-
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren
zur Herstellung des hormonell aktiven, natürlichen Metaboliten 1α,24-Dihydroxy-Vitamin
D2 sowie auf Zwischenprodukte, die im Zuge
dieser Herstellung erzeugt werden. Die Erfindung bezieht sich weiters
auf ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung,
die eine pharmazeutisch wirksame Menge an 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D2 enthält.
-
Vitamin D und seine aktiven Metaboliten
sind bekannterweise wichtig für
die Regulierung des Calciumstoffwechsels bei Tieren und Menschen.
Die natürliche,
bei Tieren und Menschen vorkommende Form von Vitamin D ist Vitamin
D3. Es ist herausgefunden worden, dass Vitamin
D3 sowohl beim Tieren als auch bei Menschen
dadurch aktiviert wird, dass es an der C25-Position
in der Leber hydroxyliert wird und darauf eine 1α-Hydroxylierung in der Niere
folgt, um das Hormon 1α,25-Dihydroxy-Vitamin
D3 ["1,25-(OH)2D3"]
zu bilden (siehe US-A-3.880.894). Der wichtigste physiologische
Weg zum Verlust von Vitamin-D3-Metaboliten,
25-Dihydroxy-Vitamin D3 und 1,25-(OH)2D3 wird durch C24-Oxidation ausgelöst.
-
Holick, M. F., Kleiner-Bossallier,
A., Schnoes, H. K., Kasten, P. M., Boyle, I. T. und DeLuca, H. F.,
J. Biol. Chem. 248, 6691–6696
(1973).
-
Vitamin D2 ist
die wichtigste, natürlich
vorkommende Form von Vitamin D, die in Pflanzen gefunden werden
kann. Vitamin D2 unterscheidet sich in seiner
Struktur von Vitamin D3 insofern, dass Vitamin D2 an der C24-Position
eine Methyl-Gruppe und eine Doppelbindung zwischen C22 und
C23 aufweist.
-
Kurz nach ihrer Entdeckung schien
es offensichtlich, dass Vitamin D3 und Vitamin
D2 eine ähnliche,
wenn auch nicht äquivalente,
biologische Aktivität
besaßen.
Weiters wurde allgemein geglaubt, dass der Stoffwechsel (d. h. die
Aktivierung und der Abbau) von Vitamin D2 derselbe
war wie für
Vitamin D3 (siehe Harrison's Principles
of Internal Medicine: Part Seven, „Disorders of Bone and Mineral
Metabolism: Chap. 35", in E. Braunwald, K. J. Isselbacher, R. G. Petersdorf,
J. D. Wilson, J. B. Martin und H. S. Fauci (Hrsg.), Calcium, Phosphorous
and Bone Metabolism: Calcium Regulating Hormones, 1860–1865, McGraw-Rill,
New York. In dieser Hinsicht wird die aktive Form von Vitamin D2 ["1,25-(OH)2D2"]
als 1α,24,25-Trihydroxy-Vitamin
D2 angenommen. Darüber hinaus sind 24-Hydroxy-Derivate
von 25-Hydroxy-Vitamin D2 und 1,25-(OH)2D2, das sind 24,25-Dihydroxy-Vitamin
D2 und 1α,24,25-Trihydroxy-Vitamin D2, bekannt. Was nahe legt, dass der Abbau
von Vitamin D2 über denselben C24-Oxidationsschritt
wie Vitamin D3 erfolgt. Jones, G., Rosenthal,
D., Segev, D., Mazur, Y., Frolow, F., Halfon, Y., Robinavich, D.
und Shakked, Z., Biochemistry 18, 1094–1101 (1979).
-
Vor kurzem wurde herausgefunden,
dass ein aktives Analog von Vitamin D2,
1 α-Hydroxy-Vitamin D2 ["1α-(OH)D2"],
jedoch pharmakologische Eigenschaften aufweist, die sich deutlich
von denen seines Gegenstücks
Vitamin D3 ["1α-(OH)D3"] unterscheiden.
Die EP-A-0.381.750 offenbart, dass 1α-(OH)D2 Knochenschwund
bei menschlichen Osteoporose-Patienten umkehrt, wenn es in Dosierungen
von 2,0 μg/Tag
oder mehr verabreicht wird. Aufgrund seiner Toxizität können Dosierungen
von 2,0 μg/Tag oder
mehr mit 1α-(OH)D3 nicht sicher beibehalten werden.
-
Solche ausgeprägte pharmakologische Eigenschaften
können
durch die Entdeckung der Erfinder, dass pharmakologische, dem Menschen
verabreichte Dosen von 1α-(OH)D2 zum Teil zu biologisch aktivem 1α,24-Dihydroxy-Vitamin
D2 ["1α,24-(OH)2D2"] metabolisiert werden,
erklärt
werden. Wie untenstehend detaillierter beschrieben werden wird,
stellt die Hydroxylierung des 1-hydroxylierten Vitamin-D2-Moleküls
an der C24-Position einen Aktivierungsweg
dar, der für
das Vitamin-D2-Molekül eigen ist.
-
Obwohl 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D3 ["1α,24-(OH)2D3"] chemisch synthetisiert
wurde (US-A-4.022.891), ist nicht bewiesen worden, dass es eine
natürliche
Verbindung in biologischen Systemen ist. Die Erfinder haben zudem
herausgefunden, dass sich die biolo gische Aktivität von 1α,24-(OH)2D2 deutlich von
der für
1α,24-(OH)2D3 gezeigten unterscheidet.
Ishizuka et al., haben beispielsweise festgestellt, dass 1α,24-(OH)2D3 die 1,25-(OH)2D3-Rezeptorstelle
stärker
bindet als 1,25-(OH)2D3 selbst (Ishizuka,
S., Bannai, K., Naruchi, T. und Hashimoto, Y., Steroids 37(1), 33–42 (1981);
Ishizuka, S., Bannai, K., Naruchi, T. und Hashimoto, Y., Steroids
39(1), 53–62
(1982)). Mit einem ähnlichen
Versuch haben die Erfinder herausgefunden, dass das 1,25-(OH)2D3 doppelt so kompetitiv
bei der Bindung der 1,25–(OH)2D3-Rezeptorstelle
ist wie 1α,24-(OH)2D2. Die Erfinder
haben zudem festgestellt, dass 1α,24-(OH)2D2 relativ schlechte
Bindungsaffinität
gegenüber
dem Vitamin-D-Serum-Bindungsprotein im Blut aufweisen, was auf eine
relativ kurze Nalbwärtszeit
schließen
lässt,
was wiederum ein Anzeichen für niedrige
Toxizität
ist.
-
Die Erfinder haben gezeigt, dass
bei Menschen, denen 1α-(OH)D2 verabreicht worden war, zirkulierendes
1α,24-(OH)2D2 vorhanden war.
Dies weist darauf hin, dass Vitamin D2 bei
Tieren und Menschen natürlich
zu 1,25-(OH)2D2 sowie 1α,24-(OH)2D2 metabolisiert
wird. Die relativen Verhältnisse
der beiden Vitamin-D2-Hormone scheinen je
nach Vorläufer
und Menge des Vorläufers,
die dem C24-Weg zugeführt wird, zu variieren. Daher
kommt es bei erhöhten
Dosen von 1α-(OH)D2 zu einem höheren Verhältnis von 1α,24-(OH)2D2 zu 1,25-(OH)2D2.
-
Diese Ergebnisse, die untenstehend
detaillierter erläutert
werden, weisen darauf hin, dass 1α,24-(OH)2D2 die gewünschte Eigenschaft,
hohe biologische Aktivität
bei geringer Toxizität,
besitzt. Die Tatsache, dass 1α,24-(OH)2D2 ein signifikanter
Metabolit ist, wenn pharmakologische Mengen an 1α-(OH)D2 verabreicht
werden, lässt
darauf schließen,
dass 1α,24-(OH)2D2 die gewünschte pharmakologische
Wirkung von 1α-(OH)D2 mediiert und ein nützliches therapeutisches Arzneimittel
zur Behandlung von unterschiedlichen Arten von mit dem Calciumstoffwechsel
in Verbindung stehenden Erkrankungen ist.
-
Die Erfindung stellt ein Syntheseverfahren zur
Herstellung von 1 α,24-(OH)2D2 bereit, welches eine
bioaktive Form von Vitamin D2 ist. Das Hormon kann
auch als 1α,24-Dihydroxyergocalciferol
bezeichnet werden und wird durch die hierin untenstehend angeführte Struktur
wiedergegeben. Die Verbindung besitzt starke biologische Aktivität und eine kurze
systemische Clearance, was auf geringe Toxizität hinweist.
-
Zusammenfassend gesagt umfasst das
Verfahren zur Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D2 die Verwendung von Ergosterol als Ausgangsmaterial,
die Bildung von 24-Hydroxy-Vitamin
D2 und anschließend die 1α-Hydroxylierung der 24-Hydroxy-Verbindung.
Im Zuge dieser Synthese werden auch neuartige Zwischenprodukte hergestellt.
-
Die durch das Verfahren der Erfindung
erhältliche
Verbindung ist für
die Behandlung von zahlreichen Erkrankungen nützlich, die durch Vitamin-D-Mangel
gekennzeichnet sind, sowie verschiedener Knochenschwunderkrankungen,
insbesondere für
eine Behandlung ohne die Begleiterscheinungen von Hypercalcämie oder
Hypercalcurie. Die durch das Verfahren der Erfindung erhältlichen
Verbindungen können
vorteilhaft als aktive Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen
für Vitamin-D-Mangelerkrankungen
verwendet werden, um Knochenschwund oder Abnahme des Knochenmineralstoffgehalts
bei Personen, die prädisponiert sind,
einen solchen Schwund auszubilden, gegenzusteuern oder zu verhindern
und um die Knochendichte bei Personen, die an renaler Osteodystrophie
leiden, zu stabilisieren.
-
Die durch das Verfahren der Erfindung
erhältliche
Verbindung kann weiters für
topische Wirkstoffe zur Behandlung von gewissen Hauterkrankungen
von Nutzen sein. Die Verbindung kann vorteilhaft als aktiver Bestandteil
für topische
Zusammensetzungen eingesetzt werden, die auch andere Wirkstoffe
umfassen können,
die sich zur Linderung von Hauterkrankungen eignen.
-
Weitere Vorteile sowie ein umfassenderes Verständnis der
spezifischen Adaptionen, der Variationen in der Zusammensetzung
und der physikalischen und chemischen Eigen schaften gemäß vorliegender
Erfindung ergeben sich aus der Lektüre der folgenden detaillierten
Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen.
-
Die vorliegende Erfindung wird hierin
nachstehend in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen beschrieben,
worin ähnliche
Bezeichnungen auf ähnliche
Elemente verweisen und worin:
-
1 präparative
Stufen bei der Synthese von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin
D2 darstellt; und
-
2 präparative
Stufen bei der Synthese von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin
D2 darstellt, wobei 24-Hydroxy-Vitamin D2 den Ausgangspunkt bildet.
-
Die vorliegende Erfindung stellt
ein Syntheseverfahren zur Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D2 [1α,24-(OH)2-D2] bereit.
-
Die hierin verwendeten Begriffe „biologische Aktivität", „biologisch
aktiv", „bioaktiv"
oder „biopotent"
sind so zu verstehen, dass sie biochemische Eigenschaften von Verbindungen
wie etwa das Beeinflussen des Stoffwechsels, z. B. die Serum-Calcium-Konzentration
beeinflussend, oder die Bindung an ein geeignetes Rezeptorprotein,
z. B. an ein Vitamin-D-Rezeptorprotein bindend, bezeichnen.
-
Die Erfindung umfasst die Herstellung
einer Verbindung der Formel (1).
-
-
Ein Aspekt der Erfindung sieht ein
Verfahren zu Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin
D2 vor, Folgendes umfassend:
-
- (a) Acetylierung von Ergosterol, um dessen 3β-Acetat zu
bilden;
- (b) Umsetzung mit einem Triazolindion und Ozonisieren, um 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat
zu bilden;
- (c) Addition von 3-Methylbutan-2-on an 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat,
um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat
zu bilden;
- (d) Addition von Methylmagnesiumbromid an (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat, um
(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol
zu bilden;
- (e) Reduktion von(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol,
um 24-Hydroxyergosterol zu bilden;
- (g) Bestrahlung von 24-Hydroxyergosterol, um 24-Hydroxyvitamin
D2 zu bilden;
- (h) Tosylierung von 24-Hydroxyvitamin D2 in
Gegenwart von trockenem Pyridin, um 24-Hydroxy-Vitamin D2-3β-tosylat
zu bilden;
- (i) Solvolyse von 24-Hydroxyvitamin D2-tosylat,
um 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D2 zu bilden;
- (j) allylische Oxidation von 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D2 mit Selendioxid, um 1α,24-Dihydroxycyclovitamin D2 zu bilden; und
- (k) Hydrolyse des 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamins D2 mit einem Gemisch aus
-
Dimethylsulfoxid und einer organischen
Säure,
um ein Gemisch aus 5,6-cis-la-Hydroxy- und dem 5,6-trans-1α,24-Dihydroxyvitamin
D2 zu bilden und ein Diels-Alder-Addukt
von 5,6-trans-1α-Hydroxyvitamin
D2 zu bilden, um durch Reinigung 1α,24-Dihydroxyvitamin
D2 zu erhalten.
-
Ein zweiter Aspekt der Erfindung
sieht ein Verfahren zur Herstellung von 24-Hydroxy-Vitamin D2 vor, Folgendes umfassend:
-
- (a) Acetylierung von Ergosterol, um dessen 3β-Acetat zu
bilden;
- (b) Umsetzung mit Triazolindion und Ozonisieren, um 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat
zu bilden;
- s(c) Addition von 3-Methylbutan-2-on an 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat,
um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat
zu bilden
- (d) Addition von Methylmagnesiumbromid an (22E)-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo)-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat, um
(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol
zu bilden;
- (e) Reduktion von (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol,
um 24-Hydroxyergosterol zu bilden; und
- (g) Bestrahlung von 24-Hydroxyergosterol, um 24-Hydroxyvitamin
D2 zu bilden.
-
Ein dritter Aspekt der vorliegenden
Erfindung sieht ein Verfahren zur Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin
D2 vor, Folgendes umfassend:
-
- (a) Tosylierung von 24-Hydroxyvitamin D2,
um 24-Hydroxyvitamin D2-tosylat zu bilden;
- (b) Methanolyse des 24-Hydroxyvitamin D2-tosylats, um
24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D2 zu bilden;
- (c) Oxidation von 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D2, um
1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin D2 zu bilden; und
- (d) aufeinander folgende Hydrolyse und Durchführung einer
Diels-Alder-Reaktion von 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin
D2, um 1α,24-Dihydroxyvitamin D2 zu bilden.
-
Weitere Aspekte der Erfindung stellen
Synthese-Zwischenprodukte sowie Verfahren für deren Herstellung bereit,
wie in den nachfolgenden Ansprüchen
erläutert
wird. Die Zwischenprodukte sind im Zuge der Durchführung der
Verfahren des ersten, zweiten und dritten Aspekts erhältlich.
-
Ein weiterer Aspekt der Erfindung
stellt ein Verfahren zur Herstellung eines medizinischen Mittels
zur Behandlung einer durch Vitamin-D-Mangel herbeigeführten Knochen schwunderkrankung
bei einem Säugetier
bereit, umfassend die Herstellung von 1α,24-Dihydroxyvitamin D2 durch
ein Verfahren nach dem ersten oder dritten Aspekt und das Vermischen des
1α,24-Dihydroxyvitamins
D2 mit einem pharmazeutisch annehmbaren
Vehikel.
-
Die Synthese von 1α,24-Dihydroxyvitamin
D2 wird gemäß dem in den 1 und 2 dargestellten Schema
durchgeführt.
Wie in 1 ersichtlich
ist, dient bei der Synthese Ergosterol als Ausgangsmaterial. Ergosterol
wird durch ein sechsstufiges Verfahren in 24-Hydroxyergosterol (5,7,22-Ergostatrien-3β,24-diol
(7)) übergeführt. Das
24-Hydroxyergosterol wird nun bestrahlt und durch auf dem Gebiet der
Erfindung gut bekannte Verfahren thermisch in 24-Hydroxy-Vitamin
D2 übergeführt. Wie
in 2 ersichtlich ist,
wird das 24-Hydroxy-Vitamin D2 anschließend in
einem sechsstufigen Verfahren hydroxyliert, um 1α,24-Dihydroxyvitamin D2 zu erhalten, wobei ein ähnliches Verfahren wie das
von Paaren et al., J. Org. Chem. 45, 3253 (1980), beschriebene angewandt
wird.
-
Im Speziellen wird Ergosterol acetyliert
um das 3β-Acetat
(2) zu bilden. Mit dem B-Ring der Ergosterol-Struktur wird ein Addukt
(3) gebildet, indem das 3β-Acetat
mit einem Triazolindion umgesetzt wird. Das Addukt (3) wird dann
ozonisiert, um die Seitenkette abzuschneiden und ein C-21-Aldehyd
zu bilden (4). Die Seitenkette wird durch Umsetzung des erhaltenen
Aldehyds mit der geeigneten Ketoverbindung, um das 24-Enon zu bilden,
wiederhergestellt (5). Das Enon wird anschließend in das 24-Methyl-3β,24-dihydroxy-Addukt
umgewandelt (6). Dieses Addukt wird mit einem Lithiumaluminiumhydrid umgesetzt,
um das Addukt von Schutzgruppen zu befreien und 24-Hydroxyergosterol
zu bilden (7). Nun wird das 24-Hydroxyergosterol bestrahlt und wärmebehandelt,
um 24-Hydroxy-Vitamin D2 zu bilden. Das 24-Hydroxy-Vitamin
D2 wird nun tosyliert, um das 3β-Tosylat
von 24-Hydroxy-Vitamin D2 zu bilden. Das Tosylat
wird durch Solvolyse verdrängt,
um 6-Methoxy-24-hydroxy-3,5-cyclovitamin D2 zu
bilden. Das Cyclovitamin D2 wird dann einer
allylischen Oxidation unterzogen, um das 1α,24-Dihydroxycyclovitamin-Derivat
zu bilden. Das 1α,24-Dihydroxycyclovitamin-Derivat
wird aufeinander folgend solvolysiert und einer Diels-Alder-Reaktion
unterzogen, die die 6-Methoxy- Gruppe
entfernt und 1α,24-Dihydroxyvitamin D2 (5,6-cis) von 5,6-trans-1α,24-Dihydroxyvitamin
D2 trennt.
-
Die durch die Verfahren der Erfindung
erhältliche
Verbindung ist auf verschiedenen klinischen sowie veterinärmedizinischen
Gebieten anwendbar und ist besonders für die Behandlung von abnormalem Calcium-
und Phosphor-Metabolismus nützlich.
Im Speziellen soll die Verbindung aus Formel (1) beispielsweise
dazu dienen, die Osteoblasten-Aktivität anzuregen,
die durch das Messen des Serumspiegels in Osteocalcin bestimmt wird.
Osteocalcin ist eines der wichtigsten Proteine für die Knochenmatrix. Die Verbindung
der Formel (1) bindet sich weniger stark an das Vitamin-D-Serum-Bindungsprotein
als 1,25-(OH)2D3,
was auf eine rasche Clearance und niedrige Toxizität hinweist,
was wiederum die pharmazeutischen Eigenschaften verbessert.
-
Die durch die Verfahren der Erfindung
erhältliche
Verbindung kann zur Steuerung des Calcium-Stoffwechsels eingesetzt
werden, wie z. B. zur Behandlung von durch Leberversagen, Nierenversagen,
Magendram-Versagen etc. verursachtem, abnormalem Calcium-Stoffwechsels. Die
Verbindungen der Formel (1) können
zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Vitamin-D-Mangelerkrankungen
sowie von damit verbundenen Erkrankungen verwendet werden, wie z.
B. renale Osteodystrophie, Steatorrhoe, antikonvulsive Osteomalazie,
hypophosphatämische
Vitamin-D-resistente Rachitis, Osteoporose, einschließlich postmenopausaler
Osteoporose, seniler Osteoporose, Steroid-Osteoporose und anderer Krankheitsbilder,
die für
Knochenschwund charakteristisch sind, Pseudo-Vitamin-D-Mangel-Rachitis,
Ernährungs-
und Malabsorptionsrachitis, Osteomalazie und Osteopenie nach Hypoparathyreose,
post-operative Hypoparathyreose, idiopathische Hypothyreose, Pseudoparathyreose und
Alkoholismus.
-
1α,24-Dihydroxyvitamin
D2 ist zudem für die Behandlung von hyperproliferativen
Hauterkrankungen wertvoll, wie z. B. Psoriasis, Ekzemen, fehlender Hautfestigkeit,
dermaler Hydratation und Sebumsekretion.
-
Die Verbindung der Formel (1) kann
als aktive Verbindung in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet
werden, die im Vergleich zu bekannten Analoga der aktiven Form von
Vitamin D3 weniger Nebenwirkungen und eine
geringe Toxizität aufweisen,
wenn sie beispielsweise bei durch anormalen Calcium-Staoffwechsel
herbeigeführten
Erkrankungen eingesetzt werden.
-
1α,24-Dihydroxyvitamin
D2, das durch die Verfahren der Erfindung
erhältlich
ist, kann im Einklang mit herkömmlichen
pharmazeutischen Verfahren verarbeitet werden, um medizinische Mittel
zur Verabreichung an Patienten, z. B. Säugetiere einschließlich Menschen,
herzustellen. Die Verbindung der Formel (1) kann beispielsweise
im Gemisch mit herkömmlichen
Arzneimittelträgern
eingesetzt werden, wie z. B. pharamzeutisch annehmbaren Trägersubstanzen,
die für
die enterale (z. B. orale), parenterale oder topische Anwendung
geeignet sind und mit der aktiven Verbindung nicht schädlich reagieren.
-
Zu geeigneten pharmazeutisch annehmbaren
Trägern
gehören
u. a. Wasser, Salzlösungen,
Alkohole, Gummiarabicum, pflanzliche Öle (z. B. Mandelöl, Maiskeimöl, Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Olivenöl, Kokosnussöl), Mineralöl, Lebertran, ölige Ester,
wie z. B. Polysorbat 80, Polyethylenglykole, Gelatine, Kohlenhydrate
(z. B. Lactose, Amylose oder Stärke),
Magnesiumstereat, Talk, Kieselsäure,
viskoses Paraffin, Fettsäuremonoglyceride
und -diglyceride, Pentaeryhtritfettsäureester, Hydroxymethylcellulose,
Polyvinylpyrrolidon, etc.
-
Die pharmazeutischen Zubereitungen
können
sterilisiert werden und, falls gewünscht, mit Hilfsmitteln vermischt
werden, wie z. B. Schmiermittels, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren,
Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen
Drucks, Puffern, Farbstoffen, Geschmackstoffen und/oder einer oder
mehreren aktiven Verbindungen, wie z. B. Vitamin D3 und
dessen 1α-hydroxylierten
Metaboliten, konjugierten Estrogenen oder deren Äquivalenten, Anti-Estrogenen,
Calcitonin, Biphosphonaten, Calciumzusätzen, Cobalamin, Pertussis-Toxin
und Bor.
-
Für
die parenterale Verabreichung eignen sich besonders injizierbare,
sterile Lösungen,
vorzugsweise ölige
oder wässrige
Lösungen,
wie auch Suspensionen, Emulsionen oder Implantate einschließlich Suppositorien.
Die parenterale Verabreichung schließt subkutane, intramuskuläre oder
intravenöse
Injektion, naopharyngeale oder mucosale Absorption oder transdermale
Absorption ein. Ampullen sind bequeme Dosierungseinheiten.
-
Für
die enterale Verabreichung eignen sich besonders Tabletten, Dragees,
Flüssigkeiten,
Tropfen, Suppositorien, Lutschtabletten, Pulver oder Kapseln. Wenn
ein gesüßtes Vehikel
erwünscht
ist, können
Sirupe, Elixiere oder dergleichen verwendet werden.
-
Für
die topische Verabreichung können
geeignete nicht-sprühbare,
viskose, halbfeste oder feste Formen eingesetzt werden, die einen
Träger
einschließen,
die für
die topische Verabreichung kompatibel ist und eine dynamische Viskosität aufweist,
die vorzugsweise größer als
jene von Wasser ist, wie z. B. Mineralöl, Mandelöl, selbstemulgierendes Bienenwachs,
pflanzliches Öl,
weißes
Petrolatum und Propylenglykol. Geeignete Formulierungen schließen u. a.
Cremen, Salben, Lotionen. Lösungen,
Suspensionen, Emulsinnen, Pulver, Linimente, Salben, Aerosole, Hautpflaster
etc. ein, die, falls gewünscht,
sterilisiert oder mit Hilfswirkstoffen vermischt werden, wie z.
B. Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Demulgatoren, Netzmittel
etc. Eine Cremezubereitung gemäß vorliegender
Erfindung schließt
geeigneterweise z. B. ein Gemisch aus Wasser, Mandelöl, Mineralöl und selbstemulgierendem
Bienenwachs ein; eine Salbenzubereitung z. B. Mandelöl und weißes Petrolatum;
und eine Lotionzubereitung z. B. trockenes Propylenglykol.
-
Topische Zubereitungen der Verbindung,
die für
die Behandlung von Hauterkrankungen von Nutzen sind, schließen die
Epithelisierung herbeiführende
Mittel wie Retinoide (z. B. Vitamin A), Chromanole wie Vitamin E, β-Agonisten
wie Isoproterenol oder zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), entzündungshemmende
Wirkstoffe wie Corticosteroide (z. B. Hydrocortison oder dessen
Acetate, oder Dexamethason) sowie keratoplastische Stoffe wie Kohlenteer
oder Anthralin ein. Wirksame Mengen solcher Mittel liegen z. B.
bei Vitamin A bei etwa 0,003 bis etwa 0,3 Gew.-% der Zusammensetzung, bei
Vitamin E bei etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.-%, bei Isoproterenol bei
etwa 0,1 bis etwa 2 Gew.-%, bei cAMP bei etwa 0,1 bis etwa 1 Gew.-%
bei Hydrocortison bei etwa 0,25 bis etwa 5 Gew.-%, bei Kohlenteer
bei etwa 0,1 bis etwa 20 Gew.-% und bei Anthralin bei etwa 0,05 bis
etwa 2 Gew.-%.
-
Für
die rektale Verabreichung wird die Verbindung als pharmazeutische
Zusammensetzung ausgebildet, die eine Zäpfchenbasis wie Kakaoöl oder andere
Triglyceride enthält.
Um die Lagerfähigkeit
zu verlängern,
schließt
die Zusammensetzung vorzugsweise ein Antioxidans wie Ascorbinsäure, butyliertes
Hydroxyanisol oder Hydrochinon ein.
-
Zur Behandlung von Calcium-Stoffwechselstörungen wird
eine orale Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen
bevorzugt. Im Allgemeinen ist die Zusammensetzung der Erfindung in
Dosierungseinheiten abgegeben, die etwa 0,5 μg bis etwa 25 μg pro Dosierungseinheit
in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Die Dosis der
Zusammensetzung liegt im Allgemeinen bei etwa 0,01 bis etwa 1,0 μg/kg/ Tag,
vorzugsweise bei etwa 0,04 bis etwa 0,3 μg/kg/Tag.
-
Für
die topische Behandlung von Hauterkrankungen beträgt die Dosis
der Verbindung in einer topischen Zusammensetzung im Allgemeinen
etwa 0,01 μg
bis etwa 10 μg
pro Gramm der Zusammensetzung.
-
Es ist offensichtlich, das die derzeit
bevorzugten Mengen der aktiven Verbindung im Einzelfall je nach
Wirksamkeit der spezifischen verwendeten Verbindung, der jeweiligen
formulierten Zusammensetzung, der Verabreichungsart sowie von der/dem zu
behandelnden Stelle und Organismus variiert. Die spezifische Dosis
für einen
bestimmten Patienten hängt
beispielsweise von Alter, Körpergewicht,
allgemeinem Gesundheitszustand und Geschlecht, von der Ernährung, der
zeitlichen Steuerung und Art der Verabreichung, der Ausscheidungsrate,
von den Medikamenten, die in Kombination verwendet werden, und der
Schwere der jeweiligen Krankheit, die therapiert wird, ab. Die Dosen
für eine
vorbestimmten Wirt können
anhand von herkömmlichen Überlegungen be stimmt
werden, wie der übliche
Vergleich der unterschiedlichen Aktivitäten der abhängigen Verbindungen und der
eines bekannten Wirkstoffs mittels z. B. eines geeigneten herkömmlichen
pharmakologischen Protokolls.
-
Die Verbindung kann des weiteren
vorteilhaft in veterinärmedizinischen
Zusammensetzungen verwendet werden, wie z. B. Futterzusammensetzungen für Haustiere
zur Behandlung oder Verhinderung von Hypocalcämie. Im Allgemeinen wird die
Verbindung im Tierfutter so angegeben, dass der normale Verbrauch
derartigen Futters das Tier mit etwa 0,01 bis etwa 1,0 μg/kg/Tag
versorgt.
-
Die folgenden Beispiele sind als
rein illustrativ und in keiner Weise als die übrige Offenbarung einschränkend zu
verstehen. In den folgenden Beispielen wurden die Protonen-NMR-Spektren (1H-NMR) mit einem Bruker AM-400 (400 MHz)
mit Aspect 3000 Computer in CDCl3-Lösungen mit
CHCl3 als innerem Standard aufgenommen.
Chemische Verschiebungen sind in ppm angegeben. Ultraviolett-Spektren
wurden mit einem Hitachi U-2000 Spektralphotometer aufgenommen und
sind für
Ethanollösungen
angegeben.
-
Beispiel 1: Herstellung,
Reinigung und Identifizierung von 1α,24-(OH)2D2 in menschlichen Leberzellen, die mit 1α-(OH)D2 inkubiert wurden
-
Im Wesentlichen reines 1α-(OH)D2 wurde von Bone Care International, Inc.
of Madison, Wisconsin, USA, zur Verfügung gestellt. Das 1α-(OH)D2 wurde mit Hep-3B-Zellen kultiviert, die
mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren aus einem menschlichen
Hepatom entnommen wurden.
-
Lipidextrakte wurde mittels auf dem
Gebiet bekannter Verfahren hergestellt und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) auf Zorbax-S1L, das mit Hexan/Isopropanol/ Methanol entwickelt
wurde, unterzogen. Der mutmaßliche 1α,24-(OH)2D2-Metabolit eluierte
zwischen dem Ausgangsmaterial 1α-(OH)D2 und dem Standard 1,25-(OH)2D2 (ebenfalls von Bone Care International, Inc.
of Madison, Wisconsin, USA, zur Verfügung gestellt). Das 1α,24-(OH)2D2 wurde mittels
des HPLC-Systems weiter gereinigt, bevor eine Identifizierung des
Metaboliten durch Massenspektrometrie-Analyse vorgenommen wurde.
-
Der gereinigte Metabolit war polarer
als das Ausgangsmaterial 1α-(OH)D2 und wurde daher vorläufig als Dihydroxy-Vitamin-D2-Metabolit angenommen. Der Metabolit besaß zudem
das. Vitamin-D-Chromophor, was auf Beibehaltung cis-Trien-Systems
von Vitamin D hinwies. Da der Metabolit aus 1α-(OH)D2 gewonnen
worden war, war seine Struktur 1α,X-(OH)2D2.
-
Mittels auf dem Gebiet bekannter
Verfahren wurde das Trimethylsilyl-Derivat von 1α,X(OH)2D2 hergestellt, und das TMS-Derivat und die
native Verbindung wurden Massenspektrometrie unterzogen. Das TMS-Derivat
wurde mittels GC/MS analysiert, und die Identifizierung erfolgte
größtenteils
anhand der Interpretation der Fragmentierungsmuster des Pyro-Metaboliten.
Das Molekülion
wies ein m/z von 644 auf, was auf Dihydroxyvitamin D2 plus
drei TMS-Gruppen hindeutete, die 216 Einheiten an zusätzlicher
Masse ausmachten. Da 1 α-(OH)D2 3β- und
1α-Gruppen
besitzt und der mutmaßliche
Metabolit ein zusätzliches
Hydroxyl aufwies, wurden somit alle drei Hydroxyle derivatisiert.
Charakteristische Fragmente wurden bei m/z 601, 511, 421, 331 festgestellt,
was einen Verlust an 43 Masseneinheiten an Fragment allein oder
zusammen mit ein, zwei oder drei TMS-Gruppen von je 90 Einheiten
darstellte. Dieses Muster lässt
sich höchstwahrscheinlich
durch die Spaltung der C-24-zu-C-25-Bindung erklären, was einen C3H7-Verlust
von 43 Masseneinheiten bedeutete. Dies stellt den Verlust des C26-C25-C27-Fragments
dar. Darüber
hinaus fehlte im Massenspektrum das m/z 131-Fragment, das für sämtliche
25-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen charakteristisch ist.
-
Das Massenspektrum wies das m/z 513-Fragment
auf, was auf einen Verlust von 131 Masseneinheiten aufgrund der
Spaltung des A-Rings unter Verlust des ebenso für Vita min-D-Zusammensetzungen
charakteristischen C2-C3-C4 hindeutete. Das Massenspektrum enthielt
weiters m/z 143, das wahrscheinlich aus der C-24-C-23-Spaltung und
einem Verlust einer Methyl-Gruppe enstanden war. Der unübliche Verlust
von 43 Einheiten, der auf eine C24-C25-Fragilität schließen ließ, zusammen mit dem Verlust
eines Fragments aufgrund von C23-C24-Spaltung zeigte, dass das zusätzliche
Hydroxyl in 1α,X(OH)2D2 an der C-24-Position
lag. Somit war die Struktur als 1α,24-(OH)2D2 identifiziert.
-
Der ursprüngliche Metabolit wurde mittels
Direktsonden-Massenspektrometrie analysiert. Diese Analyse stimmte
mit einem Hydroxyl an der 24-Position und auch mit der oben erläuterten
GC/MS-Analyse der TMS-Derivate überein.
Der ursprüngliche Metabolit
wies das erwartete Molekülion
bei m/z 428 und ein charakteristisches Fragment bei m/z 367 auf, was
den Verlust eines Wasser- und des C25-C26-C27Fragments von
43 Masseneinheiten andeutete.
-
Beispiel 2: Synthese von
1,24-Dihydroxy-Vitamin D2
-
(22E)-5,7,22-Ergostatrien-3(3-ylacetat
(2)
-
Zu einer Lösung von 50 g (0,13 Mol) Ergosterol
(1) in 300 ml wasserfreiem Pyridin wurden 33,3 ml (0,35 Mol) Acetanhydrid
zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht
gerührt
und anschließend
600 ml Wasser zugegeben. Der Niederschlag wurde abfiltriert, dreimal
mit jeweils 200 ml Acetonitril gewaschen und dann luftgetrocknet
um 42,0 g (74%) von (2) zu gewinnen.
-
22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3βyl-acetat
(4)
-
Zu einer Lösung von 33,0 g (0,075 Mol)
Ergosterolacetat (2) in 1000 ml Chloroform wurden 13,2 g (0,075
Mol) 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion zugegeben. Die Lösung des
somit gebildeten (3) wurde bei Raumtemperatur für 30 min gerührt, und
anschließend
wurden 5 ml Pyridin zugegeben. Die Lösung wurde auf –78°C abgekühlt, bei –78 °C für 2 h mit
einem Ozon-Sauerstoff-Gemisch behandelt und dann sorgfältig mit
Stickstoff gespült.
Anschließend wurden
50 ml Dimethylsulfid zugegeben und das Gemisch wurde mit 3 Wasser,
dann zweimal mit 200 ml 2N HCl und schließlich mit 300 Wasser gewaschen. Die
organische Phase wurde abgetrennt, über wasserfreiem MgSO4 getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene
eingeengt. Der Rückstand
wurde auf einer Kieselgelsäule
mittels 30% Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 16,0 g (39%) der
obigen Verbindung als schaumigen Feststoff zu gewinnen.
-
1H-NMR: (400
MHz; CDCl3): δppm 0,85 (3H, s, 18-CH3), 1,10 (3H, s, 19-CH3),
1,15 (3H, d, 21-CH3), 1,99 (3H, s, 3β-CH3CO), 5,45 (1H, m, 3α-H), 6,26 (1H, d, 7-H), 6,40
(1H, d, 6-H), 7,42 (5H, m, PH), 9,58 (1H, d, HCO).
-
(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3βylacetat
(5)
-
Butyllithium (1,6 M Lösung in
Hexan 8,94 ml, 0,014 Mol) wurde zu einer gerührten, gekühlten (0°C) Lösung von Diisopropylamin (1,45
g, 0,014 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) unter Stickstoff zugesetzt.
3-Methylbutan-2-on (1,23 g, 0,014 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran
(6 ml) wurde innerhalb von 15 min bei 0°C zugetropft. Die Lösung wurde
bei 0°C
für eine
weitere Stunde gerührt,
dann auf –70°C abgekühlt und
eine Lösung
von Aldehyd (4) (6,0 g, 0,011 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran
(60 ml) zugesetzt. Die Temperatur wurde auf –20°C erhöht und für 3 h gehalten. Anschließend wurde
Eisessig (20 ml) bei –20°C zugegeben,
und die Lösung
wurde auf Raumtemperatur gebracht. Ether (800 ml) und Wasser (400
ml) wurden zugegeben, und die organische Phase abgetrennt und mit
10%iger Salzsäure
(2 × 300
ml), gesättigter
Natriumbicarbonat-Lösung
(2 × 300
ml) und Wasser (2 × 300
ml) gewaschen. Durch Einengen wurde das Rohprodukt (7,5 g) erhalten, das
in Tetrahydrofuran (100 ml), das 1,5 N Essigsäure (12 ml) enthielt, gelöst. Nach
Rückflusserhitzen
für 1,5
h wurde das Gemisch mit Ether (600 ml) verdünnt, mit 5%iger Natriumcarbonat-Lösung (2 × 200 ml)
und Wasser (2 × 200
ml) gewaschen und getrocknet (wasserfreies MgSO4).
Durch Einengen unter reduziertem Druck wurde das Rohprodukt (7,0
g) erhalten. Chromatographie auf Kieselgel (50 Ethylacetat in Hexan)
ergab das Enon (5) 4,0 g (59%).
-
1H-NMR: (400
MHz): δppm
0,83 (3H, s, 18-CH3), 0,99 (3H, s, 19-CH3), 1,09 (6H, dd, 26 und 27-CH3),
1,12 (3H, d, 21-CH3), 2,0 (3H, s, 3(3-CH3CO), 2,84 (1H, m, 25-H), 5,45 (1H, m, 3α-H), 6,06
(1H, d, 23-H), 6,24 (1H, d, 7-H), 6,39 (1H, d, 6-H), 6,71 (1H, dd,
22-H), 7,42 (5H, m, Ph).
-
(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol
(6)
-
Das Enon (5) (3,5 g, 5,7 mMol) in
trockenem Ether (100 ml) wurde auf 0°C abgekühlt, und Methylmagnesiumbromid
(3,0 M Lösung
in Ether, 6,8 ml, 0,02 Mol) zugetropft. Nach 1 h bei 0°C wurde gesättigtes
Ammoniumchlorid (100 ml) zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt.
Die wässrige Phase
wurde mit Ether (2 × 200
ml) extrahiert. Die vereinigten Etherphasen wurde über wasserfreiem MgSO4 getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt,
um 3,0 g (90%) Rohprodukt von (6) zu gewinnen.
-
(22E)-5,7,22-Ergostatrien-3β,24-diol
(7)
-
Zu einer Lösung von 3,0 g (5,1 mMol) von
(6) in trockenem Tetrahydrofuran (250 ml) wurden 3,6 g (0,09 Mol)
Lithiumaluminiumhydrid zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluss
3 h lang erhitzt, im Eiswasserbad abgekühlt und das Reaktionsgemisch dann
durch vorsichtiges Zutropfen von Eiswasser (5 ml) zersetzt. Das
Gemisch wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt, um
einen Großteil
des Tetrahydrafurans zu entfernen. Der Rückstand wurde in 200 ml Ethylacetat
gelöst,
zweimal mit gesättigter NaCl-Lösung (2 × 200 ml)
gewaschen, über
wasserfreiem MgSO4 getrocknet und im Vakuum
eingeengt. Der Rückstand
wurde auf einer Kieselgelsäule
mittels 30%igem Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 1,5 g (71%) von
(7) zu gewinnen.
-
1H-NMR: (400
MHz, CDCl3): δppm 0,64 (3H, s, 18-H), 0,88
(6H, dd, 26 und 27-CH3), 0,93 (3H, s, 19-CH3), 1,06 (3H, d, 21-CH3),
1,19 (3H, s, 28-CH3), 3,55 (1H, m, 3α-H), 5,36
(1H, d, 7-H), 5,42 (2H, m, 22 und 23-H), 5,52 (1H, d, 6-H). UV (Ethanol) λmax:
282 nm.
-
24-Hydroxyvitamin D2 (8)
-
Ein Gramm (2,4 mMol) von (7) wurde
in 250 ml Ether und Benzol (4 : 1) gelöst und unter Rühren unter
Stickstoff in einer wassergekühlten Quarz-Tauchküvette mittels
einer Hanovia-Mitteldruck-UV-Lampe für 2 h bestrahlt. Die Lösung wurde im
Vakuum eingeengt, in 100 ml Ethanol erneut gelöst und über Nacht rückflusserhitzt. Die Lösung wurde
im Vakuum bis zur Trockene eingeengt und der Rückstand auf einer Kieselgelsäule mittels
30%igem Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 0,55 g (55%) von (8)
zu gewinnen.
-
1H-NMR: (400
MHz, CDCl3): δppm 0,57 (3H, s, 18-CH3), 0,92 (6H, dd, 26 und 27-CH3),
1,06 (3H, s, 19-CH3), 1,06 (3H, d, 21-CH3), 1,20 (3H, s, 28-CH3),
3,93 (1H, m, 3-H), 4,79 (1H, m (scharf), 19-H), 5,01 (1H, m (scharf),
19-H), 5,43 (2H, m, 22 und 23-H), 6,02 (1H, d, 7-H), 6,22 (1H, d,
6-H). UV (Ethanol) λmax: 265 nm.
-
24-Hydroxyvitamin D2-tosylat (9)
-
Zu einer Lösung von 0,55 g (1,3 mMol)
von (8), gelöst
in 5 ml wasserfreiem Pyridin, wurden 0,6 g (3,2 mMol) Tosylchlorid
zugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff bei 5 °C für 20 h gerührt. Das Reaktionsgemisch
wurde in 100 ml kalte, gesättigte NaHCO3-Lösung
gegossen und mit Ether (3 × 100 ml)
extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurde mit 5%iger
HCl-Lösung
(2 × 200
ml), gesättigter
Natriumbicarbonat-Lösung
(2 × 200
ml) und gesättigter
NaCl-Lösung
(2 × 200
ml) gewaschen, über wasserfreiem
MgSO4 getrocknet und im Vakuum eingeengt,
um 0,62 g (84%) von (9) zu erhalten.
-
1H-NMR: (400
MHz, CDCl3): δppm 0,57 (3H, s, 18-CH3), 0,92 (6H, dd, 26 und 27-CH3),
1,06 (3H, s, 19-CH3), 1,08 (3H, d, 21-CH3), 1,24 (3H, s, 28-CH3),
2,43 (3H, s, CH3 (Tosylat)), 4,69 (1H, m, 3-H),
4,77 (1H, m (scharf), 19-H), 5,0 (1H, m (scharf), 19-H), 5,42 (2H,
m, 22 und 23-H), 6,03 (1H, d, 7-H), 6,25 (1H, d, 6-H) und 7,83 (4H,
d, aromatisch).
-
24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin
D2 (10)
-
Zu einer Lösung von 0,6 g (1,06 mMol)
von (9) in 50 ml wasserfreiem Methanol wurde Natriumbicarbonat 4,0
(0,047 Mol) zugegeben. Das Gemisch wurde unter für 6 h rückflusserhitzt. Das Reaktionsgemisch
wurde im Vakuum eingeengt. Wasser (100 ml) wurde zugegeben und anschließend eine
Extraktion mit Ether (2 × 200
ml) durchgeführt.
Die vereinigten Etherextrakte wurde über wasserfreiem MgSO4 getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene
eingeengt, um 450 mg (100%) von (10) als Öl zu gewinnen.
-
1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamins
D2 (11)
-
tert-Butylhydroperoxid (870 μl (2,61 mMol); 3M
in Toluol) wurde zu einer Suspension von 73 mg (0,66 mMol) Selendioxid
in 50 ml wasserfreiem Dichlormethan unter Stickstoff zugegeben.
Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff für 3 h gerührt. Dann
wurden 0,1 ml wasserfreies Pyridin zugegeben, und dann eine Lösung von
450 mg (1,06 mMol) von (10) in 15 ml wasserfreiem Dichlomethan gelöst. Das
Gemisch wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur für 10 min
gerührt,
anschließend
25 ml 10%ige NaOH-Lösung
zugegeben, und das Gemisch wurde mit Ether (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten
Etherextrakte wurde mit 10%iger NaOH-Lösung (2 × 100 ml), Wasser (2 × 100 ml)
und gesättigter
Natriumchlorid-Lösung
(2 × 100
ml) gewaschen, über
wasserfreiem MgSO4 getrocknet und im Vakuum
bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule mittels
eines Gemischs aus 30%igem Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 110
mg (24%) von (11) zu gewinnen.
-
1H-NMR: (400
MHz, CDCl3): δppm, 0,55 (3H, s, 18-CH3), 0,90 (6H, dd, 26 und 27-CH3),
1,03 (3H, d, 21-CH3), 1,19 (3H, s, 28-CH3), 3,25 (3H, s, -OCH3), 4,19
(1H, d, 6-H), 4,19
(1H, m, 1-H), 492 (2H, d, 7-H), 5,15 (1H, m (scharf), 19-H), 5,2
15 (1H, m (scharf), 19-H), 5,42 (2H, m, 22 und 23-H).
-
5,6-cis- und 5,6-trans-1α,24-Dihydroxyvitamin
D2 (12, 13)
-
110 mg (0,25 mMol) 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin
D2 (11) wurden in 2,0 ml Dimethylsulfoxid und
1,5 ml Essigsäure
gelöst
und unter Stickstoff für 1
h auf 50°C
erhitzt. Die Lösung
wurde auf Eis und 50 ml gesättigte
NaHCO3-Lösung
gegossen. Das Gemisch wurde mit Ether (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten
Etherextrakte wurde mit gesättigter NaHCO3-Lösung
(3 × 100
ml), Wasser (2 × 100
ml) und gesättigter
NaCl-Lösung
(2 × 200
ml) gewaschen und über
wasserfreiem MgSO4 getrocknet und im Vakuum
eingeengt, um 100 mg (93%) Rohprodukt von (12) und (13) zu gewinnen.
-
5,6-cis-1α,24-Dihydroxyvitamin
D2 (12)
-
Zu einer Lösung von (12) und (13) in 5
ml Ethylacetat wurden 20 mg (0,2 mMol) Maleinsäureanhydrid zugegeben, und
das Gemisch wurde bei 35°C
für 24
h unter Stickstoff gerührt.
Die Lösung wurde
im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule mittels 50%igem
Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 20 mg (22%) von (12) zu gewinnen.
-
1H-NMR: (400
MHz, CDCl3): δppm 0,57 (3H, s, 18-CH3), 0,89 (6H, dd, 26 und 27-CH3),
1,04 (3H, d, 21-CH3), 1,21 (3H, s, 28-CH3), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,40 (1H, m, 1-H),
5,0 (1H, m (scharf), 19-H), 5,33 (1H, m (schart), 19-H), 5,44 (2H,
m, 22 und 23-H), 6,01 (1H, d, 7-H), 6,37 (1H, d, 6-H). UV (Ethanol) λmax: 265
nm.
-
Obwohl die vorliegende Erfindung
nun einigermaßen
spezifisch beschrieben und anhand von Beispielen erläutert worden
ist, ist es für
Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen,
einschließlich
Abänderungen,
Zusätze
und Auslassungen am beschriebenen Inhalt vorgenommen werden können. Dementsprechend
seien diese Modifikationen auch von der vorliegenden Erfindung umfasst,
und der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung soll nur durch die
breitest gefasste Interpretation, die aus den nachfolgenden Ansprüchen gesetzmäßig hervorgehen
kann, eingeschränkt werden.