DE2526981A1 - 1alpha,24-dihydroxycholecalciferol- derivate und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann · Dr. R. Xcenigsbergei-Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.

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53/My

Case F3060-K416 (Teijin)/HO

TEIJIN LIMITED
Osaka / Japan

1 α,24-Dihydroxycholecalciferol-Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft neue 1 α,24-Dihydroxycholecalciferole, Derivate davon, neue Vorstufen davon und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Mittel für Warmblüter, . die eine pharmazeutisch wirksame Menge der neuen 1oc, 24-Dihydroxycholecalcif erole enthalten, und ein Verfahren, um den Calcium-Metabolismus von Warmblütern . ' zu regulieren, bei dem eine pharmazeutisch wirksame Menge von 1 α,24-Dihydroxycholecalciferol verabreicht wird.

Die neuen 1a,24-Dihydroxycholecalciferole und Derivate davon werden durch die folgende Formel

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(5)

dargestellt, worin

R₁, R₂ und R, gleich oder unterschiedlich sein können und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, bedeuten.

Die allgemeine Formel (5) stellt allgemein Ioc,24-(S)-Dihydroxycholecalciferol und seine Derivate (das als 1 a,24(S)-DHCC und seine Derivate bezeichnet werden) der folgenden Formel

OR,

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dar, worin R₁, Rp und R^ die gleiche Bedeutung wie oben gegeben besitzen, 1a,24(R)-Dihydroxycholecalciferol und seine Derivate (das als 1 a,24(R)-DHCC und seine Derivate bezeichnet werden) der folgenden Formel

(5-2)

worin R^, R₂ und R, die gleiche Bedeutung wie oben gegeben besitzen, und eine Mischung aus ioc,24(S)-Epimer der Formel (5-1) und 1a,24(R)-Epimer der Formel (5-2).

In der vorliegenden Anmeldung wird die obige Mischung aus dem 1oc,24(S)-Epimer der Formel (5-1) und dem 1oc,24(R)-Epimer der Formel (5-2) in beliebigem Verhältnis durch die folgende Formel

(5-3).

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ausgedrückt. In anderen Worten wird -OR, in der 24-Stellung durch

dargestellt.

Die gleiche Darstellung wie in den obigen Formeln (5), (5-1) und (5-2) wird verwendet, um die Vorstufen für diese Verbindungen darzustellen.

Von den 1oc,24-Dihydroxycholecalciferolen und seinen Derivaten der Formel (5) besitzen 1cc,24-Dihydroxycholecalciferole der Formel

(5-a)

• OH

die nützlichsten pharmakologischen Wirkungen, wie die Anmelderin festgestellt hat.

Die Ioc,24-Dihydroxycholecalciferole der Formel (5-a) bedeuten ebenfalls (i) 1a,24(S)-Dihydroxycholecalciferol [ioc,24(S)-DHCC], (ii) 1cc,24(R)-DihydrQxycholecalciferol [1a,24(R)-DHCC]

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und (iii) eine Mischling aus 1a,24(S)-DHCC und 1a,24(i$-DHCC (1a,24-DHCC epimere Mischung).

Wie im folgenden in ausführlichen Tierversuchen erläutert wird, zeigen das 1 a,24(S)-DHCC allein, das 1a,24(R)-DHCC allein und Mischung davon eine sehr wertvolle pharmakologische Aktivität, um den Calcium-Metabolismus von Warmblütern zu regulieren, und sie besitzen eine wesentlich niedrigere Toxizität (I£>5(0 als 1 a-Hydroxycholecalciferol (Ia-HCC), welches ein zu aktiven Formen des Vitamins D, bekanntes Analoges ist.

Das 1a-Hydroxycholecalciferol (Ia-HCC) wird durch die folgende Formel

H0^x

(B-I)

dargestellt.

Soweit der Anmelderin bekannt ist, wurde über die 1a,24-Dihydroxycholecalciferole noch nicht berichtet, die einzige Ausnahme ist eine Arbeit der Erfinder der vorliegenden Anmeldung in The Journal of Steroid Biochemistry, Band 5, Nr. 4, Juni 1974, Fourth International Congress on Hormonal Steroids, Mexico-City, 2. bi:; 7. iJoptember 1974, Abstracts of Papers Presented (t^t.-^ohlich publiziert am 16. August 1974). In dieser Arbeit v/ir-'J ;j η;-'/--//er,<: η, rlaß 24-Hydroxycholesterin (24-HC) der

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(B-2)

24,15-Dihydroxycholesterin (24,25-DHC) der folgenden Formel

(B-3)

und deren 1α-Hydroxyderivate in Vitarain D-Derivate nach bekannten, üblichen Verfahren überführt werden können. Es sind jedoch nur die Verbindungen der Formel (B-2) und (B-3)_t die damals in Vitamin D-Derivate überführt werden konnten. Dementsprechend ist es seit dem oben erwähnten Kongress in Mexico-City nur bekannt, daß die Umwandlung von 1 oc-Hydroxyderiva-ten der Formel (B-2) in Vitamin D-Derivate noch untersucht wurde, und auf dem Kongress wurde nicht über die Umwandlung der 1 α-Hydroxyderivate der Formel (B-3) in Vitamin D-Derivate berichtet. Nach den damaligen Arbeiten der Anmelderin und ihren folgenden Untersuchungen war es nicht möglich, mit den Verfahren, die vor der Einreichung der vorliegenden Anmeldung bzw. vor dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung bekannt waren, Vitamin D-Derivate des Cholecalciferol-Typs aus diesen Derivaten herzustellen, wie im folgenden näher erläutert wird. Der Anmelderin gelang es jetzt jedoch, eine Gruppe von neuen ia-24-Dihydroxycholecalciferolen und deren Derivaten der Formel (5)

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und bevorzugt der Formel (5-a) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das im folgenden näher erläutert wird, zu synthetisieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden in Einzelheiten beschrieben.

(1) Erste Reaktionsstufe

Erfindungsgemäß wird 1α-24-Dihydroxycholesterin (das als 1a-24-DHC bezeichnet wird) der folgenden Formel (2-a)

OH

(2-a)

durch Umsetzung von ioc,2cc-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on (das als Ia,2a-Epoxy bezeichnet wird) der folgenden Formel

(D

mit einem Alkalimetall und einem Protondonor in Anwesenheit von flüssigem Ammoniak oder einem flüssigen Amin hergestellt.

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10C-24-DHC, das durch die Formel (2-a) dargestellt wird, bedeutet eine Mischung aus 1a-24(S)-Dihydroxycholesterin [ioc-24(S)-DHC] und 1oc-24(R)-Dihydroxycholesterin [ia-24(R)-DHC] in beliebigen Verhältnissen, und gemäß dem Verfahren der ersten Stufe oben wird 1oc-24-DHC als Mischung aus (S)-Epimer und (R)-Epimer erhalten.

Soweit der Anmelderin bekannt ist, sind ia-24-Epoxy der Formel (1) und 1<x-24-DHC der Formel (2-a) beide neue Verbindungen, die in der Literatur nicht beschrieben werden, sondern die erstmals von der Anmelderin synthetisiert wurden.

Das obige 1<x-24-DHC kann in eine Gruppe von ia-24-DHCC und seinen Derivaten der Formel (5), insbesondere der Formel (5-a), nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das näher erläutert wird, überführt werden. Zusätzlich sind diese Verbindungen wertvolle Zwischenprodukte für andere Steroide, die physiologische Aktivitäten besitzen, beispielsweise Zwischenprodukte für die Synthese von 1<x-24,25-Trihydroxycholecalciferol, welches eine aktive Form von Vitamin D, ist.

Beispiele von flüssigen Aminen, die bei der ersten Stufe verwendet werden können, sind primäre, sekundäre oder tertiäre Alkylamine wie Methylamin, Äthylamin, Diäthylamin oder Triäthylamin. Die Verwendung von flüssigem Ammoniak ist jedoch bevorzugt. Obgleich im Hinblick auf den flüssigen Ammoniak keine besondere Beschränkung besteht, ist es bevorzugt, ihn beispielsweise durch Destillation zu behandeln, um das Wasser daraus so weit wie möglich zu entfernen. Die geeignete Menge an flüssigem Ammoniak oder flüssigem Amin beträgt das 5- bis 50Ofache, insbesondere das 10- bis 20Ofache, bezogen auf das Gewicht des 1a,2oc-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-ons.

Beispiele von bevorzugten Alkalimetallen sind Lithium, Natrium und Kalium. Lithium ist besonders geeignet. Es wird eine überschüssige Menge an Alkalimetall, bezogen auf das 1cc,2a-Epoxy der Formel (1), verwendet, beispielsweise das 5- bis 25Ofache

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(ausgedrückt als Atomäquivalent), insbesondere das 10 bis 200fache, bezogen auf die Menge an Ia,2oc-Epoxy der Formel (1).

Bevorzugt wird ein inertes organisches Lösungsmittel für das Ia,2a-Epoxy der Formel (1) verwendet, damit die Umsetzung glatt verläuft. Beispiele bevorzugter Lösungsmittel sind die Äther wie Äthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan oder 1,2-Dimethoxyäthan, aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Ligroin, Pentan, Hexan, Cyclohexan oder Methylcyclohexan und Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Verbindungen.

Die Menge an organischem Lösungsmittel ist mindestens gleich, bezogen auf das Volumen des verwendeten flüssigen Ammoniaks, und beträgt bevorzugt das 1- bis 2fache, bezogen auf das Volumen des flüssigen Ammoniaks.

Geeignete Protonendonoren sind die Ammoniumsalze wie die Ammoniumsalze organischer Säuren und die Ammoniumsalze von anorganischen Säuren. Spezifische Beispiele der Ammoniumsalze •sind Ammoniumchlorid, Ammoniumbromid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumhydrogenphosphat, Ammoniumacetat, Ammoniumformiat, Ammoniumbenzoat, Ammoniumbenzolsulfonat und Ammonium-p-toluensulfat. Von diesen sind die Ammoniumsalze der anorganischen Säuren wie Ammoniumchlorid besonders bevorzugt. Die Menge an Ammoniumsalz ist mindestens äquimolar zu dem verwendeten Alkalimetall, bevorzugt beträgt sie das bis zu 10-molarfache, bezogen auf das letztere.

Niedrigere Alkohole wie Methanol, Äthanol oder tert.-Butylalkohol können ebenfalls als Protonendonoren verwendet werden.

Das Zugabeverfahren der Reaktionsreagentien ist bei der Durchführung der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens sehr wichtig, und vorteilhafterweise wird eines der folgenden drei Zugabeverfahren ausgewählt.

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(A) Das 1a,2cc-Epoxy wird zu einer Mischung zugegeben, die flüssiges Ammoniak und Alkalimetall enthält, und dann wird das Ammoniumsalz zugefügt. Zur Zeit ist es bevorzugter, das Ammoniumsalz nacheinander in zwei oder mehreren kleinen Teilen zuzufügen.

(B) Ein geringer Anteil (wünschenswerterweise weniger als das 0,7-molfache, bezogen auf die Menge an verwendetem Alkalimetall) des Ammoniumsalzes wird zuvor zu einer Mischung, die das flüssige Ammoniak und das Alkalimetall enthält, zugegeben. Das 1a,2oc-Epoxy wird zu diesem System zugefügt und dann wird der Rest des Ammoniumsalzes zugegeben.

(C) Das 1 α,2a-Epoxy und das Ammoniumsalz werden gleichzeitig in kleinen Portionen zu einer Mischung zugegeben, die flüssiges Ammoniak und Alkalimetall enthält.

Von den obigen Verfahren ist das Verfahren (A) besonders bevorzugt.

Die Reaktionstemperatur beträgt üblicherweise von -70⁰C bis zur Rückflußtemperatur des flüssigen Ammoniaks in dem Reaktionssystem.

Es ist vorteilhaft, daß, nachdem der gesamte Protonendonor zugegeben wird, die Umsetzung bis zum Rückfluß des flüssigen Ammoniaks weitergeführt wird, bis das im Überschuß verwendete Alkalimetall vollständig zersetzt ist. Somit ist es möglich, daß man das Endprodukt ΐα-24-DHC in höherer Ausbeute erhält.

Ein Verfahren war früher bekannt, bei dem 1a,2a-Epoxy-cholesta-4,6-dien-3-on der Formel

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CB-A-)

mit metallischem Lithium und Ammoniumchlorid in Anwesenheit von flüssigem Ammoniak umgesetzt wird, wobei 1cc-Hydroxycholesterin (loc-HC) der Formel

OH

(B-5)

gebildet wird, um 1 oc-Hydroxycholecalciferol (B-1) herzustellen (D.H.R.Barton et al, J.Am.Chem.Soc., £5, 2748, 1973).

Es wurde gefunden, daß das 1oc,2oc-Epoxy, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch eine Oxogruppe (=0) in der 24-Stellung substituiert ist, und erfindungsgemäß verläuft die Vier-Stufen-Reduktionsreaktion eines solchen 1a,2oc-Epoxys, d.h.

(1) die Reduktion der Carbonylgruppe in der 24-Stellung,

(2) die Reduktion der 1a,2oc-Epoxygruppe,

(3) die Reduktion des 4,6-Diens zu einem 5-En und

(4) die Reduktion der Carbonylgruppe in der 3-Stellung

glatt in einer einzigen Stufe, und wenn bevorzugte Bedingungen verwendet werden, kann das 1α-24-Dihydroxycholesterin (10C-24-DHC) in hoher Ausbeute von 60 bis 15% synthetisiert

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werden. Die Tatsache, daß bei einer solchen Vier-Stufen-Reduktionsreaktion die Stufen (1) bis (4) glatt in einer einzigen Stufe ablaufen, wird in keiner Publikation beschrieben, und es wird angenommen, daß dies eine neue Reaktion ist, die zum ersten Mal von der Anmelderin gefunden wurde.

(2) Herstellung von 1a,2a-Epoxy

Das 1a,2a-Epoxy der Formel (1), das als Ausgangsmaterial bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, kann leicht, beispielsweise durch das folgende Verfahren, hergestellt werden, wobei als Ausgangsmaterial Fucosterin der folgenden Formel

(A-I)

verwendet wird, das in großen Mengen in braunen Meeresalgen vorhanden ist. Ein Beispiel dieses Verfahrens wird im folgenden näher erläutert.

Fucosterin wird mit Ozon bei niedrigen Temperaturen oxydiert und das entstehende Ozonid wird mit einem Essigsäure/Zink-System reduziert, um 24-Ketocholesterin der folgenden Formel

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(A-2)

in einer Ausbeute von ungefähr 60 bis 7590 zu bilden. Das entstehende 24-Ketocholesterin wird oxydiert, beispielsweise mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyanobenzochinon (DDQ) bei Rückflußbedingungen, beispielsweise unter Verwendung von Dioxan, wobei
Cholesta-1,4,6-trien-3»24-dion der folgenden Formel

(A-3)

gebildet wird, und dann wird dieses Oxydationsprodukt bei
Zimmertemperatur unter alkalischen Bedingungen (pH-Wert ungefähr 7,5 bis 9) unter Verwendung von Wasserstoffperoxid epoxydiert.

Dieses Verfahren ermöglicht die Synthese von 1a,2a-Epoxy der
Formel (1) in einer Ausbeute von ungefähr 40 bis 55% aus dem 24-Ketocholesterin der Formel (A-2).

Das Cholesta-1,4,6-trien-3,24-dion der Formel (A-3) ist ebenfalls eine neue Verbindung, die zum ersten Mal von der Anmelderin synthetisiert wird.

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Wenn ein niedriger Alkohol wie Methanol als Lösungsmittel für die obige Epoxydierungsreaktion verwendet wird, scheidet sich das entstehende 1a,2a-Epoxy aus dem niedrigen Alkohollösungsmittel ab. Das ausgeschiedene Epoxy kann dann aus der Reaktionsmischung durch Filtration abgetrennt und direkt als Ausgangsmaterial bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.

(3) Abtrennung von (S)- und (R)-Epimeren von 1a-24-DHC

Wie bereits angegeben, wird das 1cc-24-DHC der Formel (2), das bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wird, als Mischung aus 1a-24(S)-DHC und 1oc-24(R)-DHC erhalten.

Es wurde gefunden, daß erfindungsgemäß das (S)-Epimer und das (R)-Epimer glatt durch substituierte oder nichtsubstituierte Benzoylierung der Hydroxylgruppen in den 3- und 24-Stellungen des ia-24-DHC abgetrennt werden können. Mit anderen Worten, in der 1-Stellung kann eine Hydroxylgruppe selbst vorhanden sein oder es kann eine mit einer Schutzgruppe geschützte Gruppe vorhanden sein, die in die Hydroxylgruppe überführbar ist, um die Trennung der (S)- und (R)-Epimeren zu bewirken.

Die substituierte oder nichtsubstituierte Benzoylierung der 3- und 24-Stellungen des 1 α-24-DHC kann durchgeführt werden, indem man das 1 α-24-DHC mit substituiertem oder unsubstituiertem Benzoylchlorid beispielsweise in einem inerten organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer organischen Base wie eines Säureakzeptors umsetzt. Diese Umsetzung ist üblicherweise als Schotten-Baumann-Reaktion bekannt. Eine organische Base wie ein Pyridin kann bei der obigen Umsetzung als inertes organisches Lösungsmittel verwendet werden, und in diesem Fall ist die Verwendung eines Säureakzeptors nicht besonders erforderlich.

Die substituierte oder unsubstituierte Benzoylierung der 3- und 24-Stellungen des 1α-24-DHC kann selektiv erreicht werden, indem man mit substituiertem oder unsubstituiertem Benzoyl-

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chlorid beispielsweise in einer Pyridinlösung bei niedriger Temperatur (z.B. -5 bis 10⁰C) während einer geeigneten Zeit (z.B. 10 bis 24 Stunden) umsetzt. Die Hydroxylgruppe in der 1-Stellung kann acyliert werden, beispielsweise indem man ein Sterin, dessen Hydroxylgruppen in den 3- und 24-Stellungen geschützt sind, mit Acylchlorid in einer Pyridinlösung bei 0 bis 50⁰C umsetzt. Die Hydroxylgruppe in der 1-Stellung kann trimethylsilyliert werden, beispielsweise indem man ein Sterin, dessen Hydroxylgruppen in den 3- und 24-Stellungen geschützt sind, mit N-Trimethylsilyl-imidazol in einer Pyridinlösung bei hoher Temperatur (z.B. 50 bis 110⁰C) umsetzt.

Führt man die substituierte oder unsubstituierte Benzoylierung von 10C-24-DHC bei höheren Temperaturen, beispielsweise bei 15 bis 100⁰C, bevorzugt 30 bis 80°C, durch, so können die 1-, 3- und 24-Stellungen des ioc-24-DHC in einer einzigen Stufe benzoyliert werden.

Beispiele von substituierten oder unsubstituierten Benzoylgruppen sind Benzoyl-, p-Brombenzoyl-, 2,4-Dibrombenzoyl-, p-Chlorbenzoyl- und p-Nitrobenzoylgruppen. Von diesen sind die Benzoyl- und p-Brombenzoylgruppen besonders bevorzugt.

In 1-Stellung von 1cc-24-DHC kann eine Hydroxylgruppe gebunden sein. Beispiele von Schutzgruppen dafür sind die oben erwähnten substituierten oder unsubstituierten Benzoylgruppen, Acylgruppen (organische Carbonsäurereste) oder Gruppen, die eine Ätherbindung ergeben. Beispiele solcher Acylgruppen sind Acetyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Pentanoyl-, Caproyl-, Cyclohexanoyl-, Chloracetyl- und Bromacetylgruppen. Beispiele von Schutzgruppen, die Ätherbindungen mit den Hydroxylgruppen in der 1-Stellung ergeben können, sind eine tert.-Butylgruppe, eine Benzylgruppe, eine Triarylgruppe wie eine Triphenylmethylgruppe, eine Tetrahydropyranylgruppe, eine Methoxymethylgruppe oder.eine alkylsubstituierte Silylgruppe wie eine Trimethylsilylgruppe.

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Die obigen Acylgruppen einschließlich der substituierten oder unsubstituierten Benzoylgruppen sind als Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen in der 1-Stellung bevorzugt.

Um das 1cc-24-DHC in das (S)-Epimer und das (R)-Epimer zu trennen, wird das ioc-24-DHC der Formel (2-a) zuerst in ein Benzoylderivät von 1oc-24-DHC, ausgedrückt durch die folgende Formel

(2-b)

überführt, worin

R"» eine substituierte oder unsubstituierte Benzoylgruppe und

Rf- ein Wasserstoff atom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, bedeuten.

Dieses Benzoylderivat wird dann der Chromatographie unterworfen, wobei ein Trägermaterial verwendet wird, das wenigstens Siliciumdioxid (SiO₂) enthält, um es in das 1oc-24(S)-Epimer und das Ia-24(R)-Epimer zu trennen.

Diese Epimere sind ebenfalls neue Verbindungen, die von der Anmelderin zum ersten Mal synthetisiert und erfolgreich getrennt wurden.

Als Trägermaterial, das Siliciumdioxid enthält, kann man beispielsweise verwenden: Silikagel, Kieselsäure, Siliciuradioxid-Aluminiumoxid-Gel, Diatomeenerde oder Kaolin. Das Silikagel, die Kieselsäure und das Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Gel, die hauptsächlich Siliciumdioxid enthalten, sind besonders geeignet.

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Die Chromatographie kann auf irgendeine geeignete Weise durchgeführt werden wie Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie. Um große Mengen zu trennen, ist es die Säulenchromatographie bevorzugt. Die Säulenchromatographie wird beispielsweise durchgeführt, indem man Silikagel als Trägermaterial und η-Hexan, Benzol, Äthylacetat, Methylenchlorid oder Äther als Entwicklungslösungsmittel verwendet, um die Epimeren in reiner Form zu erhalten. Unreine Fraktionen können wiederholt der Säulenchromatographie unterworfen werden oder fraktioniert kristallisiert werden, um geringe Mengen an Verunreinigungen zu entfernen.

Die Entwicklungsgeschwindigkeit von 1oc-24(R)-DHC ist hoch, wohingegen die Entwicklungsgeschwindigkeit seines Benzoylderivats niedrig ist.

(4) Zweite Reaktionsstufe (Synthese des 5,7-Dien-Derivats)

Erfindungsgemäß wird das 1cc-24-DHC der Formel (2-a), das bei der Umsetzung der ersten Stufe erhalten wird, in ein geschütztes Derivat des 1oc,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-diens überführt, nachdem die Wasserstoffatome der Hydroxylgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen mit einer Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, geschützt wurden oder nachdem das 1 α-24-DHC-benzoylderivat der Formel (2-b) in das- 1ct-24(S)-Epimer und das Ia-24(R)-Epimer getrennt wurde oder nachdem die Benzoylschutzgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen der Formel (2-a) in andere Schutzgruppen, die in Hydroxylgruppen überführbar sind,überführt wurden.

Erfindungsgemäß können mindestens ein geschütztes 1oc,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien-Derivat und ein geschütztes 1oc,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien-Derivat (diese werden im folgenden der Einfachheit halber als 5,7-Dien-Derivate bezeichnet) der Formel

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OR',

OR'

(3)

hergestellt werden, indem man mindestens ein geschütztes Derivat des 1 α-24(S)-Dihydroxycholesterins und ein geschütztes Derivat des ia-24(R)-Dihydroxycholesterins der folgenden Formel

(2)

worin R'

R¹π und

gleich oder unterschiedlich sind und je

eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne Änderung der Struktur der folgenden Formel (3) mit einem allylischen Bromierungsmittel in einem inerten organischen Medien umsetzt und dann die Reaktionsmischung mit einemDehydrobromierungsmittel behandelt.

Es ist wichtig, daß bei der zweiten Stufe der Herstellung der obigen 5,7-Dien-Derivate die Hydroxylgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen des ia-24-DHC und seiner Epimeren der Formel (2) geschützt sind. Wenn die Umsetzung in der zweiten Stufe durchgeführt wird, ohne daß diese drei Hydroxylgruppen des ioc-24-DHC geschützt werden, können die Oxydation und die Zersetzung der Hydroxylgruppen nicht verhindert werden, und die Ausbeute an den gewünschten 5,7-Dien-Derivaten wird sehr niedrig.

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Die Schutzgruppe kann irgendeine Schutzgruppe sein, die in eine Hydroxylgruppe in den 1-, 3- und 24-Stellungen überführt werden kann, ohne daß das Cholesta-5,7-dien-Skelett nach der Umwandlung in das 5,7-Dien-Derivat zerstört wird. Beispiele solcher Schutzgruppen werden im folgenden angegeben.

(1) Acrylgruppen:

1-12 oder aliphatische Carbonsäurereste oder deren

nitro-, halogen- und alkoxy-substituierten Derivate, z.B.mit Acetyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Pentanoyl-, Capronyl-, Cyclohexanoyl-, Chloracetyl-, Bromacetyl-, Benzoyl-, p-Brombenzoyl-, p-Nitrobenzoyl-, Äthylbenzoyl- und Toluylgruppen. Von diesen sind die Acetyl-, Benzoyl- und Propanoylgruppen besonders bevorzugt.

(2) Gruppen, die mit Hydroxylgruppen Ätherbindungen ergeben

Eine tert.-Butylgruppe, eine Benzylgruppe, eine Triarylmethylgruppe wie eine Triphenylmethylgruppe, eine Tetrahydropyranylgruppe, eine Methoxymethylgruppe und eine alkylsubstituierte Silylgruppe wie eine Trimethylsilylgruppe. Von den obigen Schutzgruppen sind die Acylgruppen (1) besonders bevorzugt, aber die vorliegende Erfindung ist darauf keinesfalls beschränkt.

Die Bromierungsmittel für die Allyl-Stellung kann irgendeineVerbindung sein,die üblicherweise für die Bromierung von Allylstellungen verwendet wird, beispielsweise kann man bevorzugt N-Bromsuccinimid, 1,3-Dibrora-5,5-dimethylhydantoin und N-Bromcaprolactam verwenden. Üblicherweise beträgt die Menge an allylischem Bromierungsmittel das 1-2 äquivalentfache, bezogen auf die Menge an 5-En der Formel (2). Bei der vorliegenden Erfindung findet zuerst eine Umsetzung zwischen dem 1cc-24-DHC der Formel (2), bevorzugt einem geschützten 10C-24-DHC oder seinem geschützten Epimer, und dem allylischen Bromierungsmittel in einem inerten organischen Medium statt. Geeigneterweise wird diese Umsetzung bei Zimmertemperatur bis 14O°C durchgeführt.

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Das inerte organische Medium ist eines, welches mit dem Bromierungsmittel nicht reagiert. Vorteilhafterweise wird beispielsweise ein Kohlenwasserstoff oder ein halogenierter Kohlenwasserstoff wie Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol, Brombenzol, Chlorbenzol, Nitrobenzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder 1,2-Dibromäthan verwendet. Man kann auch ein Ätherlösungsmittel wie Äthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylcellosolv oder Phenylcellosolv verwenden. Diese inerten organischen Lösungsmittel können entweder allein oder miteinander vermischt eingesetzt werden.

Die Umsetzung verläuft bei der obigen Temperatur. Gewünschtenfalls kann die Umsetzung unter Bestrahlung mit aktinischem Licht mit einer Wellenlänge durchgeführt werden, die den Infrarotbis Ultraviolettstrahlen entspricht. In diesem Fall verläuft die Umsetzung bei einer Temperatur, die niedriger ist als Zimmertemperatur. Ein Radikalinitiator wie Azo-bis-isobutyronitril, Benzoylperoxid oder Cyclohexyl-hydroperoxid kann ebenfalls in geringer Menge zugesetzt werden.

Das Dehydrobromierungsmittel ist bevorzugt Trimethylphosphit, s-Collidin oder Diäthylanilin und diese Verbindungen können gemeinsam verwendet werden. Theoretisch verläuft die Umsetzung vollständig, wenn.die Menge an Dehydrobromierungsmittel äquimolar zu dem bfomierten Produkt ist, das man bei der "vorhergehenden Bromierungsreaktion erhält; um geeignete Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten sicherzustellen, wird das Dehydrobromierungsmittel aber bevorzugt in einer Menge von mindestens dem ungefähr 2-molfachen, bezogen auf die Menge an bromiertem Produkt, verwendet. Da das Dehydrobromierungsmittel ebenfalls als Reaktionsmedium wirkt ,besteht für seine Menge keine besondere obere Grenze.

Im allgemeinen verläuft die Umsetzung sehr gut bei einer Temperatur von 80 bis 250⁰C, bevorzugt 120 bis 180⁰C. Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit von der Art des Dehydrobromierungsmittels, der Art des Reaktionslösungsmittels usw. Bei-

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spielsweise ist bei einer bevorzugten Ausführungsform, bei der die Umsetzung unter Rückfluß in einem Xylol-s-Collidin-System durchgeführt wird, die Umsetzung innerhalb einer kurzen Zeit von ungefähr 20 Minuten beendigt.

Gegen Ende der Umsetzung wird das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert, wobei man ein öliges, rohes 5,7-Dien-Derivat erhält.

(5) Dritte Reaktionsstufe (Reinigung des rohen 5,7-Dien-Derivats

Wie bereits oben angegeben, ist bereits ein Verfahren zur Her stellung von 1 oc-Hydroxycholesterin (Ia-HC) der Formel

OH

(B-5)

bekannt (D.H.R.Barton et al, J.Am.Chem.Soc.,95, 2748, 1973).

Es ist weiterhin bekannt, daß das obige 1 oc-Hydroxycholesterin (Ia-HC) in 1a,3ß-Diacetoxycholesta-5,7-dien der Formel

(B-6)

worin Ac CH^CO- bedeutet, überführt werden kann, wobei die gleiche Umsetzung wie bei der zweiten Stufe der vorliegenden

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Erfindung, wie oben beschrieben, durchgeführt wird, und dieses Produkt kann dann thermisch durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen umgelagert werden, um es in das 1a,3ß-Diacetoxycholecalciferol (Vitamin D-Derivat) der Formel

(B-I).

>0A

zu überführen.

Die Anmelderin hat daher versucht, das 5,7-Dien-Derivat der Formel

das bei der zweiten Stufe erhalten wird, durch direkte Bestrahlung mit ultraviolettem Licht nach dem für die Synthese von Ioc,j5ß-Diacetoxycholecalciferol der Formel (B-1) bekannten Verfahren umzulagern, aber das gewünschte 1α-24-Dihydroxycholecalciferol-Derivat der Formel

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(5)

worin R^,,

und Rg die gleiche Bedeutimg wie oben gegeben

besitzen [Formel (2)], konnte nicht isoliert werden.

Die Anmelderin nimmt an, daß dies darauf zurückzuführen ist, daß das 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) unrein ist und vermutlich ein 4,6-Dien-Derivat der Formel

(6)

enthält, worin R-, R^ und Rg die gleiche Bedeutung wie oben gegeben besitzen. Aufgrund dieser Annahme hat die Anmelderin ver_T sucht, daß rohe, bei der zweiten Stufe wie oben gebildete und abgetrennte 5,7-Dien-Derivat zu reinigen, wobei eine bekannte Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Silikagel als Adsorptionsmittel, d.h. eine Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie, verwendet wurde. Es gelang jedoch mit keinem dieser chromatographischen Verfahren, das 4,6-Dien-Derivat der Formel (6) aus dem rohen 5,7-Dien-Derivat der For-

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mel (3) abzutrennen.

Ein Beispiel ist bekannt, bei dem die Chromatographie unter Verwendung von Silbernitrat für die Trennung und Reinigung von Acetoxycholesta-5,7-dienen (Tetrahedron Letters, Nr. 40, 4147, 1972 und DT-OS 2 400 931) angewendet wurde.

Die Anmelderin hat daher daran gedacht, daß es möglich sein würde, die Silbernitrat-Chromatographie mit dem obigen rohen 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) durchzuführen,und hat versucht, das rohe 5,7-Dien-Derivat durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 2%igem Silbernitrat-Silikagel zu reinigen. Dieser Versuch mißlang, und das 4,6-Dien-Derivat konnte nicht abgetrennt werden.

Verschiedene weitere Untersuchungen von Reinigungsverfahren für das rohe 5,7-Dien-Derivat haben schließlich zu dem Ergebnis geführt, daß freies 5,7-Dien gut von dem freien 4,6-Dien und anderen Verunreinigungen abgetrennt werden kann, indem man ein chromatographisches Verfahren verwendet und die Schutzgruppe von dem rohen 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) abspaltet und es in 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien (das freie 5,7-Dien) der Formel

(3-a)

OH

überführt und in Berührung mit einem Trägermaterial bringt, das Siliciumdioxid enthält und daran nichtmetallisches Silber adsorbiert enthält.

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Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren kann nicht nur mit dem rohen, geschützten 5,7-Dien-Derivat, das bei der zweiten Stufe erhalten wird, sondern ebenfalls mit dem 5,7-Dien-Derivat in 24(S)-Epimer-Form oder dem 5,7-Dien-Derivat in 24(R)-Epimer-Form durchgeführt werden. Auf jeden Fall ist es wesentlich, daß eine rohe Verbindung dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren unterworfen wird, nachdem die Schutzgruppe in den 1-, 3- und 24-Stellungen abgespalten wurde, um sie in das freie 5,7-Dien der Formel (3-a) zu überführen.

Geeignete Trägermaterialien, die Siliciumdioxid enthalten und daran adsorbiert nichtmetallisches Silber enthalten, sind Silikagel und Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Gel, die Silbernitrat enthalten oder wobei Silbernitrat an diesen haftet. Das Silikagel ist besonders vorteilhaft.

Solches Silikagel wird beispielsweise hergestellt, indem man Silbernitrat in Wasser oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Acetonitril oder Alkoholen löst, die Lösung .mit Silikagel mischt und dann das Lösungsmittel aus der Mischung abdampft. Wenn es für die Säulenchromatographie verwendet wird, wird es gewünschtenfalls aktiviert und in eine Glassäule gefüllt. Wenn es für die DünnschichtChromatographie verwendet wird, wird ein geeignetes Fixiermittel wie Gips oder Stärke in das Silikagel eingearbeitet, das auf 'obige Weise hergestellt wurde, und gewünschtenfalls wird ebenfalls ein fluoreszierendes Mittel zugegeben. Die Masse wird dann auf einer geeigneten Platte (Glas oder Polyesterfilm) in einer. Dicke von 0,2 bis 2 mm ausgestrichen, fixiert und aktiviert.

Um eine Dünnschichtchromatographie-Platte, die nur aus Silikagel besteht, mit Silbernitrat zu imprägnieren, wird die Platte in eine Lösung aus Silbernitrat in einem organischen Lösungsmittel (z.B. Acetonitril oder ein Alkohol) in einer geeigneten Konzentration getaucht, getrocknet und dann aktiviert.

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2528981

Die Menge an Silbernitrat, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, beträgt geeigneterweise 0,1 bis 20 Gew.%, .bezogen auf das Silikagel, insbesondere bevorzugt 0,5 bis 10 Gew.%. Wenn die Menge an Silbernitrat unter 0,1 Gew.% oder über 20 Gew.% liegt, wird die Trennfähigkeit schlecht. Im letzteren Fall wird das Silbernitrat verschwenderisch verwendet.

Beispiele von Entwicklungslösungsmitteln oder Eluierungslösungemitteln, die für die Dünnschichtchromatographie oder die Säulenchromatographie verwendet werden können, sind organische Lösungsmittel wie Cyclohexan, η-Hexan, Benzol, Toluol, Chloroform, 1,2-Dichlormethan, 1,2-Dichloräthan, Aceton, Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Äthylacetat, Methanol, Äthanol und Propanol und Mischungen davon. Von diesen sind Mischung aus niedrigsiedenden Lösungsmitteln wie η-Hexan, Benzol, Chloroform, Aceton, Äthylacetat oder Methanol besonders geeignet. Geeignete Mischverhältnisse können leicht experimentell bestimmt werden.

Die Entwicklungsverfahren, die Eluierung und die Bestimmung bzw. Feststellung können auf zufriedenstellende Weise entsprechend bekannten chromatographischen Verfahren durchgeführt werden.

Die Anmelderin hat bei der Anwendung dieses Reinigungsverfahrens gefunden, daß das rohe 5,7-Dien-Derivat, das bei der zweiten Stufe erhalten wird, das 4,6-Dien in einem Gewichtsverhältnis von ungefähr 1/2 bis 1/4, bezogen auf das gereinigte 5,7-Dien, enthält. Eine so große Menge an 4,6-Dien kann von dem 5,7-Dien nach dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren abgetrennt und im wesentlichen vollständig entfernt werden.

Es wurde gefunden, daß dieses Reinigungsverfahren es ermöglicht, das obige freie 5,7-Dien leicht in hoher Reinheit und Ausbeute herzustellen, wie im folgenden näher beschrieben wird. Dieses 5,7-Dien, entweder als solches oder nachdem mindestens eine

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der Hydroxylgruppen in seinen 1-, 3- und 24-Stellungen mit der gleichen Schutzgruppe wie oben geschützt wurde, kann in ein 1α-24-Dihydroxycholecalciferol oder dessen geschützte Derivate durch Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung und Umlagerung (Isomerisierung) umgewandelt werden.

Es wird daher angenommen, daß das Reinigungsverfahren bei der dritten Stufe der vorliegenden Erfindung einen sehr hohen technischen Wert besitzt.

(6) Vierte Stufe (Synthese von 1α-24-Cholecalciferol oder seinen geschützten Derivaten)

ioc-24-Cholecalciferol oder seine Derivate, die durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon mit einer Schutzgruppe gebildet werden und die durch die folgende Formel

(5)

dargestellt werden, worin R₁, R₂ und R^ die gleiche Bedeutung wie oben bei Formel (3-b) besitzen, können erhalten werden, indem man mindestens ein freies 5,7-Dien, das bei der dritten Stufe gereinigt und abgetrennt wurde, oder die Derivate davon, die durch Schutz von mindestens einer der Hydroxylgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen des freien 5,7-Diens, ausgedrückt durch die folgende Formel

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_₂₈_ 2526381

(3-t>)

worin R., Rp und R, gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom ohne Änderung der Struktur der Formel (5) überführbar ist, bedeuten, in einem inerten organischen Lösungsmittel mit ultravioletten Strahlen bestrahlt und dann das entstehende Produkt isomerisiert.

Das freie 5,7-Dien oder seine geschützten Derivate der Formel (3-b) kann 1ct,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder die geschützten Derivate oder 1oc,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-.dien oder die geschützten Derivate oder eine Mischung davon in beliebigen Verhältnissen sein und diese Verbindungen können in den Ioc-24(S)-Typ, den 1a-24(R)-Typ oder den gemischten Typ von Dihydroxycholecalcxferol oder seinen geschützten Derivaten nach der vierten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahren überführt werden.

Wenn R^, Rp und/oder R^ in den Formeln (3-b) und (5) eine Schutzgruppe bedeuten, kann dies die gleiche Schutzgruppe sein, wie sie durch R'a» R^!g und/oder RV in Formel (2) dargestellt wird. Das gereinigte ict,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien der Formel (3-a) kann in sein geschütztes Derivat nach dem gleichen Verfahren überführt werden, wie es oben für die Trennung des 1a-24-DHC in die (S)- und (R) Epimeren in Abschnitt (3) beschrieben wurde.

Bei der vierten Stufe der vorliegenden Erfindung ist jedoch die Verwendung eines gereinigten freien 5,7-Diens, in dem alle

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Gruppen R₁, R₂ und R^ der Formel (3-b) Wasserstoffatome bedeuten, vorteilhafter als die Verwendung der geschützten Derivate. Da Τα-24-Dihydroxycholecalciferol der folgenden Formel

(5-a)

ein sog. Analoges der aktiven Formen von Vitamin D, ist, ermöglicht die Verwendung von gereinigtem freiem .5»7-Dien der .Formel (3-b) die direkte Herstellung von Analogen von der aktiven Form des Vitamins D, der Formel (5-a). Wenn andererseits ein geschütztes Derivat der Formel (3-b) verwendet wird, sind zwei zusätzliche Stufen erforderlich, um die. . Hydroxylgruppen des gereinigten freien 5,7-Diens zu schützen und die Schutzgruppen des entstehenden geschützten ϊα-24-Dihydroxycholecalciferols abzuspalten. Insbesondere treten bei der Abspaltung der Schutzgruppen eine Teilzersetzung oder eine Degenerierung von 1α-24-Dihydroxycholecalciferol auf.

Auch aus diesem Grund ist das Reinigungsverfahren in der dritten Stufe bei der vorliegenden Erfindung ein sehr vorteilhaftes Reinigungsverfahren.

Das gereinigte 5,7-Dien oder seine geschützten Derivate der Formel (3-b), bevorzugt gereinigtes freies 5,7-Dien, wird in das 1α-24-Dihydroxycholecalciferol oder seine geschützten Derivate der Formel (5) oder (5-a) überführt, indem man das

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freie gereinigte 5,7-Dien oder sein geschütztes Derivat in einem inerten organischen Lösungsmittel zuerst mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Die ultravioletten Strahlen sind solche, von denen bekannt ist, daß sie Wellenlängen von ungefähr 200 bis 360 nm besitzen, und bei der vorliegenden Erfindung sind solche, die Wellenlängen von 260 bis 310 nm besitzen, besonders bevorzugt.

Beispiele von inerten organischen Lösungsmitteln, die bei dieser Stufe verwendet werden können, sind Kohlenwasserstoffe und halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol, Brombenzol, Chlorbenzol, Nitrobenzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Cycloäthan oder 1,2-Dibromäthan; Äther wie Diäthylather, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylcellosolv oder Phenylcellosolv; und Alkohole wie Methanol, Äthanol, Propanol, Hexanol oder Cyclohexanol. Benzol, Toluol, Diäthylather, Methanol und Äthanol, entweder allein oder als Mischungen, werden bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet. Wird ein solches Lösungsmittel verwendet, so kann .die nachfolgende Isomerisierungsreaktion, die noch beschrieben wird, in dem gleichen Lösungsmittel nach der ultravioletten Bestrahlung durchgeführt werden.

Die geeignete Temperatur für die ultraviolette Bestrahlung beträgt -20 bis 80⁰C, bevorzugt -10 bis 20⁰C. Bevorzugt wird die Bestrahlung in sauerstofffreier inerter Atmosphäre wie in Argon- oder Stickstoffatmosphäre durchgeführt.

Man nimmt an, daß als Folge der ultravioletten Bestrahlung die 9,10-Stellungen des 1<x,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-diens oder seines Derivats gespalten werden und das Ια-24-Dihydroxyprecholecalciferol-Derivat als Hauptprodukt gebildet wird.

Die Isomerisierung von Precholeealciferol ergibt das 1a-24-Dihydroxycholecalciferolderivat der Formel (5) oder (5-a).

Die Temperatur bei der Isomerisierungsreaktion ist für das

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Fortschreiten der Reaktion nicht besonders wichtig.

Das 1<x-24-Dihydroxyprecholecalciferol-Derivat und das ia-24- ' Dihydroxycholecalciferol-Derivat zeigen einen bestimmten Gleichgewichtswert, der sich entsprechend der Temperatur ändert, und bei niedrigeren Temperaturen erhöhen sich die Anteile an der letzteren Verbindung. Offensichtlich werden jedoch bei niedrigeren Temperaturen die Umwandlungsgeschwindigkeiten zu der letzteren Verbindung langsamer. Die Temperatur kann daher in Abhängigkeit vom Gleichgewichtswert und der Umwandlungsgeschwindigkeit ausgewählt werden. In diesem Sinn ist die Temperatur nicht besonders wichtig für den Fortlauf der Umsetzung selbst.

Bei der tatsächlichen Versuchsdurchführung werden diese Punkte in Betracht gezogen und Isomerisierungstemperaturen von 10 bis 120⁰C, bevorzugt von 40 bis 10Ö°C, werden verwendet.

Wünschenswerterweise wird die Isomerisierung üblicherweise •in einem inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt. Wenn das gleiche bevorzugte Lösungsmittel wie oben beschrieben verwendet wird, kann es ebenfalls als Lösungsmittel für die Isomerisierungsreaktion dienen.

Das 1α-24-Dihydroxycholecalciferol oder seine geschützten Derivate der Formel (5-a) oder (5) werden so gebildet.

Wenn die Schutzgruppe des geschützten Derivats von 1oc-24-Dihydroxycholecalciferol eine.Acylgruppe ist, kann sie durch Entacylierung abgespalten werden, wobei man ein Verfahren verwendet, das darin besteht, daß man in Alkalilösung eines Alkohols wie Methanol oder Äthanol zersetzt oder indem man reduktiv mit LiAlH^, beispielsweise in einem Lösungsmittel wie Äther, zersetzt. Bevorzugt wird die Entacylierung bei einer Temperatur von -10° bis 50⁰C durchgeführt.

Wenn die Schutzgruppe eine Ätherbindung mit der Hydroxylgruppe

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bildet, kann ein Teil davon leicht durch Reduktion oder durch Behandlung mit einer Säure oder Alkali entfernt werden.

Das Abspalten der Schutzgruppen wird bevorzugt direkt mit der Reaktionsmischung, die man bei der vierten Stufe erhält, durchgeführt .

Das so gebildete 1 α-24-Dihydroxycholecalciferol kann abgetrennt und durch Säulenchromatographie, präparative DünnschichtChromatographie , Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie oder Umkristallisation gereinigt werden. Man kann ebenfalls die Chromatographie verwenden, wobei man einen Träger verwendet, der Siliciumdioxid enthält, das daran adsorbiert nichtmetallisches Silber enthält, wie es oben für die Reinigung des rohen 5,7-Diens beschrieben wurde, beispielsweise kann man Silikagel, welches Silbernitrat enthält, verwenden. 1a-24-Dihydroxycholecalciferol höherer Reinheit kann isoliert werden, indem man zwei oder mehrere dieser Reinigungsverfahren kombiniert.

(7) Pharmakologieehe Aktivitäten der erfindungsgemäßen Produkte

Das 1α-24-Dihydroxycholecalciferol (1a-24-DHCC) der Formel (5-a), das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wie oben beschrieben erhalten wird, insbesondere (i) 1a-24(S)-Dihydroxycholecalciferol, (ii) 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol oder (iii) eine Mischung der Dihydroxycholecalciferole (i) und (ii) in beliebigen Verhältnissen, ist eine neue Verbindung, die von der Anmelderin erfolgreich synthetisiert und isoliert wurde. Diese Verbindungen sind Vitamin D,-Analoge mit überlegenen Aktivitäten und ihre Toxizität ist niedrig.

Es ist bereits bekannt, daß 1α-25-Dihydroxycholecalciferol (1a-25-DHCC) und 1a-Hydroxycholecalciferol (Ia-HCC) überlegene Aktivitäten als Analoge der aktiven Formen von Vitamin D, besitzen. Kürzlich wurde gefunden, daß Ia-HCC eine sehr hohe Toxizität besitzt und daß seine Nebenwirkungen bei der kontinuierlichen Verabreichung Schwierigkeiten mit sich bringen. Für

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das 1CC-25-DHCC stehen keine Toxizitätswerte zur Verfügung, aber aus verschiedenen verfügbaren Tatsachen scheint es so, daß es mindestens so toxisch ist wie das Ia-HCC.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Toxizität des Ia-HCC zu erniedrigen. ia-24,25-Trihydroxycholecalciferol (1a-24,25-THCC) scheint, wie in vivo festgestellt wurde, eine recht selektive, obgleich nicht so starke aktivierende Wirkung auf den intestinalen Calciumtransport zu besitzen. Wenn die epimere ΐα-24-DHCC-Mischung, 1a-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC (diese werden allgemein als 1a-24-DHCC bezeichnet) , in vivo weiter metabolisiert werden, wird das 1a-24-DHCC vermutlich in das 1a-24,25-THCC überführt. Dies läßt den Schluß zu, daß die Wirkung der epimeren ia-24-DHCC-Mischung, 1a-24(R)-DHCC und Ia-24(S)-DHCC selektiv sein kann. Das 1a-24-DHCC ist eine neue Verbindung, die in vivo noch nicht festgestellt wurde,und man nimmt an, daß sie eine neue Aktivität aufweist.

Die Anmelderin hat Vergleichsversuche der Aktivitäten der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen mit Ia-HCC durchgeführt und gefunden, daß die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen, wie es aus den folgenden Beispielen hervorgeht, mindestens die gleiche Wirkung wie Ia-HCC beim intestinalen Calciumtransport besitzen, daß ihre Wirkung auf die Knochenresorption geringer ist als ungefähr ein Drittel der Wirkung von Ia-HCC und daß ihre LD₅₀" Werte ungefähr ein Zehntel des Werts von Ia-HCC betragen. Es wurde insbesondere festgestellt, daß 1a-24(S)-DHCC eine etwas schwächere Wirkung auf die Aktivierung des intestinalen Calciumtransports besitzt als 1a-24(R)-DHCC, daß es aber fast keine Knochenresorption zeigt.

Dementsprechend kann das erfindungsgemäße 1a-24-DHCC als einzigartige Medizin mit verminderten Nebenwirkungen und hoher Sicherheit verwendet werden, verglichen mit bekannten Analogen von aktiven Formen des Vitamins D^, wenn die Verbindungen beispielsweise bei Krankheiten verabreicht werden, die durch . abnor-

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male Metabolisierung con Calcium induziert werden. Pharmakologische Versuche, die von der Anmelderin durchgeführt wurden, haben eindeutig gezeigt, daß verschiedene optimale pharmazeutische Präparationen hergestellt werden können, entsprechend unterschiedlichen Krankheitszuständen.

Bei den pharmakologisehen Versuchen wurde gefunden, daß geeignete Dosen der obigen neuen aktivierten Vitamin D^-Derivate bei der klinischen Anwendung ungefähr 0,04 bis 0,4 /ug (96,2 bis 962 ρ Mol)/kg Körpergewicht betragen.

Man nimmt an, daß die 1 α-24-DHCC-Verbindungen der Formol (5-a) auf verschiedenen klinischen und Veterinären Gebieten verwendet werden können und daß sie für die Behandlung des abnormalen Metabolismus von Calcium und Phosphor, verursacht durch Leberversagen, Nierenversagen, Versagen des gastro-intestinalen Trakts und bei parathyroidem Versagen und verwandten Knochenkrankheiten verwendet werden können wie Vitamin D-abhängige Rachitis, Nierenosteodystrophie, Hypoparathyroidismus, Osteo-.poröse, Knochenerweichung, Paget'sche Krankheit, Malabsorptionssyndrom, Hypocalcaemie, die durch Leberzirrhose induziert wird, Hypocalcaemie, die durch Steatorrhoe induziert wird, Hypocalcaemie, die durch Vitamin D-resistente Rachitis erzeugt wird. Es wird angenommen, daß diese Verbindungen sicherere Arzneimittel sind als die bekannten Ia-HCC und 1a-25-DHCC. Es ist ebenfalls möglich, ein Mittel zu verwenden, das mindestens eine der folgenden Verbindungen 1 α-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC zusammen mit anderen Mitteln enthält, die den CaI-ciummetabolismus regulieren. Beispielsweise können die Verbindungen bei der Behandlung von Paget¹scher Krankheit zusammen mit Calcitonin verwendet werden.

Geeignete Verabreichungsrouten sind orale, buccale und parenterale (intramuskuläre, subkutane j intravenöse und rektale) Verabreichung. Dosisformen sind beispielsweise komprimierte Tabletten, beschichtete Tabletten., harte oder weiche, elastische Gelatinekapseln, Äthylalkohollösungen, Öllösungen und wäßrige Suspensionen.

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Das Lösungsmittel für die Öllösungen kann ein pflanzliches Öl wie Mais-, Baumwollsamen-, Cocosnuß-, Mandel- oder Erdnußöl sein, ein Fischleberöl oder ein öliger Ester wie Polysorbate 80.

Für die rektale Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen zu pharmazeutischen Mitteln verarbeitet werden, die einen Suppositorien-Grundstoff wie Kakaoöl oder andere Triglyceride enthalten. Um die Lagerbeständigkeit zu verlängern, enthalten die Mittel vorteilhafterweise ein Antioxydans wie Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hydrochinon.

Futtermittel für Haustiere können hergestellt werden, die das erfindungsgemäße Ια-24-DHCC in einer Menge enthalten, so daß keine toxischen Wirkungen auftreten, um die Hypocalcaemie von Kühen zum Zeitpunkt des Kalbens oder nach dem Zeitpunkt des Kalbens zu verhindern oder um die Hypocalcaemie von Haustieren zu verhindern, die keine Hypocalcaemie-Vorgeschichte aufweisen. Werden diese Verbindungen Geflügel während der Legezeit verabreicht, so kann das Legen von weichschaligen Eiern vermieden werden. Dies ist ein weiteres Merkmal des erfindungsgemäßen Ια-24-DHCC.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Die Untersuchungsverfahren, die in diesen Beispielen verwendet werden, um die Eigenschaften der Endprodukte näher zu bestimmen, sind die folgenden.

Sofern nicht anders angegeben, werden die NMR-Spektren mit einem Varian EM 360 oder JEOL PS/PFT-100 (Nippon Electronics Co., Ltd.)-Gerät in Deuterochloroform (CDCl,) unter Verwendung von Tetramethylsilan als interner Standard bestimmt.

Die Massenspektren und die Hochauflösungsmassenspektren.werden unter Verwendung eines Shimadzu LKB-9000-Geräts (Warenzeichen

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für ein Produkt von Shimazu Seisakusho Co., Ltd.) bestimmt.

Die UV-Spektren werden mit einem Hitachi EPS-3T-Gerät (Warenzeichen für ein Produkt der Hitachi Ltd.) unter Verwendung einer Äthanollösung gemessen.

Die Schmelzpunkte werden mit einem Mikroskop mit Heiztisch bestimmt und die erhaltenen Werte werden nicht korrigiert.

Die absolute Konfiguration von ia-24-Dihydroxycholesterin wird folgendermaßen bestimmt:

Eine epimere Mischung aus 24,24-Epoxycholesterin-3-benzoat, d.h. eine Mischung aus

und

worin B„ eine Benzoylgruppe bedeutet , wird unter Verwendung von Silikagel als Carrier bzw. Träger chromatographiert, um die beiden Epimeren zu trennen und zu gewinnen. Beide Epimere werden mit Methanol behandelt, um ein 24-OH-Derivat und ein

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25-OCH-z-Derivat zu bilden. Um die absolute Konfiguration der beiden Epimeren zu bestimmen, wird das modifizierte Horean-Verfahren verwendet, welches in Tetrahedron Letter 1_» 15, 1975» beschrieben wird. Durch Reduktions der beiden Epimeren, deren absolute Konfiguration so bestimmt wurde mit einem AlCl^-LiAlH^-System, wird ein24(R)-Hydroxyderivat aus dem 24-(R), 25-Ep oxy derivat und ein 24(S)-Hydroxyderivat aus dem 24(S), 25-Epoxyderivat erhalten. Da es bekannt ist, daß das letztere S-Derivat polarer ist als das erstere R-Derivat, wird angenommen, daß diese Tatsache ebenfalls für das 1 cc-24-Dihydroxycholesterin gilt. Dieses 1 α-24-Dihydroxycholesterin wird in das Tribenzoat- oder Dibenzoat-Derivat überführt, welches dann durch eine Silikagelsäule chromatographiert wird. Somit werden ein stärker polares Epimer in ein 1 α-24(S)-Derivat und ein weniger polares Epimer in ein 1ct-24(R)-Derivat überführt.

Wenn in der vorliegenden Anmeldung kein besonderer Hinweis auf ein R-Derivat oder auf ein S-Derivat erfolgt, beispielsweise wenn nur das ioc-24-DHCC erwähnt wird, so bedeutet dies ■eine äquimolare Mischung aus 1a-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC.

Beispiel 1

(A) Synthese des Ausgangsmaterials

1cc,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on wird nach-den folgenden drei Stufen (1) bis (3) hergestellt.

(1) Synthese von 24-Ketocholesterin aus Fucosterin: Fucosterin (4,1 g) wird in 100 ml Methylenchlorid gelöst und unter Kühlen der Lösung mit. Trockeneis-Aceton auf ungefähr -20⁰C wird das Fucosterin während 30 Minuten mit Ozon in einer Bildungsgeschwindigkeit von 0,86 g/h und in einer Konzentration von 17,2 g/nr (0^) oxydiert. Nach der Umsetzung werden 8 g Zinkpulver und 200 ml Eisessig zugegeben und das entstehende Ozonid wird 24 Stunden reduktiv bei Zimmertemperatur zersetzt. Das entstehende Zinkacetat wird dann durch Filtration abgetrennt und mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumcarbonat gewaschen. Die abgetrennte Methylenchloridphase wird

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gut mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Methylenchlorid wird bei vermindertem Druck abdestilliert und die entstehenden, farblosen Kristalle werden unter Verwendung von Silikagel als Trägerstoff säulenchromatographiert (eluiert mit Benzol-n-Hexan-Lösungsmittelmischung), und man erhält 2,8 g 24-Ketocholesterin in einer Ausbeute von 70,3%.

(2) Synthese von 24-Ketocholesta-1,4,6-trien-3-on aus 24-Ketocholesterin: 4,0 g 24-Ketocholesterin und 7,0 g 2,3-Dichlor-5,6-dicyanobenzochinon werden in 140 ml Dioxan gelöst und die Lösung wird bei Rückflußtemperatur des Dioxans 27 Stunden gerührt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung auf Zimmertemperatur abgekühlt. Das entstehende Hydrochinonderivat wird durch Filtration abgetrennt und mit 30 ml Dioxan gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und das Dioxan wird bei vermindertem Druck abdestilliert, wobei man eine schwarzbraune, ölige Verbindung erhält.

Die ölige Verbindung wird durch Säulenchromatographie abgetrennt und gereinigt, wozu man Aluminiumoxid als Trägermaterial verwendet (es wird mit einer Lösungsmittelmischung aus Methylenchlorid und Aceton eluiert), und man erhält 2,76 g 24-Ketocholesta-1,4,6-trien-3-on in Form von Kristallen. Bei der Analyse des Produktes erhält man die folgenden Ergebnisse:

NMR-Spektrum:

0,86 (3H, S, C-18-CH₃), 1,20 (3H, S, C-19-CH^), 1,15 (6H, D, J=10 Hz, C-26,27-CH^), 5,95 - 6,10 (3H, M, C-4, 6,7-H), 6,29 (1H, dD, J=I1, 15 Hz, C-Z-R)₁ 7,10 (1H, J=11 Hz, C-1-H);

Molekulargewicht (durch Gasmassenspektrum): 394· (M⁺).

(3) Synthese von 1oc,2oc-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on aus 24-Ketocholesta-1,4,6-trien-3-on: 3,53 g 24-Ketocholesta-1,4,6-trien-3-on werden in einer Mischung aus 100 ml Methanol, 20 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Dioxan gelöst und

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1,6 ml einer 5 gew.&Lgen Methanollösung von Natriumhydroxid und 5 ml 3O$6iges wäßriges Wasserstoffperoxid werden zugegeben. Die Umsetzung wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Umsetzung wird eine geringe Menge Essigsäure zugegeben, um die Lösung auf einen pH-Wert von 7 zu neutralisieren. Die Reaktionsmischung wird dann extrahiert, indem man Wasser und Äther zufügt. Die Ätherphase wird gut mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wird bei vermindertem Druck abdestilliert, man erhält 4,04 g eines hellgelben Feststoffs. Das feste Produkt wird unter Verwendung von Silikagel säulenchromatographiert (man eluiert mit einer Lösungsraittelmischung aus Benzol und Äther), und man erhält 2,52 g ioc,2oc-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on, welches die folgenden Eigenschaften besitzt: Fp.:150 bis 151,5°C
UV-Spektrum:?.^⁸¹¹⁰¹ = 291 mn

Hochresolutionsmassenspektrum:
gefunden = 410,2793
berechnet (M⁺) = 410,2821 (C₂₇

NMR-Spektrum:

0,80 (3H, S, C-18-Hs), 1,15 (3H, S, C-19-Hs), 3,43 (1H, dD, J=4 Hz, J=1,5 Hz, C-2-H), 3,60 (1H, D, J=4 Hz, C-1-H), 5,68 (1H, D, J=1,5 Hz, C-4-H), 6,10 (2H, S, C-6, C-7-Hs).

(B) Synthese des erfindungsgemäßen 1α-24-Dihydroxycholesterins (erste Stufe)

Flüssiger Ammoniak (10. ml), der mit metallischem Natrium getrocknet wurde, wird in einen Dreihalskolben, der mit einem" Tropftrichter und einem Trockeneiskühler ausgerüstet ist, eingeschlossen, wobei der Kolben mit einem Kühlmedium gekühlt wird, welches Aceton und Trockeneis enthält. Metallisches Lithium (150 mg) wird zu dem flüssigen Ammoniak gegeben, und man rührt während 10 Minuten. Die Mischung wird in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst und 100 mg 1a,2cc-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on werden tropfenweise im"Verlauf von 10 Minuten zugefügt.

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Nach der Zugabe wird der Kolben von dem Kühlmedium abgetrennt und 20 Minuten unter Rückfluß des Ammoniaks behandelt. Dann wird der Kolben wieder in das Kühlmedium eingetaucht und 1,5g vollständig trockenes Ammoniumchloridpulver werden langsam im Verlauf von 2 Stunden zugegeben. Der Kolben wird aus dem Kühlmedium entnommen und die Umsetzung wird unter Rühren weitergeführt .

Man hört mit dem Rühren auf, wenn die blaue Farbe der Lösung vollständig verschwindet. Der Kühler wird aus dem Kolben entnommen und Stickstoffgas wird eingeleitet, um das Ammoniak zu entfernen.

Äthylacetat (60 ml) und 60 ml 1n Chlorwasserstoffsäure werden zu dem Rückstand zugegeben, um ihn der Verteilungsextraktion zu unterwerfen. Die abgekühlte Äthylacetatphase wird gut mit Wasser gewaschen und getrocknet und anschließend wird das Äthylacetat bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in 3 ml Äthylacetat gewaschen und durch eine Säule chromatographiert, die Silikagel als Trägermaterial enthält, wobei man ein Eluierungslösungsmittel verwendet, das eine Mischung aus Benzol und Aceton enthält. Man erhält 61 mg gereinigtes Produkt mit den folgenden Eigenschaften: NMR-Spektrum (in C₅D₅N),S (ppm):

0,70 (3H, S, 18-CH₃), 0,99 (3H, S, 19-CH₃), 3,28 (4H, M, 24-H und Hydroxy H), 3,82 (1H, M, 1ß-H), 4,00 (1H, M, 30C-H), 5,50 (1H, M, 6-H)
Massenspektrum (vergl. Fig. 1):

418 (M⁺), 400, 382
Hochresolutionsmassenspektrum:

Gefunden: 418,3428

Berechnet M⁺(C₂₇H₄₆O₃) = 418,3449

Aus den obigen Eigenschaften kann das entstehende Produkt als 1a-24-Dihydroxycholesterin identifiziert werden.

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Beispiel 2

Synthese von 1cc-24-Dihydroxycholesterin (erste Stufe):

Flüssiges Ammoniak (15 ml), welches mit metallischem Natrium getrocknet wird, wird in einen Dreihalskolben eingeschlossen, der mit einem Tropftrichter und einem Trockeneiskühler ausgerüstet ist, während man den Kolben mit einem Kühlmedium kühlt, das Aceton und Trockeneis enthält. Dann werden 400 mg metallisches Natrium zugegeben und man rührt 10 Minuten. Die Mischung wird dann in 18 ml Tetrahydrofuran gelöst und 100 mg ΐα,2α-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on werden tropfenweise im Verlauf von 10 Minuten zugefügt.

Nach der Zugabe werden 1,8 g Ammoniumchloridpulver im Verlauf von 1 Stunde auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 zugegeben. Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt und 69 mg (Ausbeute 68%) eines Produktes, welches das gleiche NMR-Spektrum, Massenspektrum und Hochresolutionsmassenspektrum wie in Beispiel 1 zeigt, werden erhalten. Dieses Produkt wird als 1oc,2a-24-Dihydroxycholesterin identifiziert.

Beispiel 3

(A) Synthese von ΐα-24-Dihydroxycholesterin-tribenzoat

1,25 g 1α-24-Dihydroxycholesterin werden mit 1,55 g \Benzoylchlorid und 20 ml Pyridin vermischt und dann bei 40⁰C während eines Tages umgesetzt. Wasser (5 ml) wird zu der Reaktionsmischung gegeben und dann wird diese mit 50 ml Diäthyläther extrahiert. Die Ätherphase wird mit Säure und dann mit Alkali gewaschen, getrocknet und eingedampft, um den Äther zu entfernen; man erhält rohes 1a,3ß-24-Tribenzoyloxycholest-5-en.

(B) Trennung des 24(R)-Derivats und 24(S)-Derivats von 1oc,3ß-24-Tribenzoyloxycholest-5-en

Eine η-Hexan-Lösung aus 1,58 g rohem 1oc,3ß-24-Tribenzoyloxycholest-5-en wird durch eine Säule chromatographier, die 100 g Silikagel als Carrier-enthält, um es in Fraktionen mit

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jeweils einem Volumen von 50 ml zu teilen. Die Reinheit jeder dieser Fraktionen wird durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie bestimmt und die entsprechenden Fraktionen' werden vereinigt und die Lösungsmittel werden abgedampft. Zwei Epimere mit den folgenden NMR-Spektren werden erhalten. Das weniger polare Epimere (500 mg), das zu einem frühen Zeitpunkt eluiert wird, ist das 24(R)-Derivat, und das stärker polare Epimer (490 mg), das zu einem späteren Zeitpunkt gegen Ende eluiert wird, ist das 24(S)-Derivat. NMR-Spektren von icc,3ß-24(R)-Tribenzoyloxycholest-5-en:

0,65 (3H, S, C-18), 0,92 (3H, S, C-21), 1,01 (6H, b, S, C-25, 26), 1,20 (3H, S, C-19), 5,00 (1H, M, C-24), 5,20 (1H, M, C-3), 5,44 (1H, M, C-1), 5,70 (1H, M, C-6), 7,5 (9H, M, Benzoyl), 8,1 (6H, M, Benzoyl)

NMR-Spektrum von 1cc,3ß-24(S)-Tribenzoyloxycholest-5-en: 0,63 (3H, S, C-18)

Die anderen Spektrumswerte sind die gleichen wie für das 24(R)-Derivat.

Beispiel 4

(A) Synthese von 1a-24-Dihydroxycholesterin-dibenzoat

2,5 g 1oc-24-Dihydroxycholesterin werden mit 2,10 g Benzoylchlorid und 40 ml Pyridin vermischt und die Mischung wird 1 Tag bei 20⁰C stehengelassen.

Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(A) behandelt, wobei man rohes 1 cc-Hydroxy-3ß-24-dibenzoyloxycholest-5-en erhält.

(B) Abtrennung des 24(R)-Derivats und des 24(S)-Derivats von 1oc-Hydroxy-3ß-24-dibenzoyloxycholest-5-en

2,1 g rohes 1a-Hydroxy-3ß-24-dibenzoyloxycholest-5-en werden durch eine Säule chromatographiert<, die 30 g Silikagel enthält, wobei man ein Eluierungslösungsmittel verwendet, das

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eine 200:1-Mischung aus Benzol und Äthylacetat enthält, und in Fraktionen von jeweils 50 ml teilt. Jede der Fraktionen wird der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unterworfen, um ihre Reinheit zu bestimmen. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Lösungsmittel wird abdestilliert, wobei zwei Epimere mit den folgenden NMR-Spektrumswerten erhalten werden.

Das weniger polare Epimer (500 mg, Fp. 168 bis 169°C) ist das 24(R)-Derivat und das stärker polare Epimer (600 mg, Fp. 139,5 bis 140,5°C) ist das 24(S)-Derivat.

NMR-Spektrum von ia-Hydroxy-3ß-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en:

0,67 (3H, S, C-18), 0,96 (6H, b, S, C-19,21), 1,00 (6H, D, J=6 Hz, C-25,26), 3,96 (1H, M, C-1), 5,06 (1H, M, C-24), 5,36 (1H, M, C-3), 5,71 (1H, M, C-6), 7,52 (6H, M, Benzoyl), 8,12 (4H, M, Benzoyl)

NMR-Spektrum von 1a-Hydroxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en: 0,70 (3H, S, C-18)

Die anderen Spektrumswerte sind gleich wie bei dem 24(S)-Derivat.

Beispiel 5

(A) Synthese von 1cc,3ß-24-Triacetoxycholest-5-en

300 mg 1cc-24-Dihydroxycholesterin werden mit 40 ml Essigsäureanhydrid und 125 ml Pyridin 3 Stunden bei 95⁰C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(A) behandelt, wobei man rohes 1a,3ß-24-Triacetoxychölest-5-en erhält. Das rohe Produkt wird durch eine Säule chromatographiert, die Silikagel als Carrier enthält, wobei man ein Eluierungslösungsmittel verwendet, das Benzol enthält, und man erhält 325 mg gereinigtes 1<x,3ß-24-Triacetoxycholest-5-en als öliges, gereinigtes Produkt mit den folgendem NMR-Spektrum und Massenspektrum:

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NMR-Spektrum:

0,67 (3H, S, C-18), 2,02 (9H, S, 3-Acetyl), 4,8 (2H, M, 3α- und 24-H₂), 5,05 (1H, M, 1ß-H), 5,65 (1H, M, 6-H) Massenspektrum:

484 (M⁺-CH₃COOH), 424, 364

(B) Synthese von 1a,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

3OO mg 1oc,3ß-24-Triacetoxycholest-5-en werden mit 90 mg 1,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin in 4,5 ml n-Hexan 15 Minuten unter Rückflußbedingungen umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und das entstehende 5,5-Dimethy!hydantoin und das überschüssige 1,3-Dibrom-5,5-dimethy!hydantoin werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert, man erhält 349 mg einer gelben, öligen Verbindung. Xylol (2,5 ml) wird zu dieser Substanz zugegeben, wobei eine Lösung gebildet wird. Die entstehende Lösung wird tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung, die bei 165⁰C gehalten wird, aus 0,85 ml s-Collidin in 1,9 ml Xylol zugegeben und die Umsetzung wird dann weitere 10 Minuten durchgeführt. Nach der Umsetzung wird das Hydrobromid des s-Collidins durch Filtration abgetrennt und das s-Collidin und Xylol werden bei vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in Diäthyläther gelöst. Die Ätherphase wird mit 1n Chlorwasserstoffsäure und einer 5$igen wäßrigen Lösung aus Natriumbicarbonat und wiederholt mit Wasser gewaschen. Sie wird dann mit Aktivkohle behandelt und der Äther wird bei vermindertem Druck abgedampft, wobei man 310 mg einer gelben, öligen Verbindung erhält. Diese ölige Verbindung wird sorgfältig zweimal durch Säulenchromatographie (Eluierung mit Benzol) unter Verwendung von Kieselsäure chromatographiert, man erhält 69 mg (Ausbeute 23%) eines nichtkristallinen gereinigten Produktes. Aus den folgenden Spektrumswerten wird dieses Produkt als 1a,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien identifiziert.

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UV-Spektrum, λ ^^ano1 (um):
262, 271, 282, 294

NMR-Spektrum:

2,02 und 2,04 (9H, S, CH₃COO-), 4,75 (2H, b, 3«- und 24-H), 5,01 (1H, b, 1Ö-H), 5,35 (1H, D, J=5,5 Hz, 6- oder 7-H), 5,69 (1H, D, J=5,5 Hz, 6- oder 7-H)

Massenspektrum:

542 (M⁺), 514, 482, 422, 362, 249, 204

Beispiel 6

Synthese von 1cc,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

150 mg 1oc,3ß-24-Triacetoxycholest-5-en v/erden mit 45 mg 1,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin in 3 ml n-Hexan 15 Minuten bei Rückflußbedingungen umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und die entstehenden Kristalle werden durch Filtration .entfernt. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert, wobei man eine gelbe, ölige Verbindung erhält. Zu dieser Verbindung gibt man 1,3 ml Xylol. Die entstehende Lösung wird tropfenweise im Verlauf von ungefähr 15 Minuten zu einer Lösung aus 0,25 ml Trimethylphosphit in 4 ml Xylol unter Rückflußbedingungen zugefügt und die Umsetzung wird weitere 90 Minuten weitergeführt. Die Reaktionsmischung wird dann bei einer Temperatur unter 75°C konzentriert, und man erhält 148 mg ölige Verbindung. Diese Verbindung wird auf gleiche V/eise wie in Beispiel 5(B) behandelt. Das Endprodukt zeigt die gleichen UV-, Massen- und NMR-Spektrumswerte wie das ioc,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien, das in Beispiel 5(B) erhalten wurde.

Beispiel 7

Synthese von ia,3ß-24-Tribenzoyioxy-cholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

200 mg 1cc,3ß-24-Tribenzoyloxy-cholest-5-en, das auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(A) beschrieben hergestellt wurde, wer-

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den 15 Minuten unter Rückfluß zusammen mit 55 mg N-Bromsuccinimid in 15 ml Tetrachlorkohlenstoff erwärmt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und die entstehenden Kristalle werden durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird konzentriert und 5 ml Xyxlol werden zu dem Rückstand zugegeben, wobei eine Lösung gebildet wird.

Die entstehende Lösung wird tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung aus 0,2 ml Trimethylphosphit in 4 ml Xylol unter Rückfluß gegeben, und die Mischung wird weitere 90 Minuten am Rückfluß erwärmt.

Die Reaktionsmischung wird dann bei einer Temperatur unter 75°C konzentriert und der Rückstand wird sorgfältig zweimal durch eine Säule chromatographiert, die Kieselsäure enthält, wobei man Benzol als Eluierungsmittel verwendet. Man erhält 50 mg (Ausbeute 25%) eines gereinigten, nichtkristallinen Produktes. Dieses Produkt zeigt die folgenden Spektren und wird als 1a,3ß-24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien identifiziert. UV-Spektrum, Λ

231, 262, 271, 282, 294

NMR-Spektrum:

4,95 (2H, b, 3α-Η und 24-H), 5,32 (2H, b, 1ß-H und 6- oder 7-H), 5,72 (1H, D, J=6 Hz, 6- oder 7-H), 7,49 und 8,02 (15H, M, aromatischer H)

Massenspektrum:

728 (M⁺), 638, 620, 606, 484, 362

Beispiel 8

Synthese von ia,3ß-24(S)-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

1a-Hydroxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt auf gleiche V/eise wie in Beispiel 4(B) beschrieben , wird mit LiAlHi in trockenem Diäthyläther reduziert, wobei 1<x,3ß-24(S) Trihydroxycholest-5-en gebildet wird. Dieses Produkt (180 mg)

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wird dann mit 24 ml Essigsäureanhydrid und 75 ml Pyridin 3,5 Stunden bei 95°C umgesetzt. Das Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(A) behandelt und durch eine Säule chromatographiert, die Kieselgel als Trägermaterial enthält, wobei man 195 mg ict,3ß-24(S)-Triacetoxycholest-5-en erhält.

150 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 5 gereinigt, und man erhält 43,5 mg (Ausbeute 29%) eines gereinigten Produktes mit den folgenden Spektrumswerten. Dieses gereinigte Produkt wird als Ia,3ß-24(S)-Triacetoxycholesta-5,7-dien identifiziert.

UV-Spektrum, λ ^³¹¹⁰¹ (mn):

262, 271, 282, 294
NMR-Spektrum:

202 und 2,04 (9H, S, CH₃COO-), 4,75 (2H, b, c-3-, C-24-H), 5,01 (1H, b, c-1-H), 5,35 (1H, D, J=5-6 Hz, C-6- oder C-7-H), 5,69 (1H, D, J=5-6 Hz, C-6- oder C-7-H) Massenspektrum:

542 (M⁺), 514, 482, 422, 362, 249, 209

Beispiel 9

Synthese von 1cc,3ß-24(S)-Tribenzoyloxy-cholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

100 mg 1oc,3ß-24(S)-Tribenzoyloxy-cholest-5-en, das auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(B) erhalten wurde, werden 15 Minuten unter Rückfluß zusammen mit 23 mg 1 ,3-DiDrOm-S,5-dimethylhydantoin in 16 ml Tetrachlorkohlenstoff erwärmt. Die Reaktionsmischung wird gekühlt und die entstehenden Kristalle werden durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird konzentriert und 2,5 ml Xylol werden zu dem Rückstand gegeben. Die Lösung wird tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung unter Rückfluß aus 0,3 ml s-Collidin in 2 ml Xylol gegeben und dann wird weitere 10 Minuten am Rückfluß erwärmt.

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Nach der Umsetzung wird das Hydrobromid von s-Collidin durch Filtration entfernt und s-Collidin und Xylol werden bei vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird in Diäthylather gelöst. Die Ätherphase wird mit 1n Chlorwasserstoffsäure und einer 5°6igen wäßrigen Lösung aus Natriumbicarbonat und dann wiederholt mit Wasser gewaschen. Die Ätherphase wird getrocknet und der Äther wird bei vermindertem Druck verdampft; man erhält eine gelbe, ölige Verbindung.

Die ölige Verbindung wird sorgfältig zweimal durch eine Säule chromatographiert, die Kieselsäure enthält, wobei man Benzol als Eluierungslösung verwendet; man erhält 28 mg (Ausbeute 28%) eines gereinigten, nichtkristallinen Produktes. Dieses Produkt besitzt die folgenden Spektren und wird als Icx,3ß-24(S)-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien identifiziert.

UV-Spektrum Λ S5^ano1 (mn):

231, 262, 271, 282, 294

NMR-Spektrum:

4,95 (2H, b, C-3 und C-24-Hs), 5,32 (2H, b, C-1 und C-6 oder C-7-H), 5,72 (1H, D, J=6 Hz, C-6 oder C-7-H), 7,49 und 8,02 (15H, M, aromat.Hs)

Massenspektrum:

728 (M⁺), 638, 620, 606, 484, 362

Beispiel 10

Synthese von 1oc-Acetoxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

1<x-Hydroxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird mit Essigsäureanhydrid und Pyridin auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(A) umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 5 beschrieben gereinigt; man erhält 1oc-Acetoxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en.

462 mg ia-Acetoxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en werden mit

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188,6 mg N-Bromsucciniraid in 16 ml Tetrachlorkohlenstoff 30 Minuten unter Rückfluß umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und die erhaltenen Kristalle werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert, wobei man eine gelbe, ölige Verbindung erhält. Zu der Verbindung gibt man 6,8 ml Xylol, um eine Lösung herzustellen. Die Lösung wird tropfenweise zu einer Lösung aus 0,5 ml Trimethylphosphit in 8 ml Xylol unter Rückfluß gegeben und die Umsetzung wird weitere 90 Minuten weitergeführt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung bei vermindertem Druck konzentriert, und man erhält ein öliges Produkt. Dieses Produkt zeigt die folgenden Spektren und es wird als ia-Acetoxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien identifiziert.

UV-Spektrum, Λ ^^ano1 (um):

231, 262, 271, 282, 294

NMR-Spektrum:

2,04 (3H, S, CH₃COO-), 4,7-5,4 (3H, M, 1ß,3a- und 24-H₃), 5,33 (1H, D, J=6 Hz, 6- oder 7-H), 5,70 (1H, D, J=6 Hz, 6- oder 7-H), 7,4 - 8,2 (10H, M, aromat.Hs).

Beispiel 11

Synthese von 1oc,3ß-24(R)-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

1<x-Hydroxy-3ß-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 8 unterworfen. Ein gereinigtes Produkt mit den gleichen UV-, NMR- und Massenspektrenwerten wie das entsprechende S-Epimer, welches in Beispiel 8 erhalten wurde, wird in einer Ausbeute von 28% gebildet. Dieses Produkt wird als 1a,3ß-24(R)-Triacetoxycholesta-5,7-dien identifiziert.

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Beispiel 12

Synthese von 1 cc,3ß-24(R)-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

1a,3ß-24(R)-Tribenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(B) beschrieben, wird dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 beschrieben unterworfen.

Ein gereinigtes Produkt mit den gleichen UV-, NMR- und Massenspektren wie das entsprechende S-Epimer, welches man in Beispiel 9 erhält, wird in einer Ausbeute von 2.1% erhalten. Dieses Produkt wird als 1<x,3ß-24(R)-Tribenzoyloxycholesta-5-dien identifiziert.

Beispiel 13

Synthese von icc-Acetoxy-3ß-24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

1oc-Hydroxy-3ß-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 10 beschrieben unterworfen.

Ein gereinigtes Produkt mit den gleichen UV- und Massenspektren wie das entsprechende S-Epimer, welches man in Beispiel 10 erhält, wird erhalten. Dieses Produkt wird als 1a-Acetoxy-3ß-24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien identifiziert.

Beispiel 14

(A) Synthese von 1 α,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien aus 1 cc,3ß-24-Triacetoxycholest-5-en

Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 5(B) wird ioc,3ß-24-Triacetoxycholest-5-en mit 1 ^-Dibrom-S^-dimethylhydantoin und s-Collidin in η-Hexan umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird mit Säure und Alkali in Äther gewaschen und mit Aktivkohle

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behandelt; man erhält eine rohe Reaktionsmischung, die 1a,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien enthält.

(B) Hydrolyse von 1 α,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien

Das bei (A) oben erhaltene rohe Produkt wird in einer 5%igen Methanollösung von Kaliumhydroxid hydrolysiert, wobei man eine rohe Reaktionsmischung erhält, die 1oc,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien enthält.

(C) Bestimmung der Reinheit von icc,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

Das UV-Spektrum von 100% reinem 1oc,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien beträgt Λ ^^ano1 = 282 nm und das UV-Spektrum von 100% reinem 1oc,3ß-24-Trihydroxy-4,6-dien beträgt Λ

240 nm. Eigene Untersuchungen zeigen, daß das Mischverhältnis zwischen diesen beiden Verbindungen bestimmt werden kann, indem man ihre A _mo -Werte vergleicht.

Das Verhältnis des 5,7-Dien-Derivats und des 4,6-Dien-Derivats in der oben bei (B) erhaltenen rohen Reaktionsmischung wird nach diesem Verfahren bestimmt, und man stellt fest, daß das Molverhältnis von 1 α,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien zu 1oc,3ß-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien ungefähr 3:1 beträgt.

(D) Abtrennung von 1 α,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1<x,3ß-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien (dritte Stufe

(D-1) Abtrennung durch präparative Dünnschichtchromatographie :

Eine im Handel erhältliche Platte für präparative Dünnschichtchromatographie (Silikagel, ein Produkt der Merck Company, 20 cm χ 20 cm χ 0,5 mm) wird in eine Lösung aus Silbernitrat in Acetonitril eingetaucht, um die Platte in einer Menge von ungefähr 1,5 Gew.% Silbernitrat zu imprägnieren, und dann wird die Platte bei 70⁰C 2 Stunden in der Wärme behandelt. Die so

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erhaltene chromatographische Platte wird für die anschließenden Trennstufen verwendet.

Die rohe Reaktionsmischung (30 mg), die man bei (B) oben erhält, wird auf der Platte adsorbiert und längs ungefähr 20 cm mit einer Lösungsmittelmischung aus 6% Methanol und Chloroform entwickelt. Nach dem Trocknen an Luft der Platte wird die Reaktionsmischung erneut mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt. Es treten zwei Banden mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,23 und ungefähr 0,33 auf. Diese Fraktionen werden abgekratzt und mit Äthylacetat aus dem Silikagel extrahiert. Man erhält 17,1 mg (57%) einer farblosen, festen Verbindung (Rf = 0,23) und 6,0 mg (20%) einer farblosen, festen Verbindung (Rf = 0,33).

Ein Teil der Platte wird unter Verwendung von Schwefelsäure angefärbt und eine Bande mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,38 wird festgestellt. Diese Fraktion wird abgekratzt und auf gleiche Weise wie oben beschrieben extrahiert, und man erhält ungefähr 1 mg feste Verbindung.

Diese Produkte besitzen die folgenden Spektren. Das Produkt mit einem Rf-Wert von 0,23 wird als 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien identifiziert; das Produkt mit einem Rf-Wert von 0,33 wird als 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien identifiziert und das Produkt mit einem Rf-Wert von 0,38 wird als 1a-24-Dihydroxycholesterin identifiziert.

(1) Produkt mit einem Rf-Wert von 0,23 (1ct,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien)

UV-Spektrum (vergl. Fig. 2), λ £S^ano1 (mn):

262, 271 (6= 11 000), 282 (£ = 12 000), 294 ( £ = 7000)
NMR-Spektrum (in C,DgO):

0,63 (3H, S, 18-CH₃), 3,30 (1H, M, 24-H), 3,70 (1H, M 1ß-H), 4,08 (1H, M, 3CC-H), 5,30 (1H, D, J=6 Hz, 6- oder 7-H), 5,60 (1H, D, J=6 Hz, 6- oder 7-H)

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Massenspektrum (vergl. Fig. 3):

416 (M⁺), 398, 380, 357, 251, 22?, 197, 157 Fp.: 102 Ms 103⁰C

(2) Produkt mit einem Rf-Wert von 0,33 (icc,3ß-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien)

UV-Spektrum, λ ^^ano1 (am):

233, 240, 248
Massenspektrum:

416 (M⁺), 398, 380

(3) Produkt mit einem Rf-Wert von 0,38 (ioc-24-Dihydroxycholesterin)

Dieses entspricht einer Standardprobe mit einem Rf-Wert von 0,38.

(D-2) Trennung durch Säulenchromatographie:

Silikagel, das im Handel für die Verwendung in der Säulenchromatographie erhältlich ist (C-200, Warenzeichen für ein Produkt der Wako Jyunyaku Kogyo Kabushiki Kaisha), wird mit ungefähr 2 Gew.% Silbernitrat unter Verwendung einer Lösung imprägniert und dann 2 Stunden bei 70°C in der Wärme behandelt. Das Silikagel wird dann in eine Glassäule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 30 cm gepackt. 40 mg der rohen Reaktionsmischung, die man bei (B) oben erhält, werden in die Säule gegossen und mit einer Lösungsmittelmischung eluiert, die Benzol und Äthylacetat enthält. Man teilt in Fraktionen mit einem jeweiligen Volumen von ungefähr 20 ml. Diese Fraktionen werden dann getrennt, wobei man mit Dünnschichtchromatographie und UV-Spektrum die Chromatographie verfolgt.

Wenn das Voluraenverhältnis von Benzol zu Äthylacetat 2:1 bis 1:1 beträgt, werden 7,6 mg (Ausbeute 19%) eines Produktes, entsprechend einem Rf-Wert von 0,33 in (D-1), erhalten. Wenn dieses Verhältnis 1:1 beträgt, werden 19,6 mg (49%) eines Produktes, entsprechend einem Rf-Wert von 0,23, erhalten.

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Diese Produkte werden nach verschiedenen Spektrumswerten identifiziert.

Vergleichsbeispiel 1

In diesem Beispiel wird die Trennung von 1oc,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1a,3ß-24-Trihydroxy-cholesta-4,6-dien mit einem Trägermaterial erläutert, welches Siliciumdioxid, aber kein nichtmetallisches Silber enthält (Vergleich mit der dritten Stufe).

30 mg einer Mischung aus 1oc,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und ia,3ß-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von 3:1, die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(A) und (B) hergestellt wurde und die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(C) identifiziert wurde, wird durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 30 cm unter Verwendung von Silikagel als Trägermaterial geleitet, um sie in ihre Bestandteile zu trennen.

Eine Lösungsmittelmischung aus Benzol und Äthylacetat wird als Entwicklungslösungsmittel in unterschiedlichen Mischverhältnissen von 10:1 bis 1:1 verwendet, und die Ausgangsmischung wird in Fraktionen mit einem Volumen von je ungefähr 20 ml geteilt. Die Trennung wird versucht, wobei man mit Dünnschichtchromatographie und UV-Spektrum die Chromatographie verfolgt. Wenn das Mischverhältnis von Benzol zu Äthylacetat ungefähr 2:1 beträgt, beginnt die Hauptkomponente abzufließen. Analyse der jeweiligen Fraktionen mit UV-Spektrum zeigt, daß in allen analysierten Fraktionen eine Absorption bei 283, 240, 248, 262, 271, 282 und 294 nm beobachtet wird. Daraus folgt, daß, wenn Silikagel als Trägermaterial verwendet wird, das 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien nicht von dem 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien abgetrennt werden kann. Man findet weiterhin, daß sich diese Fraktionen in ihrer Zusammensetzung kaum unterscheiden und daß das Molverhältnis von 5,7-Dien zu 4,6-Dien bei ungefähr 3:1 erhaltenbleibt (vgl. das folgende Vergleichsbeispiel 3).

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Vergleichsbeispiel 2

In diesem Beispiel wird die Trennung von 1cc,3ß-24-Triacetoxy~ cholesta-5,7-dien und 1oc,3ß-24-Triacetoxycholesta-4,6-dien unter Verwendung eines Trägermaterials, das Siliciumdioxid, aber kein nichtmetallisches Silber enthält, erläutert (Vergleich mit der dritten Stufe).

Eine Mischung aus 1a,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien und 1cc,3ß-24-Triacetoxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von 3:1» die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(A) hergestellt wurde und die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(C) identifiziert wurde, wird der präparativen DünnschichtChromatographie unter Verwendung der gleichen Platte, wie sie in Beispiel 14 (D-1) verwendet wurde, unterworfen, wobei man ein Silikagel-Trägermaterial verwendet, welches mit Silbernitrat behandelt wurde (Entwicklungslösungsmittel, 0,4% Methanol-Chloroform). Man stellt mit UV-Spektrum nur einen Flecken bei Rf ungefähr 0,4 fest.

Diese Fraktion wird isoliert, und man erhält eine ölige Substanz, deren UV-Spektrum Absorptionen bei 233, 240, 248, 262, 271, 282 und 294 nm zeigt.

Man stellt fest, daß die Abtrennung von ia,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien aus 1oc,3ß-24-Triacetoxycholesta-4,6-dien nicht gelingt, selbst wenn Silikagel, welches nichtmetallisches Silber enthält, als Trägermaterial verwendet wird (vgl. Vergleichsbeispiel 4).

Beispiel 15

Trennung von 1<x,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1a,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-4,6-dien (dritte Stufe)

1ct-Hydroxy-3ß-24(R)-dibenzoyloxychulest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird auf gleiche V/eise wie in Beispiel 5(A) gezeigt, behandelt, um 1oc-Acetoxy-3ß-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en herzustellen.

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Dieses Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 10 beschrieben behandelt, wobei man eine rohe Reaktionsmischung erhält, welche icc-Acetoxy-3ß-24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien enthält. Die rohe Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(B) hydrolysiert und durch präparative Dünnschichtchromatographie auf gleiche Weise wie in (D-1) beschrieben getrennt.

Die Reaktionsmischung, die 1a,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1oc,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3:1 enthält, kann in die zwei Bestandteile genau getrennt werden.

Das Produkt, das aus dem Flecken abgetrennt wird, der aus 1a,3ß-24.(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien stammt, besitzt die folgenden Eigenschaften.

UV-Spektrum /\ ^^ano1 (mn):

262, 271 (£ 11 000), 282 (11 800), 294 (7000) NMR-Spektrum (CUDgO):

3,25 (1H, M, C-24-H), 3,68 (1H, M, 1ß-H), 4,10 (1H, M, 3<x-H)_f 5,30 (1H, D, J=6 Hz, 6- oder 7-H), 5,60 (1H, D, J = 6 Hz, 6- oder 7-H)
Massenspektrum:

416 (M⁺), 398, 380, 357, 251, 227, 197, 157 Fp.: 96 bis 99°C

Beispiel 16

Trennung von 1oc,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1oc,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-4,6-dien (dritte Stufe)

ict-Hydroxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und getrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben), wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(A) behandelt, v/obei man 1cc-Acetoxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en erhält. Dieses Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 10 beschrieben behandelt, wobei inan eine rohe Reaktionsmischung er-

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hält, die 1oc-Acetoxy-3ß-24(S)-dibenzoylcholesta-5,7-dien enthält. Diese Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(B) hydrolysiert und auf gleiche Weise wie in (D-1). oben durch präparative DünnschichtChromatographie abgetrennt.

Die rohe Reaktionsmischung, die Ia,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1a,3ß-24(s)-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3:1 kann scharf in die beiden Bestandteile getrennt werden.

Das Produkt, das von dem Flecken abgetrennt wird, der auf 1a,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien basiert, besitzt die folgenden Eigenschaften.

UV-Spektrum, Ti*^¹ (mn):

262, 271 (10 800), 282 (11 500), 294 (6900) NMR-Spektrum (in CUDgO):

3,27 (1H, M, C-24-H), 3,67 (1H, M, 1ß-H), 4,10 (1H, M, 3«-H), 5,30 (1H, D, J=6 Hz, 6- oder 7-H), 5,60 (1H, D, J=6 Hz, 6- oder •7-H)
Massenspektrum:

416 (M⁺), 398, 380, 357, 251, 227, 197, 157 Fp.: 120 bis 124°C

Beispiel 17

Synthese von 1a-24(Dihydroxycholecalciferol (vierte Stufe)

16 mg 1oc,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-1) beschrieben, werden in 500 ml Diäthyläther gelöst und diese Lösung wird mit ultravioletten Strahlen 2,5 Minuten bei 5°C in einer Argonatmosphäre unter "Verwendung einer 200 W Hochdruck-Quecksilberlampe (654A-36, Warenzeichen für ein Produkt der Hanovia Company) bestrahlt. Ein Teil der Lösung wird entnommen und ihr UV-Spektrum wird bestimmt. Man beobachtet eine Erhöung in der Absorption bei 262 bis 263 nm, die auf das 1cc-24-Dihydroxyprecholecalciferol zurückzuführen ist. Nach der Umset- ■

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zung wird der Äther bei Zimmertemperatur bei vermindertem Druck abgedampft. Benzol (50 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung erfolgt während 2 Stunden bei Rückfluß des Benzols.

Nach der Umsetzung wird das Benzol bei vermindertem Druck abgedampft, man erhält 16 mg eines farblosen Feststoffs. Dieses Produkt wird sorgfältig durch präparative DünnschichtChromatographie unter Verwendung von Silikagel als Trägermaterial, das ungefähr 1,5/6 Silbernitrat enthält [das auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-1) beschrieben erhalten wurde], abgetrennt (man entwickelt zweimal mit 6% Methanol-Chloroform). Man erhält drei Banden, die durch ultraviolette Strahlen bestätigt werden. Aus der am wenigsten polaren Bande erhält man 2,8 mg farblosen Feststoff. Dieses Produkt besitzt die folgenden Eigenschaften und wird als 1α-24-Dihydroxycholecalciferol identifiziert.

UV-Spektrum (Fig. 4) X^^ano1 (mn) = 265

max

_λ Äthanol _{(nm) = 228}

NMR-Spektrum (C₃D₆O):

0,57 (6H, D, 18-CH₃), 0,87 (6H, D, J=7 Hz, 26- und 27-CH₃), 0,96 (3H, D, J=5 Hz, 21-CH₃), 3,19 (1H, M, 24-H), 4,15 (1H, M, 1ß-H), 4,36 (1H, M, 3oc-H), 4,85 (1H, b, S, 19-H), 5,30 (1H, b, S, 19-H), 6,05 (1H, D, J"_AB = 11 Hz, 6- oder 7-H), 6,26 (1H, D, J_AB = 11 Hz, 6- oder 7-H), Massenspektrum (Fig. 5):

416 (M⁺), 398, 380, 269, 251, 134 Hochresolutionsmassenspektrum:

gefunden: 416,32768

berechnet, M⁺ (C₂₇H₄₄O₃) = 416,32927

Fp.: 84 bis 85⁰C

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Beispiel 18

Synthese von Ict-24(R)-Dihydroxycholecalciferol (vierte Stufe)

10 mg 1a,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 15 beschrieben, werden in 140 ml Diäthyläther gelöst und die entstehende Lösung wird 2 Minuten bei 5⁰C mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Ein Teil der Lösung wird entnommen und sein UV-Spektrum wird bestimmt. Eine Erhöhung der Absorption bei 262 bis 263 nm wird beobachtet, und es wird angenommen, daß dies auf die Vorstufe zurückzuführen ist. Nach der Umsetzung wird der Äther bei Zimmertemperatur und vermindertem Druck abgedampft. Benzol (50 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung wird während 2 Stunden in Argonatmosphäre beim Rückfluß des Benzols durchgeführt.

Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung auf gleiche Weise wie in Beispiel 17 beschrieben behandelt und durch präparative DünnschichtChromatographie getrennt und gereinigt. Aus der am wenigsten polaren Bande werden 1,8 mg farbloser Feststoff erhalten. Dieses Produkt besitzt die folgenden Eigenschaften und wird als 1cc-24(R)-Dihydroxycholecalciferol identifiziert.

UV-Spektrum A^^ano1 (nm) = 265

XIi el Λ

(nm) = 228

NMR-Spektrum (C₃D₆O):

0,59 (3H, S, 18-CH₃), 0,87 (6H, D, J=7 Hz, 26- und 27-CH₃), 3,20 (1H, M, 29-H), 4,14 (1H, M, 1ß-H), 4,42 (1H, M, 3a-H), 4,87 (1H, b, S, 19-H), 5,32 (1H, b, S, 19-H), 6,08 (1H, ^D» ^JAB ^{= 11 Hz}» ⁶" ^{oder 7}~^H)» ⁶>3° (^1H» ^D» ^jab ^{= 11 Hz}» ⁶" oder 7-H)

Massenspektrum:

416 (M⁺), 398, 380, 269, 251 Hochresolutionsmassenspektrum:

gefunden: 416,33084

berechnet (M⁺) = 4.16,32927 (C₂₇H₄₄O₃)

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Beispiel 19

Synthese von 1cc-24(S)-Dihydroxycholecalciferol (vierte Stufe)

15 mg 1a,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 16 beschrieben, werden in 140 ml Diäthyläther gelöst, und die entstehende Lösung wird 2 Minuten bei 5⁰C mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Dann wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 18 beschrieben wiederholt, und man erhält 2,8 rag farblosen Feststoff. Dieses Produkt hatte die folgenden Eigenschaften und wurde als 1oc-24(S)-Dihydroxycholecalciferol identifiziert.

UV-Spektrum Λ S?*²¹⁰¹ (um) = 265
λ j^anol _{(nm) β 228}

NMR-Spektrum (in C₅DgO):

0,58 (3H, S, 18-CH₅), 0,87 (6H, D, J=7 Hz, 26- und 27-CH₃), 3,20 (1H, M, 24-H), 4,14 (1H, M, 1ß-H), 4,42 (1H, M, 30C-H), 4,87 (1H, b, S, 19-H), 5,32 (1H, b, S, 19-H), 6,08 (1H, D, J_AB=11 Hz, 6- oder 7-H), 6,30 (1H, D, J_AB=11 Hz, 6- oder 7-H) Massenspektrum:

416 (M⁺), 398, 380, 269, 251, 134

Hochresolutionsmassenspektrum:

berechnet: 416,33095

gefunden (M⁺): 416,32927 (C₂₇H₄₄O₃)

Beispiel 20

(A) Synthese von 1oc,3ß-24-Triacetoxycholest-5,7-dien aus 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

200 mg 1ct,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und getrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-1) beschrieben, werden mit 2 ml Essigsäureanhydrid und 5 ml Pyridin 3 Stunden bei 95⁰C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird in Eis-Wasser gegeben und mit 40 ml Diäthyläther extrahiert. Die Ätherphase wird mit verdünnter Chlorwasserstoff säure, dann mit Alkali und

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weiter mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der Äther wird verdampft, und man erhält 1a,3ß-24-Triaeetoxycholesta-5,7-dien als hellgelbliche, ölige Verbindung.

(B) Synthese von 1a-24-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat (vierte Stufe)

50 mg ia-24-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat werden in 500 ml Diäthyläther gelöst. Die entstehende Lösung wird mit ultravioletten Strahlen in einer Argonatmosphäre 4 Minuten bei 50⁰C bestrahlt.

Ein Teil dieser Lösung wird entnommen und sein UV-Spektrum wird bestimmt. Eine Erhöhung in der Absorption bei 262 bis 263 nm wird beobachtet, und man nimmt an, daß sie auf die Vorstufe zurückzuführen ist. Nach der Umsetzung wird der Äther bei vermindertem Druck und Zimmertemperatur verdampft. Benzol (100 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung wird während 2 Stunden in Argonatmosphäre unter Rückfluß von Benzol durchgeführt. Nach der Umsetzung wird der Hauptteil des Benzols bei vermindertem Druck abdestilliert und zu dem Rückstand gibt man 2 ml 5%iges Kaliumhydroxid/Methanol, 2 ml Methanol und 2 ml Benzol. Die Mischung wird 1 Tag bei Zimmertemperatur stehengelassen, so daß die Hydrolyse ablaufen kann. Das Reaktionsprodukt wird mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphase wird wiederholt mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wird bei vermindertem Druck abgedampft, man erhält 35 mg einer hellgelben, öligen Verbindung.

Diese Substanz wird durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel als Trägermaterial, welches Silbernitrat enthält, auf gleiche Weise wie in Beispiel 17 beschrieben abgetrennt und gereinigt. Aus der weniger polaren Bande werden 5,7 mg Feststoff erhalten. Da die verschiedenen Spektren und Eigenschaften dieses Produktes vollständig denen von Ια-24-Dihydroxycholeealciferol, welches in Beispiel 17 erhalten wurde, entsprechen, wird das Produkt nach der Isomeri-

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sierung als 1a-24-Diacetoxycholecalciferol-3-acetat identifiziert.

Beispiel 21

(A) Synthese von 1<x,3ß-24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien aus 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

160 mg 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-1) beschrieben, werden mit 410 mg Benzoylchlorid und 15 ml Pyridin umgesetzt.

Die Reaktionsmischung wird mit Wasser verdünnt und mit 40 ml Diäthyläther extrahiert. Die Ätherphase wird mit verdünnter Chlorwasser stoff säure und dann mit Alkali und schließlich mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der Äther wird abgedampft, man erhält 1cc,3ß-24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien als farbloses, amorphes Produkt.

(B) Synthese von 1a-24-Dibenzoyloxycholecalciferol-3ß-benzoat (vierte Stufe)

30 mg 1a,3ß-24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien werden in 500 ml Benzol gelöst und die entstehende Lösung wird mit ultravioletten Strahlen in Argonatmosphäre 2 Minuten bei 10⁰C bestrahlt. Nach der Umsetzung wird die Isomerisierung 2 Stunden in Argonatmosphäre unter Rückfluß von Benzol durchgeführt. Nach der Umsetzung wird der Hauptteil des Benzols bei vermindertem Druck verdampft und 2 ml 5%iges Kaliumhydroxid-Methanol und 2 ml Benzol werden zu dem Rückstand gegeben. Die Mischung wird 28 Stunden bei Zimmertemperatur in Argonatmosphäre gehalten, um die Hydrolyse durchzuführen. Das Reaktionsprodukt wird mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wird bei vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird dem gleichen Trenn- und Reinigungsverfahren wie. in Beispiel 20 unterworfen. Man erhält 1,9 mg 1cc-24~Di-

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hydroxycholecalciferol, das die gleichen Eigenschaften besitzt wie das Produkt, das in Beispiel 20 erhalten wurde.

Aus diesem Ergebnis wird das nach der Isomerisierungsreaktion erhaltene Produkt als 1a-24-Dibenzoylcholecalciferol-3-benzoat identifiziert.

Beispiel 22

(A) Synthese von 1a-Hydroxy-3ß-24-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien aus 1 α,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

250 mg 1 α,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-1) beschrieben, werden mit 210 mg Benzoylchlorid und 5 ml Pyridin vermischt und die Mischung wird 1 Tag bei 23 C stehengelassen. Die entstehende Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 21 beschrieben behandelt, und man erhält 1 oc-Hydroxy-3ß-24-dibenasoyloxycholesta-5,7-dien.

(B) Synthese von 1a-Hydroxy-24-benzoyloxycholecalciferol-3ßbenzoat (vierte Stufe)

20 mg 1a-Hydroxy-3ß-24-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien werden in 500 ml Diäthyläther gelöst. Die Lösung wird mit ultravioletten Strahlen bestrahlt, isomerisiert und auf gleiche Weise wie in Beispiel 21(B) beschrieben hydrolysiert, wobei man 1,9 mg 1α-24-Dihydroxycholecalciferol erhält, das die gleichen Eigenschaften besitzt wie das in Beispiel 20 erhaltene Produkt.

Aus diesen Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt, das man nach der Isomerisierungsreaktion erhält, 1 oc-Hydroxy-24-benzoylcholecalciferol-3ß-benzoat ist.

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Beispiel 25

Synthese von 1oc-24(R)-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat (vierte Stufe)

Das in Beispiel 15 erhaltene 1oc,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 20(A) beschrieben acetyliert, wobei man 1cc,3ß~24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien erhält„ 25 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 20(B) beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß die Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen 2 Minuten durchgeführt wurde. Man erhält 3»4 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften mit denen von 1oc-24(R)-Dihydroxycholecalciferol übereinstimmen.

Aus diesem Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt, das man nach der Isomerisierungsreaktion erhält, 1oc-24(R)-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat ist.

Beispiel 24

Synthese von 1a-24(R)-Dibenzoyloxycholecalciferol-3ß-benzoat (vierte Stufe)

Das 1a,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 21(A) beschrieben benzoyliert, wobei man 1cc,3ß-24(R)-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien erhält« Dieses Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 21(B) beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß 30 mg dieses Produktes verwendet werden und daß die Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen 2 Minuten bei 12°C durchgeführt wird» Man erhält 3,4 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften mit denen von 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol übereinstimmen_o

Danach wird das Produkt nach der Isomerisierungsreaktion als 1 a-24(R)-Dibenzoyloxycholecalciferol-3ß-benzoat identifiziert„

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Beispiel 25

Synthese von 1oc-Hydroxy-24 (R)-benzoyloxycholecalcif erol-3ßbenzoat (vierte Stufe)

Das 1oc,3ß-24 (R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 22(A) beschrieben benzoyliert, um 1a-Hydroxy-3ß-24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien herzustellen,

10 mg dieses Produktes werden auf gleiche V/eise wie in Beispiel 22(B) beschrieben behandelt, und man erhält 1,2 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften denjenigen von 1cc-24(R)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen _o

Aus diesem Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt nach der Isomerisierung 1 cc-Hydroxy-24 (R) -benzoyloxycholecalcif erol-3ßbenzoat ist.

Beispiel 26

Synthese von 1a-24(S)-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat (vierte Stufe)

Das in Beispiel 16 erhaltene 1oc,3ß-24(s)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 20(A) beschrieben acetyliert, wobei 1 α,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien gebildet wird_o 20 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 23 beschrieben behandelt, wobei man 3,1 mg eines Produktes erhält, dessen Eigenschaften denen von 1a-24(S)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen.

Aus diesem Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt nach der Isomerisierungsreaktion 1 oc-24(S)-Diacetoxycholecalcif erol-3ßacetat ist„

Beispiel 27

Synthese von 1a-Hydroxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3ßbenzoat (vierte Stufe)

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Das in Beispiel 16 erhaltene 1a,3ß-24(S)-Trihydroxxcholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 22(A) beschrieben benzoyliert, wobei 1a-Hydroxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien gebildet wird« 15 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 25 beschrieben behandelt, wobei man 1,5 mg eines Produktes erhält, dessen Eigenschaften denen von 1a-24(S)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen. Daraus wird bestätigt, daß das nach der Isomerisierung erhaltene Produkt 1 ct-Hydroxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3ß-benzoat ist.

Beispiel 28

Synthese von 1a-Acetoxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3ßbenzoat (vierte Stufe)

Das auf gleiche Weise wie in Beispiel 27 beschrieben erhal :eno 1oc-Hydroxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 26 beschrieben acetyliert, wobei 1oc-Acetoxy-3ß-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien gebildet wird.

15 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 26 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß die Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen 1 Minute bei 8⁰C durchgeführt wirdo Man erhält 1,5 mg eines Produktes, des-sen Eigenschaften denen von 1oc-24(S)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen» Daraus wird bestätigt, daß das nach der Isomerisierung erhaltene Produkt 1oc-Acetoxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3ß-benzoat ist.

Vergleichsbeispiel 3

Synthese von 1α-24-Dihydroxycholecalciferol aus 1cc,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, das 1oc,3ß-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien enthält (Vergleich mit der vierten Stufe)

10 mg einer Mischung aus 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3:1, die auf gleiche Weise wie in Vergleichs-

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-⁶7- 2528981

beispiel 1 beschrieben erhalten wird, werden in 500 ml Diäthylather gelöst, und die Lösung wird 2 Minuten bei 5°C mit ultravioletten Strahlen bestrahlte Nach der Umsetzung wird der Diäthylather sorgfältig bei vermindertem Druck abgedampft. Zu dem Rückstand fügt man 50 ml Benzol und die Isomerisierung wird 2 Stunden in Argonatmosphäre unter Rückfluß von Benzol durchgeführt. Nach der Umsetzung wird das Benzol abdestilliert, und man erhält 10 mg einer braunen, öligen Verbindung.

Das UV-Spektrum dieses Produktes ist kompliziert, insbesondere besitzt es keine spezifische Absorption des 1α-24-Dihydroxycholecalciferols, welches ein Absorptionsmaximum bei 265 nm zeigt, und die Bildung von 1α-24-Dihydroxycholecalciferol konnte nicht bestätigt werden_o

Dies wurde weiter bestätigt, wenn man die obige Verbindung der präparativen Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel-Trägermaterial, das daran adsorbiert Silbernitrat enthält, unterwirft und das Chromatogramm mit dem Chromatogramm einer Standardprobe von 1α-24-Dihydroxycholecalciferol vergleichtο Das Produkt zeigt keinen Fleck, der der Standardprobe entspricht.

Daraus ist ersichtlich, daß die Reinheit von 1a,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien niedrig ist, 1oc,3ß-24-Trihydroxycholecalciferol durch Isomerisierung unter Verwendung von ultravioletter Bestrahlung nicht gebildet wird»

Vergleichsbeispiel 4

Synthese von 1oc-24-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat aus 1a,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien, das 1oc,3ß-24-Triacetoxycholesta-4,6-dien enthält (Vergleich der vierten Stufe)

10 mg einer Mischung aus 1oc,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien und 1oc,3ß-24-Triacetoxy-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3:1, erhalten auf gleiche Yfeise wie in Vergleichsbeispiel 2 beschrieben, werden in 500 ml Diäthylather gelöst und

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die Lösung wird 2 Minuten bei 5⁰C mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Die Reaktionsmischung färbt sich gelblich-braun„ Nach der Umsetzung wird der Diäthyläther sorgfältig bei vermindertem Druck abdestilliert. Benzol (50 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung wird 2 Stunden in Argonatmosphäre unter Rückfluß des Benzols durchgeführt. Nach der Umsetzung wird die Hauptmenge des Benzols bei vermindertem Druck abdestilliert. Zu dem Rückstand gibt man 1 ml 5%iges Kaliumhydroxid-Methanol und die Mischung wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur in Argonatmosphäre zur Durchführung der Hydrolyse stehengelassen. Nach der Umsetzung wird das Benzol abgedampft und das UV-Spektrum wird bestimmt< > Das Produkt wird der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Die Ergebnisse sind die gleichen wie bei Vergleichsbeispiel 3 und es wurde keine Bildung von 1α-24-Dihydroxycholecalciferol beobachtet«.

Beispiel 29

Einfluß auf die Aktivierung des intestinalen Calciumtransports des 1 α-24-Dihydroxycholecalciferols (1 oc-24-DHCC)

(a) Vergleich mit 1 cc-Hydroxycholecalciferol (Ia-HCC)

Männliche Wistarratten mit einem Körpergewicht von ungefähr 200 g müssen über Nacht fasen, und dann wird ihnen oral 625 ρ Mol einer Lösung von jeweils 1a-24-DHCC und Ia-HCC in Maisöl verabreicht» Nach einer vorbestimmten Zeitdauer wird eine Lösung aus radioaktivem Calciumchlorid ( CaCl₂, 30/uCi/ml) oral verabreichte Der Radioaktivitätsgehalt im Blut wird im Verlauf von 10 bis 60 Minuten bestimmt. Die maximalen Werte werden als Index für die intestinale Calciumabsorption festgesetzte

Einer Kontrollgruppe von Ratten wird Maisöl allein in der gleichen Menge verabreicht. Die Dosis der Maisöllösung von 1a-24-DHCC oder Ia-HCC und des Maisöls betrugen 0,0125 ml/100 g Körpergewicht jeder Ratte, und die Dosis an radioaktiver wäßriger Calciumchloridlösung (pH 7,0) betrug 0,1 ml/100 g Körperge-

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wicht jeder Ratte·

Der Radioaktivitätsgehalt wurde bestimmt, indem man 0,2 ml des Serums in eine Vial-Fläsche gab, 12 ml einer Lösung zugab, die einen Scintillator enthält [enthaltend 1200 ml Toluol, 800 ml Äthylcellosolv, 8 g 2,5-Diphenyloxazol und 300 mg 2,2'-p-Phenylen-bis-(5-phenyloxazol)], und indem man die Radioaktivität mit einem flüssigen Scintillationszähler bestimmte. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Zeit nach der	Radioaktivität	im Serum (cpm)	1 cc-HCC
Verabreichung (Std.)	1α-24-DHCC		95 (4)
Vergleich	275 + 95 (4)+	275 +	221 (4)
4	360 + 150 (4)	697 +	150 (4)
8	996 + 80 (4)	1035 +	210 (4)
12	924 +130 (4)	643 +	28 (4)
24	426 + 61 (4)	332 +

Die Vierte in Klammern zeigen die Anzahl der Ratten in einer besonderen Gruppe an

Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, daß 1a-24-DHCC eine fast gleiche Wirkung besitzt wie Ia-HCC im Hinblick auf die Aktivierung der intestinalen Calciumabsorption.

(b) Vergleich zwischen 1a-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-

DHCC

Männliche Wistarratten mußten über Nacht fasten und dann wird ihnen oral 625 P Mol einer Lösung von je 1a-24(R)-DHCC und 1oc-24(S)-DHCC in Maisöl verabreicht. 8 Stunden nach der Verabreichung werden die Ratten getötet und die intestinale Calciumabsorption wird mit dem umgekehrten gut sac-Verfahren bestimmt [Martin und DeLuca, AmercJ.Physiol.2i6 . 1351 (1969)] Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben»

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Tabelle II

⁴⁵Ca (S/M)

Vergleich 1,29 + 0,16 (4)⁺

1cc-24(R)-DHCC 5,86 + 1,98 (4)

1a-24(S)-DHCC 2,68+0,80 (4)

⁺ Die Zahl in Klammern zeigt die Anzahl der Ratten in einer besonderen Gruppe an

Die Versuchsbedingungen sind die folgenden:

Verwendeter intestinaler Trakt: Duodenum, 7 cm

Menge an Medium, das in das umgekehrte Duodenum gegeben wird, 0,7 ml

Zusammensetzung des Mediums:

NaCl 125 mM Fructose 10 mM

Tris-Cl-Puffer 30 mM (pH 7,4) CaCl₂ 0,25 mM

⁴⁵CaCl₂ 10/uCi/l

Inkubationsbedingungen:

37°C, 90 Minuten

eine gasförmige Mischung aus 95% O₂ und 5% CO₂ wird durchgeleitet

Menge an Flüssigkeit, die für die Radioaktivitätsmessungen verwendet wird 0,1 ml

Die anderen Bedingungen sind gleich wie bei (a) oben«

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß 1<x-24(R)-DHCC eine größere Aktivität zeigt, die intestinale Calciumabsorption zu aktivieren, als 10C-24 (S) -DHCC.

Beispiel 50

Vergleich von Ia-HCC, 1a-24-DHCC, 1a-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC im Hinblick auf die Aktivierung der intestinalen Calciumabsorption

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Das Versuchsverfahren ist gleich wie in Beispiel 29(b). Die erhaltenen Ergebnisse sind in'Tabelle III angegeben.[

)osis

Tabelle III

125 P Mol

625 ρ Mol

3 125 ρ Mol

Vergleich
1 cc-HCC
1α-24-DHCC
1CC-24 (S)SHCC

3,59+0,23 (4) 4,12+0,25 (4) 3,97+0,28 (4)

3,31+0,12 (15)⁺

4,10+0,27 (4) 5,10+0,27 (4) 4,84+0,32 (4) 5,47+0,33 (4)

4,17+0,31 (4) 5,18+0,20 (4) 1a-24(R)-DHCC 4,42+0,41 (4) 5,93+0,33 (4) 5,84+0,39 (4)

⁺ Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Ratten in einer besonderen Gruppe an

Die in Tabelle III aufgeführten Ergebnisse bestätigen die Versuchsergebnisse von Beispiel 29. In anderen Worten, ist die intestinale Calciumabsorption von 1α-24-DHCC mindestens gleich der Aktivität von Ia-HCC und unter 1α-24-DHCC, 1a-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC bestehen die folgenden Beziehungen im Hinblick auf die Fähigkeit, die intestinale Calciumabsorption zu aktivieren:

1a-24(R)-DHCC >1α-24-DHCC > 1a-24(S)-DHCC

Beispiel

31

Vergleich der Knochenabsorptionswirkung zwischen 1α-24-DHCC und Ia-HCC

Männlichen Wistarratten (je mit einem Körpergewicht von ungefähr 150 g) wird subkutan eine wäßrige Lösung aus ^CaCl₂ in

einer Dosis von 50/uCi/Ratte verabreicht und die Ratten werden

/ Λ5

6 Wochen gehalten. Das so verabreichte ^Ca wird schnell absorbiert und ein größerer Teil sammelt sich nach einigen Stunden in den Knochen. 3 Wochen später wird der -^Ca-Gehalt im Blut konstant und nur die Knochen befinden sich in dem spezifisch markierten Zustand. Dies wird durch makroautoradiographische Analyse des gesamten Körpers bestätigt. Die Ratten wer-

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den 6 Wochen gehalten und dann wird ihnen oral kontinuierlich einmal am Tag eine Lösung aus *2 125 P Mol von je Ia-HCC und ia-24-DHCC verabreicht. Blut wird im Verlauf der Zeit entnommen und der Radioaktivitätsgehalt des Serums wird gemäß dem in Beispiel 29(a) beschriebenen Verfahren bestimmte Eine Erhöhung in dem Serum-Radioaktivitätsgehalt wird als Index des Einflusses der Knochenabsorption angesehene Der Kontrollgruppe wird nur Maisöl allein verabreicht. Die Anzahl der Ratten, die untersucht werden, beträgt jeweils 4 in einer Gruppe„ Die erhaltenen Ergebnisse si^nd .in Fig„ 6 dargestellte In dieser Figur bedeutet das Symbol -* einen wesentlichen Unterschied in dem Serum-Radioaktivitätsgehalt, verglichen mit der Vergleichsprobe O

Aus den in Fig_e 6 dargestellten Ergebnissen ist erkennbar, daß bei Ia-HCC die Knochenabsorption beachtlich 2 Tage nach dem Beginn der Verabreichung zunimmt und daß diese Erscheinung mit der Zeit größer wird. Andererseits nimmt bei 1a-24-DHCC die Knochenabsorption nur nach einem Verlauf von 4 Tagen beachtlich zu, aber danach ist das Ausmaß der Erhöhung wesentlich niedriger als bei Ia-HCC (ungefähr 1/3 am 8. Tag). Dies legt nahe, daß 1a-24-DHCC einen schwächeren Knochenabsorptions-Effekt zeigt als Ia-HCC und eine niedrigere Toxizitäto

Beispiel 32

Vergleich der Knochenabsorptionswirkung und der Körpergewichtsänderung zwischen Ia-HCC, 1a-24-DHCC, 1a-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC

Ein ähnlicher Versuch wie in Beispiel 31 beschrieben wird mit den obigen vier Verbindungen durchgeführt» Im Gegensatz zu Beispiel 31 wird der Versuch 3 Wochen nach der Verabreichung von CaCl2 begonnen» Sowohl der Radioaktivitätsgehalt des Serums als auch die gesamte Calciumkonzentration im Serum werden bestimmt. Für die Messung der Calciumkonzentration wird ein Calciumbestimmungssack (hergestellt von Iatron Company) verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV und V angegeben.

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Tabelle IV

Ca-Gehalt im Serum

\ Zeit	O	Serum-Aktivität (cpm)	5	,26 12,9+0,18	7	9
\(Tage)	699+53,	7 621+48,6	,35 12,6+0,23	597+33,9	608+49,3
	690+39,	4 1056+66,8	,16 11,5+0,33	1184+51,1	904+57,1
Vergleich	675+54,	9 948+64,6	700+32,8	661+78,8
1a-HCC
1α-24-DHCC	648+44,	3 874+30,4	778+26,9	681+63,7
1ct-24(R)-
DHCC	780+43,	5 539+45,2	520+53,8	609+91,5
1a-24(S)-		Tabelle V
DHCC		Ca-Gehalt im	Serum
	11,4+0	,32 10,0+0,29	11,1+0,22	10,6+0,15
		10,4 +0,21 14,1+0,29	14,7+0,33	13,8+0,41
Vergleich		11,7+0	11,5+0,23	12,1+0,19
1a-HCC	11,3+0	13,3+0,25	12,8+0,35
1α-24-DHCC	11,2+0	11,2+0,29	11,5+0,24
1a-24(R)-DHCC
1a-24(S)-DHCC

Aus den in den Tabellen IV und V aufgeführten Ergebnissen ist erkennbar, daß die Versuchsergebnisse von Beispiel 31 wieder bestätigt werden«, In anderen Worten zeigen diese Ergebnisse, daß 1α-24-DHCC eine schwächere Knochenabsorptionswirkung als Ia-HCC besitzt,und von 1α-24-DHCC, 1a-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC gilt für die Knochenabsorptionswirkung die folgende Beziehung:

1a-24(R)-DHCC > 1α-24-DHCC > 1a-24(S)-DHCCo

Es ist besonders bemerkenswert, daß bei 1a-24(s)-DHCC kaum eine Knochenabsorptionswirkung beobachtet wird, und diese Wirkung ist fast gleich wie bei. der Vergleichsprobe. Dies legt den Schluß nahe, daß 1α-24(S)-DHCC keinen Einfluß auf die spezifische aktivierende intestinale Calciumabsorption zeigt und dies ist für klinische Anwendungen sehr wichtig.

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Die Änderungen im Körpergewicht, die in dem vorliegenden Versuch bestimmt wurden, sind in Fig. 7 dargestellt. Es ist bemerkenswert, daß 1α-24-DHCC eine größere Änderung im Körpergewicht aufweist als Ia-HCC, und insbesondere zeigt 1a-24(S)-DHCC kaum einen Unterschied im Hinblick auf die Vergleichsgruppe. Dies legt den Schluß nahe, daß, ähnlich wie bei der Knochenabsorption, die Toxizität von 1a-24-DHCC geringer ist als von Ia-HCC.

Beispiel 33

Vergleich der Toxzität zwischen 1a-24-DHCC und Ia-HCC

Die Toxizität von jeder der obigen zwei Verbindungen wird nach bekannten Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Species Geschlecht -^ro (/^usAg)

Verabreichungs- 1a-HCC 1a-24-DHCC verfahren

Maus S per os 474 > 2500

	intravenös	508	33	000 -	3	300
ί		167	3	300 -	1	000
	per os	100		-
t	330 ·

g 744

Aus der obigen Tabelle ist erkennbar, daß die Toxizität von 1 α-24-DHCC ein Zehntel oder weniger von der von 1 a-HCC beträgt. Dieses Ergebnis ist ebenfalls aus den Ergebnissen der Beispiele 31 und 32 ersichtlich.

Aufgrund der in den Beispielen 29 bis 33 erhaltenen Ergebnisse können die Eigenschaften von 1α-24-DHCC mit denen von

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1	als	1/3	1
weniger	als	1/10	1
weniger		1

Ia-HCC, wie sie in Tabelle VII aufgeführt sind, verglichen werden. Bei diesen Werten wird die Aktivität von Ia-HCC als 1 angenommen.

Tabelle VII

Ια-24-DHCC Ia-HCC

Einfluß auf die Aktivierung
der intestinalen Calciumabsorption

Knochenabsorptionswirkung
akute Toxizität

Da gezeigt wurde, daß das erfindungsgemäße 1a-24-DHCC die intestinale Calciumabsorption selektiv aktiviert und eine schwächere Knochenabsorptionswirkung zeigt, verglichen mit bekannten Analogen der aktiven Form von Vitamin D^, wird angenommen, daß es ein sehr wertvolles Arzneimittel ist, welches mit nur wenigen Nebenwirkungen bei der Behandlung von Krankheiten verwendet werden kann, die durch abnormalen Metabolismus von Calcium induziert werden. Insbesondere ist 1a-24(S)-DHCC eine besonders wertvolle Substanz in dieser Hinsicht, und es wird angenommen, daß sie große Verwendung finden wird.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. ) Mischung in beliebigen Verhältnissen von 1cc-24(S)-Dihydroxycholecalciferol und 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der folgenden Formel

   HO

   2. 1a-24(S)-Dihydroxycholecalciferol der folgenden Formel

   OH

   HO

   3β 1α-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der folgenden

   Formel

   509883/1052

   4. 1a-24(S)-Dihydroxycholecalciferol-Derivpt, 1a-24(R)· Dihydroxycholecalciferol-Derivat oder eine Mischung dieser Derivate in beliebigen Verhältnissen, ausgedrückt durch die folgende Formel

   OR,

   R.., Rp und R^ gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß die Struktur der obigen Formel geändert wird, mit dem Proviso, daß mindestens eine der Gruppen R^, Rp und R, eine Schutzgruppe bedeutet.

   5-09883/1 052

   2526881

   5. Mischung in beliebigen Verhältnissen von 1a,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder seinen Derivaten und 1cc,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder seinen Derivaten, ausgedrückt durch die folgende Formel

   DR₂

   R₁, Rp und R^ gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoff atom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoff atom überführbar ist, bedeuten.

   6. 1a,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

   ORp

   R.., R₂ und R, gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoff atom überführbar ist, ohne daß sich die Struktur der obigen Formel ändert.

   509883/1052

   7. 1a,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

   R., Rp und R, gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß sich die Struktur der obigen Formel änderte

   8. 1α-24-Dihydroxycholesterin oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

   (2)

   R/^, Rc und Rg gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß sich die Struktur der obigen Formel ändert.

   509883/1052

   9ο 1α-24(S)-Dihydroxycholesterin oder ein Derivat davon,

   gebildet durch den Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

   OR",

   OR5

   (2-c)

   R% ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder nichtsubstituierte Benzoylgruppe bedeutet und

   R₁- ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeutet, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist·

   10. 1cc-24(R)-Dihydroxycholesterin oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

   CR",

   (2-d)

   worin R" ^ und R,- die in Anspruch 9 gegebenen Bedeutungen besitzen.

   11_β 1a,2a-Epoxy-24~ketocholesta-4,6-dien-3-on der

   folgenden Formel

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   12. Verfahren zur Herstellung von 1α-24-Dihydroxycholesterin der folgenden Formel

   OH

   (2-a)

   OH

   dadurch gekennzeichnet, daß man 1a,2oc-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on der Formel

   (D

   mit einem Alkalimetall und einem Protonendonor in Anwesenheit von flüssigem Ammoniak oder einem flüssigen Amin umsetzte

   13. Verfahren zur Gewinnung eines Benzoylderivats von 1CC-24(S)-Dihydroxycholesterin und eines Benzoylderivats von 1a-24(R)-Dihydroxycholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß

   509883/1052

   man ein Benzoylderivat von 1 oc-24-Dihydroxycholesterin der folgenden Formel

   OR"

   (2-b)

   R¹V eine substituierte oder unsubstituierte Benzoylgruppe bedeutet und

   R₁- ein Wasserstoff atom oder eine Schutzgruppe bedeutet, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, in ein 1cc-24(S)-Epimer und ein 1oc-24(R)-Epimer durch Chromatographie trennt, wobei man ein Trägermaterial verwendet, das mindestens Siliciumdioxid enthält.

   14o Verfahren zur Herstellung von mindestens einer der folgenden Verbindungen wie einem 1a,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dienderivat und einem 1 <x,j5ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dienderivat, ausgedrückt durch die folgende Formel

   OR'

   QRV.

   (3)

   ¹6 gleich oder unterschiedlich sind

   und je eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasser stoff atom

   509883/ 1052

   überführbar ist, ohne daß die Struktur der Formel (3) geändert wird,

   dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine der folgenden Verbindungen, nämlich ein 1cc-24(S)-Dihydroxycholesterinderivat und ein 1a-24(R)-Dihydroxycholesterinderivat, ausgedrückt durch die folgende Formel

   ORV

   (2)

   worin R'a» R¹E und R'g die oben gegebenen Bedeutungen besitzen, mit einem allylischen Bromierungsmittel in einem inerten organischen Medium umsetzt und die entstehende Reaktionsmischung mit einem Dehydrobromierungsmittel behandelt.

   15« Verfahren zur Trennung und Gewinnung von mindestens einer der folgenden Verbindungen, nämlich 1cc,3ß-24(s)- und 1a,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, aus Trihydroxycholesta-4,6-dien durch ein chromatographisches Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung aus mindestens einer der folgenden Verbindung, nämlich 1oc,3ß-24(S)- und 1<x,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien,der folgenden Formel

   OH

   HO

   (3-a)

   und Trihydroxycholesta-4,6-dien der folgenden Formel

   50 9 8 83/1052

   OH

   OH

   als Lösung in einem inerten organischen Lösungsmittel an einem Trägermaterial chromatographiert, das Siliciumdioxid und daran adsorbiert nichtmetallisches Silber enthält.

   16. Verfahren zur Herstellung von mindestens einer der folgenden Verbindungen» nämlich 1oc-24(S)- und 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol und deren Derivate, ausgedrückt durch die folgende Formel

   (5)

   R,, Rp und R^ gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoff atom überführbar ist, ohne die Struktur der Formel (5) zu ändern,

   dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine der folgenden Verbindungen, nämlich 1ce,3ß-24(S)- und 1a,3ß-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien-Derivate," ausgedrückt durch die folgende

   509883/1052

   Formel

   CR

   (3)

   worin R^, R₂ und R-, die oben gegebenen Bedeutungen besitzen, ultravioletter Bestrahlung in einem inerten organischen Lösungsmittel aussetzt und daß man das entstehende Produkt isomerisiert.

   17. Verfahren zur Herstellung von mindestens einer der folgenden Verbindungen, nämlich 1oc-24(S)- und 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol, der folgenden Formel

   OH

   (5-a)

   dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eins der geschützten 1cc-24(S)- und 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferole, ausgedrückt durch die folgende Formel

   509883/1052

   (5¹)

   OR,

   worin R₁, Rp und R, die bei Formel (5) gegebenen Bedeutungen besitzen, mit dem Proviso, daß mindestens eine der Gruppen R^, R2 und R^ eine Schutzgruppe bedeutet, die in ein Wasserstoff atom überführbar ist,

   hydrolysiert oder reduktiv zersetzt, um eine Schutzgruppe abzuspalten.

   18. Pharmazeutisch wirksames Mittel für Warmblüter, - dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1oc-24(S)- und 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel

   (5-a)

   OH

   509883/1052

   enthält.

   19. Pharmazeutisches Mittel für Warmblüter gemäß Anspruch 18, das oral oder durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion verabreichbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1oc-24(S) und I0C-24(R) -Dihydroxycholecalcif erol der Formel (5-a) und ein Trägermaterial enthält, das gegenüber Warmblütern nicht toxisch ist.

   20. Pharmazeutisches Mittel, um den Calciurametabolismus von Warmblütern zu regulieren, nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1a-24(S)- und 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel (5-a) und ein für Warmblüter nichttoxisches Trägermaterial enthält.

   21. Prophylaktisches oder therapeutisches pharmazeutisches Mittel für Vitamin D-Mangelkrankheiten und verwandte Krankheiten nach einem der Ansprüche 18, 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1oc-24(S)- und 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel (5-a) enthält.

   Warmblütern, dadurch gekennzeichnet, daß man eine pharmaz tisch wirksame Menge von mindestens einem 1cc-24(S)-1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferon der Formel (^Q oral, subkutan, intramuskulär oder intravenös ve

   23. Verfahren nach Anspruch--^2, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Menge 0,0>^5is 10/Ug/Tag/kg Körpergewicht des Warmblüters beträgt.

   24. Ver-fanren zur Verhütung oder Regulierung von Krankheiten^iiie durch Vitamin D-Mangel induziert werden, oder ver 2

   509883/1052

   Π3?Γ·

   art

   2S26981

   < kutan, intramuskulär oder intravenös verabreichte

   30. Verfahren zur Verhinderung von Hypojaaicaemie von Haustieren, dadurch gekennzeichnet, daß man^öindestens eine der folgenden Verbindungen, nämlich Ioc^hS)- und/oder 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferpl den Baustieren verabreicht.

   31. Verfahrenj^jam das Legen von weichschaligen Eiern von Geflügel zu verjaei-dön, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens einender folgenden Verbindungen, nämlich 1oc-24(S)- und/ oder jl^24(R)-Dihydroxycholecalciferol, dem Geflügel verab —■

   JJl. Futtermittel für Haustiere und Geflügel, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,2 bis 20/Ug/kg Futtermittel von mindestens einer der folgenden Verbindungen, nämlich 1oc-24(s)- und/oder 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol, enthält ₀

   Angereicherte Milch, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis 1,0yug/l von mindestens einer der folgenden Verbindungen, nämlich 1a-24(S)- und/oder 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol, enthält.

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