CH665835A5 - 1alpha,25-dihydroxy-22z-dehydrovitamin d-verbindung. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG Technisches Gebiet Die Erfindung betrifft eine biologisch aktive Vitamin D-Verbindung, nämlich eine neue lcc,25-dihydroxylierte Vitamin D-Verbindung mit einer 22,23-cis-Doppelbindung in der Seitenkette.

Stand der Technik Die Calcium- und Phosphat-Homöostase bei Tieren und Menschen wird durch Vitamin D-Metaboliten reguliert, und die Verbindung la,25-Dihydroxyvitamin D3 wird allgemein als der aktivste und bedeutsamste vom Vitamin D abgeleitete Regulator des normalen Calcium- und Phosphat-Gleichgewichts angesehen. Dieser natürliche Metabolit und Verbindungen, die ihm strukturell verwandt sind, sind somit von grossem pharmazeutischem Interesse als wirksame Mittel zur Verhinderung und Behandlung von Knochenerkrankungen und verwandten Unregelmässigkeiten des Calcium-Metabolismus. Zusätzlich zu den natürlichen D3-Metaboli-ten sind in den letzten Jahren eine Reihe von Verbindungen hergestellt worden, die aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit Anwendung finden oder als therapeutische Mittel sehr vielversprechend sind, wozu la-Hydroxyvitamin D3, la-Hydro-xyvitamin D;, la,25-Dihydroxyvitamin Di und bestimmte fluorierte Analogverbindungen gehören (US-PSen 3 741 996, 3 907 843, 3 880 894, 4 226 788, 4 358 406). Die meisten der bekannten aktiven Analogverbindungen sind durch den Typ von Sterol-Seitenkette charakterisiert, wie er beim Vitamin D3 auftaucht (d.h. gesättigte Seitenkette). Bekannte Analogverbindungen mit einer 22,23-ungesättigten Seitenkette werden durch die Verbindungen der Vitamin D2-Serie repräsentiert (d.h. 22.23-trans-ungesättigt mit einem C-24-Methyl-substituenten). und umfassen zusätzlich zu den oben angegebenen Verbindungen 25-Hydroxyvitamin D2 (US-PS 3 585 221) und die 24- und 24,25-Dihydroxyderivate (Jones et al., Arch. Biochem. Biophys. 202, 450 (1980)) und drei Verbindungen ohne den 24-Methylsubstituenten (US-PS 3 786 062; Bogoslovskii et al., J. Gen. Chem. USSR, 48_(4) 828 (1978); Chem. Abstr. 89, 163848j, 209016s).

Darstellung der Erfindung Es wurde nun eine neue Analogverbindung des Vitamin D gefunden, welche durch die nachstehende Struktur I dargestellt werden kann;

oH

OH

Diese neue Verbindung ist charakterisiert durch eine 22,23-Doppelbindung in der Seitenkette mit der eis (oder Z)-Geometrie. Aufgrund der Gegenwart dieser 22Z-Doppelbin-dung, welche zu einer Seitenlcettengeometrie führt, die recht unterschiedlich ist von derjenigen der Verbindungen mit der normalen gesättigten Seitenkette (beispielsweise beim la,25-Dihydroxyvitamin D3) oder einer 22,23-trans-(22E)-ungesät-tigten Seitenkette (beispielsweise in la,25-Dihydroxyvitamin D2), wurde angenommen, dass dieses cis-ungesättigte Produkt eine geringe biologische Aktivität aufweisen würde, sofern überhaupt eine biologische Aktivität vorhanden wäre. Überraschenderweise zeigt dieses Material im Gegensatz zu seiner geänderten Seitenkettenstruktur eine hohe Aktivität und ist so aktiv wie la,25-Dihydroxyvitamin D3 in seiner Fähigkeit, die Serum-Calcium-Niveaus bei Testtieren zu erhöhen.

Das neue erfindungsgemässe Produkt, die obige Verbindung I, wurde aus einem 22Z-Dehydrovitamin D-Vorläufer mit der nachstehenden Struktur II hergestellt durch enzyma-tische Hydroxylierung in vitro am Kohlenstoffatom 25 unter Verwendung einer Leben-Homogenat-Präparation von Ratten mit einem Vitamin D-Mangel.

OH

Ho

Das folgende Vorgehen wurde angewendet; Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Diät mit geringem Calcium - und Vitamin D-Mangel, wie sie von Suda et al. [J. Nutr. 100, 1049 (1970)] beschrieben wurde, für zwei Wochen gefüttert. Sie wurden durch Enthauptung getötet und ihre Lebern wurden entfernt. Ein 20% (w/v)-Homogenat wurde in eiskalter 0,25 M Sucrose hergestellt. Die Inkubation wurde durchgeführt in 10 ml Inkubationsmedium in einem 125 ml fassenden Erlenmayer-Kolben der ein Aliquot des Leberho-mogenats enthielt, bestehend aus 1 g Gewebe, 0,125 M Sucrose, 50mM Phosphatpuffer (pH 7,4), 22,4 mM Glucose-6-phosphat, 20 mM ATP, 160 mM Nicotinamid, 25 mM Suc-cinat, 0,4 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0,1 M KCl und 0,5 Einheiten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 400 (j.g des Substrats, der obigen Verbindung I, gelöst in 100 (il 95%igen Ethanols, initiiert. Das Inkubationsgemisch wurde bei 37 °C inkubiert unter Schütteln mit 80 Schwingungen/Minute für 3 Stunden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ml Methanol und 10 ml Dichlormethan abgebrochen. Nach weiterer Zugabe von 10 ml Dichlormethan wurde die organische Phase gesam5

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melt, während die wässrige Phase mit 10 ml Dichlormethan erneut extrahiert wurde. Die organischen Phasen aus den gesamten drei Extraktionen wurden vereint und mit einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand, welcher das gewünschte Produkt enthielt, wurde in 1 ml eines Gemisches von CHCl3:Hexan (65:35) gelöst und auf eine mit Sephadex LH-20 gepackte Säule (0,7 cm x 14 cm) aufgebracht, equi-libriert und mit demselben Lösungsmittel eluiert. Die ersten 10 ml wurden verworfen, während die folgenden 40 ml gesammelt und eingedampft wurden. Der Rückstand wurde sodann gelöst in 8%igem 2-Propanol in Hexan und einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterworfen (Modell LC/GPC 204 HPLC, Firma Waters Associates, Medford, MA) unter Verwendung einer Zorbax-SIL-Säule (4,6 mm x 25 cm, DuPont, Wilmington, Delaware), die unter einem Druck von 1000 psi mit einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wurde. Das gewünschte 25-hy-droxylierte Produkt wurde bei 44 ml eluiert. Dieses Produkt wurde weiter durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromato-graphie gereinigt, wobei eine Umkehrphasen-Säule verwendet wurde (Richrosorb Rp-18, 4,6 mm x 25 cm, E. Merck, Darmstadt, West-Deutschland), die unter einem Druck von 1200 psi und einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wurde. Die Säule wurde mit 22% H20 in Methanol eluiert und die Verbindung wurde bei 50 ml eluiert. Dieses Produkt wurde ferner durch HPLC gereinigt, wobei die Zorbax-SIL-Säule und die oben beschriebenen Bedingungen verwendet wurden. Das erhaltene Produkt wurde sodann der physikalischen Charakterisierung unterworfen.

Die UV-Absorption des Produktes in 95%igem Ethanol zeigte ein A.max = 265 nm und ein Xmi„ = 228 nm, wodurch das Vorhandensein des 5,6-cis-Trien-chromophoren angezeigt wurde.

Das Massenspektrum der Substanz enthält ein Molekülion bei m/e 414, wie es für ein 25-hydroxyliertes Produkt erforderlich ist. Die Eliminierung von einem und zwei Molekülen H20 ergibt Fragmentionen bei m/e 396 und 378. Der Verlust der gesamten Steroid-Seitenkette (Abspaltung der C17/C20-Bindung) führt zu dem Fragment m/e 287, welches durch Eliminierung von einem oder zwei Molekülen H20 zu den Peaks bei m/e 269 und 251 führt. Das Spektrum zeigt deutliche Peaks bei m/e 152 und 134 (152-H20), welche Ring A-Fragmente repräsentieren und Hinweise für la,3ß-Dihydroxyvitamin D-Verbindungen sind. Zusätzlich zeigt das Spektrum einen sehr deutlichen Fragmentpeak bei m/e 59, welcher sich aus der Abspaltung der C24/C25-Bindung ergibt. Das Vorhandensein dieses Ions bestätigte die Gegenwart der 25-Hydroxygruppe in dem Produkt. Somit bestätigten diese Daten die Struktur des Produktes, welches als die la,25-dihydroxylierte Verbindung erhalten wurde, welche durch die obige Struktur I dargestellt ist.

Die biologischen Aktivitäten der neuen Analogverbindungen wurden durch in vivo-Versuche bei Ratten demonstriert. Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Diät mit einem geringen Calcium- und Vitamin D-Mangel nach Suda et al. (obige Literaturangabe) für 3 Wochen gefüttert. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 5 Ratten eingeteilt. Die Ratten in einer Kontrollgruppe empfingen 0,05 ml 95%igen Ethanols intrajugular, während die Ratten in den anderen Gruppen 325 pMol der Verbindung I oder von la,25-Dihydroxyvitamin D3 gelöst in 0.05 ml 95%igem Ethanol erhielten. 18 Stunden später wurden sie durch Enthauptung getötet und das Blut wurde gesammelt. Das Serum, welches durch_Zentrifugieren des Blutes erhalten wurde, wurde mit 0,l%iger Lanthanchlorid-Lösung (1:20) verdünnt und die Serum-Calcium-Konzentration wurde mit einem Atomabsorptions-Spektrophotometer ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt:

Ansteigen der Serum-Calcium-Konzentration in Ansprache auf eine Einzeldosis von 325 pMol der Verbindung I oder von la,25-Dihydroxy vitamin D3, welche 18 Stunden vor der Tötung verabfolgt werden 5 Verabfolgte Serum-Calcium-Konzentration

Verbindung (mg/100 ml) ± Standardab weichung

Ethanol 4,2 ± 0,1a)

io Verbindung I 5,2 ± 0,2 b)

1 a,25-Dihydroxy vitamin D3 5,4 ± 0,4b)

b) ist deutlich unterschiedlich vona) p <0.001

Die obigen Ergebnisse zeigen dass die neue Analogver-15 bindung in hohem Masse wirksam ist und eine biologische Aktivität aufweist, die im wesentlichen zu derjenigen von la,25-Dihydroxy vitamin D3 äquivalent ist.

Aufgrund dieser hohen Wirksamkeit wird diese erfin-dungsgemässe Verbindung als ein therapeutisches Mittel An-20 wendung finden in der Therapie oder Prophylaxe von Erkrankungen derartig verschiedener Arten, wie Rachitis, Hy-poparathyroidismus, Knochendystrophie, Knochenerweichung oder Osteoporose beim Menschen oder zur Behandlung von verwandten Calcium-Mangelerkrankungen (z.B. 25 Milchfieber, Beinschwäche, geringe Eierschalenstärke) bei Tieren. In gleicher Weise kann die Verbindung bei der Behandlung von bestimmten malignen Erkrankungen angewandt werden, wie bei Leukämie beim Menschen.

Zu therapeutischen Zwecken kann die Verbindung nach so jeder herkömmlichen Verabfolgungsweise und in jeder geeigneten Form für die ausgewählte Verabfolgungsweise verabfolgt werden. Die Verbindung kann mit jedem verträglichen und unschädlichen pharmazeutischen Träger in Form von Pillen, Tabletten, Gelatinekapseln oder Suppositorien oder 35 in Form von Lösungen, Emulsionen, Dispersionen oder Suspensionen in unschädlichen Lösungsmitteln oder Ölen formuliert werden, und derartige Formulierungen können auch andere therapeutisch wirksame und vorteilhafte Bestandteile enthalten, wie sie für die spezifischen Anwendungen geeignet 40 sein können. Für Anwendung beim Menschen wird die Verbindung vorteilhafterweise in Mengen von 0,25 bis 10 (ig pro Tag verabfolgt, wobei die spezifische Dosierung in Übereinstimmung mit der zu behandelnden Krankheit und mit der medizinischen Entwicklung, dem Zustand und dem Anspre-45 chen des Patienten ausgewählt wird, wie dem Fachmann vertraut ist.

Das 22Z-Dehydro-Vorläufersubstrat, die obige Verbindung II, welche für die Herstellung des neuen Produktes gemäss der Erfindung erforderlich ist, wird selber nach dem 50 Verfahrensschema I gemäss Anlage und gemäss nachfolgender Beschreibung hergestellt. In der Beschreibung beziehen sich die Verbindungsbezeichnungen nach arabischen Ziffern (z.B. (1), (2), (3), etc.) auf die so durchnumerierten Strukturen in dem Verfahrensschema. Das gewünschte Substrat 55 (Verbindung II) für die oben beschriebene 25-Hydroxylie-rungsreaktion wird durch die arabische Ziffer (11) im Verfahrensschema I und in der folgenden Beschreibung identifiziert.

(22Z)-3ß-(Methoxymethoxy)- 5a,8a-(4 -phenyl-1,2-urazol)-60 cholesta -6,22-dien (2)

Isopentylphosphoniumbromid [(CH3)2CHCH2CH2PPh3Br] (1,67 g, 4,04 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (73 ml) wurde mit n-Butyllithium (1,7 M Lösung in Hexan, 2,42 ml, 4,11 mMol) bei 3-5 °C 65 unter Rühren behandelt. Nach 1-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die orange-rote Lösung auf 3 °C gekühlt und der Aldehyd (1) (1,84 g, 3,36 mMol in wasserfreiem Tetrahydrofuran (24 ml) wurde zugesetzt. Das farblose

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Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur (1H, m, 3-H), 5,20 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,69 und gerührt und sodann in Wasser eingegossen und mit Benzol 5,95 (2H, ABq, J = 12 Hz, 7-H und 6-H); UVX,max 261 nm,

extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit 5% HCl, ge- ^mm 234 nm.

sättigtem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, ge- Die thermische Isomerisierung dieser Provitamin-Zwi-

trocknet (Na2S04) und unter vermindertem Druck zu einem 5 schenverbindung (56 mg, 0,15 mMol) in unter Rückfluss sie-Ö1 eingeengt, welches über einer Säule mit Silikagel gereinigt dendem Ethanol (3 Stunden) ergab die ölige Vitamin-Ana-

wurde. Die Eluation mit einem Gemisch von Benzol-Ether logverbindung (5) (43 mg, 77%) nach der Trennung mittels

(94:6) lieferte das Addukt (2) (1,38 g, 68%) als einen HPLC. NMR 5 0,60 (3H, s, 18- H3), 0,89 und 0,90 (6H, je-

Schaum: NMR 5 0,83 (3H, s, 18-H3), 0,89 und 0,91 (6H, je- weils d, J = 6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J = 6,6

weils d, J = 6,8 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J=6,8 io Hz, 21-H3), 3,96 (1H, s, 3-H), 4,82 und 5,05 (2H, jeweils

Hz, 2I-H3). 0,98 (3H, s, I9-H3), 3,30 (IH, dd, J, =4,4 Hz, schmales Multiplet, 19-H2), 5,20 (2H, br m, 22-H und -

J, = 14 Hz, 9-H), 3,38 (3H, s, OC H3), 4,33 (1H, m, 3-H), 23-H), 6,04 und 6,24 (2H, ABq, J = 11,4 Hz, 7-H und 6- H);

4,70 und 4,81 (2H, ABq, J=6,8 Hz, 0CH20), 5,21 (2H, br UV^max 265,5 nm, Xmin 228 nm; IR: 3427, 1458, 1379, 1048,

m, 22-H und 23-H), 6,23 und 6,39 (2H, ABq, J = 8,5 Hz, 966, 943, 892 cm"1; Massenspektrum m/z 382 (M+, 21), 349

6-H und 7-H), 7,41 (5H, br m, Ar-H); IR: 1756, 1703, 1601, « (5), 271 (8), 253 (14), 136 (100), 118 (82). Die Vitamin-Ana-

1397, 1046 cm"1; Massenspektrum m/z 601 (M+ , 1%), 426 logverbindung (5) ist eine bekannte Verbindung (Bogoslovs-

(4), 364 (61), 349 (16), 253 (18), 251 (18), 119 (PhNCO, 100). kii et al., obige Literaturangabe).

(22Z)-5a,8a- ( 4-Phenyl-l ,2-urazoljcholesta -6,22-dien- 5ß-o/

(3).

Eine Lösung des Addukts (2) (601 mg, 1 mMol) und p-Toluolsulfonsäure (523 mg, 2,75 mMol) in einem Gemisch aus Methanol (20 ml)-THF (12 ml) wurde 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in gesättigtes Natriumbicarbonat eingegossen und einige Male mit Benzol extrahiert. Die Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na2S04) und unter vermindertem Druck eingedampft. Die Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (Benzol-Ether 70:30 als Eluationsmittel) ergab das Hydroxyaddukt (3) (550 mg, 99%) als einen Schaum: NMR 5 0,83 (3 s, I8-H3), 0,89 und 0,91 (6H, jeweils d, J = 6,8 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,95 (3H, s, 19-Hj), 0,98 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H3), 3,16 (lH,dd, J, =4,4 Hz, J2= 14 Hz, 9-H), 4,44 (1H, m, 3-H), 5,22 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,22 und 6,39 (2H, ABq, J = 8,5 Hz, 6-H und 7-H), 7,40 (5H, br m, Ar-H; IR: 3447, 1754, 1700, 1600, 1397 cm-1; Massenspektrum m/z 557 (m+, 1%), 382 (35), 349 (33), 253 (20), 251 (33), 119 (100), 55 (82).

(22Z)-Cholesta-5,7,22-trien-3$-ol (4)

Das Addukt (3) (530 mg, 0,95 mMol) wurde in das Dien

(4) überführt durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid (1 g) in Tetrahydrofuran (60 ml) unter Rückfluss für 18 Stunden. Nach der herkömmlichen Aufarbeitung wurde das Produkt durch Chromatographie über Silika gereinigt (Benzol-Ether 94:6 als Eluationsmittel), um das reine Dien (4 ) (290 mg, 76%) nach der Umkristallisation aus Ethanol zu

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ergeben Schmelzpunkt 148-151 "C; [a] ^ =-132"

(c = 0,9, CHC13); NMR § 0,66 (3H, s, 18-H3),0,90 und 0,91 (6H, jeweils d, J = 6,8 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,96 (3H, s, 19-Hj), 0,98 (3H, d, J = 6,9 Hz, 21-H3), 3,64 (1H, m, 3-H), 5,20 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,39 und 5,57 (2H, ABq, J = 6 Hz, 7-H und 6-H); UVmax 281 nm; IR: 3346, 1463, 1375, 1364, 1067, 1040, 831 cm-1; Massenspektrum m/z 382 (M~\ 100), 349 (65), 323 (32), 271 (15), 253 (30).

(5Z,7E,22Z)-9,10 -Secocholesta-5,7,10( 19),22 -tetraen-3f>-

ol (5)

Die Bestrahlung des 5,7-Diens (4) (150 mg, 0,39 mMol), welches in Ehter (120 ml) u Benzol (30 ml) (mit Argon für 40 Minuten entgast) gelöst war, wurde bei 0 C für 13 Minuten unter Verwendung einer UV-Lampe und eines Vycor-Filters durchgeführt. Die HPLC (1% von 2-Propanol in Hexan) des erhaltenen Gemisches lieferte das Provitamin (56,9 mg, 38%) als ein farbloses Öl: NMR 5 0.75 (3H, s, 18-CH3), 0,90 und 0.91 (6H, jeweils d, J = 6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0.99 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H3), 1,64 (3H, s, 19-H3), 3,90

1-Hydroxylierung der Verbindung (5)

20 Frisch umkristallisiertes p-Toluolsulfonylchlorid (50 mg, 0,26 mMol) wurde zu einer Lösung des Vitamins (5) (50 mg, 0,13 mMol) in wasserfreiem Pyridin (300 |il) zugesetzt. Nach 30 Stunden bei 4 C wurde das Reaktionsgemisch in Eis/gesättigte NaHC03 unter Rühren eingegossen. Das Gemisch 25 wurde 15 Minuten gerührt und mit Benzol extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit gesättigter NaHC03, gesättigtem Kupfersulfat und Wasser gewaschen, getrocknet (Na2 S04) und unter vermindertem Druck eingeengt, um das ölige Tosylat (6) zu ergeben. Das rohe Tosylat (6) wurde mit 30 NaHC03 (150 mg) in wasserfreiem Methanol (10 ml) behandelt und das Gemisch wurde 8,5 Stunden bei 55 C gerührt. Nach dem Kühlen und dem Einengen auf 2 ml wurde das Gemisch mit Benzol (80 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na2S04) und unter vermindertem Druck 35 eingeengt Die ölige 3,5-Cyclovitamin D-Verbindung (7), die so erhalten wurde, war von hinreichender Reinheit, um für die folgende Oxidationsstufe ohne jegliche Reinigung verwendet zu werden. Zu einer heftig gerührten Suspension von Se02 (5,1 mg, 0,046 mMol) in wasserfreiem CH2C12 (5 ml) 40 wurde tert.-Butylhydroperoxid (16,5 (il, 0,118 mMol) zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde wasserfreies Pyridin (50 |il) zugesetzt und das Gemisch wurde weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit CH2C12 (3 ml) verdünnt und auf 0 C gekühlt. Das rohe 3,5-Cyclvitamin-Produkt (7) in 45 CH2C12 (4,5 ml) wurde sodann zugegeben. Die Reaktion schritt bei 0 C für 15 Minuten fort und das Reaktionsgemisch wurde sodann langsam (30 Minuten) auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Gemisch wurde in einen Trenntrichter überführt und mit 30 ml 10%iger NaOH ge-50 schüttelt. Ether (150 ml) wurde zugesetzt und die abgetrennte organische Phase wurde mit 10%iger NaOH, Wasser gewaschen und über Na2S04 getrocknet. Die Einengung zur Trockne unter vermindertem Druck ergab einen gelben öligen Rückstand, der gereinigt wurde über einer Silikagel-55 TLC-Platte unter Entwicklung mit 7:3 Hexan-Ethylacetat und das 1-Hydroxycyclovitamin-Produkt (20 mg, 37%) ergab: NMR S 0,59 (3H, s, 18- H3), 0,63 (IH, m, 3-H), 0,89 und 0,90 (6H, jeweils d, J = 6,9 Hz, I6-H3 und 27-H3), 0,96 (3H, d, J = 6,9 Hz, 21-H3), 3,25 (3H, s, -OCH3), 4,17 (2H, 60 m, 1-H und 6-H), 4,96 (1H, d, J = 9,3 Hz, 7-H), 5,1-5,4 (4H, br m, 19-H->, 22-H und 23-H); Massenspektrum m/z 412 (M+, 26), 380 (48), 339 (22), 269 (28), 245 (20), 135 (100). Dieses Produkt setzte sich hauptsächlich zusammen aus der la-Hydroxycyclovitamin D-Verbindung der Struktur 65 (8), wie auch aus einer geringen Menge des entsprechenden lß-Hydroxy-Epimeren. Diese Komponenten können in dieser Stufe getrennt werden, sofer dies gewünscht wird, jedoch ist eine derartige Trennung nicht erforderlich.

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Das nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene 1-H-droxycyclovitamin-Produkt (18 mg) wurde erhitzt (55 "C/15 min) in Eisessig (0,8 ml), das Gemisch wurde neutralisiert (Eis/gesättigte NaHC03) und mit Benzol und Ether extrahiert, um nach der HPLC (1,5 % von 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel)-Trennung die reinen la-Hydroxy-3ß-acetoxyvitamine (9) (6,60 mg, 34%, Eluation bei 42 ml) und (10) (4,20 mg, 22%, Eluation bei 50 ml) zu ergeben.

Verbindung (9): NMR 5 0,60 (3H, s, 18-H3), 0,90 und 0,92 (6H, jeweils d, J = 7,0Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H3), 2.04 (3H, s, -OCOC H3), 4,41 (1H, m, 1--H), 5,02 (1H, schmales Multiplet, 19-H) 5,1-5,4 (4H, br m, 3-, 19-, 22- und 23-H, 6,03 und 6,35 (2H, ABq, J= 11,4 Hz, 7-H und 6-H); UVX.max 264,5 nm, X min 227,5 nm; Massenspektrum m/z 440 (M+, 10), 380 (72), 362 (7), 269 (31), 251 (12), 135 (100), 134(99).

Verbindung (10 ): NMR § 0,60 (3H, s, 18-H3), 0,90 und 0,91 (6H, jeweils d, J = 7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J = 6,9 Hz, 21-H3), 2,05 (3H, s, -OCOCH3), 4,49 (1H, m, 1-H), 5,00 und 5,14 (2H, jeweils schmales Multiplet, 19-H2), 5,20 (3H, br m, 3-, 22- und 23-H), 5,82 und 6,59 (2H, ABq, J = 12,0 Hz, 7-H und 6-H); UVXmax 270 nm, /,min 228 nm; Massenspektrum m/z 440 (M+, 4), 380 (30), 269 (10), 135 (100), 134 (52).

Hydrolyse des 3ß-Acetoxyrestes in den Verbindungen (9) und (10)

Jede der 3ß-Acetoxy-Derivate (9) und (10) wurde getrennt hydrolysiert unter Verwendung des gleichen Verfahrens. Eine Lösung von 3 ß-Acetoxyvitamin (0,7-6 mg) in Ethanol (0,1 ml) wurde mit 10% KOH in Methanol (0,8 ml) behandelt und das Gemisch wurde für 1 Stunde auf 50 C erhitzt. Nach der üblichen Aufarbeitung und der abschliessenden HPLC-Reinigung (8% von 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel) wurden die entsprechenden 1-Hydroxy vitamine erhalten, nämlich:

Verbindung (11): NMR Ô 0,59 (3H, s, 18-H3), 0,89 und 0,90 (6H, jeweils d, J = 7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,96 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H3), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,43 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, schmales Multiplet, 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 5 22- und 23-H), 6,02 und 6,39 (2H, ABq, J = 11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV/,niilx 264,5 nm, À,min 227,5 nm; Massenspektrum m/z 398 (M+, 21), 380 (8), 287 (6), 269 (7), 251 (5), 152 (36), 134 (100). (Eluationsvolumen 39 ml).

Verbindung (12): NMR 5 0,61 (3H, s, 18-H3), 0,89 und 10 0,91 (6H, jeweils d, J = 7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H, d, J = 6,9 Hz, 21-H3), 4,25 (1H, m, 3-H), 4,51 (1H, m, 1-H), 4,98 und 5,13 (2H, jeweils schmales Multiplet, 19-H2), 5,21 (2H, br , 22-H und 23-H), 5,89 und 6,59 (2H, ABq, J = 11,5 Hz, 7-H und 6-H); VA,max 273 nm, Âmin229,5 nm; Massen-15 Spektrum m/z 398 (M+, 17), 380 (4), 287 (5), 269 (5), 251 (4), 152 (29), 134 (100). (Eluationsvolumen 38 ml).

In dem oben beschriebenen Verfahren wurde die Hoch-druck-Flüssigchromatograhie (HPLC) durchgeführt mittels einer Vorrichtung der Firma Waters associates, Modell 20 ALC/GPC 204 unter Verwendung einer Säule mit Zorbax-Sil (DuPont) (6,2 mm x 25 cm Säule, Fliessgeschwindigkeit 4 ml/min, 1500 psi). Die Säulenchromatographie wurde durchgeführt mit Silikagel 60, 70-230 mesh ASTM (Merck). Die präparative Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde 25 durchgeführt über Silica 60 PF-254 (Platten mit 20 x 20 cm, 1 mm Silicagel). Die Bestrahlung wurden durchgeführt durch Verwendung einer Quecksilberdampf-Bogenlampe Hanovia 608A36, welche mit einem Vycor-Filter ausgerüstet war. Alle Reaktionen werden vorzugsweise unter einer Inertgasatmosphäre (z.B. Argon) durchgeführt.

Die erfmdungsgemässe Verbindung kann, sofern dies gewünscht wird, in kristalliner Form durch Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln, wie Hexan, Ethern und Alkoholen (absolut oder wässrig) und Gemischen davon er-3; halten werden, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet bekann ist.

30

Verfahrensschema I

um'CHjOCH,

(2) R»CH,OCH, ' <11 R*H

l£> R-H 16) R«T«

(â) X,*Actl»l m> X,«H

(£1 X,*Ac«trl (12) X| « H

c

Claims (3)

1. 665 835
2. 2. Verbindung nach Anspruch 1 in kristalliner Form.

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verbindung der Struktur oM

   Oh

   HO
3. 3. Pharmazeutische Formulierung, welche die Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten enthält.