

Beispiel 8

Synthese von l<v3jS-24(S)-Triacetoxyeholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

l«-Hydroxy-3/)-24(S)-dibenzoyloxyeholesl-5-en, hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird mit LiAlH₄ in trockenem Diethylether reduziert, wobei l/x,3j3-24(S)-Trihydroxycholest-5-en gebildet wird. Dieses Produkt (180 mg) wird dann mit 24 ml Essigsä'ureanhydrid und 75 ml Pyridin 3,5 Stunden bei 95° C umgesetzt. Das Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(A) behandelt und durch eine Säule Chromatographien, die Kieselgel als Trägermaterial enthält, wobei man 195 mg l«,3/?-24(S)-Triaceioxycholest-5-en erhält.

150 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 5 gereinigt, und man erhält 43,5 mg (Ausbeute 29%) eines gereinigten Produktes mit den folgenden Spektrumswerten. Dieses gereinigte Produkt wird als lix,3j3-24(S)-Triacetoxycholesta-5,7-dien identifiziert.

UV-Spektrum,A,},'.!r''(nm):
262,271,282,294

NMR-Spektrum:

2,02 und 2,04 (9 H, S, CH iCOO-).

4,75(2 H,b,c-3-,C-24-H),

5,01(1 H,b,c-1-H),

5,35(1 H, D, J = 5-6Hz,C-6-oderC-7-H),

5,69(1 H₁D₁J = 5-6Hz,C-6-oderC-7-H)

Massenspektrum:

542 (M ^), 514,482,422,362,249,209

Beispiel 9

Synthese von l<x,3/i-24(S)-Tribenzoyloxy-cholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

100 mg lix,3jJ-24(S)-Tribcnzoyloxy-cholLⁱst-5-en, das auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(11) erhalten wurde, werden 15 Minuten unter Rückfluß zusammen mit 23 mg l^-Dibrom-S,') dimelhylhydantoin in 16 ml Tetrachlorkohlenstoff erwärmt. Die Reaktionsmischung wird gekühlt und die entstehenden Kristalle werden durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird konzentriert und 2,5 ml Xylol werden zu dem Rückstand gegeben. Die Lösung wird tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung unter Rückfluß aus 0,3 ml s-Collidin in 2 ml Xylol gegeben und dann wird weitere 10 Minuten am Rückfluß erwärmt.

Nach der Umsetzung wird das Hydrobromid von s-Collidin durch Filtration entfernt und s-Collidin und Xylol werden bei vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird in Diäthyläther gelöst. Die Ätherphase wird mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure und einer 5%igen wäßrigen Lösung aus Natriumbicarbonat und dann wiederholt mit Wasser gewaschen. Die Ätherphase wird getrocknet und der Äther wird bei vermindertem Druck verdampft; man erhält eine gelbe, ölige Verbindung.

Die ölige Verbindung wird sorgfältig zweimal durch eine Säule Chromatographien, die Kieselsäure enthält, wobei man Benzol als Eluierungslösung verwendet; man erhält 28 mg (Ausbeute 28%) eines gereinigten, nichtkristallinen Produktes. Dieses Produkt besitzt die folgenden Spektren und wird als Ia,3j9-24(S)-Tribenzoyloxycholcsta-5,7-dien identifiziert.

UV-SpoktrumA,;,¹!'; (nm):

211.262,271,282,294

NMR-Spektrum:

4,95(2 H, b.C-3 und C-24- Hs)₁
5,32(2 H,b,C-1 undC-6oderC-7-H),
5,72(1 H₁D₁J = 6Hz,C-6oderC-7-H),
7,49 und 8,02 (15 H, M, aromat. Hs)

Massenspektrum:

728 (M -), 638,620,606,484,362

Beispiel 10

Synthese von 1«-Acetoxy-3j3-24(S)-Dibenzoyloxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

1a-Hydroxy-3/f-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird mit Essigsäureanhydrid und Pyridin auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(A) umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 5 beschrieben gereinigt; man erhält la-Acetoxy-3j3-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en.

462 mg l«-Acetoxy-3j3-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en werden mit 188,6 mg N-Bromsuccinimid in 16 ml Tetrachlorkohlenstoff 30 Minuten unter Rückfluß umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und die erhaltenen Kristalle werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert, wobei man eine gelbe, ölige Verbindung erhält. Zu der Verbindung gibt man 6,8 ml Xylol, um eine Lösung herzustellen. Die Lösung wird tropfenweise zu einer Lösung aus 0,5 ml Trimethylphosphit in 8 ml Xylol unter Rückfluß gegeben und die Umsetzung wird weitere 90 Minuten weitergeführt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung bei vermindertem Druck konzentriert, und man erhält ein öliges Produkt. Dieses Produkt zeigt die folgenden Spektren und es wird als

1iX-Acetoxy-3^-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien
identifiziert.

UV-SpcktrunU,;,¹,"; ' (nm):

231,262,271,282,294

NMR-Spektrum:

2,04(3 11,S₁CH₁COO-),
4,7-5,4(3 fl.M, I/Ux- und 24-H₁),
5,33(1 H₁D, I = 6Hz,6-oder7-H),
5,70(1 H₁D₁J = 6 Hz,6- oder 7-H),
7,4-8,2(10 H, M, aromat. Ils)

Beispiel Il

Synthese von l<x,3/i-24(R)-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

l(X-Hydroxy-3/j-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 8 unterworfen. Ein gereinigtes Produkt mit den

gleichen UV-, NMR- und Masscnspcktrcnwcrlcn wie das entsprechende S-Epimer, welches in Beispiel 8 erhalten wurde, wird in einer Ausbeule von 28% gebildet. Dieses Produkt wird als 1nt,3/?-24(R)-Triacetoxyeholesta-5,7-dien identifiziert.

Beispiel 12

Synthese von

5,7-dien (zweite Stufe)

1«,3/i-24(R)-Tribenzoyloxycholest-5-cn, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(B) beschrieben, wird dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 beschrieben unterworfen.

Ein gereinigtes Produkt mit den gleichen UV-, NMR- und Massenspektren wie das entsprechende S-Epimer, welches man in Beispiel 9 erhält, wird in einer Ausbeute von 27% erhalten. Dieses Produkt wird als 1«,3/?-24(R)-Tribcnzoyloxycholesta-5-dien identifiziert.

Beispiel 13

Synthese von l«-Acetoxy-3/J-24(R)-dibenzoyloxycholcsla-5,7-dicn (zweite Stufe)

1«-Hydroxy-3j3-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-cn, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird mit dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 10 beschrieben unterworfen.

Ein gereinigtes Produkt mit den gleichen UV- und Massenspektren wie das entsprechende S-Epimer, welches man in Beispiel 10 erhält, wird erhalten. Dieses Produkt wird als 1a-Acetoxy-3/?-24(R)-dibenzoyloxycholesla-5,7-dien identifiziert.

Beispiel 14

(A) Synthese von I a,3^-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien aus 1«,3/7-24-Triacetoxycholest-5-en

Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 5(B) wird l«,3/?-24-Triacetoxycholest-5-en mit 1,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin und s-Collidin in η-Hexan umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird mit Säure und Alkali in Äther gewaschen und mit Aktivkohle behandelt; man erhält eine rohe Reaktionsmischung, die la,3j3-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien enthält.

(B) Hydrolyse von 1«,3/?-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien

Das bei (A) oben erhaltene rohe Produkt wird in einer 5%igen Methanollösung von Kaliumhydroxid hydrolisiert, wobei man eine rohe Reaktionsmischung erhält, die l«,3/f-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien enthält.

(C) Bestimmung der Reinheit von
1a,3^-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

Das UV-Spektrum von 100% reinem 1<x,3j3-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien beträgt A^"¹"¹ = 282 nm und das UV-Spektrum von 100% reinem 1«,30-24-Trihydroxy-4,6-dien beträgt Aj,!!¹,"""' = 240 nm. Eigene Untersuchungen zeigen, daß das Mischverhältnis zwischen diesen beiden Verbindungen bestimmt werden kann, indem man ihre A_max-Werte vergleicht.

Das Verhältnis des 5,7-Dien-Derivats und des 4,6-Dien-Derivats in der oben bei (B) erhaltenen rohen Reaktionsmischung wird nach diesem Verfahren bestimmt, und man stellt fest, daß das Molverhältnis von 1«,3/J-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien zu 1«,3/?-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien ungefähr 3 :1 beträgt.

(D) Abtrennung von l.\,J//-24-Trihydroxyeholesta-

5,7-dien und l<x,3/i-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien

(driltij Stufe)

(D-I) Abtrennung durch präparalive
' Dünnschichtchromatographie

Eine im Handel erhältliche Platte für präparalive Diinnschichtchromatographie (Silikagcl, ein Produkt der Merck Company, 20 cm χ 20 cm χ 0,5 mm) wird in

κι eine Lösung aus Silbernitrat in Acetonitril eingetaucht, um die Platte in einer Menge von ungefähr 1,5 Gcw.-% Silbernitrat zu imprägnieren, und dann wird die Platte bei 70"C 2 Stunden in der Wärme behandelt. Die so erhaltene chromatographische Platte wird für die -, anschließenden Trennstufen verwendet.

Die rohe Reaktionsmischung (30 mg), die man bei (B) oben erhält, wird auf der Platte adsorbiert und längs ungefähr 20 cm mit einer Lösungsmittelmischung aus 6% Methanol und Chloroform entwickelt. Nach dem

jo Trocknen an Luft der Platte wird die Reaktionsmischung erneut mit dem gleichen Lösungsmittel entwikkelt. Es treten zwei Banden mit einem Rf-Wctt von ungefähr 0,23 und ungefähr 0,33 auf. Diese Fraktionen werden abgekratzt und mit Äthylacetat aus dem

j) Silikagcl extrahiert. Man erhält 17,1 mg (57%) einer farblosen, festen Verbindung (Rf = 0,23) und 6,0 mg (20%) einer farblosen, festen Verbindung (Rf = 0,33).

Ein Teil der Platte wird unter Verwendung von Schwefelsäure angefärbt und eine Bande mit einem

in Rf-Wcrt von ungefähr 0,38 wird festgestellt. Diese Fraktion wird abgekratzt und auf gleiche Weise wie oben beschrieben extrahiert, und man erhält ungefähr 1 mg feste Verbindung.

Diese Produkte besitzen die folgenden Spektren. Das

j-, Produkt mit einem Rf-Wert von 0,23 wird als l«,3/?-24-Trihydroxycholesla-5,7-dien identifiziert; das Produkt mit einem Rf-Wert von 0,33 wird als la,3j3-24-Trihydroxycholesla-4,6-dien identifiziert und das Produkt mit einem Rf-Wcri von 0,38 wird als

4(i lA-24-Dihydroxycholesterin identifiziert.

(1) Produkt mit einem Rf-Wert von 0,23 (la,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien)

UV-Spektrum (vergl. F i g. 2), A^'JV¹¹¹"¹ (nm):
·<"> 262, 271 (f = 11 000), 282 (ε = 12 000), 294

(ε = 7000)

NMR-Spektrum (in C₃D₆O):
0,63(3 H, S, 18-CHj),
3,30(1 H, M, 24-H),

■"'" 3,70(1 H,M, 1J3-H), 4,08(1 H,M,3a-H),

5,30(1 H.D.J = 6Hz,6-oder7-H),
5,60(1 H₁D₁] = 6Hz,6-oder7-H)
Massenspektrum (vergl. F i g. 3):
_r>. 416 (M + ), 398,380,357,251,227,197,157

Fp.: 102 bis 103⁰C

(2) Produkt mit einem Rf-Wert von 0,33 (1<%,3j9-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien)

Wi UV-Spektrum.Ai,!!;""" (nm):

233,240,248
Massenspektrum:

416(M + ), 398,380

_h, (3) Produkt mit einem Rf-Wert von 0,38 (Ια-24-Dihydroxycholesterin)

Dieses entspricht einer Standardprobe mit einem Rf-Wert von 0,38.

(D-2) Trennung durch Säulenchromatographie

Silikagel, das im Handel für die Verwendung in der Säulenchromatographie erhältlich ist(C-2OO, Warenzeichen für ein Produkt der Wako Jyunyaku Kogyo Kabushiki Kaisha), wird mit ungefähr 2 Gew.-% Silbernitrat unter Verwendung einer Lösung imprägniert und dann 2 Stunden bei 70⁰C in der V/ärme behandelt. Das Silikagel wird dann in eine Glassäule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 30 cm gepackt. 40 mg der rohen Reaktionsmischung, die man bei (B) oben erhält, werden in die Säule gegossen und mit einer Lösungsmittelcluierung eluiert, die Benzol und Äthylacetat enthält. Man teilt in Fraktionen mit einem jeweiligen Volumen von ungefähr 20 ml. Diese Fraktionen werden dann getrennt, wobei man mit Dünnschichtchromatographie und UV-Spektrum die Chromatographie verfolgt.

Wenn das Volumenverhältnis von Benzol zu Äthylacetat 2 :1 bis 1 :1 beträgt, werden 7,6 mg (Ausbeute 19%) eines Produktes, entsprechend einem Rf-Wert von 0,33 in (D-I), erhalten. Wenn dieses Verhältnis 1 :1 beträgt, werden 19,6 mg (49%) eines Produktes, entsprechend einem Rf-Wert von 0,23, erhalten.

Diese Produkte werden nach verschiedenen Spektrumswerten identifiziert.

Vergleichsbeispiel 1

In diesem Beispiel wird die Trennung von 1<x,3/?-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1«,3/?-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien mit einem Trägermaterial erläutert, welches Siliciumdioxid, aber kein nichtmetallisches Silber enthält (Vergleich mit der dritten Stufe).

30 mg einer Mischung aus l«,3j3-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1a,3/?-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von 3 :1, die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(A) und (B) hergestellt wurde und die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(C) identifiziert wurde, wird durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 30 cm unter Verwendung von Silikagel als Trägermaterial geleitet, um sie in ihre Bestandteile zu trennen.

Eine Lösungsmittelmischung aus Benzol und Äthylacetat wird als Entwicklungslösungsmittel in unterschiedlichen Mischverhäitnissen von 10:1 bis 1:1 verwendet, und die Ausgangsmischung wird in Fraktionen mit einem Volumen von je ungefähr 20 ml geteilt. Die Trennung wird versucht, wobei man mit Dünnschichtchromatographie und UV-Spektrum die Chromatographie verfolgt. Wenn das Mischverhältnis von Benzol zu Äthylacetat ungefähr 2 :1 beträgt, beginnt die Hauptkomponente abzufließen. Analyse der jeweiligen Fraktionen mit UV-Spektrum zeigt, daß in allen analysierten Fraktionen eine Absorption bei 283, 240, 248, 262, 271, 282 und 294 nm beobachtet wird. Daraus folgt, daß, wenn Silikagel als Trägermaterial verwendet wird, das 1a,3^-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien nicht von dem 1«,3/J-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien abgetrennt werden kann. Man findet weiterhin, daß sich diese Fraktionen in ihrer Zusammensetzung kaum unterscheiden und daß das Molverhältnis von 5,7-Dien zu 4,6-Dien bei ungefähr 3 :1 erhalten bleibt (vgl. das folgende Vergleichsbcispiel 3).

Vergleichsbeispiel 2

In diesem Beispiel wird die Trennung von 1 «,3)9-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien und 1«,3j3-24-Triacetoxycholcsta-4,6-dien unter Verwendung eines Trägermaterials, das Siliciumdioxid, aber kein nichtmetallische! Silber enthält, erläutert (Vergleich mit der dritten Stufe) Eine Mischung aus la,3/3-24-TriacetoxychoIesta-5,7· dien und 1«,3/?-24-Triaceloxycholesta-4,6-dien in einen· ) Molverhältnis von 3:1, die auf gleiche Weise wie ir Beispiel 14(A) hergestellt wurde und die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(C) identifiziert wurde, wird dei präparativen Dünnschichtchromatographie unter Verwendung der gleichen Platte, wie sie in Beispiel 14(D-I]

κι verwendet wurde, unterworfen, wobei man ein Silika· gel-Trägcrmalerial verwendet, welches mit Silbernitrai behandelt wurde (Entwicklungslösungsmittel, 0,4% Methanol-Chloroform). Man stellt mit UV-Spektrum nur einen Flecken bei Rf ungefähr 0,4 fest.

ι Ί Diese Fraktion wird isoliert, und man erhält eine ölige Substanz, deren UV-Spektrum Absorptionen bei 233 240,248,262,271,282 und 294 nm zeigt.

Man stellt fest, daß die Abtrennung von 1<x,3j9-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien aus 1«,3/?-24-Triacetoxy-

2(i cholesta-4,6-dien nicht gelingt, selbst wenn Silikagel, welches nichtmetallisches Sillier enthält, als Trägermaterial verwendet wird (vgl. Vergleichsbeispiel 4).

Beispiel 15

Trennung von 1«,3/?-24(Rl-Trihydroxycholesta-

5,7-dien und 1a,3/?-24(R)-TrihydroxychoIesta-

4,6-dien (dritte Stufe)

la-Hydroxy-30-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en, her-

JIi gestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(A) gezeigt, behandelt, um l«-Acetoxy-3jS-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en herzustellen. Dieses Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 10 beschrieben

j") behandelt, wobei man eine rohe Reaktionsmischung erhält, welche l«-Acetoxy-3)3-24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien enthält. Die rohe Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(B) hydrolysiert und durch präparative Dünnschichtchromatographie auf

to gleiche Weise wie in (D-1) beschrieben getrennt.

Die Reaktionsmischung, die la,3jS-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7dien und 1«,30-24{R)-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3:1 enthält, kann in die zwei Bestandteile genau getrennt

Γ) werden.

Das Produkt, das aus dem Flecken abgetrennt wird, der aus l«,3j3-24(R)-Trihydroxycho!esta-5,7-dien stammt, besitzt die folgenden Eigenschaften.

UV-Spektrum A*¹,¹?¹"" (nm):
¹⁽¹ 262.271 (ε 11 000), 282 (11 800), 294 (7000)

NMR-Spektrum (C₃D₆O):

3,25(1 H,M,C-24-H),3,fc8(1 H₁M, 10-H),
4,10(1 H,M,3«-H),

.,5 5,30(1 H₁D₁J = 6 Hz₁6-oder 7-H)₁
5,60(1 H₁D₁J = 6Hz,6-oder7-H)

Massenspektrum:

416 (M +), 398,380,357,251,227,197,157
Fp.:96bis99°C

Beispiel 16

Trennung von 1«,30-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und la,3j3-24(S)-Trihydroxycholesta-4,6-dien

(dritte Stufe)

1 λ- Hydroxy-30-24(S)-diben2:oyloxycholest-5-en, hergestellt und getrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird auf gleiche Weise wie in Beispiel

5(A) behandelt, wobei man l«-Acetoxy-3j3-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en erhält. Dieses Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 10 beschrieben behandelt, wobei man eine rohe Reaktionsmischung erhält, die 1 ix- Acetoxy-Sjä^^SJ-dibenzoylcholesta-Sy-dien enthält. Diese Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(B) hydrolysiert und auf gleiche Weise wie in (D-I) oben durch präparative Dünnschichtchromatographie abgetrennt.

Die rohe Reaktionsmischung, die I«,3j9-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und I«,3j3-24(S)-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3 :1 kann scharf in die beiden Bestandteile getrennt werden.

Das Produkt, das von dem Flecken abgetrennt wird, der auf lix,3j3-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien basiert, besitzt die folgenden Eigenschaften.

UV-Spektrum. Ai^T" (nm):

262,271 (10800), 282(11 500), 294 (6900)

N M R-Spektrum (in C₃D₆O):

3,27(1 H,M.C-24-H),3,67(1 H, M, IjS-H),

4,10(1 H,M,3ä-H),

5,30(1 H₁D₁J = 6 Hz,6- oder7-H),

5,60(1 H₁D₁J = 6 Hz,6- oder7-H).

Massenspektrum:

416 (M+), 398,380,357, 251,227,197,157

Fp.: 120 bis 124° C

Beispiel 17

Synthese von ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol
(vierte Stufe)

16 mg l(x,3^-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-I) beschrieben, werden in 500 ml Diäthyläther gelöst und diese Lösung wird mit ultravioletten Strahlen 2,5 Minuten bei 5°C in einer Argonatmosphäre unter Verwendung einer 200-W-Hochdruck-Quecksilberlampe (654A-36, Warenzeichen für ein Produkt der Hanovia Company) bestrahlt. Ein Teil der Lösung wird entnommen und ihr UV-Spektrum wird bestimmt. Man beobachtet eine Erhöhung in der Absorption bei 262 bis 263 nm, die auf das l«-24-Dihydroxyprecholecalriferol zurückzuführen ist. Nach der Umsetzung wird der Äther bei Zimmertemperatur bei vermindertem Druck abgedampft. Benzol (50 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung erfolgt während 2 Stunden bei Rückfluß des Benzols.

Nach der Umsetzung wird das Benzol bei vermindertem Druck abgedampft, man erhält 16 mg eines farblosen Feststoffs. Dieses Produkt wird sorgfältig durch präparative Dünnschichtchromatographie unier Verwendung von Silikagel als Trägermaterial, das ungefähr 1,5% Silbernitrat enthält [das auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-I) beschrieben erhallen wurde], abgetrennt (man entwickelt zweimal mit 6% Methanol-Chloroform). Man erhält drei Banden, die durch ultraviolette Strahlen bestätigt werden. Aus der am wenigsten polaren Bande erhält man 2,8 mg farblosen Feststoff. Dieses Produkt besitzt die folgenden Eigenschaften und wird als Ιίχ-24-Dihydroxycholccalciferol identifiziert.

UV-Spektrum (F ig. 4)
A !,'!'."""'inmU 265

NMR-Spektrum(CjD₆O):
0,57(6 H, D, 18-CHi),
0,87 (6 H, DJ = 7 Hz,26-und 27-CHj),
0,96(3H₁DJ = 5Hz,21-CH₃),
3,19(1 H, M.24-H),4,15(1 H₁M, 1/3-H),
4,36(1 H, M,3a-H),4,85(1 H,b, S, 19-H),
5,30(1 H₁ b, S₁19-H),
6,05(1 H.DJab= H Hz,6-oder 7-H)₁
6,26(1H,DJab= 11 Hz₁ 6-oder 7-H).

Massenspektrum (F i g. 5):

416 (M+), 398,380,269,251,134

Hochresolutionsmassenspektrum:
gefunden: 416,32768
berechnet, M+ (C27H44O1) = 416,32927

Fp.: 84 bis 85° C

Beispiel 18

Synthese von la-24(R)-Dihydroxycholecalciferol
(vierte Stufe)

10 mg lflc,3j3-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 15 beschrieben, werden in 140 ml Diäthyläther gelöst und die entstehende Lösung wird 2 Minuten bei 5° C mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Ein Teil der Lösung wird entnommen und sein UV-Spektrum wird bestimmt. Eine Erhöhung der Absorption bei 262 bis 263 nm wird beobachtet, und es wird angenommen, daß dies auf die Vorstufe zurückzuführen ist. Nach der Umsetzung wird der Äther bei Zimmertemperatur und vermindertem Druck abgedampft. Benzol (50 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung wird während 2 Stunden in Argonatmosphäre beim Rückfluß des Benzols durchgeführt.

Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung auf gleiche Weise wie in Beispiel 17 beschrieben behandelt und durch präparative Dünnschichtchromatographie getrennt und gereinigt. Aus der am wenigsten polaren Bande werden 1,8 mg farbloser Feststoff erhalten. Dieses Produkt besitzt die folgenden Eigenschaften und wird als 1*-24(R)-Dihydroxycholecalciferol identifiziert.

UV-Spektrum

A2,Ür^ol(nm) = 265
Aäin^ham"(nm) = 228

NMR-Spektrum (C₃D₆O):
0,59(3 H₁S₁18-CH₃),
0,87 (6 H₁ D₁J = 7 Hz, 26- und 27-CH₃),
3,20(1 H, M, 29-H), 4,14(1 H, M, IjS-H),
4,42(1 H, M, iix- H), 4,87(1 H,b,S, 19-H),
5,32(1 H.b.S, 19-H),
6,08(1 H.D.Jab= Π H/.6- oder 7-H),
6,30(1 H, D, |,\D = 11 I Iz, 6- oder 7 -H).

Massenspektrum:

416(M ').398,380,264, 251

Hochresolulionsinassenspektrum:
gefunden: 416,33084
berechnet (M ') =

um« ''(nm)"
λί,ιΐΓ"' (nm)

265
228

Beispiel 19

Synthese von I«-24(S)-Dihydroxycholi;calciferol
(vierte Stufe)

15 mg l«,3/i-2<t(S)-Trihydroxycholesla-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 16 beschrieben, werden in 140 ml Diathylather gelöst, und die entstehende Losung wird 2 Minuten bei 5⁰C mit

ultravioletten Strahlen bestrahlt. Dann wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 18 beschrieben wiederholt, und man erhält 2,8 mg farblosen Feststoff. Dieses Produkt hatte die folgenden Eigenschaften und wurde als !«^(SJ-DihydroxycholecalciferoI identifiziert.

UV-Spektrum

A,},'Jr"'(nm) = 265
A-J₁*¹'""¹ (nm) = 228

NMR-Spektrum (in CiD₆O):
0,58(3 H₁S, 18-CH₃),
0,87(6H₁DJ = 7Hz,26-und27-CH₃),
3,20(1 H, M. 24- H), 4,14(1 H₁MJjS-H),
4,42(1 H, M,3«-H),4,87(1 H,b,S, 19-H),
5,32(1 H, b, S, 19-H),
6,08(1 H.DJab = 11 Hz, 6-oder 7-H),
6,30(1 H.DJab= 11 Hz,6-oder7-H)

Massenspektrum:

416(M+), 398,380,269,251,134

Hochresolutionsmassenspektrum:
berechnet: 416,33095
gefunden (M⁺): 416,32927 (C₂₇H₄₄O₃)

gel als Trägermaterial, welches Silbernitrat enthält, auf gleiche Weise wie in Beispiel 17 beschrieben abgetrennt und gereinigt. Aus der weniger polaren Bande werden 5,7 mg Feststoff erhalten. Da die verschiedenen Spektren und Eigenschaften dieses Produktes vollständig denen von Ια-24-Dihydroxycholecalciferol, welches in Beispiel 17 erhalten wurde, entsprechen, wird das Produkt nach der Isomerisierung als Ια-24-Diacetoxycholecalciferol-3-acetat identifiziert.

Beispiel 20

(A) Synthese von l«,3]?-24-Triacetoxycholest-5,7-dien aus 1 a,3/?-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

200 mg l«,3j3-24-TrihydToxycholesta-5,7-dien, hergestellt und getrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-I) beschrieben, werden mit 2 ml Essigsäureanhydrid und 5 ml Pyridin 3 Stunden bei 95° C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird in Eis-Wasser gegeben und mit 400 ml Diethylether extrahiert. Die Ätherphase wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure, dann mit Alkali und weiter mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der Äther wird verdampft, und man erhält l«,3j3-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien als hellgelbliche, ölige Verbindung.

(B) Synthese von Ια-24-Diacetoxycholecalciferol-30-acetat (vierte Stufe)

50 mg 1a-24-Diacetoxycholecalciferol-3^-acetat werden in 500 ml Diethylether gelöst. Die entstehende Lösung wird mit ultravioletten Strahlen in einer Argonatmosphäre 4 Minuten bei 50°C bestrahlt.

Ein Teil dieser Lösung wird entnommen und sein UV-Spektrum wird bestimmt. Eine Erhöhung in der Absorption bei 262 bis 263 nm wird beobachtet, und man nimmt an, daß sie auf die Vorstufe zurückzuführen ist. Nach der Umsetzung wird der Äther bei vermindertem Druck und Zimmertemperatur verdamplt. Benzol (100 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung wird während 2 Stunden in Argonatmo-Sphäre unter Rückfluß von Benzol durchgerührt. Nach der Umsetzung wird der Hauptteil des Benzols bei vermindertem Druck abclostilliert und zu dem Rückstand gibt man 2 ml 5%igei Kuliumhydroxid/Mcthaiiol, 2 ml Methanol und 2 ml Benzol. Die Mischung wird I Tag bei Zininicrlcmpcrut ir stehengelassen, so daß die Hydrolyse ablaufen kann. Das Reaktionsprodukt wird mit Wasser verdünnt und mit Äthylacelat extrahiert. Die ÄthylacetatphasL" wird wiederholt mit Wasser gewaschen und getrockner.. Das Äthylacetat wird bei vermindertem Druck abgedampft, man erhält 35 mg einer hellgelben, öligen Verbindung.

Diese Substanz wird durch prilparativc Dünnschichtchromatographic unter Verwendung von Silika·

Beispiel 21

(A) Synthese von l<x,3jS-24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien aus l«,3j9-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

160 mg l«,3^-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(D-I) beschrieben, werden mit 410 mg Benzoylchlorid und 15 ml Pyridin umgesetzt.

2(i Die Reaktionsmischung wird mit Wasser verdünnt und mit 40 ml Diäthyläther extrahiert. Die Ätherphase wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure und dann mit Alkali und schließlich mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der Äther wird abgedampft, man erhält l«,30-24-Tribenzoyloxycho!esta-5,7-dien als farbloses, amorphes Produkt.

(B) Synthese von iix-24-Dibenzoyloxycholecalciferol-SjS-benzoat (vierte Stufe)

jo 30 mg la,3j?-24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien werden in 500 ml Benzol gelöst und die entstehende Lösung wird mit ultravioletten Strahlten in Argonatmosphäre 2 Minuten bei 10⁰C bestrahlt. Nach der Umsetzung wird die Isomerisierung 2 Stunden in Argonatmosphäre

j5 unter Rückfluß von Benzol durchgeführt. Nach der Umsetzung wird der Hauptteil des Benzols bei vermindertem Druck verdampft und 2 ml 5%iges Kaliumhydroxid-Methanol und 2 ml Benzol werden zu dem Rückstand gegeben. Die Mischung wird 28 Stunden bei Zimmertemperatur in Argonatmosphäre gehalten, um die Hydrolyse durchzuführen. Das Reaktionsprodukt wird mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wird bei vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird dem gleichen Trenn- und Reinigungsverfahren wie in Beispiel 20 unterworfen. Man erhält 1,9 mg ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol, das die gleichen Eigenschaften besitzt wie das Produkt, das in Beispiel 20

ίο erhalten wurde.

Aus diesem Ergebnis wird das nach der Isomerisierungsreaktion erhaltene Produkt als !«-24-Dibenzoyleholecalciferol-3-benzoat identifiziert.

Beispiel 22

(A)Synthese von li\-Hydroxy-3/J-24dibenzoyloxy-

cholesta-V-dien aus li\,3/J-24-Trihydroxy-

ch()lesla-5,7dien

250 mg li\,J/i-24-Trihydroxycholesla-5,7-dien, hergestellt auf gleich·* Weise wie in Beispiel 14 (D-I) beschrieben, werden mit 210 mg Benzoylchlorid und 5 ml Pyridin vermischt und die Mischung wird I Tag bei 23⁰C stehengelassen. Die entstehende Rcaktionsniischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 21 beschrieben behandelt, und man erhält lr\-Hydroxy-3/J-24-dibenzoyloxycholesia-5,7-dicn.

(B) Synthese von la-Hydroxy-24-benzoyloxycholecalciferol-3ß-benzoat (vierte Stufe)

20 mg 1a-Hydroxy-3^-24-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien werden in 500 ml Diäthyiäther gelöst. Die Lösung > wird mit ultravioletten Strahlen bestrahlt, isoinerisiert und auf gleiche Weise wie in Beispiel 21(B) beschrieben hydrolysiert, wobei man 1,9 mg l«-24-Dihydroxycholecalciferol erhält, das die gleichen Eigenschaften besitzt wie das in Beispiel 20 erhaltene Produkt. in

Aus diesen Ergebnissen wird bestätigt, daß das Produkt, das man nach der Isomerisierungsreaktion erhält, l«-Hydroxy-24-benzoylcholecalciferol-3j3-benzoat ist.

I")

Beispiel 23

Synthese von 1«-24(R)-Diacetoxycholecalciferol-3/?-acetat (vierte Stufe)

Das in Beispiel 15 erhaltene Ia,3j3-24(R)-Trihydroxy- 2n cholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 20(A) beschrieben acetyliert, wobei man la,3/?-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien erhält. 25 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 20(B) beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß die r> Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen 2 Minuten durchgeführt wurde. Man erhält 3,4 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften mit denen von 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol übereinstimmen.

Aus diesem Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt, in das man nach der Isomerisierungsreaktion erhält, 1<x-24(R)-Diaeetoxycholecalciferol-3j3-acetatisl.

Beispiel 24

Synthese von 1a-24(R)-Dibenzoyloxycholecalciferol-3/J-benzoat (vierte Stufe)

Das la,3j3-24{R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 21(A) beschrieben benzoyliert, wobei man I«,3j9-24(R)-Tribenzoyloxycho- ίο lesta-5,7-dien erhält. Dieses Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 21(B) beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß 30 mg dieses Produktes verwendet werden und daß die Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen 2 Minuten bei 12°C durchgeführt wird. Man A^r, erhält 3,4 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften mit denen von 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol übereinstimmen.

Danach wird das Produkt nach der Isomerisierungsreaktion als loc-24(R)-Dibenzoyloxycholecalcifero!-3j9- ^r>n benzoat identifiziert.

Beispiel 25 Beispiel 26

Synthese von l«-Hydroxy-24(R)-benzoyloxycholecalciferol-30-benzoat (vierte Stufe)

55

Das l«,30-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 22(A) beschrieben benzoyliert, um l<x-Hydroxy-3j3-24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien herzustellen. wi

10 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 22(B) beschrieben behandelt, und man erhält 1,2 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften denjenigen von 1*-24(R)-Dihydroxycho!ecalciferol entsprechen. b5

Aus diesem Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt nach der Isomerisierung l«-Hydroxy-24(R)-benzoyloxycholccalciferol-3/J-benzoat ist.

Synthese von 1«-24(S)-Diacetoxycholecalciferol-3/J-acetr. (vierte Stufe)

Das in Beispiel 16 erhaltene 1 a,3/?-24(S)-TrihydiOxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 20(A) beschrieben acetyliert, wobei l<x,3j?-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien gebildet wird. 20 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 23 beschrieben behandelt, wobei man 3,1 mg eines Produktes erhält, dessen Eigenschaften denen von 1 *-24(S)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen.

Aus diesem Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt nach der Isomerisierungsreaklion 1«-24(S)-Diacetoxycholecalciferol-30-acetat ist.

Beispiel 27

Synthese von l«-Hydroxy-24(S)-benzoyloxychole·
calciferol-30-benzoat (vierte Stufe)

Das in Beispiel 16 erhaltene 1a,3/J-24(S)-Trihydiroxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 22(A) beschrieben benzoyliert, wobei la-Hydroxy-3/?- 24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien gebildet wird. 15 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 25 beschrieben behandelt, wobei man 1,5 g eines Produktes erhält, dessen Eigenschaften denen von la-24(S)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen. Daraus wird bestätigt, daß das nach der Isomerisierung erhaltene Produkt l«-Hydroxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3/?-benzoat ist.

Beispiel 28

Synthese von 1a-Acetoxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3/it-benzoat (vierte Stufe)

Das auf gleiche Weise wie in Beispiel 27 beschrieben erhaltene 1«-Hydroxy-3₍9-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 26 beschrieben acetyliert, wobei la-Acetoxy-3j3-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien gebildet wird.

15 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 26 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß die Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen 1 Minute bei 8°C durchgeführt wird. Man erhält 1,5 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften denen von 1«-24(S)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen. Daraus wird bestätigt, daß das nach der Isomerisierung erhaltene Produkt 1«-Acetoxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3/?-benzoat ist.

Vergleichsbeispiel 3

Synthese von 1«-24-DihydroxychoIecalciferol

aus 1 «,3j3-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien,

das 1«,3j3-24-Trihydro>:ycholesta-4,6-dien enthält

(Vergleich mit der vierten Stufe)

10 mg einer Mischung aus 1«,3ß-24-Trihydroxycliolesta-5,7-dien und 1a,3/?-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3:1, die auf gleiche Weise wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben erhalten wird, werden in 500 ml Diäthyiäther gelöst, und die Lösung wird 2 Minuten bei 5°C mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Nach der Umsetzung wird der Diäthyiäther sorgfältig bei vermindertem Druck abgedampft. Zu dem Rückstand fuel man 50 ml Benzol und

die Isomerisierung wird 2 Stunden in Argonatmosphäre unter Rückfluß von Benzol durchgeführt. Nach der Umsetzung wird das Benzol abdestilliert, und man erhält 10 mg einer brauner., öligen Verbindung.

Das UV-Spektrum dieses Produktes ist kompliziert, ·-> insbesondere besitzt es keine spezifische Absorption des Ια-24-Dihydroxycholecalciferols, welches ein Ab-Mjrptionsmaximum bei 265 um zeigt, und die Bildung von Ια-24-Dihydroxycholccalciferol konnte nicht bestätigt werden. Ill

Dies wurde weiter bestätigt, wenn man die obige Verbindung der präparativen Dünnschichtchromatographic unter Verwendung von Silikagel-Trägermalerial, das daran adsorbiert Silbernitrat enthält, unterwirft und das Chromatogramm mit dem Chromatogramm π einer Standardprobe von lA-24-DihydroxychoIecalcifcrol vergleicht. Das Produkt z.eigt keinen Fleck, der der Standardprobe entspricht.

Daraus ist ersichtlich, daß die Reinheit von 1α,3/ϊ-24-Trihydroxycho!esla-5,7-dien niedrig ist, \a,3ß-24-Trihy- 2i> droxycholecalciferol durch Isomerisierung unter Verwendung von ultravioletter Bestrahlung nicht gebildet wird.

Verglcichsbeispiel4 2Ί

Synthese von Ια-24-Diacctoxycholecalcifcrol-

3/?-acetat aus laß/J-Triacetoxycholesta-

5,7-dien,das la,3/?-24-Triacetoxycholesta-

4,6-dien enthält (Vergleich der vierten Stufe)

10 mg einer Mischung aus la,3^-24-Triacctoxycholesta-5,7-dien und la,3j3-24-Triacetoxy-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3:1, erhalten auf gleiche Weise wie in Vergleichsbcispiel 2 beschrieben, werden in 500 ml Diäthyläther gelöst und die Lösung wird 2 π Minuten bei 5°C mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Die Reaktionsmischung färbt sich gelblich-braun. Nach der Umsetzung wird der Diäthyläther sorgfältig bei vermindertem Druck abdeslilliert. Benzol (50 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung wird ad 2 Stunden in Argonatmosphäre unter Rückfluß des Benzols durchgeführt. Nach der Umsetzung wird die Hauptmenge des Benzols bei vermindertem Druck abdestilliert. Zu dem Rückstand gibt man 1 ml 5%iges Kaliumhydroxid-Methanol und die Mischung wird 24 4^r> Stunden bei Zimmertemperatur in Argonatmosphäre zur Durchführung der Hydrolyse stehengelassen. Nach der Umsetzung wird das Benzol abgedampft und das UV-Spektrum wird bestimmt. Das Produkt wird der präparativen Dünnschichtchromatographie unterwor- ■;<> fen. Die Ergebnisse sind die gleichen wie bei Vergleichsbeispiel 3 und es wurde keine Bildung von 1 α-24-Dihydroxycholecalciferol beobachtet.

Beispiel 29 v>

Einfluß auf die Aktivierung des intestinalen

Calciumtransports des
Ια-24-Dihydroxycholecalciferols (Ια-24-DHCC)

(a) Vergleich mit la-Hydroxycholecalciferol ₍₎

(Ia-HCC)

Männliche Wistarratten mit einem Körpergewicht von ungefähr 200 g müssen über Nacht fasten, und dann wird ihnen oral 625 ρ Mol einer Lösung von jeweils Ια-24-DHCC und Ia-HCC in Maisöl verabreicht. Nach μ einer vorbestimmten Zeitdauer wird eine Lösung aus radioaktivem Calciumchlorid ('⁵CaCh, 30 μΟ/ιτι!) oral verabreicht. Der Radioaktivitätsgehalt im Blut wird im Verlauf von 10 bis 60 Minuten bestimmt. Die maximalei Werte werden als Index für die intestinale Calciumab sorption festgesetzt.

Einer Kontrollgruppe von Ratten wird Maisöl allen in der gleichen Menge verabreicht. Die Dosis de Maisöllösung von Ια-24-DHCC oder Ia-DHCC und de Maisöls betrugen 0,0125 ml/100 g Körpergewicht jede Ratte, und die Dosis an radioaktiver wäßrige Calciumchloridlösung (pH 7,0) betrug 0,1 ml/100 j Körpergewicht jeder Ratte.

Der Radioaktivitätsgehalt wurde bestimmt, inderr man 0,2 ml des Serums in eine Vial-Flasche gab, 12 m einer Lösung zugab, die einen Scintillator enthäl [enthaltend 1200 ml Toluol, 800 ml Äthylcellosolv, 8f 2,5-Diphenyloxazol und 300 mg 2,2'-p-Phenylen-bis-(5 phenyloxazol)], und indem man die Radioaktivität mi einem flüssigen Scintillationszähler bestimmte. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Zeit nach der Verabreichung

(Std.)

Radioaktivität im Serum (cpm) 1 ί.-24-DHCC 1 a-liCC

Vergleich	275 +	95 (4)*)	275	± 95(4)
4	360 ±	150(4)	697	±221 (4)
8	996 +	80(4)	1035	±150(4)
12	924 ±	130(4)	643	±210(4)
24	426 ±	61 (4)	332	± 28(4)

*) Die Werte in Klammern zeigen die Anzahl der Ratten ir einer besonderen Gruppe an.

Aus den obigen Ergebnissen gehl hervor, daQ Ια-24-DHCC eine fast gleiche Wirkung besitzt wie Ia-HCC im Hinblick auf die Aktivierung der intestinalen Calciumabsorption.

(b) Vergleich zwischen la-24(R)-DHCC und
la-24(S)-DHCC

Männliche Wistarratten mußten über Nacht fasten und dann wird ihnen oral 625 ρ Mol einer Lösung von je ta-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC in Maisöl verabreicht. 8 Stunden nach der Verabreichung werden die Ratten getötet und die intestinale Calciumabsorption wird mit dem umgekehrten gut sac-Verfahren bestimmt [Martin und D e Lu ca, Amer. J. Physiol. 216, 1351 (1969)]. Die Ergebnisse sind in Tabelle Il angegeben.

Tabellen

«Ca (S/M)

Vergleich l,29±0,16(4)<)

1a-24(R)-DHCC 5,86±1,98(4)
la-24(S)-DHCC 2,58 ±0,80 (4)
⁺ ) Die Zahl in Klammern zeigt die Anzahl der Ratten in einer besonderen Gruppe an.

Die Versuchsbedingungen sind die folgenden:

Verwendeter intestinaler Trakt:
,Duodenum, 7 cm

Menge an Medium, das in das
umgekehrte Duodenum
gegeben wird. 0,7 ml

809 526/351

	25	125 mM	37° C, 90 Minuten eine gasförmige	0,1 ml	26 981 I
49		1OmM	Mischung aus 95% O2 und 5% CO2		50 S
Zusammensetzung des Mediums		3OmM (pH 7,4)	wird durchgeleitet	Dosis	Die anderen Bedingungen sind gleich wie bei (a) oben.
NaCI	0,25 mM	Menge an Flüssigkeit, die für die Radioaktivitätsmessungen	125 p Mol	Die obigen Ergebnisse zeigen, daß 1«-24(R)-DHCC
Fructose	10 μα/Ι	verwendet wird		eine größere Aktivität zeigt, die intestinale Calciumab-
Tris-Cl-Puffer		Tabelle HI	3,59 ± 0,23 (4)	sorption zu aktivieren, als 1«-24(S)-DHCC.
CaCI2		4,12 ±0,25 (4)
«CaCb		3,97 ± 0,28 (4)	Beispiel 30
I nkubationsbedingungen:	Vergleich	4,42 ±0,41 (4)	Vergleich von Ιλ-HCC, Ιλ-24-DHCC,
1 ff-HCC	l«-24(R)-DHCCund 1ä-24(S)-DHCC
1 ίτ-24-DHCC	im Hinblick auf die Aktivierung der
1 <r-24(S)-DHCC	"' intestinaien Calciumabsorption
1 ff-24( R)-DH CC	Das Versuchsverfahren ist gleich wie in Beispiel 29(b).
	Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben.
625 p Mol 3 125 p Mol
3,31 ±0,12(15)*) I
4,10 ±0,27 (4) 5,10 ±0,27 (4) |
4,84 ± 0,32 (4) 5,47 ± 0,33 (4) §
4,17 ±0,31 (4) 5,18 ±0,20 (4) |
5,93 ± 0,33 (4) 5,84 ± 0,39 (4) f

*) Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Ratten in einer besonderen Gruppe an.

Die in Tabelle III aufgeführten Ergebnisse bestätigen die Versuchsergebnisse von Beispiel 29. In anderen Worten, ist die intestinale Calciumabsorption von Ιλ-24-DHCC mindestens gleich der Aktivität von Ιλ-DHCC und unter Ια-24-DHCC, 1«-24(R)-DHCC und 1«-24(S)-DHCC bestehen die folgenden Beziehungen im Hinblick auf die Fähigkeit, die intestinale Calciumabsorption zu aktivieren:

l,v24(R)-DHCC > Ιλ-24-DHCC > I«-24(S)-I)HCC

Beispiel Jl

Vergleich der Knochenabsorptionswirkung zwischen
Ιλ-24-DHCC und Ιλ-HCC

Männlichen Wistarratten (je mit einem Körpergewicht von ungefähr 150 g) wird subkutan eine wäßrige Lösung aus ⁴SCaCl₂ in einer Dosis von 50 μΟ^ηε verabreicht und die Ratten werden 6 Wochen gehalten. Das so verabreichte ⁴⁵Ca wird schnell absorbiert und ein größerer Teil sammelt sich nach einigen Stunden in den Knochen. 3 Wochen später wird der ⁴⁵Ca-Gehalt im Blut konstant und nur die Knochen befinden sich in dem spezifisch markierten Zustand. Dies wird durch makroautoradiographische Analyse des gesamten Körpers bestätigt. Die Ratten werden 6 Wochen gehalten und dann wird ihnen oral kontinuierlich einmal am Tag eine Lösung aus 2125p Mol von je la-HCC und Ιλ-24-DHCC verabreicht. Blut wird im Verlauf der Zeit entnommen und der Radioaktivitätsgehalt des Serums wird gemäß dem in Beispiel 29(a) beschriebenen Verfahren bestimmt. Eine Erhöhung in dem Serum-Radioaktivitätsgehalt wird als Index des Einflusses der Knochenabsorption angesehen. Der Kontrollgruppe wird nur Maisöl allein verabreicht. Die Anzahl der Ratten, die untersucht werden, beträgt jeweils 4 in einer Gruppe. Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 6 dargestellt. In dieser Figur bedeutet das Symbol einen wesentlichen Unterschied in dem Serum-Radioaktivitätsgehalt, verglichen mit der Vergleichsprobe.

Aus den in F i g. 6 dargestellten Ergebnissen ist erkennbar, daß bei lrt-HCC die Knochenabsorption beachtlich 2 Tage nach dem Beginn der Verabreichung zunimmt und daß diese Erscheinung mit der Zeit größer wird. Andererseits nimmt bei Ιλ-24-DHCC die Knochenabsorption nur nach einem Verlauf von 4 Tagen beachtlich zu, aber danach ist das Ausmaß der Erhöhung wesentlich niedriger als bei Ιλ-HCC (ungefähr ¹A am 8.Tag). Dies legt nahe, daß Ιλ-24-DHCC einen schwächeren Knochenabsorptions-Effekt zeigt als Ιλ-HCC und eine niedrigere Toxizität.

Beispiel J2

Vergleich der Knochenabsorptionswirkung und der

Körpergewichtsänderung zwischen Ιλ-HCC,
Ιλ-24-DHCC, I,x-24(R)-DHCC und hx-24(S)-DHCC

Ein ähnlicher Versuch wie in Beispiel 31 beschrieben wird mit den obigen vier Verbindungen durchgeführt. Im Gegensatz zu Beispiel 31 wird der Versuch J Wochen nach der Verabreichung von ¹⁵CaCb begonnen. Sowohl der Radioaktivitätsgehalt des Serums als auch die gesamte Calciumkonzentration im Serum werden bestimmt. Für die Messung der Calciumkonzentration wird ein Calciumbestimmungssack (hergestellt von latron Company) verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV und V angegeben.

Tabelle IV
⁴⁵Ca-Gehalt im Serum

Zeit (Tage)

Serum-Aktivität (cpm) O 5

Vergleich

Iff-24-DIICC
lff-24(R)-I)IICC
I a-24(S)-l)HCC

699 ± 53,7 690 ± 39,4 675 ± 54,9 648 ± 44,3 780 ± 43,5 ± 48,6
±66,8
± 64,6
± 30,4
145,2

597 ± 33,9
1184 db 51,1

700 ± 32,8
778 ± 26,9
520 ± 53,8

608 ±49,3 904 ±57,1 661 ±78,8 681 ±63,7

609 ±91,5

Tabelle V
Ca-üehalt im Serum

Vergleich

1 a-HCC

I β-24-DUCC

I <r-24(R)-DHCC

1^-24(S)-I)IICC

11,4 ±0,32 10,4 ±0,21 11,7 ±0,26 11,3 ±0,35 11,2 ±0,16

10.0 ±0,29

14.1 ±0,29
12,9 ±0,18
12,6 ±0,23
11,5 ±0,33

11.1 ±0,22
14,7 ±0,33
11,5 ±0,23
13,3 ±0,25

11.2 ±0,29

10,6 ±0,15 13,8 ±0,41 12,1 ±0,19 12,8 ±0,35 11,5 ±0,24

Aus den in den Tabellen IV und V aufgeführten Ergebnissen ist erkennbar, daß die Versuchsergebnisse von Beispiel 31 wieder bestätigt werden. In anderen Worten zeigen diese Ergebnisse, daß Ια-24-DHCC eine schwächere Knochenabsorptionswirkung als Ia-HCC besitzt, und von Ια-24-DHCC, la-24(R)-DHCC und 1«-24(S)-DHCC gilt für die Knochenabsorptionswirkung die folgende Beziehung:

la-24(R)-DHCC> Ιλ-24-DHCC> la-24(S)-DHCC.

Es ist besonders bemerkenswert, daß bei la-24(S)-DHCC kaum eine Knochenabsorptionswirkung beobachtet wird, und diese Wirkung ist fast gleich wie bei der Vergleichsprobe. Dies legt den Schluß nahe, daß la-24(S)-DHCC keinen Einfluß auf die spezifische aktivierende intestinale Calciumabsorption zeigt und dies ist für klinische Anwendungen sehr wichtig.

Die Änderungen im Körpergewicht, die in dem

id vorliegenden Versuch bestimmt wurden, sind in F i g. 7

dargestellt. Es ist bemerkenswert, daß Ιλ-24-DHCC

eine größere Änderung im Körpergewicht aufweist als

Ia-HCC, und insbesondere zeigt la-24(S)-DHCC kaum

einen Unterschied im Hinblick auf die Vergleichsgrup-

r> pe. Dies legt den Schluß nahe, daß, ähnlich wie bei der

Knochenabsorption, die Toxizität von Ια-24-DHCC

geringer ist als von Ia-HCC.

Beispiel 33

Vergleich der Toxizität zwischen Ια-24-DHCC und Ia-HCC

Die Toxizität von jeder der obigen zwei Verbindungen wird nach bekannten Verfahren bestimmt. Die ι, Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben.

Tabelle Vl	Geschlecht	Ll)50 dig/kg)	Ia-IICC	Ια-24-miCC
Species		Verabreichungsverfahren	474	>2 5()()
	ύ	per os	508
	9		167	33 (XX)-3 300
	δ	intravenös	KX)	3 300-1(X)O
Mülls	-to		330
	δ	per os	744	-
	9
Ratte

Aus der obigen Tabelle ist erkennbar, daß die Toxizität von 1ä-24-DHCC ein Zehntel oder weniger von der von Ia-HCC beträgt. Dieses Ergebnis ist ebenfalls aus den Ergebnissen der Beispiele 31 und 32 ersichtlich.

Aufgrund der in den Beispielen 29 bis 33 erhaltenen Ergebnisse können die Eigenschaften von Ια-24-DHCC mit denen von Ia-HCC, wie sie in Tabelle VII aufgeführt sind, verglichen werden. Bei diesen Werten wird die Aktivität von Ia-HCCaIs 1 angenommen.

53

Tabelle VII

I «-24-DHCC

Ια! ICC

Kinlluß auf die Aktivierung der intestinalcn Calciumabsorption Knochenabsorplionswirkung Akute Toxi7ität

weniger ais weniger als

Da gezeigt wurde, daß das erfindungsgemäße 1a-24-DHCC die intestinale Calciumabsorption selektiv aktiviert und eine schwächere Knochenabsorptionswirkung zeigt, verglichen mit bekannten Analogen der aktiven Form von Vitamin D₁, wird angenommen, daß es ein sehr wertvolles Arzneimittel ist, welches mit nur wenigen Nebenwirkungen bei der Behandlung von Krankheiten verwendet werden kann, die durch abnormalen Metabolismus von Calcium induziert werden. Insbesondere ist 1«-24(S)-DHCC eine besonders wertvolle Substanz in dieser Hinsicht, und es wird angenommen, daß die große Verwendung finden wird.

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1. Gemisch von la^^SJ-Dihydroxycholecalciferol und 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol in belie- -, bigen Verhältnissen der folgenden Formel

   HC)

   2. l\ -24(S)- Dihydroxycholcculciferol der folgenden Formel

   OH

   HO

   ^rOH

   .1 U-24(R)- Dihydroxycholecalciferol der folgenden Formel

   OH

   HO

   OH

   4. Ia-24(S)-Dihydroxycholecalciferol-Derivat, 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol-Derivat oder ein Gemisch dieser Derivate in beliebigen Verhältnis

   sen, ausgedrückt durch die folgende Formel

   OR.,

   R₁O

   worin

   Ri, R2 und Rj gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß die Struktur der obigen Formel geändert wird, mit dem Proviso, daß mindestens eine der Gruppen Ri, R2 und R3 eine Schutzgruppe bedeutet.

   5. Gemisch von la,3/?-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder seinen Derivaten und l«,3/?-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder seinen Derivaten in beliebigen Verhältnissen, ausgedrückt durch die folgende Formel

   worin

   Ri, R2 und Rj gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, bedeuten.

   6. l«,3/3-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder ein Derivat hiervon, gebildet durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

   OR.,

   OR,

   R₁O

   worin

   Ri, R2 und Rj gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß sich die Struktur der obigen Formel ändert.

   7. l(X,3/3-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von

   mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

   einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

   or,

   R₁ (Γ

   OR, -

   I.

   ORi'

   OR, / I/

   (2-d)

   RiO

   Ri, R2 und Rj gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar /st, ohne jii daß sich die Struktur der obigen Formel ändert.

   8. ΐΛ-24-Dihydroxycholesterin oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel _>i

   OR₁,

   γ v'Y

   R₄O

   worin

   R4" und Rs die in Anspruch 9 gegebenen Bedeutungen besitzen.

   11. l«,2a:-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on der folgenden Formel

   R4, R5 und Rs gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß sich die Struktur der obigen Formel ändert.

   9.1«-24(S)-Dihydroxycholesterin oder ein Derivat davon, gebildet durch den Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

   ORi'

   OR₅

   RiO

   12-L-)

   ·π

   12. Verfahren zur Herstellung von zumindest einer der folgenden Verbindungen, nämlich la,24(S)- und I«,24(R)-Dihyclroxycholecalciferol und deren Derivate, der folgenden Formel

   OR.,

   (5)

   R₁O

   OR,

   R4" ein Wasserstoffütom oder eine substituierte oder nichtsubstituierte Benzoylgrupjje bedeutet und R5 ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeutet, die in ein Wii.sserstoffatom überführbar ist. 10. l&-24(R)-DihydiOxycholesterin oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von mindestens worin

   Ri, R2 und Rj, die gleich oder verschieden sein können, eim Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne die Struktur der Formel (5) zu ändern, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (1) ein 1«,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on der Formel

   Y-Y

   λ Τ ι

   1rti,3/f,24(R)-Trihyc!roxycholesla-5,7-dien-Derivat.dcr Formel

   OR4·

   mit einem Alkalimetall und einem Protonendonator in Gegenwart von flüssigem Ammoniak oder einem flüssigen Amin unter Bildung von la^-Dihydroxycholesterin der Formel

   OH

   <2-a)

   HO

   zu bilden,

   (4) das gebildete 5,7-Dienderivat zur Bildung von zumindest einer der folgenden Verbindungen, nämlich la,3j3,24(S)- und 1ix,3|3,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, der Formel

   HO

   OH

   (3-a)

   umsetzt,

   (2) das gebildete !«^-Dihydroxycholesterin als r> Benzoylderivat der Formel

   OR₄"

   OR₅

   (2-b)

   4')

   Ri' O

   hydrolysiert,

   (5) zumindest eine der folgenden Verbindungen, nämlich 1«,3j3,24(S)- und 1«,30,24(R)-TrihydroxychoIesta-5,7-dien, abtrennt und gewinnt, indem man die hydrolysierten Produkte in Form einer Lösung in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einem Träger in Kontakt bringt, der zumindest Siliciumdioxid und nichtmelallisches Silber in absorbierter Form enthält, und gegebenenfalls zumindest eine der Hydroxygruppen schützt, und

   (6) zumindest eines der auf diese Weise gebildeten 1_Ä,3j3,24(S)- und 1a,3j?,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien-Derivateder Formel

   worin

   R4" eine substituierte oder unsubstituierte Benzoylgruppe bedeutet und R5 ein Wasserstoffatom oder eine in ein Wasserstoffatom überführbare Schutzgruppe bedeutet, in ein la,24(S)-Epimer und ein 1«,24(R)-Epimer durch Chromatographie unter Verwendung eines Trägers, der zumindest Siliciumdioxid enthält, trennt,

   (3) zumindest eine der folgenden Verbindungen, nämlich das 1<x,24(S)-Epimer und das 1«,24(R)-Epimer, mit einem allylischen Bromierungsmittel in einem inerten organischen Medium umsetzt und dann die erhaltene Reaktionsmischung mit einem Dehydrobromierungsmittel in Kontakt bringt, um zumindest eine der folgenden Verbindungen, nämlich ein 1«,3/?,24(S)-Trihydroxycholesta-5,/-dien-Derivat und ein

   OR,

   (3-b)

   R₁O

   worin Ri, R2 und R3 die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, einer Ultraviolettbestrahlung in einem inerten organischen Lösungsmittel aussetzt und dann das erhaltene Produkt isomerisiert und gegebenenfalls hiernach die Schutzgruppe oder die Schutzgruppen abspaltet.

   13. Pharmazeutisch wirksames Mittel für Warmblüter, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1«-24{S)- und 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel

   OH