DK142410B - Analogifremgangsmåde til fremstilling af 1alfa,24(S)-dihydroxycholecalciferol eller 1alfa,24(R)-dihydroxycholecalciferol eller blandinger deraf. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 142^+10 DANMARK m lntCI·3 c 07 c 172,00 (21) Ansøgning nr. 2733/75 (22) Indleveret den 17· JUH. 1975 (24) Løbedag 17· jun. 1975 \J/ (44) Ansøgningen fremlagt og fremlssggelsesskriftet offentliggjort den 27· Okt. 1980

DIREKTORATET FOR J

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET <30> Prioritet begæret fra den ___

18. jun. 1974, 68664/74, JP 9. dec. 1974, 141329/74, JP

9. dec. 1974, 141330/74, JP

9. dec. 1974, 141331/74, JP

9. dec. 1974, 141332/74, JP

27. dec. 1974, 149017/74, JP

27. dec. 1974, 149018/74, JP

27. dec. 1974, 149020/74, JP

27. dec. 1974, 149Ο21/74, JP

27. dec. 1974, 149022/74, JP

(71) TEIJIN LIMITED, 11, 1-chome, Minaraihonmachl, Higashi-ku, Osaka, JP.

<72> Opfinder: Toru Takeshlta, 3-18-4, Tamadaira, Hino-shi, Tokyo, JP: Yo= shlnobu HashlmoTo, 7-6-8, Kugenumakaigan, Fujisawa-shi, Kanagawa-ken, JP: Hiroyuki Kawashima, 3-18-4, Tamadaira, Hino-shi, Tokyo, JP: Sachio Jtshiraoto, 1-2J-7-703/ Kamitakaido, Suginami-ku, Tokyo, JP: Nobuo Ikeka= wa, 2-20-18, Miharadai, Nerima-ku, Tokyo, JP: Masuo Morisaki, 3-57 Sa* kuradai, Nerima-ku, Tokyo, JP.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Analogifremgangsmåde til fremstilling af 1 alfa, 24(S}-dihydroxychole* calciferol eller 1alfa,24(R)-dihydroxycholeealciferol eller blandin* ger deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af det hidtil ukendte la,24(S)-dihydroxy-cholecalciferol eller la,24(R)-dihydroxycholecalciferol eller blandinger deraf med formlen 2 142410 (5)

X

HO^ OH

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at Ια,3β,24(S)-trihydroxycholes ta-5,7-dien, Ια, 3(3,24 (R)-trihydroxy-cholesta-5,7-dien og/eller blandinger eller derivater deraf med formlen o

OR

OR2 - (3) ΓΤ i 12 1

hvor R , R og RJ er ens eller forskellige og betyder et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe, som kan omdannes til et hydrogenatom uden ændring af strukturen af formlen (5), udsættes for bestråling med ultraviolet lys i et indifferent organisk opløsningsmiddel, hvorefter det dannede produkt isomeriseres, og når 1 2 T

R og/eller R og/eller R er forskellig fra hydrogen, produktet underkastes hydrolyse eller reducerende spaltning til fraspaltning af beskyttelsesgrupperne.

Formlen (5) omfatter la,24(S)-dihydroxycholecalciferol, der i det følgende betegnes la,24(S)-DHCC, med formlen 3 142410

OH

$ 8 (5-1) y

HO OH

og la,24(R)-dihydroxycholecalciferol, der i det følgende betegnes la,24(R)-DHCC, med formlen

OH

I (5-2) a

HO'' ^^'’^^OH

og en blanding af la,24(S)-epimeren med formlen (5-1) og la,24(R)--epimeren med formlen (5-2). Blandingen af la,24(S)-epimeren med" formlen (5-1) og la,24(R)-epimeren med formlen (5-2) i et vilkårligt forhold kan udtrykkes ved formlen 4 142410

OH

(5.3) y i r\

HO T0H

Udgangsmaterialerne for forbindelser med ovenstående formler (5), (5-1) og (5—2) har tilsvarende konstitution.

la,24(S)-DHCC, la,24(R)-DHCC og blandinger deraf har særdeles nyttig farmakologisk virkning som reguleringsmiddel for calciumstofskiftet i varmblodede dyr, og disse forbindelser har tillige en meget lavere toksicitet (LD^q) end la-hydroxychole-calciferol (Ια-HCC), der er en kendt analog af aktive former af vitamin , hvilket forklares nærmere i det følgende.

la-Hydroxycholecalciferol (ΐα-HCC) kan udtrykkes ved formlen J (B-l) I ^ 5 142410

De her omhandlede la,24-dihydroxycholecalciferoler med formlen (5) er hidtil ukendte forbindelser. I The Journal of Steroid Biochemistry, bind 5, nr. 4, juni 1974 - Fourth International Congress on Hormonal Steroids - Mexico City, 2.-7. september 1974, Abstracts of Papers Presented (publiceret 16. august 1974) anføres, at 24-hy-droxycholesterol (24-HC) med formlen

OH

/γθ—^ (B-2) 24,25-dihydroxycholesterol (24,25-DHC) med formlen

OH

/χίΛγ/- (B-3) og la-hydroxyderivaterne deraf kan omdannes til vitamin D derivater på konventionel måde. Ifølge ovennævnte litteratursted er det imidlertid kun forbindelser med formlen (B-2) og (B-3), der kunne omdannes til vitamin D derivater. Nærmere betegnet er det i ovennævnte litteratursted beskrevet, at der foretoges undersøgelser over omdannelsen af Ια-hydroxyderivateme af (B-2) til vitamin D derivater, og omdannelsen af Ια-hydroxyderivateme af (B-3) til vitamin D derivater er ikke omtalt. Ved den kendte teknik var det således ikke muligt at fremstille vitamin D derivater af cholecalciferoltypen ud fra disse la-hydroxy-derivater, hvilket forklares nærmere i det følgende.

6 142410

Fremstillingen af udgangsmaterialer forklares, mere detaljeret nedenfor.

[1] Første reaktionstrin: la,24-Dihydroxycholesterol, der i det følgende betegnes la,24-DHC, med formlen

OH

OH Χ^ΧΧ\.

I (2-a) fremstilles ved at omsætte la,2a-epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien--3-on, der i det følgende kaldes la,2a-epoxy, med formlen 0 ^ (1) med et alkalimetal og en protondonor i nærværelse af flydende ammoniak eller en flydende amin.

la,24-DHC udtrykt ved formlen (2-a) er en blanding af la,24(S)-dihydroxycholesterol[la,24(S)-DHC] og la,24(R)-dihydroxy-cholesterol [la, 24 (R)-DHC] i vilkårligt forhold, og ved fremgangsmåden ifølge ovennævnte første trin fås la,24-DHC i form af en blanding af (S)-epimeren og (R)-epimeren.

la,24-Epoxyforbindelsen med formlen (1) og la,24-DHC med formlen (2-a) er begge hidtil ukendte forbindelser.

142410

Som eksempler på flydende aminer, som kan anvendes i det første trin, kan nævnes primære, sekundære eller tertiære alkylaminer såsom methylamin, ethylamin, diethylamin eller triethylamin. Imidlertid foretrækkes det.at anvende flydende ammoniak. Selv om der ikke er særlige begrænsninger med hensyn til den flydende ammoniak foretrækkes det, at der fjernes vand i størst mulig udstrækning derfra, f.eks. ved destillation. En passende mængde flydende ammoniak eller flydende amin er 5-500 gange, især 10-200 gange vægten af la,2a-epoxy--24-ketoeholesta-4,6-dien-3-on.

Som eksempler på foretrukne alkalimetaller kan nævnes lithium, natrium og kalium. Især lithium er velegnet. Alkalimetallet anvendes i overskud med hensyn til la,2a-epoxyforbindelsen med formlen (l), f.eks. i en mængde på 5-250 gange (atomækvivalenter), især 10-200 gange mængden af lot,2a-epoxyforbindelsen med formlen (1).

Fortrinsvis anvendes et indifferent organisk opløsningsmiddel for la,2ct-epoxyforbindelsen med formlen (1), for at få reaktionen til at forløbe glat. Som eksempler på foretrukne opløsningsmidler kan nævnes ethere såsom ethylether, tetrahydrofuran, dioxan og 1,2-dimeth-oxyethan, aliphatiske carbonhydrider såsom ligroin, pentan, hexan, cyclohexan eller methyleyelohexan samt blandinger af to eller flere af disse opløsningsmidler.

Mængden af det organiske opløsningsmiddel svarer mindst til rumfanget af den anvendte flydende ammoniak, fortrinsvis 1-2 gange rumfanget af den flydende ammoniak.

Egnede protondonorer er ammoniumsalte såsom ammoniumsalte af organiske syrer og ammoniumsalte af uorganiske syrer. Som eksempler på ammoniumsaltene kan nævnes ammoniumchlorid, ammoniumbromid, ammo-niumcarbonat, ammoniumsulfat, ammoniumphosphat, ammoniumhydrogen-phosphat, ammoniumacetat, ammoniumformiat, ammoniumbenzoat, ammonium-benzensulfonat og ammonium-p-toluensulfonat. Blandt disse foretrækkes især ammoniumsaltene af uorganiske syrer såsom ammoniumchlorid. Øen anvendte mængde af ammoniumsaltet er mindst ækvimolær med det anvendte alkalimetal, og der anvendes fortrinsvis op til 10 gange molmsng-den af sidstnævnte.

Endvidere kan der som protondonorer anvendes lavere alkoholer såsom methanol, ethanol eller tert-butylalkohol.

8 142410

Tilsætningsmåden for reaktanterne er yderst vigtig ved udførelsen af det første reaktionstrin, og en af de følgende tre tilsætningsmåder kan med fordel anvendes.

(A) . la,2a-Epoxyforbindelsen sættes til en blanding indeholdende flydende ammoniak og alkalimetallet, hvorefter ammoniumsaltet tilsættes. På dette sted foretrækkes det at tilsætte ammoniumsaltet i to eller flere mindre portioner.

(B) En mindre mængde (helst en molmængde der er 0,7 gange mindre end molmsengden af det anvendte alkalimetal) af ammoniumsaltet sættes først til en blanding indeholdende den flydende ammoniak og alkalimetallet. la,2a-Epoxyforbindelsen sættes til dette system, hvorefter resten af ammoniumsaltet tilsættes.

(C) la,2a-Epoxyforbindelsen og ammoniumsaltet sætttes samtidig i små portioner til en blanding indeholdende den flydende ammoniak og alkalimetallet.

Blandt de ovenfor nævnte metoder foretrækkes især metode (A).

Reaktionstemperaturen er sædvanligvis fra -J0°C til tilbagesvalingstemperaturen for flydende ammoniak i reaktionssystemet.

Det er fordelagtigt efter tilsætning af hele mængden af protondonoren af lade reaktionen fortsætte, indtil overskuddet af alkalimetal er fuldstændig sønderdelt under tilbagesvaling af den flydende ammoniak. Dette kan give større udbytte af slutproduktet la,24~DHC.

la,2a-Epoxy-cholesta-4,6-dien-3-on med formlen kan omsættes med metallisk lithium og ammoniumchlorid i nærværelse af flydende ammoniak til dannelse af la-hydroxychole-sterol (la-HC) med formlen 9 142410 J:r^ (b"5) med henblik på fremstilling af Ια-hydroxycholecalciferol (b-1), jf. D.H.R. Barton et al., J. Am. Chem. Soc., 95, 2748, 1975.

Den anvendte la,2a-epoxyforbindelse er substitueret med en oxogruppe (=0) i 24-stillingen, og 4-trins reduktionsreaktionen af en sådan la,2a-epoxyforbindelse, dvs.

(1) reduktionen af carbonylgruppen i 24-stillingen (2) reduktionen af las,2a-epoxygruppen, (3) reduktion af 4,6-dienen til en 5-en, og (4) reduktionen af carbonylgruppen i 3-stilllngen forløber let i et enkelt reaktionstrin, når der anvendes foretrukne betingelser, hvorved la,24-dihydroxycholesterol (la,24--DHC) kan fremstilles i høje udbytter på f.eks. 60-75%.

[2] Fremstilling af la,2a-epoxyforbindelsen: la,2a-Epoxyforbindelsen med formlen (1), der anvendes som udgangsmateriale i det første reaktionstrin, kan let fremstilles, f.eks. ved nedenstående fremgangsmåde under anvendelse af udgangsmaterialet fucosterol med formlen » der findes i stor mængde i brunalger. Denne fremgangsmåde illustreres i det følgende: 10 142410

Fueosterol oxideres med ozon ved lave temperaturer, og det dannede ozonid reduceres med et eddikesyre/zink-system til dannelse af 24-ketocholesterol med formlen 0 /|] (A-2) — i et udbytte på ca. 60-75$· Den dannede 24-ketocholesterol oxideres, f.eks. med 2,3-dichlor-5,β-dicyanobenzoquinon (DDQ) under tilbagesvaling af f.eks. dioxan til dannelse af choløsta-l,4,6-trien-3,24--dion med formlen 0 (A-3) hvorpå dette oxidationsprodukt epoxideres ved stuetemperatur under alkaliske betingelser (pH-værdi = ca. 7j5-9) under anvendelse af f.eks. hydr ogenpe roxid.

Ved denne fremgangsmåde kan la,2a-epoxyforbindelsen med formlen (I) fremstilles i et udbytte på ca. 40-55% ud fra 24-ketocholesterolen med formlen (a-2).

Cholesta-l,4,6-trien-3,24-dionen med formlen (A-3) er en hidtil ukendt forbindelse.

Nar der som opløsningsmiddel ved ovennævnte epoxidations-reaktion anvendes en lavere alkohol såsom methanol, udfælder den dannede la,2a-epoxyforbindelse af det lavere alkoholopløsningsmiddel.

Den udfældede epoxyforbindelse kan isoleres fra reaktionsblandingen ved filtrering og anvendes direkte som udgangsmateriale i det første reaktions trin.

11 142410 r [3] Adskillelse af (S)- og(R)-epimere af la,24~DHC:

Som allerede nævnt fås lo,24-DHC forbindelsen med formlen (2) i det første reaktionstrin i form af en blanding af la,24(S)-DHC og la,24(R)-DHC.

Det er muligt at adskille (S)-epimeren fra (R)-epime-ren på enkel måde ved substitueret- eller usubstitueret-benzoyl-ering af hydroxylgrupperne i 3- og 24-stillingerne i la,24-DHC.

Med andre ord kan 1-stillingen i sig selv være en hydroxylgruppe eller beskyttet med en beskyttelsesgruppe, der kan omdannes dertil, for at gennemføre adskillelsen af (S)- og (R)-epimerene.

Substitueret- eller usubstitueret-benzoylering af 3~ og 24--stillingerne i la,24-DHC kan gennemføres ved at omsætte la,24-DHC med substitueret eller usubstitueret benzoylchlorid, f.eks. i et indifferent organisk opløsningsmiddel i nærværelse af en organisk base som syreacceptor. Denne reaktion er en konventionel reaktion, der er kendt som Schotten-Baumann-reaktionen. I ovennævnte reaktion kan anvendes en organisk base, f.eks. pyridin som det indifferente organiske opløsningsmiddel, og i dette tilfælde er anvendelsen af en syreacceptor ikke specielt påkrævet.

Substitueret- eller usubstitueret-benzoylering af 3- og 24--stillingeme i la,24-DHC kan gennemføres selektivt ved omsætning af la,24-DHC med substitueret eller usubstitueret benzoylchlorid, f.eks. i en pyridinopløsning ved lav temperatur, f.eks. -5 - 10°C, i passende tidsrum, f.eks. 10-24 timer. Hydroxylgruppen i 1-stillingen kan acyleres, f.eks. ved omsætning af en sterol, hvis hydroxylgrupper i 3- og 24-stillingeme i beskyttet, med et acylehlorid i en pyridinopløsning ved 0-50°C. Hydroxylgruppen i 1-stillingen kan trimethyl-silyleres, f.eks. ved at omsætte en sterol, hvis hydroxylgrupper i 3- og 24-stillingerne er beskyttet, med N-trimethylsilylimidazol i et pyridinopløsningsmiddel ved høj temperatur, f.eks. 50-110°C.

Ved gennemførelsen af den substituerede- eller usubstituerede--benzoylering af la,24-DHC ved højere temperaturer, f.eks. 15-100, fortrinsvis 30-8o°C, kan 1-, 3- og 24-stillingeme i la,24-DHC ben-zoyleres i ét trin.

Som eksempler på substituerede eller usubstituerede benzoyl-grupper kan nævnes benzoyl, p-brombenzoyl, 2,4-dibrombenzoyl, p-chlor-benzoyl og p-nitrobenzoyl. Blandt disse foretrækkes især benzoyl og p-brombenzoyl.

v 12 142410 1-Stillingen i la,24-DHC kan være substitueret med en hydroxyIgruppe. Som eksempler for beskyttelsesgrupper for denne hydroxylgruppe kan nævnes ovennævnte substituerede eller usubsti-tuerede benzoylgrupper, acylgrupper (organiske carboxylsyrerester) eller grupper, som kan danne en etherbinding. Som eksempler på acyl-grupperne kan nævnes acetyl, propanoyl, butanoyl, pentanoyl, ca-proyl, cyclohexanoyl, chloracetyl og bromacetyl. Som eksempler på beskyttelsesgrupper, der kan danne etherbindinger med hydroxylgrup-pen i 1-stillingen, kan nævnes tertiære butylgrupper, benzylgrup-per, triarylgrupper såsom triphenylmethylgruppen, tetrahydropyra-nylgrupper, methoxymethylgrupper eller en alkylsubstitueret silyl-gruppe såsom trimethylsilylgruppen.

Ovennævnte acylgrupper, herunder de substituerede eller usub-stituerede benzoylgrupper er de foretrukne beskyttelsesgrupper for hydroxylgruppen i 1-stillingen.

For at adskille la,24-DHC i (S)-epimeren og (R)-epimeren omdannes la,24-DHC med formlen (2-a) først til et benzoylderivat af la,24-DHC udtrykt ved formlen OR"21· f5 (2-») I^TT — hvor R"^ er en substitueret eller usubstitueret benzoyIgruppe, og

R

R^ er et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe, der kan omdannes til et hydrogenatom.

Dette benzoylderivat underkastes derpå chromatografi under anvendelse af et bæremateriale, som i hvert fald indeholder siliciumdi oxid, til adskillelse i en la,2^(S)-epimer og en la,22l-(R)-epimer.

Disse epimerforbindelser er ligeledes hidtil ukendte forbindelser.

Det siliciumdioxidholdige bærestof kan f.eks. være silicagel, kiselsyre, siliciumdioxid-aluminiumoxidgel, diatomejord eller kaolin. Silicagel, kiselsyre og siliciumdioxid-aluminiumoxidgel, der over- 13 142410 vejende består af siliciumdioxid, er særlig velegnet.

Chromatograferingen kan gennemføres i form af en vilkårlig egnet type chromatografi, f.eks. højtryksvæskechromatografi, tyndt-lagschromatografi eller søjlechromatografi. Til adskillelse i større målestok foretrækkes imidlertid søjlechromatografi. Søjlechromatogra-feringen gennemføres f.eks. under anvendelse af silicagel som bæremateriale og n-hexan, benzen, ethylacetat, methylenchlorid eller ether som fremkalderopløsningsmiddel til isolering af de epimere i ren form. Urene fraktioner kan underkastes gentagen søjlechromatografi eller underkastes fraktioneret krystallisation til fjernelse af små msaigder urenheder.

Fremkaldelseshastigheden for la,24(R)-DHC er stor, hvorimod fremkaldelseshastigheden for benzoylderivatet er lav.

/47 Andet reaktionstrin (syntese af 5,7-dienderivat):

Det i første reaktionstrin dannede la,24-DHC med formlen (2-a) omdannes til et beskyttet derivat af la,3(3,24-trihy-droxycholesta-5,7-dien, efter at hydrogenatomerne i hydroxylgrup-perne i 1-, 3- og 24-stillingerne er beskyttet med en beskyttelsesgruppe, eller efter adskillelse af la,24-DHC-benzoylderivatet med formlen (2-b) i la,24-(S)-epimeren og la,24(R)-epimeren, eller efter omdannelse af benzoylbeskyttelsesgrupperne il-, 3- og 24-stillingerne i formlen (2-a) til andre beskyttelsesgrupper, som kan omdannes til hydroxylgrupper.

Der kan således fremstilles mindst ét derivat valgt blandt beskyttede Ια,3β,24(S)-trihydroxycholesta-5,7-dienderivater og beskyttede Ια,3β,24(R)-trihydroxycholesta-5,7-dienderivater, der i det følgende kaldes 5,7-dienderivater, med formlen OR'6 f [ (3) ved at omsætte mindst ét derivat valgt blandt beskyttede derivater af la,24(S)-dihydroxycholesterol og beskyttede derivater af la,24(R)- l4 142410 -dihydroxycholesterol med formlen OR'6 (2) hvor R'^, R'^ og R'^ er ens eller forskellige og betyder en beskyttelsesgruppe, der kan omdannes til et hydrogenatom, uden at der sker ændringer i strukturen svarende til nedenstående formel (3) > med et allyIbromeringsmiddel i et indifferent organisk medium, hvorefter reaktionsmediet bringes i kontakt med et dehydrobromeringsmiddel.

Det er vigtigt, at hydroxylgruppeme i 1-, 3- og 24-stillin-geme i la,24-DHC og de epimere deraf med formlen (2) er beskyttede under det andet trin med dannelsen af ovennævnte 5>7-dienderivater. Såfremt det andet reaktionstrin gennemføres uden at disse tre hydroxyl-grupper i la,24-DHC er beskyttet, kan det ikke undgås, at der foregår oxidation og sønderdeling af hydroxylgruppeme, og udbyttet af de tilsigtede 5j7-clienderivater bliver meget lave.

Beskyttelsesgrupperne kan være vilkårlige beskyttelsesgrupper, som kan omdannes til en hydroxylgruppe i 1-, 3- og 24-stillingeme uden nedbrydning af cholesta-5,7-dien-skelettet efter omdannelse til 5*7-dienderivatet. I det følgende anføres eksempler på sådanne beskyttelsesgrupper.

(1) Aeylgrupper:

Cl-12 aH-Pkatiske eller aromatiske carboxylsyrerester eller nitro-, halogen- og alkoxysubstituerede derivater deraf, f.eks. acetyl, propanoyl, butanoyl, pentanoyl, eapronoyl, cyclohexanoyl, chloracetyl, bromacetyl, benzoyl, p-brombenzoyl, p-nitrobenzoyl, ethylbenzoyl og toluyl. Blandt disse grupper foretrækkes især acetyl, benzoyl og propanoyl.

(2) Grupper, som danner etherbindinger med hydroxylgruppen:

Tertiære butylgrupper, benzylgrupper, triarylmethylgrupper såsom triphenylmethylgruppen, tetrahydropyranylgrupper, methoxyme-thylgrupper og alkylsubstituerede silylgrupper såsom trimethylsilyl-gruppen. Blandt ovennævnte beskyttelsesgrupper foretrækkes især 15 r 142410 acylgruppeme (1), men opfindelsen er på ingen måde begrænset til disse grupper.

Allylbromeringsmidlet kan være en vilkårlig forbindelse, der almindeligvis anvendes til bromering af en allylstilling, og især foretrækkes det at anvende f.eks. N-bromsuccinimid, 1 ,j5-dibrom-5,5--dimethylhydantoin og N-bromcaprolactam. Sædvanligvis er den anvendte mængde allylbromeringsmiddel 1-2 ækvivalenter gange mængden af 5-enforbindelsen med formlen (2).

Ved denne fremgangsmåde omsættes først la,24- -DHC med formlen (2), fortrinsvis beskyttet la,24-DHC eller den beskyttede epimere deraf og allylbromeringsmidlet i et indifferent organisk medium. Hensigtsmæssigt gennemføres denne omsætning ved en temperatur på fra stuetemperatur på til l40°C.

Det indifferente organiske medium er et sådant, der ikke reagerer med bromeringsmidlet. Der kan med fordel anvendes f.eks. et carbonhydrid eller et halogeneret carbonhydrid Såsom hexan, heptan, cyclohexan, ligroin, benzen, toluen, xylen, brombenzen, ehlorbenzen, nitrobenzen, carbontetrachlorid, 1,2-dichlorethan eller 1,2-dibrom-ethan. Der kan også anvendes et etheropløsningsmiddel såsom ethyl-ether, tetrahydrofuran, dioxan, methyleellosolve eller phenylcello-solve. Disse indifferente organiske opløsningsmidler kan enten anvendes alene eller i indbyrdes blandinger.

Reaktionen forløber ved ovennævnte temperaturer. Om ønsket kan reaktionen gennemføres under bestråling med aetinisk lys med en bølgelængde i området fra infrarødt lys til ultraviolet lys. I dette tilfælde forløber reaktionen ved en temperatur vinder stuetemperatur.

Der kan tillige tilsættes en radikalinitiator såsom azobisisobutyro-nitril, benzoylperoxid eller cyclohexylhydroperoxid i små mængder.

Som dehydrobromeringsmiddel anvendes fortrinsvis trimethyl-phosphit, s-collidin eller diethylanilin eller blandinger deraf. Teoretisk forløber reaktionen helt til ende, når mængden af dehydrobro-meringsmidlet er ækvimolær med det bromerede produkt dannet ved ovennævnte bromeringsreaktion, men for at sikre hensigtsmæssige reaktionshastigheder og udbytter anvendes dehydrobromeringsmidlet fortrinsvis i en mængde på mindst ca. 2 gange molmængden af det bromerede produkt.

Da dehydrobromeringsmidlet tillige virker som et reaktionsmedium, er der ingen specifik øvre graoise for den anvendte msaagde deraf.

;i 'li? 16 142410 Sædvanligvis forløber reaktionen glat ved en temperatur på 80-250°C, fortrinsvis 120-l80°C. Reaktionstiden varierer afhængigt af typen af det anvendte dehydrobromeringsmiddel, reaktionsopløsningsmiddeltypen etc. Ved en foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden, hvor omsætningen gennemføres under tilbagesvaling i et xylen--s-eollidinsystem, er reaktionen f.eks. afsluttet i løbet af ca.

20 minutter.

Efter reaktionens afslutning afdestilleres opløsningsmidlet under formindsket tryk, hvorved det rå 5,7-dienderivat i form af en olie.

757 Tredje reaktionstrin (rensning af rå 5,7-dienderivat): Ια-Hydroxycholesterol (la-HC) med formlen

OH

} [ (B-5)

HO

kan fremstilles som anført ovenfor, jf. D.H.R. Barton et al., J.

Am. Chem. Soc., 95, 2748, 1973.

Endvidere kan Ια-hydroxycholesterol-(la-HC) omdannes til la,3P-diacetoxycholesta-5,7-dien med formlen OAc _ (B-6)

JxW 1 hvor Ac betyder CH^CO-, ved samme reaktion som i det andet trin af fremgangsmåden beskrevet ovenfor, og dette produkt underkastes termisk omlejring ved bestråling med ultraviolette stråler til omdannelse til la,33-diacetoxycholecalciferol (vitamin D-derivat) med formlen -) 17 142410 (B-l) s

IT

A cO"' OAc I forbindelse med den foreliggende opfindelse er det derfor blevet forsøgt at foretage termisk omlejring af 5,7-dienderivatet med formlen OR6 (3) som fås i det andet trin, ved direkte bestråling med ultraviolet lys ved den kendte fremgangsmåde ved syntesen af Ια,^ρ-diacetoxychole-calciferol med formlen (B-l), men det ønskede la,24-dihydroxychole-caleiferolderivat med formlen OR6 rn 18 142410 hvor R^, og R^ har de i forbindelse med formlen (2) angivne betydninger, kunne ikke isoleres.

Man antog, at årsagen hertil skyldtes, at 5,7-dienderivatet med formlen (3) ikke er ren og sandsynligvis indeholder et 4,6-dien-derivat med formlen OR6 OR5 ilj-1 (6) 4 5 6 i hvilken R , R og R har de ovenfor angivne betydninger. Det blev derfor forsøgt at rense det rå 5,7-dienderivat dannet og isoleret i det ovenfor beskrevne andet trin ved hjælp af kendt adsorptions-chromatografi under anvendelse af silicagel som adsorbent, dvs. tyndt-lagschromatografi eller søjleehromatografi, men ingen af disse chroma-tografiske fremgangsmåder kunne isolere 4,6-dienderivatet med formlen (6) fra det rå 5,7-dienderivat med formlen (3) ·

Det er kendt at anvende chromatografi under anvendelse af sølvnitrat til adskillelse og rensning af acetoxycholesta-5,7-diener, jf. Tetrahedron Letters, No. 40, 4147, 1972 og tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.400.931.

Det blev derfor forsøgt at anvende sølvnitratchromatografering på ovennævnte rå 5,7-dienderivat med formlen (3), idet det blev forsøgt at rense det rå 5 i7-dienderivat ved søjleehromatografi under anvendelse af 2% sølvnitrat-silicagel. Dette mislykkedes imidlertid, og det var ikke muligt at isolere 4,6-dienderivatet.

Det har vist sig, at det er muligt at rense det rå 5,7-dien-derivat og at den fri 5,7-dien udmærket kan isoleres fra den fri 4,6--dien og andre urenheder ved en chromatografisk fremgangsmåde, ved hvilken der foretages fraspaltning af beskyttelsesgruppen fra det rå 5,7-dienderivat med formlen (3) under omdannelse til la,3|3,24-tri-hydroxyeholesta-5,7-dien (den fri 5,7-dien) med formlen ' 4 i 19 ^2410

OH

-- ^"a) der bringes i kontakt irød et bærestof indeholdende siliciumdioxid, og hvorpå der adsorberes ikke-metallisk sølv.

Den her omhandlede rensningsproces kan ikke blot anvendes på det rå beskyttede 5,7-dienderivat dannet i det andet trin, men tillige på 5,7-dienderivatet i 25(S)-epimerfonrøn eller 5,7-dienderi-vatet i 24(R)-epimerformen. I alle tilfælde er det essentielt, at den rå forbindelse underkastes rensningsprocessen efter fraspalt-ning af beskyttelsesgrupperne il-, 3- og 24-stillingerne til omdannelse til den fri 5,7-dien med formlen (3-a).

Egnede bærematerialer indeholdende siliciumdioxid, og hvortil der er adsorberet ikke-metallisk sølv, er silicagel og silica--aluminiumoxid-gel, som indeholder eller hvortil der er fæstnet sølvnitrat. Silicagelen er særlig fordelagtig.

Denne silicagel kan f.eks. fremstilles ved at opløse sølvnitrat i vand eller et egnet organisk opløsningsmiddel såsom aceto-nitril eller en alkohol, hvorefter opløsningen blandes med silicagel, og derpå afdampes opløsningsmidlet fra blandingen. Når den skal anvendes til søjlechromatografi aktiveres den om ønsket og fyldes på en glassøjle. Når den skal anvendes til tyndtlagschromatografi inkorporeres et egnet fikseringsmiddel, f.eks. gips eller stivelse, i silicagelen, som er fremstillet på ovennævnte måde, og eventuelt sættes ligeledes et fluoresceringsmiddel, og blandingen udspredes på en egnet plade af glas eller polyesterfilm en tykkelse på 0,2-2 mm, hvorefter der fikseres og aktiveres.

For at imprægnere en tyndtlagschromatografiplade fremstillet af silicagel alene med sølvnitrat neddyppes pladen i en opløsning af sølvnitrat i et organisk opløsningsmiddel, f.eks. acetonitril eller en alkohol i en egnet koncentration, hvorefter der tørres og aktiveres .

20

14241 O

Den anvendte mængde sølvnitrat er hensigtsmæssigt 0,1-20 vægtprocent, beregnet på silicagel, fortrinsvis 0,5-10 vægtprocent. Når sølvnitratmængden bliver mindre end 0,1 vægtprocent eller større end 20 vægtprocent bliver adskillelsesevnen ringe.

I sidstnævnte tilfælde er der tale om spild af sølvnitrat.

Som eksempler på fremkalderopløsningsmidler eller eluerings-opløsningsmidler til tyndtlagschromatografi eller søjlechromatografi kan nævnes organiske opløsningsmidler såsom cyclohexan, n-hexan, benzen, toluen, chloroform, 1,2-dichlormethan, 1,2-dichlorethan, acetone, diethylether, tetrahydrofuran, ethylacetat, methanol, ethanol og propanol samt blandinger af disse. Særligt egnede er blandinger af letkogende opløsningsmidler såsom n-hexan, benzen, chloroform, acetone, ethylacetat eller methanol. Egnede blandingsforhold kan let bestemmes eksperimentelt.

Gennemførelsen af fremkaldelsen, elueringen og påvisningen kan foretages tilfredsstillende i overensstemmelse med konventionel chromatograferingsteknik.

Ved anvendelse af denne rensningsmetode har det vist sig, at det rå 5,7-dienderivat dannet i det andet trin indeholder 6-dienen i et vægtforhold på ea. 1/2 - 1/4, baseret på den rensede 5,7-dien.

En så stor maaagde af 4,6-dienen kan isoleres og fjernes praktisk taget fuldstændigt fra 5,7-dienen ved denne rensningsmetode.

Denne rensningsmetode gør det muligt let at fremstille ovennævnte fri 5,7-dien i stor renhed og højt udbytte, hvilket forklares nærmere i det følgende, hvilken 5,7-dien, enten som sådan eller efter beskyttelse af mindst én af hydroxylgruppeme i 1-, 3- og 24-stillingen med samme beskyttelsesgruppe som beskrevet ovenfor, kan omdannes til la,24-dihydroxycholecaleiferol eller dets beskyttede derivater ved bestråling med ultraviolet lys og efterfølgende omlejring (isomerisering).

Rensningsmetoden i det tredje trin af fremgangsmåden har derfor meget stor kommerciel værdi.

[6] Fremstilling af la,24(S)- og/eller la,24(R)-cholecalciferol.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bestråles mindst én af de fri 5,7-diener renset og isoleret i det tredje trin eller et derivat deraf fremkommet ved beskyttelse af mindst én af hydroxylgruppeme il-, 3- og 24-stillingerne i den fri 5,7-dien udtrykt ved formlen 21 142410 OR5

OR2 ,/\i/X

} _j D-b) ;

fjC I

12 3 hvor R , R og Br er ens eller forskellige og betyder et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe, som kan omdannes til et hydrogenatom uden at aandre strukturen svarende til formlen (5), 1 et indifferent organisk opløsningsmiddel, hvorefter det dannede produkt isomeriseres, og når R og/eller R og/eller R er forskellig fra hydrogen underkastes produktet hydrolyse eller reducerende spaltning til fraspaltning af beskyttelsesgrupperne.

Den fri 5,7-dien eller beskyttede derivater deraf med formlen (3-b) kan være la,2j3,24(S)-trihydroxycholesta-5,7-dien eller beskyttede derivater deraf, eller la,^,24(R)-trihydroxycholesta-5,7--dien eller beskyttede derivater deraf eller blandinger af disse i vilkårlige forhold, og de kan omdannes til la,24(S)-type, la,24(R)--type eller blandet type dihydroxycholecalciferol ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Når R1, R2 og/eller B? i formlerne (j-b) ag (5) repræsenterer beskyttelsesgrupper,kan det være den samme beskyttelsesgruppe som repræsenteret ved R'\ B'^ og/eller R'^ i formel (2). Den rensede la,5P,24-trihydroxycholesta-5,7-dien med formlen (3-a) kan omdannes til et beskyttet derivat deraf ved samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor i forbindelse med adskillelsen af la,24-DHC i de (S)-og (R)-epimere i ovenstående afsnit .

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ej: det imidlertid mere fordelagtigt at anvende en renset fri 5,7-dien, hvori alle 1 2 3 substituenterne R , R og R i formel (3-b) er hydrogenatomer, end beskyttede derivater deraf, la,24-Dihydroxycholecalciferol med formlen 22 142410

OH

__ (5-a) y Γ ho''" er en såkaldt analog af aktive former af vitamin D-^, tillader anvendelsen af renset fri 5,7-dien med formlen (3-b) den direkte fremstilling af den analoge af den aktive form af vitamin D^ med formlen (5-a). Når der på den anden side anvendes det beskyttede derivat med formlen (5-b), kræves der to ekstra trin til beskyttelse af hydroxyl-gruppeme i den rensede fri 5j7-dien og fraspaltning af beskyttelsesgrupperne i den dannede beskyttede la,24-dihydroxycholecalciferol.

Især involverer fraspaltningen af beskyttelsesgrupperne en delvis sønderdeling eller nedbrydning af la,24-dihydroxycholeealciferol.

Også af denne grund er rensningsprocessen i det tredje trin meget fordelagtig.

Den rensede 5,7-dien eller beskyttede derivater deraf med formlen (5-b), fortrinsvis renset fri 5,7-dien omdannes til la,24--dihydroxyeholecaleiferolen eller beskyttede derivater deraf med formlen (5) eller (5-a) ved først at udsætte den fri rensede 5,7--dien eller det beskyttede derivat deraf for ultraviolet bestråling i et indifferent organisk opløsningsmiddel. Den ultraviolette bestråling bar en bølgelængde i området ca. 200-360 nm, og ved den foreliggende opfindelse foretrækkes især bølgelængder i området 260-510 nm.

Som eksempler på anvendelige indifferente organiske opløsningsmidler kan nævnes carbonhydrider og halogenerede carbonhydri-der såsom hexan, heptan, cyclohexan, ligroin, benzen, toluen, xylen, brombenzen, chlorbenzen, nitrobenzen, carbontetraehlo-rid, 1,2-eycloethan eller 1,2-dibromethan, ethere såsom diethylether, tetrahydrofuran, dioxan, methylcellosolve eller phenylcellosolve samt alkoholer såsom methanol, ethanol, propanol, hexanol eller eyclo-hexanol. Især foretrækkes benzen, toluen, diethylether, methanol og i 23 142410 ethanol enten alene eller i Indbyrdes blandinger. Såfremt der anvendes et sådant opløsningsmiddel kan den efterfølgende Isomerlserlngs-reaktion gennemføres 1 samme opløsningsmiddel som den ultraviolette bestråling gennemføres i.

Egnede temperaturer for gennemførelsen af den ultraviolette bestråling ligger i området -20 - 80, især-10 - 20°C. Fortrinsvis foretages bestrålingen i en oxygenfri, indifferent atmosfære, f.eks. en argon- eller nitrogenatmosfære.

Det antages, at der som følge af den ultraviolette bestråling sker en spaltning af 9,10-stillingerne i 1α,3β,24-trihydroxy-cholesta-5,7-dien eller derivater deraf under dannelse af la,24-di-hydroxy-preeholecaleiferolderivat som hovedprodukt.

Isomeriseringen af precholecalciferolen giver la,24-di-hydroxycholecalciferolderivatet med formlen (5) eller (5-a).

Temperaturen under isomeriseringsreaktionen er ikke særlig vigtig af hensyn til forløbet af selve reaktionen.

Der dannes en ligevægt mellem la,24-dihydroxyprechole-calciferolderivatet og la,24-dihydroxycholecalciferolderivatet, der varierer afhængigt af temperaturen, og ved lave temperaturer er der en tendens til,at der findes en større mængde af sidstnævnte. Ved lavere temperaturer viser det sig imidlertid, at omdannelseshastigheden til sidstnævnte har tendens til at blive lavere. Temperaturen kan følgelig bestemmes under hensyntagen til ligevægtsværdien og omdannelseshastigheden. I denne henseende er temperaturen ikke særlig vigtig for forløbet af selve reaktionen.

Ved den aktuelle gennemførelse af fremgangsmåden tages der hensyn til disse faktorer, og der anvendes isomeriseringstemperaturer på 10-120, fortrinsvis 40-100°C.

Hensigtsmæssigt gennemføres isomeriseringen sædvanligvis i et indifferent organisk opløsningsmiddel. Hvis der anvendes samme foretrukne opløsningsmiddel som beskrevet ovenfor, kah dette også anvendes som opløsningsmiddel ved isomeriseringsreaktionen.

Der dannes således lct,24-dihydroxycholecaleiferol eller beskyttede derivater deraf med formlen (5-a) eller (5).

Når -beskyttelsesgruppen i det beskyttede derivat af la,24--dihydroxycholecaleiferol er en acylgruppe, kan denne fraspaltes ved deacylering, der omfatter fraspaltning i en alkalisk opløsning af en alkohol såsom methanol eller ethanol, eller reducerende spaltning med f.eks. LiAlH^ i et opløsningsmiddel såsom 24 142410 en ether. Deacyleringen gennemføres fortrinsvis ved en temperatur på -10-50°C.

Når· beskyttelsesgruppen danner en etherbinding med hydroxyl-gruppen, kan en del af den let· fjernes ved reduktion eller ved kontakt med en syre eller base.

Praspaltningen af beskyttelsesgrupperne gennemføres fortrinsvis direkte i den fremkomne reaktionsblanding.

Den således dannede la,24-dihydroxycholecalciferol kan isoleres og renses ved søjleehromatografi, præparativt tyndtlagschromatogra-fi, high speed væskechromatografi eller omkrystallisation. Det er ligeledes muligt at anvende chromatograféring under anvendelse af en bære indeholdende siliciumdioxid, hvortil der er adsorberet ikke-me-tallisk sølv som nævnt i forbindelse med rensningen af den rå 5>7-di-en, f.eks. silieagel indeholdende sølvnitrat. Ved at kombinere to eller flere af disse rensningsmetoder kan la,24-dihydroxyeholecalci-ferol isoleres i stor renhed.

la,24-Dihydroxycholecalciferol (la,24-DHCC) med formlen (5-a) fremstillet som beskrevet ovenfor, nærmere betegnet (1) la,24(S)-dihydroxycholecalciferol, (2) la,24(R)-dihydroxy-cholecalciferol eller (3) en blanding af dihydroxycholecalci-ferolerne (1) og (2) i vilkårlige forhold er hidtil ukendte forbindelser, som er vitamin analoge med udmærkede virkninger, og de har tillige lav toksicitet.

Det er kendt, at la,25-dihydroxycholecaleiferol (la,25-DHCC) og Ια-hydroxycholecalciferol (Ια-HCC) har udmærkede virkninger som analoge af aktive former af vitamin Dy Det er for nylig blevet erkendt, at Ια-HCC har meget høj toksicitet, og dets bivirkninger bliver .et problem ved vedvarende indtagelse. Der findes ingen tilgængelige data vedrørende toksiciteten af la,25-DHCC, men på baggrund af de forskellige tilgængelige kendsgerninger tyder det på, at det er mindst lige så toksisk som la-HCC.

På grund af la-HCC’s høje toksicitet er der behov for forbindelser med lavere toksicitet. Det har vist sig, at la,24,25-trihydroxy-cholecalciferol (la,24,25-THCC) in vivo har en rimelig selektiv, skønt ikke så kraftig,fremmende virkning på den intestinale calciumtransport. Hvis la,24-DHCC epimerblandingen, la,24(H)-DHCC og la,24(S)~DHCC (disse forbindelser vil i det følgende generisk blive betegnet som la,24-DHCC) yderligere metaboliseres in vivo vil la,24--DHCC højst sandsynlig blive omdannet til la,24,25-THCC. Dette antyder, at virkningen af la,24-DHCC epimerblandingen, la,24(R)-DHCC og 25 142410 la,24(S)-DHCC kan være selektiv. la,24-DHCC er en hidtil ukendt forbindelse, der endnu ikke er fundet in vivo, og det antages, at den har en helt ukendt virkning.

På baggrund af det ovenfor anførte er der foretaget sammenligning af virkningerne af de her omhandlede forbindelser og virkningerne af Ια-HCC, og det har vist sig, at de her omhandlede forbindelser har i det mindste ækvivalent virkning til Ια-HCC med hensyn til intestinal calciumtransport, deres virkning på knogleresorptionen er mindre end ca. en tredjedel af virkningen af Ια-HCC, og deres LD^q-værdier er mindre end ca. 1/10 af LD^Q-værdien for Ιά-HCC. Det har især vist sig, at la,24(S)-DHCC har en ganske svagere virkning med hensyn til at fremme den intestinale calciumtransport end la,24(R)-DHCC, men den fremkalder praktisk taget ingen knogleresorption.

la,24-DHCC kan således anvendes som et udmærket middel med formindskede bivirkninger og høj sikkerhed sammenlignet med de kendte analoge af aktive former af vitamin f.eks. mod sygdomme eller tilstande, som fremkaldes af anormal calciumstofskifte. Farmakologiske forsøg har vist, at forskellige optimale farmaceutiske præparater kan fremstilles alt efter de forskellige sygdomstilstande.

De farmakologiske forsøg har vist, at egnede doser af ovennævnte aktiverede vitamin D^ derivater ved klinisk anvendelse er ca.

0,04-0,4 ug (96,2 - 962 p mol) pr. kg legemsvægt.

De her omhandlede la,24-DHCC forbindelser med formlen (5-a) kan anvendes inden for forskellige kliniske og veterinære områder, og de er nyttige til behandling af anormalt calciumstofskifte og phosphor-stofskifte forårsaget af svigtende leverfunktion, svigtende nyrefunktion, svigtende mave-tarmkanalfunktion og svigtende biskjoldbruskkir-telfunktion samt beslægtede knoglesygdomme såsom vitamin D afhængig rakitis, nyreosteodystrofi, nedsat biskjoldbruskkirtelfunktion, osteoporosis, osteomalacia, Paget's sygdom, malabsorptionssyndromet, hypocalcemia fremkaldt af levercirrhosis, hypocalcemia fremkaldt af steatorrhoea, hypocalcemia fre nkaldt af vitamin D resistent rakitis.

Disse forbindelser antages at være mere sikre til medicinsk anvendelse end de kendte Ια-HCC og la,2f>-DHCC. Det er endvidere muligt at anvende et præparat indeholdende la,24(R)-DHCC og/eller la,24(S)-DHCC sammen med andre midler til regulering af calciummetabolismen. Eksempelvis kan de her omhandlede forbindelser anvendes til behandling af Paget’s sygdom i kombination med calcitonin.

1 Πι iiSS,8^j 26 142410

Forbindelserne kan passende indgives oralt, buccalt og paren-teralt (intramuskulært, subeutant, intravenøst og rectal 1). Som eksempler på dosisformer kan nævnes pressede tabletter, overtrukne tabletter, hårde og bløde elastiske gelatinekapsler, ethylalkoholopløsnin-ger, olieopløsninger og vandige suspensioner.

Opløsningsmidlet i olieopløsningeme kan være en vegetabilsk olie såsom majsolie, bomuldsfrøolie, kokosolie, mandelolie eller jordnøddeolie, en fiskeleverolie eller en olieagtig ester såsom ”Polysorbat 8o".

Til rectal indgift kan de her omhandlede forbindelser bringes på præparatform indeholdende et suppositoriegrundlag såsom kakaoolie eller andre triglycerider. For at forlænge holdbarheden kan præparatet indeholde en antioxidant såsom ascorbinsyre, butyleret hydroxyanisol eller hydroquinon.

Foderpræparater til husdyr indeholdende la,24-DHCC kan anvendes i sådanne maaigder, der ikke er toksiske, til at forebygge hypocalcemia hos køer i tiden op til og omkring kælvingen eller til forhindre hypocalcemia hos husdyr, som ikke tidligere har lidt deraf.

Når forbindelserne indgives til fjerkræ vinder ægproduktionen er det muligt at forhindre, at hønsene lægger æg med bløde skaller. Dette er et andet karakteristisk træk ved la,24-DHCC.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen og fremstillingen af udgangsmaterialer forklares nærmere i de følgende eksenqpler.

I eksemplerne anvendes følgende analysemetode til karakterisering af slutprodukterne:

Medmindre andet er anført er NMR-spektrene optaget på Varian EM 360 eller JEOL PS/PFT-100 (Nippon Electronics Co., Ltd.) i deutero-chloroform (CDCl^) vinder anvendelse af tetramethylsilan som indre standard.

Massespektrene og højopløsningsmassespektrene er optaget under anvendelse af et apparatur af typen "Shimadzu LKB-9000" fra firmaet Shimazu Seisakucho Co., Ltd.

UV-spektraene er optaget under anvendelse af typen "Hitachi EPS-3T" fra firmaet Hitachi Limited vinder anvendelse af en ethanol-opløsning.

Smeltepunkterne er bestemt ved hjælp af et smeltepunktsmikroskop, og værdierne er ikke korrigerede.

la,24-Dihydroxycholesterol's absolutte konfiguration bestemmes på følgende måde: 27 142410

En epimerblanding af 24,24-epoxycholesterol-5-benzoat, dvs. en blanding af

BzO

og hvor Bz betyder en benzoylgruppe, chromatograferes under anvendelse af silicagel som bærer til adskillelse og udvinding af de to epimere.

Hver enkelt af epimerene methanolyseres til dannelse af et 24-0H-derivat og et 25-OCH^-derivat. De to epimeres absolutte konfiguration bestemmes under anvendelse af den modificerede Horean-metode, der er beskrevet i Tetrahedron Letters 1, 15, 1975· Ved reduktion af de to epimere, hvis absolutte konfiguration således er blevet bestemt, med et AlCl^-LiAlH^-system, fås et 24(R)-hydroxyderivat ud fra 24(R),25--epoxyderivatet, og et 24(S)-hydroxyderivat ud fra 24(S),25-epoxy-derivatet. Da det er kendt, at sidstnævnte S-derivat er mere polært end R-derivatet antages det, at dette også gælder for la,24-dihydroxy-cholesterol. la,24-Dihydroxycholesterol omdannes derfor til tribenzoat-eller dibenzoatderivatet, som derpå ehromatograferes på en silicagel-søjle. En mere polær epimer omdannes således til et la,24(S)-derivat og en mindre polsar epimer omdannes til en la,24(R)-derivat.

Når der ikke udtrykkeligt refereres til et R-derivat eller et S-derivat, f.eks. når der blot angives la,24-DHCC, er dette en ækvimolær blanding af la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC.

28 142A10 På tegningen viser fig. 1 massespektret for la,24-dihydroxycholesterol, fig. 2 UV-spektret for Ια,3β,24-trihydroxycholesta-5,7-dien, fig. 3 massespektret for la/33,24-trihydroxycholesta-5,7- -dien, fig. 4 UV-spektret for la,24-dihydroxycholecalciferol, fig. 5 massespektret for la,24-dihydroxycholecalciferol, fig. 6 virkningen af la,24-dihydroxycholecalciferol, la-hydroxycholecalciferol og majsolie (kontrol) på Ca-absorp-tionen i knogler som funktion af tiden, og fig. 7 virkningen af la,24-dihydroxycholecalciferol, la,24(S)-dihydroxycholecalciferol, la,24(R)-dihydroxycholecal-ciferol, la-hydroxycholecalciferol og majsolie (kontrol) på ændringerne i legemsvægt som funktion af tiden.

Eksempel 1 (A) Fremstilling af la,2a-epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien--3-on (trin 1-3).

(1) Fremstilling af 24-ketocholesterol ud fra fucosterol: 4,1 g fucosterol opløses i 100 ml methylenchlorid, og medens opløsningen afkøles med en blanding af tør is og acetone til ca.

-20°C oxideres fucosterolen i 30 minutter med ozon ved en dannelses-hastighed på 0,86 g/time og i en koncentration på 17,2 g/nr (Og).

Efter reaktionen tilsættes 8 g zinkpulver og 200 ml eddikesyre, og det dannede ozonid underkastes reducerende spaltning ved stuetemperatur i 24 timer. Det dannede zinkacetat frafiltreres og vaskes med en vandig natriumcarbonatopløsning. Methylenchloridfasen isoleres og vaskes omhyggeligt med vand, hvorefter den tørres med vandfri natriumsulfat. Methylenchloridet inddampes under formindsket tryk, og de fremkomne hvide krystaller søjleehromatograferes, idet der anvendes silieagel som bærestof og en blanding af benzen og n-hexan som elueringsmiddel. Der fås 2,8 g 24-ketocholesterol i et udbytte på 70,3$.

(2) Fremstilling af 24-ketocholesta-l,4,6-trien-3-on ud fra 24-ke t ocholesterol; 4,0 g 24-ketocholesterol og "J,0 g 2,3-dichlor-5i6-dicyano-benzoquinon opløses i 140 ml dioxan, og opløsningen omrøres under tilbagesvaling i 27 timer. Efter endt omsætning afkøles reaktionsblandingen til stuetemperatur. Det dannede hydroquinonderivat frafil- 29 142410 treres og vaskes med JO ml dioxan. Filtratet og vaskevæsken kombineres, og dioxanet inddampes under formindsket tryk, hvorved fås en sortbrun olieagtig remanens.

Den olieagtige remanens isoleres og renses ved søjlechromato-grafi under anvendelse af aluminiumoxid som bærestof og en blanding af methylenchlorid og acetone som elueringsmiddel. Der fås 2,76 g 24-ketocholesta-l,4,6-trien-3-on i form af krystaller. Analyse af produktet giver følgende resultater.

NMR-spektrum: 0,86 (JH, s, C-18-CHj), 1,20 (JH, s, C-19-CH^), 1,15 (6H, d, J=10 Hz, 0-26,27-CH^), 5,95 - 6,10 (JH, m, C-4, 6, 7-H), 6,29 (IH, dd, J=ll, 15Hz, C-2-H), 7,10 (IH, J=ll Hz, C-l-H)

Molekylvægt (bestemt ved hjælp af gassemassspektret): 394 (M+) (3) Fremstilling af la,2a-epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on ud fra 24-ketoeholesta-l,4,6-trien-3-on: 3,53 g 24-ketocholesta-l,4,6-trien-3-on opløses i en blanding af 100 ml methanol, 20 ml tetrahydrofuran og 50 ml dioxan, og der tilsættes 1,6 ml af en 5 vægtprocentsopløsning af natriumhydroxid i methanol og 5 ml 30$'s vandig hydrogenperoxid. Omsætningen gennemføres ved stuetemperatur i 24 timer. Efter endt omsætning tilsættes en lille mængde eddikesyre til neutralisering af opløsningen til en pH-v»rdi på 7. Reaktionsblandingen ekstraheres derpå ved en blanding af vand og ether. Etherfasen vaskes omhyggeligt med vand og tørres omhyggeligt med vandig natriumsulfat. Etheren afdampes under formindsket tryk, og der fås 4,04 g lysegult fast stof. Det faste stof søjlechromato-graferes på en søjle af silicagel under anvendelse af en blanding af benzen og ether som elueringsmiddel, og der fås 2,52 g la,2a-epoxy--24-ketocholesta-4,6-dien-J-on med de nedenfor anførte data. Smeltepunkt: 150-151,5°C UV-spektrum: e^81101 291 nm ' ITIcLX.

Højopløsningsmassespektrum:

Fundet = 410.2793

Krævet (M+)=410.2821 (Cg^H^gO^) 30 1A2A 10 NMR-spektrum: 0,80 (3H, s, C-18-Hs), 1,15 (3H, s, C-19-Hs), 3,A3 (IH, dd, J=4Hz, J=l,5Hz, C-2-H) 3,60 (IH, d, J=4Hz, C-l-H), 5,68 (IH, d, J=l,5Hz, C-4-H) 6,10 (2H, s, C-6, C-7-Hs) (B) Fremstilling af la,24-dihydroxycholesterol.

10 ml flydende ammoniak tørret med metallisk natrium anbringes i en trehalset kolbe forsynet med tildrypningstragt og en tøriskøler, medens kolben afkøles med en blanding af acetone og tør is.

150 mg metallisk lithium sættes til den flydende ammoniak, og der omrøres i 10 minutter. Blandingen opløses i 15 ml tetrahydrofuran, hvorpå der i løbet af 10 minutter dråbevis tilsættes 100 mg 1α,2α--epoxy-24-ketoeholesta-4,6-dien-3-on.

Efter endt tilsætning fjernes kolben fra kølemediet, og ammoniakken tilbagesvales i 20 minutter. Derpå anbringes kolben igen i kølemediet, og i løbet af 2 timer tilsættes langsomt 1,5 g pulveriseret ammoniumchlorid, der er fuldstændig tørt. Kolben fjernes fra kølemediet, og reaktionen fortsættes under omrøring.

Omrøringen afbrydes, når opløsningens blå farve er fuldstændig forsvundet. Køleren fjernes fra kolben, og der tilføres nitrogengas til fjernelse af ammoniakken.

Til remanensen sættes 60 ml ethylacetat og 60 ml 1 N saltsyre, og der ekstraheres. Ethylacetatfasen isoleres og vaskes omhyggeligt med vand, tørres, hvorefter ethylacetat afdampes ved formindsket tryk. Remanensen opløses i 3 ml ethylacetat og chromatograferes på en søjle af silicagel, og der elueres med en blanding af benzen og acetone.

Der fås 6l mg renset produkt med følgende data: NMR-spektrum (i C^D^N), 5 (ppm): 0,70 (3H, s, 18-CH^), 0,99 (3H, s, 19-CH^), 3,28 (4H, m, 24-H og hydroxy H), 3,82 (IH, m, ljB-H), 4,00 (IH, m, 30-H), 5,50 (IH, m, 6-H)

Massespektrum (se fig. 1): 4l8 (M+), 400, 382 31 142410 Højopløsningsmassespektrum:

Pundet = 418.3428

Krævet, M+ (CgyH^O^) = 418.3449 På baggrund af ovenstående data kan det dannede produkt identificeres som la,24-dihydroxycholesterol.

Eksempel 2

Fremstilling af la,24-dihydroxycholesterol.

15 ml flydende ammoniak tørret med metallisk natrium anbringes afspærret i en trehalset kolbe forsynet med en tildrypnings-tragt og en tøriskøler, medens kolben afkøles med et kølemedium bestående af acetone og tøris. Derpå tilsættes 400 mg metallisk natrium, og der omrøres i 10 minutter. Blandingen opløses derpå i 18 ml tetrahydrofuran, og der tilsættes dråbevis i løbet af 10 minutter 100 mg la,2a-epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on.

Efter endt tilsætning tilsættes 1,8 g ammoniumchloridpulver i løbet af 1 time som beskrevet i eksempel 1. Reaktionsblandingen oparbejdes som beskrevet i eksempel 1, og der fås 69 mg (udbytte 68$) af et produkt, der har samme NMR-spektrum, massespektrum og højopløsningsmassespektrum som produktet fremstillet i eksempel 1. Produktet identificeres som la,2a-24-dihydroxycholesterol.

Eksempel 3 (A) Fremstilling af la,24-dihydroxycholesterol-tribenzoat 1,25 g la,24-dihydroxycholesterol blandes med 1,55 g benzoyl-chlorid og 20 ml pyridin, og der omsættes ved 40°C i 1 dag. Til reaktionsblandingen sættes 5 ml vand, og der ekstraheres med 50 ml diethyl-ether. Etherfasen vaskes med en syre og derpå med en base, tørres og inddampes til fjernelse af etheren, hvorved fås rå 1α,3βj24-tribenzoyl-oxycholest-5-en.

(B) Isolering af 24(R)-derivatet og 24(S)-derivatet af la,33,24-tribenzoyloxycholest-5-en_

En opløsning af 1,58 g af det rå la,3j3,24-tribenzoyloxy-cholest-5-en i n-hexan chromatograferes på en søjle indeholdende 100 g silicagel, og der opdeles i fraktioner, der hver har et rumfang på 50 ml. De enkelte fraktioners renhed bestemmes ved hjælp af højtryks-væskechromatografi, og de tilsvarende fraktioner kombineres, hvorefter opløsningsmidlet afdestilleres. Der fås to epimere med nedenstående NMR-spektre. 500 mg epimer med lav polaritet elueres på et tidligt 32 142Λ10 trin, og denne epimer er 24(R)-derivatet, og 490 mg af en epimer med større polaritet elueres hen mod afslutningen, og denne epimer er 24(S)-derivatet.

NMR-spektrum for la,^,24(R)-tribenzoyloxycholest-5-en: 0,65 (3H, s, C-l8), 0,92 (3H, s, C-21), 1,01 (6H, b, s, C-25, 26), 1.20 (5H, s, C-19), 5.00 (IH, m, C-24), 5.20 (IH, m, C-5), 5,44 (IH, m, C-l), 5,70 (IH, m, C-6), 7.5 (9H, m, benzoyl), 8.1 (6H, m, benzoyl) NMR-spektrum for la,5/3,24(D)-tribenzoyloxyeholest-5-en: 0,65 (3H, s, C-l8).

Øvrige spektraldata er de samme som for 24(R)-derivatet.

Eksempel 4 (A) Fremstilling af la,24-dihydroxycholesterol-dibenzoat 2.5 g la,24-dihydroxycholesterol blandes med 2,10 g benzoyl-chlorid og 40 ml pyridin, og blandingen henstilles i 1 dag ved 20°C.

Reaktionsblandingen oparbejdes som beskrevet i eksempel 5 (a), og der fås rå la-hydroxy-^,24-dibenzoyloxycholest-5-en.

(B) Adskillelse af 24(R)-derivatet og 24(S)-derivatet af la-hydroxy-5)3,24-dibenzoyloxycholest-5-en_ 2.1 g af det rå la-hydroxy-5P,24-dibenzoyloxyeholest-5-en ehromatograferes på en søjle indeholdende 30 g silicagel, og der elueres med en 200:l-blanding af benzen og ethylacetat, idet der opsamles fraktioner på 50 ml. De enkelte fraktioner underkastes højtryksvæske-ehromatografi til bestemmelse af renheden. Tilsvarende fraktioner kombineres, og opløsningsmidlet afdampes, hvorved fås de to epimere med følgende NMR-spektraldata.

En epimer med lav polaritet (500 mg, smp. l68-l69°C) er 24(R)-derivatet, og en epimer (600 mg, smp. Γ39,5-ΐ4θ,5°θ) med større polaritet er 24(S)-derivatet.

33 142410 NMR-spektrum for la,hydroxy-3j3,24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en: 0,67 (3H, s, C-l8) 0,96 (6H, b, s, C-19,21), 1,00 (6H, d, J=6Hz, 0-25,26), 3,96 (IH, m, C-l), 5,06 (1H, ra, C-24), 5,36, (IH, m, C-3), 5,71 (IH, m, C-6) , 7,52 (6η, m, benzoyl), 8,12 (4h, m, benzoyl) NMR-spektrum for la-hydroxy-3A,24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en: 0,70 (3H, s, C-l8) Øvrige spektraldata er de samme som for 24(s)-derivatet. Eksempel 5 (A) Fremstilling af la,3g,24-triaeetoxycholest-5-en: 300 mg la,24-dihydroxycholesterol omsættes med 40 ml eddike-syreanhydrid og 125 ml pyridin i 3 timer ved 95°C. Reaktionsblandingen oparbejdes som beskrevet i eksempel 3(A), hvorved fås rå 1α,3β,24--triacetoxycholest-5-en. Det rå produkt chromatograferes på en søjle af silicagel som bærestof og elueres med benzen, hvorved fås 325 mg renset la,3£,24-triacetoxycholest-5-en i form af et olieagtigt renset produkt med nedenstående NMR-spektrum og massespektrum.

NMR-spektrum: 0,67 (3H, s, C-l8), 2,02 (9H, s, 3-acetyl), 4,8 (2H, m, 3« og 24-H2), 5,05 (IH, m, 1β-Η), 5,65 (IH, m, 6-H)

Massespektrum: 484 (M+-CH^C00H), 424, 364.

(B) Fremstilling af la^i24-triacetoxycholesta-5,7-dien 300 mg la^,24-triacetoxycholest-5-en omsættes med 90 mg l,3-dibrom-5,5-dimethylhydantoin i 4,5 ml n-hexan under tilbagesvaling i 15 minutter. Reaktionsblandingen afkøles, og det dannede 5,5-dime-thylhydantoin og overskud af l,3-dibrom-5,5-dimethylhydantoin fjernes ved filtrering. Filtratet koncentreret -under formindsket tryk, 142410 34 hvorved fås 349 rag af en gult olieagtigt stof. Stoffet opløses 1 2,5 ml xylen. Den dannede opløsning sættes dråbevis i løbet af 15 minutter til en opløsning af 0,85' ml s-collidin i 1,9 ml xylen med en temperatur pj. 1β5°0, og omsætningen fortsættes i yderligere 10 minutter. Efter endt omsætning fjernes s-collidin, hydrobromidet ved filtrering, og s-collidinet og xylenet afdestilleres under formindsket tryk. Remanensen opløses i diethylether. Etherfasen vaskes med 1 N saltsyre og en 5$’s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og gentagne gange med vand. Derpå behandles den med aktivt kul, og etheren afdampes under formindsket tryk, hvorved fås 310 mg gult olieagtigt stof. Dette olieagtige stof adskilles omhyggeligt to gange ved søjlechromatografi på kiselsyre under anvendelse af benzen som elueringsmiddel, og der fås 69 mg (udbytte 23$) af et ikke-krystallinsk renset produkt.

Ud fra nedenstående spektraldata identificeres produktet som 1α,3β,24--triacetoxycholesta-5,7-dien.

UV-spektrum, Λ^*101 : 262, 271, 282, 294 NMR-spektrum: 2,02 og 2,04 (9H, s, CH^COO-), 4,75 (2H, b, 3a- og 24-H), 5,01 (IH, b, 1β-Η), 5,35 (IH, d, J=5,5Hz, 6 eller 7-H), 5,69 (IH, d, J=5,5Hz, 6 eller 7-H).

Massespektrum: 542 (M+)3 544, 482, 422, 362, 249, 204.

Eksempel 6

Fremstilling af lα,5β,24-triacetoxycholesta-5,7-dien 150 mg lα,3β,24-triacetoxycholest-5-en omsættes med 45 mg l,3-dibrom-5,'5-dimethylhydantoin i 3 ml n-hexan i 15 minutter under tilbagesvaling. Reaktionsblandingen afkøles, og de dannede krystaller frafiltreres. Filtratet koncentreres under formindsket tryk, hvorved fås et gult olieagtigt stof. Til dette stof sættes 1,3 ml xylen. Den fremkomne opløsning sættes dråbevis i løbet af ca. 15 minutter til en opløsning af 0,25 ml trimethylphosphit i 4 ml xylen under tilbage-svaling, og reaktionen gennemføres i yderligere 90 minutter. Reaktionsblandingen koncentreres derpå ved en temperatur på under 75°C, ] j „ 142410 j j J j ] .1 ,! 'j hvorved fås 148 mg olieagtigt stof. Dette stof behandles som beskrevet i i eksempel 5 (B). Slutproduktet udviser samme data for UV-spektret, ;| massespektret og NMR-spektret som den i eksenpel 5 (B) fremstillede \ la^^/24-triacetoxycholesta-5 ^6-dien. ;j i i

Eksempel 7 1

Fremstilling af la^,24-tribenzoyloxy-cholesta-5,7-dien ^ 200 mg lai30>24-tribenzoyloxy-cholest-5-en fremstillet på den i eksempel 5 (A) beskrevne måde opvarmes i 15 minutter under tilbagesvaling sammen med 55 mg N-bromsuccinimid i 15 ml carbontetraehlorid. Reaktionsblandingen afkøles, og de dannede krystaller frafiltreres.

Filtratet koncentreres, og til remanensen sættes 5 ml xylen til dannelse af en opløsning.

Den dannede opløsning sættes dråbevis i løbet af 15 minutter til en opløsning af 0,2 ml trimethylphosphit i 4 ml xylen under tilbagesvaling, og blandingen tilbagesvales i yderligere 90 minutter. 1

Reaktiansblandingen koncentreres derpå ved en temperatur under 75°C, og remanensen chromatograferes omhyggeligt to gange på en søjle indeholdende siliciumdioxid og under anvendelse af benzen som elue-ringsmiddel, hvorved der fås 50 mg (udbytte 25$) af et renset ikke--krystallinsk produkt. Produktet har nedenstående spektraldata og identificeres som la,3P>24-tribenzoyloxycholesta~5,7-dien.

UV-spektrum, Λ®^01 (nm)« 231, 262, 271, 282, 294 NMR-spektrum: 4,95 (2H, b, 3a-H og 24-H), 5,32 (2H, b, Ιβ-H og 6 eller 7-H9, 5,72 (IH, d, J=6Hz, 6 eller 6-H), 7,49 og 8,02 (15H, m, aromatisk H)

Massespektrum: 728 (M+), 638, 620, 606, 484, 362.

Eksempel 8

Fremstilling af la^,24(S)-triacetoxydholesta-5,7-dien lα-Hydroxy-3β,24(S)-dibenzoyloxy-cholest-5-en fremstillet på samme måde som beskrevet i eksempel 4 (B) reduceres med LiAlH^ i tør diethylether, hvorved fås 1α,3β,24(3)-^11ΐ70ΓθΧ7-οΙιο1β3^5-βη.

36 142410

Dette produkt (l80 mg) omsættes derpå med 24 ml eddikesyreanhydrid og 75 ml pyridin ved 95 °C i 3>5 timer. Produktet behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 5 (A), og der chromatograferes gennem en søjle indeholdende silicagel som bærestof, hvorved fås 195 mg la,^,24(S)-triaeetoxy-cholest-5-en.

150 mg af dette produkt renses på samme måde som beskrevet i eksempel 5, og der fås 43,5 mg (udbytte 29$) af et renset produkt med nedenstående spektraldata. Det rensede produkt identificeres som la,3^,24(S)-triacetoxycholesta-5,7-dien.

UV-spektrum, '! ®^ano1 (nm): 262, 271, 282, 294 NMR-spektrum: 2,02 og 2,04 (9H, S, CH^COO-), 4,75 (2H, b, c-3-, C-24-H), 5,01 (IH, b, c-l-h), 5,55 (IH, d, J=5-6Hz, C-6 eller 6-7-H), 5,69 (IH, d, J=5-éHz, c-6 eller C-7-H)

Massespektrum: 542 (M+), 514, 482, 422, 562, 249, 209

Eksempel 9

Fremstilling af la,3i3,24(S)-tribenzoylo:xy--cholesta-5,7-dien 100 mg la,^,24(S)-tribenzoyloxy-eholest-5-en fremstillet på den i eksempel 3 (B) beskrevne måde opvarmes under tilbagesvaling i 15 minutter sammen med 23 mg l,3-dibrom-5,5-dimethylhydantoin i 16 ml carbontetraehlorid. Reaktionsblandingen afkøles, og de dannede krystaller frafiltreres. Filtratet koncentratet, og til remanensen sættes 2,5 ml xylen. Den derved dannede opløsning dråbevis i løbet af 15 minutter til en opløsning under tilbagesvaling af 0,3 ml s-colli-din i 2 ml xylen, og der tilbagesvales i yderligere 10 minutter.

Efter endt omsætning frafiltreres s-collidin, hydrobromidet, og s-collidin og xylen afdampes ved formindsket tryk. Remanensen opløses i diethylether. Etherfasen vaskes med 1 N saltsyre og en 5$’s vandig natriumhydrogencarbonatopløsring, og derpå gentagne gange med vand. Etherfasen tørres derpå, hvorefter etheren afdampes under formindsket tryk, og der fås et gult olieagtigt stof.

142410 37

Det olieagtige stof chromatograferes omhyggeligt to gange gennem en søjle indeholdende siliciumdioxid og under anvendelse af benzen som elueringsmiddel, og der fås 28 mg (udbytte 28$) af et renset ikke-krystallinsk produkt. Produktet har nedenstående spektraldata og identificeres som la,3P,24(S)-tribenzoyloxycholesta-5,7-dien.

UV-spektrum, phenol (nm): 231, 262, 271, 282, 294 NMR-spektrum: 4,95 (2H, b, C-3 og C-24-Hs), 5,32 (2H, b, C-l og C-6 eller C-7-H), 5,72 (IH, d, J=6Hz, C-6 eller C-7-H), 7,49 og 8,02 (15H, m, aromatisk Hs),

Massespektrum: 728 (M+), 638, 620, 606, 484, 362.

Eksempel 10

Fremstilling af la-acetoxy-3|3-24 (S) -dibenzoyloxy-cholesta- _- 5,7-dien_ la-Hydroxy-3/3,24(S)-dibenzoyloxy-cholest-5-en fremstillet og isoleret på samme måde som beskrevet i eksempel 4(B) omsættes med ed-dikesyreanhydrid og pyrldin analogt med den i eksempel 5 (A) beskrevne fremgangsmåde. Reaktionsproduktet renses på samme måde som i eksempel 5, og der fås la-acetoxy-3jS,24(S)-dibenzoyloxy-cholest-5-en.

462 mg la-aeetoxy-3P,24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en omsættes med 188,6 mg N-bromsuccinimid i 16 ml carbontetrachlorid under tilbagesvaling i 30 minutter. Reaktionsblandingen afkøles, og de dannede krystaller frafiltreres. Filtratet koncentreres under formindsket tryk, hvorved fås et gult olieagtigt stof. Til stoffet sættes 6,8 ml xylen under dannelse af en opløsning. Opløsningen sættes dråbevis til en opløsning af 0,4 ml trimethylphosphit i 8 ml xylen under tilbagesvaling, og reaktionen fortsættes i yderligere 90 minutter. Efter endt reaktion koncentreres reaktionsblandingen under formindsket tryk, hvorved fås et olieagtigt produkt. Dette produkt udviser nedenstående spektraldata og identificeres som la-acetoxy-3A,24(S)-dibenzoyloxy--cholesta-5,7-dien.

UV-spektrum, \max (nm): 231, 262, 271, 282, 294 38 142410 NMR-spektrum; 2.04 (3H, s, CH^COO-) 4,7-5,4 (3H, m, 1β,3α og 24-H^) 5,33 (IH, d, J=6Hz , 6 eller 7-H) 5,70 (1H, d, J=oHz, 6 eller 7-H) 7.4 - 8,2 (10H, m, aromatisk Hs).

Eksempel 11

Fremstilling af 1α,5β,24(Β)-triacetoxy-cholesta-5,7-dien Ια-Hydroxy-5β,24-(R)-dibenzoyloxy-cholest-5-en fremstillet og isoleret på samme måde som beskrevet i eksempel 4 (B) behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 8. Det rensede produkt har helt samme UV-spektrum, NMR-spektrum og massespektrum som den tilsvarende S-epimer fremstillet i eksempel 8. Forbindelsen fås i et udbytte på 28$. Denne forbindelse identificeres som la,3/3,24(R)-triaeetoxy-cholesta--5,7-dien.

Eksempel 12

Fremstilling af la,^,24(R)-tribenzoyloxy-cholesta-5,7-dien la,^,24(R)-tribenzoyloxy-cholest-5-en fremstillet og isoleret på samme måde som i eksempel 3 (B) behandlet på samme måde som beskrevet i eksempel 9·

Der fås et renset produkt med helt samme UV-spektrum, NMR--spektrum og massespektrum som den tilsvarende S-epimere fremstillet i eksempel 9» i et udbytte på 27$. Dette produkt identificeres som la,5£,24(R)-tribenzoyloxy-cholesta-5-dien.

Eksempel 15

Fremstilling af la-acetoxy-^,24(R)-dibenzoyloxy-cholesta-'_-5,7-dien _ la-Hydroxy-3|3,24(R)-dibenzoyloxy-cholest-5-en fremstillet og isoleret på samme måde som beskrevet i eksempel 4 (B) behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 10.

Der fås et renset produkt med helt samme UV-spektrum og massespektrum som den tilsvarende S-epimer fremstillet i eksempel 10.

39 142A10

Dette produkt identificeres som la-acetoxy-53,24(R)-dibenzoyl-oxy-cholesta-5,7-dien.

Eksempel 14 (A) Fremstilling af la,53,24-triacetoxy~cholesta-5,7-dien ud fra la,3P,24-trlacetoxy-chole3t-5-en__

Analogt med den i eksempel 5 (B) beskrevne fremgangsmåde omsættes 1α,5β,24-triacetoxy-cholest-5-en med l,5“dibrom-5,5-dimethyl-hydantoin og s-collidin i n-hexan. Reaktionsproduktet vaskes med syre og base i ether og behandles med aktivt kul, hvorved fås en rå reaktionsblanding indeholdende la,53,24-triacetoxy-cholesta-5,7-dlen.

(B) Hydrolyse af la,;?3,24-triaeetoxy-cholesta-5,7“dien

Det rå produkt fremstillet ovenfor under (A) hydrolyseres i en methanolisk 5$'s kaliumhydroxidopløsning, hvorved fås en rå reaktionsblanding indeholdende la,33,24-trihydroxyeholesta-5,7-dien.

(C) Bestemmelse af renheden af la,53,24-trihydroxycholesta- -5 ,7-dien_ I UV-spektret for 100$ ren la,33,24-trihydroxycholesta-5,7-dien er Λ max^01 = nra> 1 UV-sPelct:re1: for 100$ ren la,33,24*tri-hydroxy-4,6-dien er = 240 nm. Undersøgelser har vist, at m σ.Λ blandingsforholdet mellem disse to forbindelser kan fastlægges ved sammenligning af ' „-værdierne.

mcwv

Forholdet mellem 5,7-dienderivatet og 4,6-dienderivatet i den under (B) ovenfor fremkomne rå reaktionsblanding bestemmes på denne måde, og det viser sig, at molforholdet mellem la,53,24-trihydroxy--cholesta-5,7-dien og la,J3,24-trihydroxycholesta-4,6-dien er ca. 3:1· (D) Isolering af la,53,24-trihydroxy;cholesta-5,7-dien og la,53,24-trlhydroxy-oholesta-4,6-dlen (trin 3)__ (D-l) Adskillelse ved præparativ tyndtlagschromatografi

En kommerciel tilgængelig plade til præparativ tyndtlags-chromatografi (silicagel, Merck Company, 20 cm x 20 em x 0,5 mm) ned-dyppes i en opløsning af sølvnitrat i acetonitril til imprægnering af pladen med ca. 1,5 vægtprocent sølvnitrat, hvorpå pladen varmebehandles ved 70°C i 2 timer. Den således fremstillede chromatografi-ske plade anvendes til den efterfølgende adskillelsesprocedure.

Den rå reaktionsblanding (50 mg) fremstillet ovenfor under (B) adsorberet på pladen og fremkaldes over ca. 20 cm med et 6$'s methanol--chloroform-blandingsopløsningsmiddel. Efter lufttørring af pladen 142410 40 fremkaldes reaktionsblandingen igen med samme opløsningsmiddel. Den udviser et bånd med en R^-værdi på ca. 0,23 og 1 bånd med en R^,-værdi på 0,33· Disse fraktioner sk-rabes af og ekstraheres med ethylaee-tat. Der fås 17,1 mg (57$) fast hvidt stof (Rf-værdi = 0,23) og 6,0 mg (20$) af et fast hvidt stof (R^-værdi =? 0,33).

En del af pladen farves under anvendelse af svovlsyre, og der konstateres et bånd med en Rf-værdi på ea. 0,38. Denne fraktion skrabes af og ekstraheres på samme måde som beskrevet ovenfor, hvorved fås ca. 1 mg fast stof.

Disse produkter har nedenstående spektraldata. Produktet med en R^.-vær di på 0,23 identificeres som la,3£>24-trihydroxy-cholesta--5,7-d.ien, produktet med en R^-værdi på 0,33 som la,3 β,24-1rihydroxy--cholesta-4,6-dien og produktet med en R^-værdi på 0,38 som la,24-di-hydroxy-cholesterol.

(1) Produkt med Rj,-værdi 0,23 (la,3Pj24-trihydroxy-cholesta- 5,7-dien) UV-spektrum (se fig. 2), '· (nm): . 262, 271 (e=ll,000) , 282 (e=12,000), 294 (e=7000) RMR-spektrum (i C^D^O): 0,63 (3H, s, 18-CH^), 3.30 (IH, m, 24-H), 3,70 (IH, m, 1β-Η), 4,08 (IH, m, 3a-H), 5.30 (IH, d, J=6Hz, 6 eller 7-H), 5,60 (IH, d, J=6Hz, 6 eller 7-H),

Massespektrum (se fig. 3): 416 (M+), 398, 380, 357, 251, 227, 197, 157 Smeltepunkt: 102-103°C.

(2) Produkt med R^-værdi = 0,33 (lα,3β,24-trihydroxy-cholesta--4,6-dien): UY-spektrum, (nm): 233, 240, 248 Massespektrum: 4l6 (M+), 398, 380 (3) Produkt med Rf-værdi = 0,38 (la,24-dihydroxycholesterol): Dette svarer til en standardprøve med R -værdi = 0,38.

(D-2) Adskillelse ved h.jælp af søjlechromatografi Kommercielt tilgængeligt silicagel til anvendelse ved søjlechromatografi ("C-200", Wako Jyunyaku Kogyo Kabushiki Kaisha) impræg- 4l 142410 neres med ca. 2 vægtprocent sølvnitrat ved hjælp af en sølvnitratopløsning, og der varmebehandles ved 70°C i 2 timer. Derpå pakkes silica-gelen i en glassøjle med en diameter på ca. 1 cm og en længde på 30 cm. 40 mg af den rå reaktionsblanding fremstillet ovenfor under (B) hældes på søjlen, og der elueres med et blandet opløsningsmiddel af benzen og ethylacetat. Der foretages opdeling i fraktioner hver på ca. 20 ml. Disse fraktioner adskilles, og der optages tyndtlagschromatogrammer og UV-spektret.

Når rumfangsforholdet mellem benzen og ethylacetat er 2:1 til 1:1 fås 7*6 mg (udbytte 19M af et produkt svarende til R^-værdien 0,35 i (D-l). Når forholdet er 1:1 fås 19,6 mg (49^) af et produkt svarende til Rf-værdien = 0,23.

Disse produkter identificeres ved hjælp af forskellige spektraldata.

Sammenligningseksempel 1

Dette eksempel illustrerer adskillelsen af la,3£>24-trihydroxy--cholesta-5,7-dien og la,30324-trihydroxy-cholesta-4,6-dien ved hjælp af et bæremateriale indeholdende carbondioxid med uden indhold af ikke-metallisk sølv.

30 mg af en blanding af la^,24-trihydroxy-cholesta-5,7-dien og la,3P,24-trihydroxy-cholesta-4,6-dien i molforholdet ~5:1, fremstillet på samme måde som beskrevet i eksempel 14 (A) og (B) og identificeret på samme måde som i eksempel 14 (C) chromatograferes på en søjle med en diameter på 1 cm og en lamgde på 30 cm under anvendelse af silicagel som bæremateriale i forsøg på at adskille blandingen i dens bestanddele.

Som fremkalder anvendes et blandet opløsningsmiddel af benzen og ethylacetat i forskellige blandingsrumfangsforhold fra 10:1 til 1:1, og udgangsblandingen opdeles i fraktioner med et rumfang på ca. 20 ml. Adskillelsen forsøges gennemført under optagelse af tyndtlagschromatogrammer og UV-spektre. Når blandingsforholdet mellem benzen og ethylacetat er ca. 2:1 begynder hovedkomponenten af strømme ud. Analyse af de enkelte fraktioner ved UV-spektroskopi viser, at i alle de analyserede fraktioner konstateres en absorption ved 283, 240, 248, 262, 27I3 282 og 294 nm. Det fremgår heraf, at når der anvendes silicagel som bæremateriale kan la,3P>24-trihydroxy-cholesta- 5,7-dien ikke adskilles fra la,3£j24-trihydroxy-cholesta-4,6-dien. Endvidere fremgår det, at der praktisk taget ikke er nogen forskel 42 142410 i sammensætningen af disse fraktioner, og molforholdet mellem 5,7-die-nen og 4,β-dienen forbliver ca. 3:1. (Se sammenligningseksempel 3 nedenfor).

Sammenligningseksempel 2

Dette eksempel illustrerer adskillelsen af 1α,3β,24-ίΓΐηοθ^ oxy-eholesta-5,7-dien og la,3£j24-triaceto:xycholesta-4,6-dien under anvendelse af et bæremateriale indeholdende siliciumdioxid, men uden indhold af ikke-metallisk sølv.

En blanding af la,3£>24-triacetoxy-eholesta-5,7-dien og lα,3β,24-triacetoχy-cholesta-4,β-dien i molforhold 3:1> hvilken blanding er fremstillet på samme måde som beskrevet i eksempel 14 (A) og identificeret på samme måde som i eksempel 14 (C), underkastes præparativ tyndtlagschromatografi under anvendlese af samme type plade som anvendt i eksempel 14 (D-l) og et silieagelbæremateriale behandlet med sølvnitrat (fremkalderopløsningsmiddel 0,4$ methanol-chloroform) . Ved UV-spektroskopi konstateres kun en plet med R^-værdi = ca. 0,4.

Denne fraktion isoleres, og der fås et olieagtigt stof, hvis UV-spektrum udviser absorption ved 233.> 240, 248, 262, 271, 282 og 294 nm.

Det er således ikke muligt at foretage adskillelse af 1α,3β,24--triacetoxy-cholesta-5,7-dien fra lα,3β,24-triacetoxy-cholesta-4,β-dien, selv om der anvendes silicagelholdig ikke-metallisk sølv som bæremateriale (jf. sammenligningseksempel 4).

Eksempel 15

Adskillelse af lα,3β,24(R)-trihydroxy-cholesta-5,7-dien og 1α,3β ,24(R).-trihydroxycholesta-4,6-dien_ la-*Hydroxy~3P,24(R)-dibenzoyloxy-cholest-5-en fremstillet og isoleret på samme måde som beskrevet i eksempel 4 (B) behandles på samme måde sojn beskrevet i eksempel 5 (A) til dannelse af la-acetoxy--3£,24(R)-dibenzoyloxy-eholest-5-en. Dette produkt behandles på samme måde som i eksempel 10, hvorved fås en rå reaktionsblanding indeholdende la-acetoxy-3£,24(R)-dibenzoyloxy-cholesta-5,7-dien. Den rå blanding hydrolyseres analogt med den i eksempel 14 (B) beskrevne fremgangsmåde og adskilles ved præparativ tyndtlagschromatografi som beskrevet under (D-l).

f _ 142410

Det viser sig, at reaktionsblandingen indeholdende la,30,24(R)--trihydroxy-cholesta-5,7-dien og la,33j24(R)-trihydroxy-cholesta-4,6--dien i raolforholdet ca. 3:1 klart adskilles i disse to bestanddele.

Produktet isoleres ud fra pletten baseret på la,2£>24(R)-tri-hydroxy-cholesta-5,7-dien har følgende data.

UV- spektrum, Λ^χ8ηθ1 (nm): 262, 271 (e=ll,000), 282 (11,800), 294 (7,000).

NMR-spektrum (C^DgO): 3,25 (IH, m, C-24-H), 368 (IH, m, 1|3-H) 4,10 (IH, m, 3a-H) 5,30 (IH, d, J=6Hz, 6 eller 7-h) 5,60 (1Η, d, J=6Hz, 6 eller 7-H)

Massespektrum:

416 (M+), 398, 380, 357, 251, 227, 197, 157 Smeltepunkt: 96-99°C

Eksempel 16

Adskillelse af la^,24(S)-trihydroxy-cholesta-5,7-dien og la,3 3,24(S)-trihydroxy-cholesta-4,6-dien_ la-Hydroxy-3A,24(S)-dibenzoyloxy-cholest-5-en fremstillet og isoleret på samme måde som i eksempel 4 (B) behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 5 (A) under dannelse af la-acetoxy-3£>24(S)--dibenzoyloxy-cholest-5-en. Dette produkt behandles på samme måde som i eksempel 10, hvorved fås en rå reaktionsblanding indeholdende la--acetoxy-3β,24(S)-dibenzoyl-cholesta-5,7-dien. Denne reaktionsblanding hydrolyseres analogt med den i eksempel 14 (B) beskrevne fremgangsmåde og adskilles ved præparativ tyndtlagschromatografi på samme måde som beskrevet ovenfor under (D-l).

Det viser sig, at ovennævnte rå reaktionsblanding indeholdende la,3P,24(S)-trihydroxy-cholesta-5,7-dien og la-3j3,24(S)-trihydroxy--cholesta-4,6-dien i molforholdet ca. 3=1 kan adskilles klart i bestanddelene .

Produktet isoleret fra pletten baseret på 1α,3β,24(3)-^1-hydroxy-cholesta-5,7-dien har følgende data: 44 142410 UV-spektrum, ^^1°1 (nm): 262, 271 (10,800), 282 (11,500), 294 (6,900) NMR-spektrum (1 C^D^O): 2,27 (IH, m, C-24-H), 2,67 (IH, m, 1β-Η), 4,10 (IH, m, 2a-H), 5,20 (IH, d, J=6 Hz, 6 eller 7-H), 5,60 (IH, d, J=6 Hz, 6 eller 7-H)

Massespektrum: 4l6 (M+), 298, 280, 257, 251, 227, 197, 157 Smeltepunkt: 120-124°C,

Eksempel 17

Fremstilling af lcii,24-dihydroxycholecalciferol 16 mg la,2^,24-trihydroxy-cholesta-5,7-Hion fremstillet og isoleret på samme måde som beskrevet i eksempel l4 (D-l) opløses i 500 ml diethylether, og deime opløsning bestråles med ultraviolet lys i 2,5 minutter ved 5°C i en argonatmosfære under anvendlese af en 200 watt højtrykskviksølvlampe ("654A-26", Hanovia Company). En del af opløsningen tages ud, og UV-spektret optages. Der konstateres en forøgelse i absorptionen ved 262-262 nm, hvilket antages at skyldes la,24-dihydroxy-pre-cholecaleiferol. Efter reaktionen afdampes etheren ved stuetemperatur under formindsket tryk. Til remanensen sættes 50 ml benzen, og isomeriseringen gennemføres i 2 timer under tilbagesvaling af benzenet.

Efter reaktionen er afsluttet afdampes benzenet under formindsket tryk, hvorved fås 16 mg fast hvidt stof. Dette produkt isoleres omhyggeligt ved præparativ tyndtlagschromatografi under anvendelse af silicagel indeholdende ca. 1,5$ sølvnitrat (fremstillet på samme måde som i eksempel 14 (D-l)) (fremkaldt to gange med 6% methanol-chloro-form). Der fås tre bånd, som kan bekræftes ved ultraviolet bestråling. Fra det mindst polære bånd isoleres 2,8 mg fast hvidt stof. Dette produkt har nedenstående egenskaber og identificeres som la,24-dihy.droxy· eholecalciferol.

UV-spektrum (fig. 4): /l®^31101 (nm) = 265 Λ ethanol (nm) „ 228 45 142410 NMR-spektrum (C^D^O): 0,57 (6H, d, 18-CH-j), 0,87 (bH, d, J=7Hz, 26- og 27-CH^), 0,96 (3H, d, J=5Hz, 21-CH^)^ 5,19 (IH, m, 24-H), 4,15 (IH, m, 1/3-H), 4,56 (IH, m, 3a-H), 4,85 (IH, b, s, 19-H), 5,50 (IH, b, s, 19-H), 6,05 (IH, d, JAB = 11Hz, 6 eller 7-H), 6,26 (IH, d, JAB = 11Hz, 6 eller 7-H),

Massespektrum (fig. 5)·’ 416 (M+), 598, 580, 269, 251, 134, Højopløsningsmassespektrum:

Fundet = 416.32768

Krævet, M+ (C^H^O^) = 416.32927

Smeltepunkt: 84-85°C.

Eksempel 18

Fremstilling af lot,24(R)-dihydroxycholecalclferol 10 mg la,3A,24(R)-trihydroxycholesta-5>7-dien fremstillet og isoleret analogt med den i eksempel 15 beskrevne fremgangsmåde opløses i 140 ml diethylether, og den fremkomne opløsning bestråles med ultraviolet lys ved 5°C i 2 minutter. Der udtages en prøve af opløsningen, og dens UV-spektrum optages. Der konstateres en forøgelse af absorptionen ved 262-263 nm, hvilket antages at skyldes precursoren. Efter endt reaktion afdampes etheren ved stuetemperatur under formindsket tryk. Til remanensen sættes 50 ml benzen, og isomeriseringen gennemføres i 2 timer i en atmosfære af argon under tilbagesvaling af benze net.

Efter endt reaktion oparbejdes reaktionsblandingen analogt med den i eksempel 17 beskrevne fremgangsmåde og der foretages isolering og rensning ved præparativ tyndtlagschromatografi. Fra båndet med lavest polaritet isoleres 1,8 mg hvidt fast stof. Produktet har nedenstående egenskaber og identificeres som la,24(R)-dihydroxy-ehole-calciferol.

UV-spektrum: (nm) = 265 ^ ethano! (nm) = 228 46 142410 NMR-spektrum (C^DgO): 0,59 (5H, s, 18-CHj), 0,87 (6h, d, J=7Hz, 26-·og 27-CH^) 5.20 (IH, m, 29-H), 4.14 (IH, m, 1β-Η), 4.42 (IH, m, 5a-H), 4.87 (IH, b, s, 19-H), 5.52 (IH, b, s, 19-H), 6.08 (IH, d, JAB = 11Hz, 6- eller 7-H), 6.50 (IH, d, JAB = 11Hz, 6- eller 7-H),

Massespektrum: 4l6 (M+), 598, 580, 269, 251 Højopløsningsmassespektrum:

Fundet = 416.55084

Krævet (M+) = 4l6.52927 (C^H^O^)

Eksempel 19

Fremstilling af la,24(S)-dihydroxycholecalciferol 15 mg lα,5β,24(S)-trihydroxy-cholesta-5,7-dien fremstillet og isoleret på samme måde som i eksempel 16 opløses i 140 ml diethyl-ether, og den dannede opløsning udsættes for ultraviolet bestråling i 2 minutter ved 5°C. Derpå oparbejdes reaktionsblandingen som beskrevet i eksempel 18, hvorved fås 2,8 mg fast hvidt stof. Dette produkt har nedenstående egenskaber og identificeres som la,24(S)-di-hydroxycholecaleiferol.

W-spektrum: (11111) = ^65 ASST01 (>“) -228 NMR-spektrum (i C^DgO): 0,58 (5H, s, 18-CH^), 0,87 (6H, d, J=7Hz, 26- og 27-CH^), 5.20 (IH, m, 24-H), 4.14 (IH, m, 1β-Η), 4.42 (IH, m, 5«-H), 4.87 (IH, b, s, 19-H), 5.52 (IH, b, s, 19-H), 6.08 (IH, d, Jab=11Hz, 6- eller 7-H), 6.50 (IH, d, Jab=11Hz, 6- eller 7-H),

Massespektrum: 4l6 (M+), 598, 580, 269, 251, 154.

47 142410 Højopløsningsmassespektrum:

Fundet = 416.55095

Krævet (M+) = 416.52927 (C^H^O^).

Eksempel 20 (A) Fremstilling af 1α,5β524-^ΐΕ0β^χ3τ·<2ϊιο1β8^5>7-<ϋθη ud fra la,5j3,24-trihydroxycholesta-5 ,7-dien_ 200 mg la,5β>24-trihydroxycholesta-5,7-dien fremstillet og isoleret som beskrevet i eksempel 14 (D-l) omsættes med 2 ml eddike-syreanhydrid og 5 ral pyridin ved 95°C i 5 timer. Reaktionsblandingen anbringes i isvand, og der ekstraheres med 4o ml diethylether. Ether-fasen vaskes med fortyndet saltsyre, derpå med base og derefter med vand, hvorefter der tørres. Etheren afdampes, hvorved fås 1α,5β,24-ίΓΐ-acetoxycholesta-5,7-dien i form af et let gulligt olieagtigt stof.

(B) Fremstilling af lα,24-diacetoxycholecalciferol-5β-acetat 50 mg la,24-diacetoxycholeealciferol-5A-acetat opløses i 500 ml diethylether. Den dannede opløsning udsættes for ultraviolet bestråling i en argonatmosfære ved 5°C i 4 minutter.

En del af denne opløsning udtages, og dens UV-spektrum opta ges. Der konstateres en forøgelse i absorptionen ved 262 til 265 nm, hvilket antages at skyldes precursoren. Efter endt reaktion fordampes etheren under formindsket tryk ved stuetemperatur. Til remanensen sættes 100 ml benzen, og isomeriSeringen gennemføres i 2 timer i en argonatmosfære under tilbagesvaling af benzenet. Efter endt omsætning afdampes størsteparten af benzenet under formindsket tryk, og til remanensen sættes 2 ml 5^'s kaliumhydroxidopløsning i methanol, 2 ml methanol og 2 ml benzen. Blandingen henstilles i 1 dag ved stuetemperatur til hydrolyse. Reaktionsproduktet fortyndes med vand og ekstraheres med ethylacetat. Ethylacetatfasen vaskes gentagne gange med vand og tørres. Ethylacetatet afdampes under formindsket tryk, hvorved fås 55 mg af et lysegult oliagtigt stof.

Dette stof isoleres og renses ved præparativt tyndtlagschroma-tografi under anvendelse af sølvnitratholdigt silicagel analogt med den i eksempel 17 beskrevne fremgangsmåde. Fra båndet med det mindst polære stof isoleres 5,7 mg fast stof. Da de forskellige spektre og egenskaber for dette produkt og den i eksempel 17 fremstillede 48 U241° Ια,24-dihydroxycholecalciferol stemmer fuldstændig overens identificeres produktet fremkommet efter isomerisering som la,24-diacetoxy-eholecaleiferol-3-acetat.

Eksempel 21 (A) Fremstilling af la,3£,24-tribenzoyloxycholesta-5,7-dien ud fra la,5fij24-trihydroxycholesta-5,7-dien._ 160 mg la,3£,24-trihydroxycholesta-5,7-dien fremstillet og isoleret analogt med den i eksempel 14 (D-l) beskrevne fremgangsmåde omsættes med 410 mg benzoylchlorid og 15 ml pyridin.

Reaktionsblandingen fortyndes med vand og ekstraheres med 40 ml diethylether. Etherfasen vaskes med fortyndet saltsyre, derpå med base og til sidst med vand, hvorefter den tørres. Étheren afdampes, hvorved fås la,5£i24-tribenzoyloxycholesta-5,7-dien i form af et hvidt amorft produkt.

(B) Fremstilling af la,24-dibenzoyloxycholeealciferol-3^-ben- zoat___ 50 mg la,5£i24-tribenzoyloxycholesta-5,7~dien opløses i 500 ml benzen, og den fremkomne opløsning udsættes for ultraviolet bestråling i en argonatmosfære ved 10°C i 2 minutter. Efter endt reaktion gennemføres Isomeriseringen i 2 timer i argonatmosfæren under tilbagesvaling af benzenet. Efter endt reaktion afdampes størsteparten af benzenet under formindsket tryk, og der tilsættes 2 ml 5$>'s kaliumhydroxid i methanol og 2 ml benzen. Blandingen holdes ved stuetemperatur i 28 timer i en argonatmosfære til gennemførelse af hydrolyse. Reaktionsproduktet fortyndes med vand og ekstraheres med ethylacetat. Ethylacetat-fasen vaskes gentagne gange med vand og tørres. Ethylacetatet fordampes under formindsket tryk. Remanensen oparbejdes analogt med den i eksempel 20 beskrevne fremgangsmåde, hvorved fås 1,9 mg la,24-dihydroxycholecalciferol med samme egenskaber som det i eksempel 20 fremstillede produkt.

På denne baggrund identificeres det efter3somerisationsreaktionen fremkomne produkt som la,24-dibenzoylcholecalciferol-3-benzoat.

Eksempel 22 (A) Fremstilling af la-hydroxy-3/3,24-dibenzoyloxycholesta-5,7--dien ud fra lq,5Pj24-trihydroxycholesta-5,7-dien_ 250 mg la,3j8,24-trihydroxycholesta-5,7-dien fremstillet analogt med den i eksempel 14 (D-l) beskrevne fremgangsmåde blandes med 210 mg benzoylchlorid og 5 ml pyridin, og blandingen henstilles ved 23°C i 1 dag. Den fremkomne reaktionsblanding oparbejdes analogt med den i eksempel 21 beskrevne fremgangsmåde, hvorved fås la-hydroxy-3β,24-di-benzoyloxycholesta-5,7-dien.

49 142410 (B) Fremstilling af la-hydroxy-24-benzoyloxycholecalciferol-2£-__-benzoat_ _ 20 mg la-hydroxy-3P,24-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien opløses i 500 ml diethylether. Opløsningen udsættes for ultraviolet bestråling, isomeriseres og hydrolyseres analogt med den i eksempel 21 (B) beskrevne fremgangsmåde, hvorved fås 1,9 mg la,24-dihydroxycholecalciferol, der har samme egenskaber som det ifølge eksempel 20 fremstillede produkt. Disse resultater bekræfter, at det ovenfor efter isomerisationen fremkomne produkt er la-hydroxy-24-benzoylcholecalciferol-3£-benzoat.

Eksempel 23

Fremstilling af la,24(R)-diaeetoxycholecalciferol-3£-acetat

Den i eksempel 15 fremstillede la,5|6>24(R)-trihydroxycholesta--5,7-dien acetyleres analogt med den i eksempel 20 (A) beskrevne fremgangsmåde, hvorved fås la,3£>24(R)-trihydroxycholesta-5,7-dien.

25 mg af dette produkt behandles analogt med den i eksempel 20 (B) beskrevne fremgangsmåde, bortset fra at bestrålingen med ultraviolet lys foretages i 2 minutter. Der fås 5Λ rag produkt, hvis egenskaber svarer til egenskaberne af la,24(R)-dihydroxycholecalciferol.

Dette resultat bekræfter, at det efter isomeriseringsreaktio-nen isolerede produkt er la,24(R)-diacetoxycholeealciferol-5P-acetat.

Eksempel 24

Fremstilling af la,24(R)-dibenzoyloxycholecalelferol-^-ben- _zoat _ _ la,3£,24(R)-trihydroxycholesta-5,7-dien benzoyleres analogt med den i eksempel 21 (A) beskrevne fremgangsmåde, hvorved fås la,^,24(R)-tribenzoyloxycholesta-5,7-dien. Dette produkt behandles analogt med den i eksempel 21 (B) beskrevne fremgangsmåde, bortset fra at der anvendes JO mg af dette produkt, og bestrålingen med ultraviolet lys gennemføres ved 12°C i 2 minutter. Der fås J,4 mg produkt', hvis egenskaber svarer til egenskaberne af lcx,24(R)-dihydroxycholecal-ciferol.

På baggrund af disse resultater identificeres produktet fremkommet efter isomeriseringen som la,24(R)-dibenzoyloxy-cholecalciferol--3β-benzoat.

50 142410

Eksempel 25

Fremstilling af la-hydroxy-24(R)-benzoyloxy-cholecaleiferol--_-33-benzoat_ laJ,3^i24(R)-tribydroxy-cholesta-5j7-dien benzoyleres analogt med den i eksempel 22 (A) beskrevne fremgangsmåde til la-hydroxy--3 β,24(R)-dibenzoyloxy-chole s ta-5,7-dien.

10 mg af dette produkt behandles analogt med den i eksempel 22 (B) beskrevne fremgangsmåde, hvorved fås 1,2 mg produkt, hvis egenskaber svarer til egenskaberne af la,24(R)-dihydroxycholeealciferol.

Dette resultat bekræfter, at det efter isomeriseringen fremkomne produkt er lα-hydroxy-24(R)-benzoyloxy-cholecaleiferol-3β-ben-zoat.

Eksempel 26

Fremstilling af lα,24(s)-diacetoxy-cholecalciferol-3β-aeetat

Den i eksempel 16 fremstillede lα,3β>24(S)-trihydroχycholesta--5,7-dien acetyleres analogt med den i eksempel 20 (A) beskrevne fremgangsmåde til la,3β,24(S)-trihydroxycholesta-5,7-dien. 20 mg af dette produkt behandles analogt med den i eksempel 23 beskrevne fremgangsmåde, hvorved fås 3A mg produkt, hvis egenskaber svarer til egenskaberne af la,24(S)-dihydroxycholeealciferol.

Dette resultat bekræfter, at det efter isomerisering fremkomne produkt er lα,24(S)-diacetoxycholecalciferol-3β-acetat.

Eksempel 27

Fremstilling af la-hydroxy-24(S)-benzoyloxy-eholecalciferol- _-3β-ύβηζοΒύ_

Den i eksempel 16 fremstillede lα,3β,24(S)-trihydroxycholesta--5*7-dien benzoyleres analogt med den i eksempel 22 (A) beskrevne fremgangsmåde til la-hydroxy-3β,24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien.

15 mg af dette produkt behandles analogt med den i eksempel 25 beskrevne fremgangsmåde, hvorved fås 1,5 mg produkt, hvis egenskaber svarer til egenskaberne af la,24(S)-dihydroxycholeealciferol. Dette resultat bekræfter, at det efter isomeriseringen fremkomne produkt er la-hydroxy--24(S)-benzoyloxycholecaleiferol-3β-benzoat.

Eksempel 28

Fremstilling af la-aeetoxy-24(S)-benzoyloxy-cholecalciferol- _-^β-benzoat _ lα-Hydroxy-3β,24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien fremstillet som beskrevet i eksempel 27 acetyleres analogt med den i eksempel 26 beskrevne fremgangsmåde til lα-acetoxy-3β,24(S)-dibenzoyloxycholesta--5,7-dien.

51 142410 15 mg af dette produkt behandles analogt med den 1 eksempel 26 beskrevne fremgangsmåde, bortset fra at bestrålingen med ultraviolet lys gennemføres ved 8°C i 1 minut. Der fås 1,5 mg produkt, hvis egenskaber svarer til egenskaberne af la,24(S)-dihydroxy-cholecalciferol.

Dette resultat bekræfter, at det efter isomerisering fremkomne produkt er la-acetoxy-24(S)-benzoyloxy-choleealciferol-^-benzoat.

Sammenligningseksempel 5

Fremstilling af la,24-dihydroxy-cholecalciferol ud fra 1α,3β,24--trihydroxycholesta-5,7-dien indeholdende la,^,24-trihydroxy-cholesta-4,6-dien__ 10 mg af en blanding af la,^,24-trihydroxy-cholesta-5>7-dien og la,^,24-trihydroxy~cholesta-4,6-dien i molforholdet ca. 3:1 fremstillet på samme måde som i sammenligningseksempel 1 opløses i 500 ml diethylether, og opløsningen bestråles med ultraviolet lys ved 5°C i 2 minutter. Efter omsætningen afdampes diethylether omhyggeligt ved formindsket tryk. Til remansen sættes 50 ml benzen, og isomeriseringen gennemføres i en argonatmosfære i 2 timer under tilbagesvaling af benzenet. Efter reaktionen afdampes benzenet, hvorved fås 10 mg af et brunt olieagtigt stof.

UV-spektret for dette produkt er kompliceret. Specielt mangler det en specifik absorption for la,24-dihydroxy-cholecalciferol , der har et absorptionsmaksimum ved 265 nm, og dannelsen af la,24-di-hydroxy-cholecalciferol kunne ikke bekræftes.

Dette resultat bekræftes ved at underkaste ovennævnte stof præparativ tyndtlagschromatografi under anvendelse af silieagel-bærestof med adsorberet sølvnitrat og sammenligne chromatogrammet med et chromatogram af en standardprøve af la,24-dihydroxycholecalci-ferol. Produktchromatogrammet har ikke en eneste plet tilfælles med standardprøvens chromatogram.

Det fremgår af ovenstående, at når la,30>24-trihydroxy-eholesta--5,7-dien foreligger i ringe renhed, dannes der slet intet 1α,3β,24~ -trihydroxycholecalciferol ved isomeriseringen under anvendelse af ultraviolet bestråling.

Sammenligningseksempel 4

Fremstilling af la,24-diacetoxy-cholecalciferol-5£-acetat ud fra la,^,24-triacetoxycholesta-5,7-dien indeholdende la,3jS,24--triacetoxycholesta-4,6-dien_ 10 mg af en blanding bestående af la,30,24-triacetoxy-cholesta--5,7-dien og la,3j3,24-triacetoxyoholesta-4,6-dien i molforholdet ca.

3:1 fremstillet på samme måde som i sammenligningseksempel 2 opløses 52 142410 1 500 ml diethylether, og opløsningen bestråles med ultraviolet lys ved 5°C i 2 minutter. Reaktionsblandingen bliver gulbrun. Efter reaktionen afdampes diethyletheren omhyggeligt under formindsket tryk.

Til remanensen sættes 50 ml benzen, og isomeriseringen gennemføres i 2 timer i en argonatmosfære under tilbagesvaling af benzenet. Efter reaktionen afdampes størsteparten af benzenet under formindsket tryk. Til remanensen sættes 1 ml 5%'s kaliumhydroxid i methanol, og blandingen henstilles ved stuetemperatur ved hydrolyse i 24 timer i en argonatmosfære. Efter reaktionen afdampes benzenet, og det fremkomne produkts W-spektrum optages. Produktet underkastes præparativ tyndt-lagschromatogram. De opnåede resultater stemmer helt overens med de i sammehligningseksempel 5 opnåede resultater, og der konstateres ingen dannelse af la,24-dihydroxycholeealciferol.

Eksempel A

la,24-Dihydroxycholecalciferols (la,24-DHCC) fremmende virkning på den intestinale calciumtransport_ (a) Sammenligning med la-hydroxycholecaleiferol (la-HCC).

Hanrotter af typen Wistar med en legemsvægt på ca. 200 g fastes natten over, hvorefter de oralt indgives 625 P mol af en opløsning af enten la,24-DHCC eller Ια-HCC i majsolie. Efter et forudbestemt tidsrum indgives oralt en opløsning af radioaktivt calciumchlo-rid (^Ca Cl2, 30 hCi/ml). Blodets indhold af radioaktivt stof måles over 10-60 minutter. Den målte maksimalværdi sættes som indeks for den intestinale ealciumabsorption.

Kontrolforsøg udføres med en gruppe rotter, der indgives majsolie alene i samme mængde. Dosis af majsolieopløsningen af la,24-DHCC eller Ια-HCC og af majsolie alene er 0,0125 ml pr. 100 g legemsvægt, og dosis af den vandige radioaktive caleiumchloridopløsning (pH 7,0) er 0,1 ml pr. 100 g legemsvægt pr. rotte.

Radioaktivitetsindholdet måles ved at anbringe 0,2 ml serum i et medicinglas, hvorpå der tilsættes 12 ml af en blanding indeholdende en scintillator (indeholdende 1200 ml toluen, 800 ml ethylcellosol-ve, 8 g 2,5-diphenyloxazol og 300 mg 2,2'-p-phenylen-bis(5-phenyloxa-zq1)), hvorefter radioaktiviteten bestemmes ved hjælp af en væskescin-tillationstæller. De opnåede resultater er anført nedenfor i tabel I.

53 142410

Tabel I

Tid efter Indgift lyttet. 1 serum (epm)

(timer)_ la,24-DHCC la-HCC

Kontrol 275 - 95 (4)K 275 * 95 (4) 4 560 ί 150 (4) 697 - 221 (4) 8 996 ί 80 (4) 1055 - 150 (4) 12 924 i 150 (4) 645 - 210 (4) 24 426 i 6l (4) 532 ί 28 (4) H Tallene i parenteserne angiver antallet af rotter i en bestemt gruppe.

Ovennævnte resultater viser, at la,24-DHCC har en næsten ækvivalent virkning i forhold til Ια-HCC med hensyn til at fremme den in-testinale calciumabsorption.

(b) Sammenligning af la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC.

Hanrotter af typen Wistar fastes natten over, hvorefter de oralt indgives 625 p mol af en opløsning af la,24(R)-DHCC eller la,24(S)-DHCC i majsolie. 8 timer efter indgivelsen aflives rotterne, og den intestinale calciumabsorption bestemmes ved metoden med den udkrængede mavesæk, jf. D.L. Martin og H.F. DeLuca, Amer. J. Physiol. 216, 1551 (1969).

De opnåede resultater er anført i nedenstående tabel II.

Tabel II

_ ^5Ca (S/M)

Kontrol 1,29 i 0,16 (4)K

la,24(R)-DHCC 5,86 - 1,98 (4) la,24(S)-DHCC 2,68 - 0,80 (4) K Antallet i parenteserne angiver antallet af rotter i en enkelt gruppe.

Forsøgsbetingelserne er som følger:

Anvendt tarmområde: duodenum, 7 cm Mængde af medium hælt i udkrænget duodenum: 0,7 ml

Det anvendte mediums sammensætning:

NaCl 125 mM

Fructose 10 mM

Tris-Cl-buffer 50 mM (pH = 7,4)

CaCl2 0,25 mM

^5CaCl2 10 pCi/liter 5 4 142410

Inkubationsbetingelser: 57°C, 90 minutter der gennemledes en gasblanding af 95$ 0^ og 5$ COg væskemængde anvendt til radioaktivitetsmåling: 0,1 ml De øvrige betingelser er de samme som ovenfor under (a).

De opnåede resultater viser, at la,24(R)-DHCC har en kraftigere aktiverende virkning på den intestinale ealeiumabsorption end la,24(S)-DHCC.

Eksempel B

Sammenligning af Ια-HCC, la,24-DHCC, la,24(R)-DHCG og la, 24(S)-DHCC med hensyn til den fremmende virkning på _den intestinale ealeiumabsorption._

Den anvendte forsøgsmetode er nøjagtig magen til den i eksempel A (b) anvendte. De opnåede resultater er anført i nedenstående tabel III.

Tabel III

_DoSls 125 P mol 625 P mol 5,125 Ρ mol

Kontrol 5,31 ± 0,12 (15)X

la-HCC 5,59 - 0,25 (4) 4,10 - 0,27 (4) 5,10 - 0,27 (4) la,24-DHCC 4,12 - 0,25 (4) 4,84 ± 0,52 (4) 5,47 - 0,55 (4) la,24(S)-DHCC 5,97 - 0,28 (4) 4,17 - 0,51 (4) 5,18 ± 0,20 (4) la,24(R)-DHCC 4,42 ± 0,41 (4) 5,95 - 0,55 (4) 5,84 - 0,59 (4) x Tallene i parenteserne angiver antallet af rotter i en enkelt gruppe.

De ovenfor i tabel III anførte resultater bekræfter forsøgsresultaterne opnået ifølge eksempel A. Med hensyn til den intestinale calciumabsorption er med andre ord la,24-DHCC en i det mindste ækvivalent virkning med Ια-HCC, og blanding la,24-DHCC, la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC gælder nedenstående relation for virkningsgraden med hensyn til aktiveringen af den intestinale calciumabsorption, la,24(R)-DHCC > la,24-DHCC > la,24(S)-DHCC

Eksempel C

Sammenligning af la,24-DHCC og Ια-HCC med hensyn til knogle-_absorptionsvirkning_

Hanrotter af typen Wistar, hver med en legemsvægt på ca.

150 g indgives subeutant en vandig opløsning af ^CaCl0 i en dosis ^ 45 pa 50 pCi pr. rotte og holdes i 6 uger. Det saledes indgivne ^Ca absorberes hurtigt, og i løbet af flere timer er en større del deraf 45 opsamlet i knoglerne. 5 uger senere bliver "Oa-indholdet i blodet 55 142410 konstant, og kun knoglerne udviste radioaktivt indhold. Dette bekræftes af en makroautoradiografisk analyse af hele legemet. Efter forløbet af de 6 uger indgives rotterne kontinuerligt oralt 1 gang om dagen en opløsning af 2,125 p mol af enten Ια-HCC eller la,24-DHCC. Blodprøver udtages med mellemrum, og indholdet af radioaktivitet i serumet måles ved hjælp af den i eksempel A (a) beskrevne metode.

En forøgelse af det radioaktive indhold i serumet sættes som indeks for knogleabsorptionsvirkningen. Kontrolgruppen indgives majsolie alene. Der anvendes fire rotter i hver forsøgsgruppe. De opnåede resultater fremgår af fig. 6 på tegningen. I fig. 6 angiver tegnet x en signifikant forskel i indholdet af radioaktivitet i serumet i forhold til kontrolgruppen. Det fremgår af de i fig. 6 viste resultater, at Ια-HCC bevirker en signifikant forøgelse af knogleabsorptionen 2 dage efter indgivelsens påbegyndelse, og denne tendens bliver kraftigere., med tiden. Derimod bevirker la,24-DHCC først en signifikant forøgelse af knogleabsorptionen efter 4 dage, hvorefter graden af forøgelse er meget mindre end med Ια-HCC (ca. 1/3 på den 8. dag). Dette resultat synes at vise, at la,24-DHCC har en svagere knogleabsorberende virkning end Ια-HCC, og det har lavere toksicitet.

Eksempel D

Sammenligning af virkningerne på knogleabsorptionen og søndringer i legemsvægt for Ια-HCC, la,24-DHCC, la,24(R)--DHCC og la,24(S)-DHCC._

Ovennævnte fire forbindelser anvendes ved et forsøg svarende til det i eksempel C udførte. Til forskel fra forsøget i eksempel 31 if er påbegyndes forsøget 3 uger efter indgivelsen af ^CaClg. Såvel radioaktivitetsindholdet i serumet som den totale calciumkoncentration i serumet måles. Til måling af calciumkoncentrationen anvendes et calciummålingsapparatur fra firmaet Iatron Company. De opnåede resultater er anført i nedenstående tabel IV og V.

56 142410

Tabel IV 45

Serum "Oa indhold

Tid _Serumradioaktivitet (cpm)_ (dage) 0579

Kontrol 699 -53,1 621 - 48,6 597-33,9 608 - 49,3 la-HCC 690 ί 39,4 1056 t 66,8 1184 ΐ 51,1 904 ί 57,1 la,24-DHCC 675 - 54,9 948 ί 64,6 700 t 32,8 66l ί 78,8 la,24(R)-DHCC 648 - 44,3 874 - 30,4 778 ± 26,9 681'- 63,7 la,24(S)-DHCC 780 i 43,5 539 - 45,2 520 ί 53,8 609 - 91,5

Tabel V

Serum Ca indhold

Tld(dage) _Serum ,Ca (mg/dl_ _ 0 5_7_9

Kontrol 11,4 - 0,32 10,0 - 0,29 11,1 - 0,22 10,6 ± 0,15 la-HCC 10,4 - 0,21 14,1 - 0,29 14,7 - 0,33 13,8 - 0,41 la,24-DHCC 11,7 - 0,26 12,9 - 0,l8 11,5 - 0,23 12,1 - 0,19 la,24(R)-DHCC 11,3-0,35 12,6 - 0,23 13,3 - 0,25 12,8 - 0,35 la,24(S)-DHCC 11,2+0,16 11,5-0,33 11,2.-0,29 11,5-0,24

De i tabel IV og V anførte resultater bekræfter de i eksempel C. opnåede resultater. Med andre ord viser disse resultater, at la,24--DHCC har en langt svagere knogleabsorberende virkning end la-HCC, og for la,24-DHCC, la,24(R)-DHCC og la,24(S)-DHCC gælder følgende relation med hensyn til knogleabsorptionsvirkningen: la,24(R)-DHCC > la,24-DHCC > la,24(S)-DHCC.

Det er især bemærkelsesværdigt, at der praktisk taget ikke konstateres nogen knogleabsorberende virkning med la,24(S)-DHCC, og virkningen deraf er nærmest ækvivalent med den i kontrolgruppen opnåede. Dette viser, at la,24(S)-DHCC har en specifik fremmende virkning på den intestinale calciumabsorption, hvilket antages at have meget stor betydning ved de kliniske anvendelser.

De ved dette forsøg konstaterede søndringer i legemsvægten fremgår af fig. 7 på tegningen. Det er interessant, at la,24-DHCC bevirker en mindre ændring i legemsvægten end la-HCC, og især la,24(S)-DHCC udviser ringe forskel fra kontrolgruppen. Som det også er tilfældet ved knogleabsorptionen antyder dette, at toksiciteten af la,24-DHCC er mindre end toksiciteten af la-HCC.

57 142410

Eksempel E

Sammenligning af la,24-DHCC og Ια-HCC med hensyn til toksicitet.

Toksiciteten for de to ovennævnte forbindelser bestemmes på kendt måde. Resultaterne fremgår af nedenstående tabel VI.

Tabel VI

_LD5q (lig/kg)_ Λ

Art Køn Indgiftsmåde Ια-HCC la,24-DHCC

Mus han Per os 474 >2500 hun 508 han Intravenøst 167 55.000 - 5200 hun 100 5500 - 1000

Rotte han Per os 55° hun ?44

Det fremgår klart af tabel VI, at toksiciteten af la,24-DHCC er 1/10 eller mindre end toksiciteten af Ια-HCC. Dette resultat bekræftes af de i eksempel C og D opnåede resultater.

På basis af de i eksempel A til E opnåede resultater sammenlignes la,24-DHCC med Ια-HCC som vist i tabel VII, Ved denne opstilling er aktiviteten for Ια-HCC sat til 1.

Tabel VII

la,24-DHCC la-HCC

Virkning af frem- , , mende intestinal 1 1 calciumabsorption

Knogleabsorbe- , rende virkning > l/5 1

Akut toksicitet >1/10 1

Det fremgår af ovenstående, at la,24-DHCC selektivt fremmer den intestinale calciumabsorption og udviser en svag knogleabsorberende virkning sammenlignet med de kendte analoge af aktive former af vitamin D^. la,24-DHCC antages derfor at være særdeles anvendelig som medicin, som kan anvendes med meget få bivirkninger til behandling af sygdomme eller tilstande fremkaldt af anormal calciumstofskifte. Især er la,24(S)-DHCC et meget lovende stof i denne henseende, og det forventes at få udbredt anvendelse.