PT99998B

PT99998B - Metodo para a preparacao e utilizacao da 1-alfa,24-di-hidroxi-vitamina d2

Info

Publication number: PT99998B
Application number: PT99998A
Authority: PT
Inventors: Charles W Bishop; Joyce C Knutson; Robert M Moriarty; Raju Penmasta; Stephen Strugnell; Glenville Jones; Liang Guo
Original assignee: Bone Care Int Inc
Priority date: 1991-01-08
Filing date: 1992-01-08
Publication date: 1999-06-30
Also published as: MX9200070A; CN1078072C; EP0550702A1; ZA92108B; DK0550702T3; PT99998A; WO1992012165A1; DE69229103D1; EP0550702B1; CN1067243A; EP0914825A3; EP0550702A4; AU1247592A; ES2134207T3; ATE179604T1; DE69233074T2; DE69233074D1; CN1133712A; CN1032256C; ATE240736T1

Description

MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO DA la,24-DI-HIDROXI-VITA· MINA D₂

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito à la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ e à sua utilização para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de doenças induzidas pela deficiência em vitamina D, da osteodistrofia renal, de perturbações da pele, e de perturbações depletivas dos ossos.

presente invento refere ainda as composições farmacêuticas profilácticas ou terapêuticas contendo este composto, o método de tratamento que os utiliza, bem como o processo para a preparação do referido composto a partir do ergosterol, através de uma série de reacções sucessivas. É ainda objecto do invento um alimento para mamíferos que utiliza o referido composto.

CAMPO TÉCNICO

Este invento diz respeito a compostos de vitamina D biologicamente activos. Mais especificamente, este invento respeito ao metabolito natural, hormonalmente activo, la,24-di diz ₂, e aos invento diz

-hidroxi-vitamina D metabolito. Este farmacêutica, a qual inclui métodos para a também respeito uma quantidade eficaz de la,24-di-hidroxi-vitamina preparação deste a uma composição farmaceuticamente 2, e a um método para controlar o metabolismo anormal do cálcio por meio da administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do composto.

ANTECEDENTES DO INVENTO

A vitamina D e os seus metabolitos activos são conhecidos como sendo importantes na regulação do metabolismo do cálcio em animais e humanos. A forma de vitamina D que ocorre naturalmente em animais e humanos é a vitamina D₃· Tem sido mostrado que em animais, incluindo humanos, a vitamina D₃ é activada através do facto de ser hidroxilada na posição C₂₅ no fígado, seguido pela hidroxilação em la no rim de modo a produzir a hormona la,25-di-hidroxi-vitamina D₃ [1,25-(OH)₂D . Ver patente dos E.U.A. No. 3 880 894. A via fisiológica principal para o catabolismo dos metabolitos da vitamina D,

25-hidroxi-vitamina D,

3' ~₃

1,25-(OH)₂D₃ é iniciada pela oxidação em C₂₄· Ver Holick, M.F., Kleiner-Bossalier, A., Schnoes, H.K., Karsten, P.M., Boyle, I.T., e DeLuca., H.F., J. Biol. Chem.. 248, 6691-6696 (1973).

A vitamina D é a forma principal, que ocorre naturalmente, da vitamina D en contrada em plantas. A vitamnina D„ *

difejre estruralmente da vitamina D no facto da vitamina D₂ ter um grupo metiko em C₂₄ e ter uma dupla ligação entre C₂₂ e C_23<

Pouco depois da sua descoberta, pareceu evidente que a vitamina e a vitamina possuiam actividade biológica semelhante, se não equivalente. Tem-se também vulgarmente acreditado que o metabolismo (i.e., a activação e catabolismo) da vitamina D₂ era o mesmo da vitamina D₃· Ver Harrison's Principies of Internai Medicine: Parte sete, Disorders of Bone and Mineral Metabolism: Capítulo 35, em E. Braunwald, K.J. Isselbacher, R.G. Petersdorf, J.D. Wilson., J.B. Martin e H.S. Fauci (eds.), Calcium, Phosphorus and Bone Metabolism: Calcium Requlatinq

Hormones. McGraw-hill, New York, pág. 1860-1865. Ralativamente a isto, acredita-se que a forma activa da vitamina D₂ seja la,25-di-hidroxi-vitamina D₂ [l,25-(0H)₂D₂]. Para além disso são conhecidos derivados 24-hidroxi de 25-hidroxi-vitamina D₂ e de 1,25-(OH)₂D₂, isto é, 24,25-di-hidroxi-vitamina D₂ e la,24,25-tri-hidroxi-vitamina D₂, sugerindo que o catabolismo da vitamina D₂, semelhantemente ao da vitamina D₃, se processa através do mesmo passo de oxidação em ^c24' ^^er J°^nes, G., Rosenthal, D., Segev, D., Mazur, Y., Frolow, F., Halfon, Y., Robinavich, D. e Shakked, Z., Biochemistry, 18:1094-1101 (1979).

Foi recentemente descoberto, contudo, que um análogo activo de vitamina D₂, Ια-hidroxi-vitamina D₂ [^,,la-(OH)D2^H] possui propriedades farmacológicas distintamente diferentes das exibidas pelo seu análogo correspondente de vitamina D3, la-hidroxi-vitamina D₃ [la-(OH)D₃]. O pedido de Patente dos E.U.A. No. 07/569 412, cedido em comum com o presente pedido de patente, revela que a la-(OH)D₂ pode inverter a perda de massa óssea em pacientes humanos osteoporóticos quando administrada em dosagens de 2,0 /xg/dia ou superiores. Devido à toxicidade, níveis de dosagem de 2 ^g/dia ou maiores não são obtidos, com segurança, com a la-(OH)D₃.

Essas propriedades farmacológicas distintas podem ser explicadas pela presente descoberta dos inventores que dosagens farmacológicas de la-(OH)D₂ administradas a humanos são metabolizadas em parte em la,24-di-hidroxi-vitamina D [”la,24-(OH)D ] biologicamente activa. Como explicado com mais pormenor a seguir, a hidroxilação na posição 24 do carbono da molécula de vitamina D₂ 1-hidroxilada, representa uma via de activação peculiar para a molécula de vitamina D₂.

Embora a la,24-di-hidroxi-vitamina D₃ [la,24-(OH)₂D₃] tenha sido sintetizada quimicamente (Patente dos E.U.A. No. 4 022 891), não demonstrou ser um composto natural em sistemas biológicos. Para além disso, os inventores presentes descobriram que a la,24-(OH)₂D₂ possui actividade biológica distintamente diferente da exibida pela la,24-(OH)₂D₃. Por exemplo, Ishizuka et al.. descobriram que a la,24-(OH)₂D₃ se liga ao local receptor de la,25-(OH)₂D₃ mais firmemente do que a própria la,25-(OH)₂D₃. Ver Ishizuka, S., Bannai, K., Naruchi, T. e Hashimoto, Y., Steroids, 37:1,33-42 (1981); Ishizuka S., Banai, K., Naruchi, T. e Hashimoto, Y., Steroids, 39:1,53-62 (1982). Utilizando um ensaio semelhante, os presentes inventors descobriram que a la,24-(OH)₂D₂ é duas vezes menos competitiva na ligação ao local receptor da la,24-(OH)₂D₃ do que a la,24-(OH)₂D₃. Os presentes inventores descobriram também que a la,24-(OH)₂D₂ mostra uma afinidade de ligação relativamente fraca para a proteína do sangue de ligação ao soro da vitamina D, o que é uma evidência de um semi-vida bastante curta indicativa de toxicidade baixa.

Os presentes inventores demonstraram a presença de la,24-(OH) D circulante em humanos a quem foi administrada la-(OH)D₂· Isto indica que em animais e no homem, a vitamina D₂ é metabolizada naturalraente em ambas as la,25-(OH)₂D₂ e la,24-(OH)₂D₂· A proporção relativa das duas hormonas vitamina D₂

parece variar de acordo com o precursor e com a quantidade de precursor apresentado à via C₂₄· Deste modo, parece que à medida que as dosagens de la-(OH)D₂ aumentam, a proporção de la,24-(OH)₂D₂ para la,25-(OH)₂D₂ aumenta.

Estes resultados, que são apresentados com mais pormenor mais adiante, indicam que a la,24-(OH)₂D₂ possui a caracterí stica desejável de actividade biológica elevada com toxicidade baixa. O facto da la,24-(OH)₂D₂ ser um metabolito significativo quando são administrados níveis farmacológicos de la-(OH)D₂indica que a la,24-(OH)₂D₂ pode ser a causa dos efeitos farmacológicos desejáveis da la-(OH)D₂ e ser uma droga terapêutica útil para o tratamento de vários tipos de perturbações que envolvem o metabolismo do cálcio.

SUMÁRIO DO INVENTO invento proporciona a la,24-(OH)₂ ^D2, a qula é uma forma bioactiva de vitamina D₂. A hormona pode ser também referida como la,24-di-hidroxi-ergocalciferol e é representada pela estrutura apresentada, mais adiante, nesta Memória Descritiva. 0 composto possui uma actividade biológica potente e uma remoção sistémica rápida, o que indica toxicidade baixa.

invento abrange também um novo método para a produção de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂, o qual implica a utilização de ergosterol como material de partida, a formação de 24-hidroxi-vitamina D₂ e, em seguida, a hidroxilação em la do composto 24-hidroxi. No decurso desta síntese, são também produzidos novos intermediários.

composto deste invento é útil no tratamento de várias doenças caracterizadas pela deficiência em vitamina D e várias perturbações depletivas dos ossos, em particular no tratamento sem a incidência concomitante de hipercalcemia ou hipercaluria. Os compostos do invento são vantajosamente utilizados como compostos activos de composições farmacêuticas para doenças provocadas por deficiência em vitamina D, para inverter ou prevenir a perda de massa óssea ou do conteúdo mineral dos ossos em pessoas predispostas a desenvolver tal perda, e para estabilizar a densidade óssea em pessoas que sofrem de osteodistrofia renal.

composto do invento é também útil como agente tópico para o tratamento de certas perturbações da pele. 0 composto do invento é vantajosamente utilizado como ingrediente activo para composições tópicas, as quais podem também incluir outros agentes capazes de melhorar as perturbações da pele.

Outras vantagens e uma apreciação mais completa das adaptações específicas, variações composicionais, e atributos físicos e químicos do presente invento, serão visulizados após um exame da descrição detalhada que se segue do invento, tomada em conjunto com os desenhos que a acompanham.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS presente invento irá ser descrito, mais adiante, nesta Memória Descritiva, em conjunção com os desenhos apensos, em que, em toda a parte, designações semelhantes se referem a elementos semelhantes e nos quais:

A Figura 1 ilustra os passos preparativos para a síntese da 24-hidroxi-vitamina e

A Figura 2 ilustra os passos · preparativos para a síntese.da la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ a partir da 24-hidroxi--.. -vitamina D₂. . í

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA presente invento proporciona a la>24-di-hidroxi-vitamina D₂ [la,24-(OH)₂ ^d2] sintética.

Tal como utilizados nesta Memória Descritiva, os termos actividade biológica”, bioactivo ou biõpotente, têm por finalidade referir-se a propriedades bioquímicas de compostos tais como as que afectam o metabolismo, por. exemplo as que afectam a concentração de cálcio no soro, ou a ligação a uma proteína receptora apropriada, por exemplo a. ligação à proteína receptora de vitamina D.

Num dos seus aspectos, o invento ' abrange o composto biologicamente activo de fórmula geral (I):

Noutro aspecto, o invento envolve a preparaçao do composto de fórmula (I). A síntese da la,24-di-hidroxi-vitamina ΐ>2 ® levda a cabo de acordo com o esquema apresentado nas Figuras 1 e 2. Como se vê na Figura 1, a síntese utiliza ergosterol como material de partida. O ergosterol ê convertido em 24-hidroxi-ergosterol (5,7,22-ergostatrieno-3B,24-diol (7)) por meio de um processo em seis passos. 0 24-hidroxi-ergosterol é em seguida irradiado e convetido termicamente através de métodos bem conhecidos nesta técnica de modo a obter-se a 24-hidroxi-vitamina D₂· Como se vê na Figura 2, a 24-hidroxi-vitamina D₂ é em seguida hidroxilada num processo em seis passos de modo a obter-se a la,24-di-hidroxi-vitamina D₂, utilizando um procedimento semelhante ao descrito por Paaren, et al.. J. Orq. Chem.. vol 45, p. 3253 (1980).

Especificamente, o ergosterol é acetilado de modo a formar o 3B-acetato (2). É em seguida formado um aducto (3) com o anel B da estrutura ergosterol por meio de reacção do 3B-acetato com uma triazolidinodiona. O aducto (3) é em seguida ozonado a fim de truncar a cadeia lateral de modo a formar um aldeído em C-21 (4) . A cadeia lateral 'e restabelecida por meio de reacção do aldeído resultante com o composto ceto apropriado de modo a obter-se a 24-enona (5). A enona ê em seguida convertida no aducto 24-metilo, 3B,24-di-hidroxi (6). Este aducto é em seguida feito reagir com um hidreto de alumínio e lítio de modo a desproteger o aducto e a produzir o 24-hidroxi-ergosterol (7). 0 24-hidroxi-ergosterol é em seguida irradiado e tratado termicamente de modo a formar a 24-hidroxi-vitamina D₂· A 24-hidroxi-vitamina D„ é em seguida tosilada de modo a obter-se o 3B-tosilato da 24-hidroxi-vitamina D₂- 0 tosilato é deslocado por solvólise de modo a obter-se a 6-metoxi-24-hidroxi-3,5-ciclovitamina D_2> A ciclovitamina D₂ é sujeita a oxidação alílica de modo a formar o derivado la,24-di-hidroxi-ciclovitamina. 0 derivado la,24-di-hidroxi-ciclovitamina é sequencialmente solvolisado e sujeito a uma reacção do tipo Diels-Alder, a qual remove o grupo 6-metoxi e separa a la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ (5,6-cis) da 5,6-trans-la,24-di-hidroxi-vitamina D₂· composto do invento em vários campos clínicos e veterinários, e é particularmente útil para o tratamento do metabolismo anormal do cálcio e do fórforo. Especificamente, o composto de fórmula (I) é destinado a ser utilizado, por exemplo, para estimular a actividade osteoblástica, como medido pelos níveis de osteocalcina no soro. A osteocalcina é uma das principais proteínas na matriz dos ossos. O composto de fórmula (I) liga-se à proteína de ligação ao soro da vitamina D de modo mais fraco do que se liga a 1,25-(OH), indicativo de uma remoção rápida e de baixa toxicidade, o que melhora as suas propriedades farmacêuticas.

Num outro aspecto, o invento inclui um método para controlar o metabolismo do cálcio, tal como para o tratamento do metabolismo anormal do cálcio causado, por exemplo, por insuficiência hepática, insuficiência renal, insuficiência gastrointestinal, etc. Os compostos de fórmula (I) podem ser utilizados para tratar profiláctica ou terapeuticamente doenças causadas por deficiência em vitamina D e doenças relacionadas, por exemplo, osteodistrofia renal, esteatorreia, osteomalacia, raquitismo resistente à vitamina D hipofosfatémico, osteoporose, incluindo osteoporose pós-menopausa, osteoporose senil, osteoporose induzida por esteróides, e outos estados de doença característicos da perda de massa óssea, raquitismo (dependente da vitamina D) de pseudodeficiência, raquititismo nutricional e de má absorção, osteomalacia e osteopenias secundárias ao hipoparatiroidismo, hipoparatiroidismo pós-cirúrgico, hipotiroidismo idiopático, pseudoparatiroidismo, e alcoolismo.

A la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ é também valiosa para o tratamento de perturbações hiperproliferativas da pele tais como psoríase, eczema, falta de firmeza adequada da pele, hidratação da pele e secreção de sebo.

composto de fórmula (I) é útil como composto activo em composições farmacêuticas possuindo efeitos secundários reduzidos e baixa toxicidade quando comparadas com os análogos conhecidos de formas activas de vitamina , quando aplicadas, por exemplo, a doenças induzidas pelo metabolismo anormal do cálcio. Estas composições farmacêuticas constituem outro aspecto do invento.

O composto farmacologicamente activo deste invento pode ser processado de acordo com métodos convencionais em farmácia de modo a produzirem-se agentes medicinais para administração a pacientes, por exemplo, a mamíferos incluindo humanos. Por exemplo, o composto de fórmula (I) pode ser empregado em mistura com excipientes convencionais, por exemplo, substâncias veículo farmaceuticamente aceitáveis para aplicação entérica (por exemplo, oral), parentérica, ou tópica, que não reajam de modo prejudicial com o composto activo.

Veículos aceitáveis farmaceticamente adequados incluem, mas não estão limitados a, ãgua, soluções salinas, álcoois, goma arábica, óleos vegetais (por exemplo, óleo de amêndoas, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, azeite, óleo de coco), óleo mineral, óleos de fígados de peixes, ésteres oleosos tal como Polysorbate 80, polietileno-glicois, gelatina, hidratos de carbono (por exemplo, lactose, amilose e amido), estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, monoglicerídeos e diglicerídeos de ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos de pentaeritritol, hidroximetil-celulose, polivinil-pirrolidona, etc.

As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e, se for desejado, ser misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizadores, agentes molhantes, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou um ou mais outros compostos activos, por exemplo, vitamina e seus metabolitos Ια-hidroxilados, estrogénios conjugados ou seus equivalentes, anti-estrogénios, calcitonina, bifosfonatos, suplementos de cálcio, cobalamina, toxina da tosse convulsa e boro.

Para aplicação parentérica, são particularmente adequadas soluções injectáveis, estéreis, de preferência soluções oleosas ou aquosas, bem como suspensões, emulsões, ou implantes, incluindo supositórios. A administração parentérica inclui adequadamente a injecção subcutânea, intramuscular, ou intravenosa, a absorção nasofaríngica ou mucósica, ou absorção transdérmica. As ampolas são unidades de dosagem convenientes.

Para aplicação entérica, são particularmente adequados os comprimidos, drageias, líquidos, gotas, supositórios, pastilhas, pós, ou cápsulas. Pode ser utilizado um xarope, elixir ou análopes se for desejado um veículo edulcorado.

Para aplicação tópica, podem ser empregadas formas não pulverizáveis viscosas, semi-sólidas ou sólidas, as quais incluem um veículo compatívelcom a administração tópica e tendo uma viscisidade dinâmica de preferência superior à da ãgua, por exemplo, óleo mineral, óleo de amêndoas, cera de abelhas auto-emulsionãvel, óleo vegetal, parafina mole branca, e propileno-glicol. As formulações adequadas incluem, mas não estão

limitadas a, cremes, pomadas, loções, soluções, suspensões, emulsões, pós, linimentos, unguentos, aerossois, emplastros transdérmicos, etc., os quais são, se desejado, esterilizados ou misturados com agentes auxiliares, por exemplo, conservantes, estabilizadores, desemulsionantes, agentes molhantes, etc. Uma preparação de creme de acordo com o presente invento inclui, adequadamente, por exemplo, mistura de água, óleo de amêndoas, óleo mineral e cera de abelhas auto-emulsionãvel; uma preparação de pomada inclui, adequadamente, por exemplo, óleo de amêndoas e parafina mole branca; e uma preparação de loção inclui, adequadamente, por exemplo, propileno-glicol seco.

As preparações tópicas do composto de acordo com presente invento úteis para o tratamento de perturbações da pele podem também incluir agentes indutores de epitelialização tais como retinoides (por exemplo, vitamina A), cromanois tais como vitamina E, β-agonistas tais como isoproterenol, ou monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), agentes anti-inflamatórios tais como corticosteroides (por exemplo, hidrocortisona ou o seu acetato, ou dexametasona) e agentes ceratoplásticos tais como alcatrão mineral ou antralina. As quantidades eficazes de tais agentes são, por exemplo, cerca de 0,003 a cerca de 0,3% de vitamina A, em peso da composição; cerca de 0,1 a cerca de 10% de vitamina E; cerca de 0,1 a cerca de 2% de isoproterenol; cerca de 0,1 a cerca de 1% de cAMP; cerca de 0,25 a cerca de 5% de hidrocortisona; cerca de 0,1 a cerca de 20% de alcatrão mineral; e cerca de 0,05 a cerca de 2% de antralina.

Para administração rectal, o composto é formado numa composição farmacêutica contendo uma base para supositórios, tal como óelo de cacau e outros triglicerídeos. Para prolongar a vida em armazenamento, a composição inclui, vantajosamente, um anti-oxidante tal como ácido ascórbico, hidroxianisole butiladoi ou hidroquinona.

Para o tratamento das perturbações metabólicas do cálcio, é preferida a administração oral das composições farmacêuticas do presente invento. Geralmente, o composto deste invento é distribuído por meio de uma forma de dosagem unitária, que compreende cerca 0,5 pg a cerca de 25 yg num veícul farmaceuticamente aceitável por dosagem unitária. A dosagem do composto de acordo com este invento, situa-se geralmento entre cerca de 0,01 e cerca de 1,0 Mg/kg/dia, de prferência entre cerca de 0,04 e cerca de 0,3 ^g/kg/dia.

Para tratamento tópico de perturbações da pele, a dosagem do composto do presente invento, numa composição tópica, situa-se geralmento entre cerca de 0,01 MU ^e cerca de 10 μg por grama de composição.

Ê de ter em consideração que a quantidades preferidas reais de composto activo num caso específico variarãode acordo com o composto específico utilizado, as composições específicas formuladas, o modo de aplicação, e o local e organismo particulares a serem tratados. Por exemplo, a dose específica para um paciente particular depende da idade, peso do corpo, estado geral de saúde e sexo, da dieta, da altura e modo de administração, da taxa de excreção, e dos medicamentos utilizados em combinação e da gravidade da perturbação particular à qual a terapia é aplicada. As dosagens para um determinado hospedeiro podem ser determinadas utílizndo considerações convencionais, por exmplo, por comparação usual das actividades diferenciais dos compostos sujeitos a apreciação e de um composto conhecido, tal como por meio de um protocolo farmacológico convencional apropriado.

Ainda num outro aspecto, o composto do presente invento pode também ser vantajosamente utilizado em composições veterinárias, por exemplo, composições alimentares para animais domésticos para tratar ou prevenir a hipocalcemia. Geralmente, o composto do presente invento é distribuído no alimento para a animais, de tal modo que o consumo normal de tal alimento proporcione ao animal cerca de 0,01 a cerca de 1,0 gg/kg/dia.

Os exemplos que se seguem destinam-se a uma finalidade meramente ilustrativa, e não limitativa da parte restante da descoberta seja de que maneira for. Nos exemplos que se seguem, os espectros de ressonância magnética nuclear de protões (h RMN) foram registados com um Brucker AM-400 (400 MHz) com expressão de Computador 3000 em soluções de CDCl^ como padrão interno. Os deslocamentos químicos são expressos em ppm. Os espectros de ultravioletas são registados com um Espectrofotõmetro Hitachi U-2000 e são referidos a soluções de etanol.

Geração, purificação e identificação da la,24-(OH)_D. em células

ZZ de fígado humano incubadas com la-(OH)D₂

Exemplo 1

A la-(OH)D₂ substancialmente pura foi obtida a partir de Bone Care International, Inc. of Madison, Wisconsin. A la-(OH)D₂ foi cultivada com células Hep 3B, derivadas de um hematoma humano utilizando métodos conhecidos nesta técnica.

extractos lípidos foram gerados por meio de métodos conhecidos e foram sujeitos a cromatografia líquida de de pressão elevada (HPLC) sobre Zorbax SIL desenvolvida com hexano/isopropanol/metanol (91:7:2)). 0 metabolito putativo la,24-(0H) D elui

Z Z entre a la-(OH)D₂ progenitora e a 1,25-(OH)₂D₂ padrão (também obtida a partir de Bone Care International, Inc. of Madison, Wisconsin). A la,24-(OH)₂D₂ foi posteriormente purificada por meio deste sistema de HPLC antes da identificação do metabolito ter sido levada a cabo utilizando análise de espectrometria de massa.

O metabolito purificado era mais polar do que o material de partida, la-(OH)D , e deste modo concluiu-se experimentalmente que era um metabolito di-hidroxi-vitamina D₂. Este metabolito possuia também o cromóforo da vitamina D, o que indicava a retenção do sistema cis-trieno da vitamina D. Visto que o metabolito era derivado da la-(OH)D₂, a sua estura era, por conseguinte, Ια,Χ-(OH)₂D₂.

derivado trimetilsililo da la,X-(OH)₂D₂ foi preparado de acordo com métodos conhecidos nesta técnica e a espectrometria de massa foi levada a cabo sobre o derivado TMS e o composto nativo. 0 derivado TMS foi analisado por meio de CG-EM, e a identificação foi principalmente derivada da intrepretação do padrão de fragmentação do piro-metabolito. 0 ião molecular possuia a m/z de 644, o que indicava a di-hidroxi-vitamina D com dá adição de três grupos TMS correspondendo a 216 unidades de massa adicional. Visto que a la-(OH)D₂ tem grupos 3B e la e o metabolito putativo tinha um hidroxilo adicional, todos os três hidroxilos eram, deste modo, derivatizados. Foram encontrados fragmentos distintivos a m/z 601, 511, 421, 331 representando uma perda de 43 unidaes de massa do fragmento sozinho ou em adição a um, dois ou três grupos TMS de 90 unidades cada. Este padrão foi era muito provavelmente explicado pela clivagem da ligação entre C-24 e c-25, correspondendo a perda de CgH? a 43 unidades de massa. Isto representa a perda do fragmento ^C26^-C25^-C27’ ^{Para a}l®^m disso, faltava ao espectro de massa o fragmento de m/z 131 característico de todos os compostos de vitamina D 25-hidroxilados.

O espectro de massa mostrou o fragmento de m/z 513 indicando 1 indicando perda de 131 unidades de massa devido à clivagem do anel A com perda de C₂-C₃~C₄ também característico dos composto de vitamina D. 0 espectro de massa continha também m/z 143 o qual era provavelmente derivado da clivagem da ligação entre C-24 e C-23 e a uma perda de um grupo metilo. A perda anormal de 43 unidades indicando fragilidade da ligação ^C24^_C25 em associação com a perda de um fragmento devido à clivagem da ligação ^c23“^c24 indicou que o hidroxilo extra na la,X-(OH)₂D₂ era no carbono 24. Por conseguinte, a estrutura foi identificada como la,24-(OH)₂D₂.

O metabolito nativo foi analisado por espectometria de massa de sondagem directa. Esta análise foi consistente com um hidroxilo na posição 24, e foi também consistente com a análise

CG.EM do derivado TMS anteriormente descrita. O metabolito nativo mostrou o ião molecular esperado a m/z 428 e um fragmento distintivo a m/z 367, indicando perda de uma molécula de ãgua e do fragmento ^C25“^C26^-C27 de 43 unidades de massa.

Síntese da la,24-ài-hidroxi-vitamina P₂

Exemplo 2

Acetato de (22E)-5,7,22-ergostatrieno-3B-ilo (2)

A uma solução de 50 g (0,13 mol) de ergosterol (1) em 300 ml de piridina anidra foram adicionados 33,3 ml (0,35 mol) de anidrido acético. A mistura foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e, em seguida, foram adicionados 600 ml de ãgua. 0 precipitado foi filtrado e lavado três vezes com porções de 200 ml de acetonitrilo e, em seguida, seco ao ar de modo a obterem-se 42,0 g (74%) de (2.).

Acetato de 22-oxo-5a,8a-(4-fenxl-3_/5-dioxo-l,2,4-triazolidino-1,2-di-il)-23,24-dinor-6-choleno-35-ilo (4)

A uma solução de 33,0 g (0,075 mol) de acetato de ergosterol (2) em 1000 ml de clorofórmio foram adicionados 13,2 g (0,075 mol) de 4-fenil-l,2,4-triazolino-3,5-diona. A solução deste modo formada (3.) foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos e, em seguida, foram adicionados 5 ml de piridina. A solução foi arrefecida até -78 °C e tratada a -78°C com uma mistura de ozono-oxigénio durante 2 horas e, em seguida, completamente purgada com azoto. Em seguida, foram adicionados 50 ml de sulfureto de dimetilo e a mistura foi lavada com 300 ml de ãgua, em seguida duas vezes com 200 ml de HCl 2N e finalmente 300 ml de ãgua. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgSO₄ aniodro e concentrada até à secura in vacuo. O resíduo foi purificado sobre uma coluna de gel de sílica utilizando acetato de etilo a 30% em hexano de modo a produzirem-se 16,0 g (39%) do composto em epígrafe sob a forma de um sólido semelhante a espuma.

’ή RMN: (400 MHz; CDC1₃) : íppm 0,85 (3H, s, 18-CH₃) , 1,10 (3H, S, 19-CH₃), 1,15 (3H, d, 21-CH₃), 1,99 (3H, s, 36-CH₃CO), 5,45 (1H, m, 3«-H), 6,26 (1H, d, 7-H), 6,40 (1H, d, 6-H), 7,42 (5H, m, Ph), 9,58 (1H, d, HCO).

Acetato de (22E) 5a,8a-(4-fenil-3,5-aioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)colesta-6,22-dieno-24-ona-36-ilo (5)

Foi adicionado butil-lítio (8,94 ml de solução 1,6M em hexano, 0,014 mol) a uma solução agitada, arrefecida (0°C), de di-isopropilamina (1,45 g, 0,014 mol) de tetra-hidrofurano seco (20 ml) sob azoto. Foi adicionada 3-metilbutan-2-ona (1,23 g, 0,014 mol) em tetra-hidrofurano seco (6 ml), gota a gota, a 0°C, durante 15 min. A solução foi agitada a 0’C durante mais 1 h, em seguida arrefecida até -70°C e foi adicionada uma solução do aldeído (4) (6,0 g, 0,011 mol) em tetra-hidrofurano seco (60 ml). A temperatura foi aumentada até -20°C e a solução foi levada até a temperatura ambiente. Foram adicionados éter (800 ml) e água (400 ml) e a camada orgânica foi separada e lavada com ácido clorídrico a 10% (2 x 300 ml), e água (2 x 300 ml). A concentração deu origem ao produto bruto (7,5 g) o qual foi dissolvido em tetra-hidrofurano (100 ml) contendo ácido clorídrico 1,5 N (12 ml). Depois de refluxo durante 1,5 h, a mistura foi diluída com éter (600 ml), lavada com solução de carbonato de sódio a 5% (2 x 200 ml) e água (2 x 200 ml) , e seca (MgSC>₄ anidro) . A concentração sob pressão reduzida deu origem ao produto bruto (7,0 g). A cromatografia sobre gel de sílica (acetato de etilo a 50% em hexano) deu origem a 4,0 g (59%) da enona (5).

H RMN: (400 MHz): 6 ppm 0,83 (3H, s, 18-CH₃), 0,99 (3H, S, 19-CH₃), 1,09 (6H, dd, 26 e 27-CH₃), 1,12 (3H, d, 21-CH₃), 2,0 (3H, S, 3fi-CH₃CO), 2,84 (1H, m, 25-H), 5,45 (1H, m, 3α-Η), 6,06 (1H, d, 23-H), 6,24 (1H, d, 7-H), 6,39 (1H, d, 6-H), 6,71 (1H, dd, 22-H), 7,42 (5H, m, Ph) .

(22E)-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-6,22-ergostadieno-3B,24-diol (6)

A enona (5) (3,5 g, 5,7 mmol) em éter seco (100 ml) foi arrefecida até 0°C e foi adicionado, gota a gota, brometo de metilmagnésio (6,8 ml de solução 3,0 M em éter, 0,02 mol). DEpois de 1 h a 0°C, foi adicionado cloreto de amónio saturado (100 ml). A camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída com éter (2 x 200 ml). As fases etéreas combinadas foram secas sobre MgSO₄ anidro e concentradas até à secura in vacuo de modo a obterem-se 3,0 g (90%) de produto bruto de (j5) .

(22E)-5,7,22-ergostadieno-3B,24-diol (7)

A uma solução de 3,0 g (5,1 mmol) de (6) em tetra-hidrofurano seco (250 ml) foram adicionados 3,6 g (0,09 mol) de alumino-hidreto de lítio. A mistura foi aquecida sob refluxo durante 3 h, arrefecida com banho de gelo-ãgua e a mistura reaccional foi decomposta gota, de gelo-água (5 ml) foi concentrado in vacuo por meio da adição cuidadosa, gota a A mistura foi filtrada e o filtrado __ de modo a remover a maior parte do tetra-hidrofurano. O resíduo foi dissolvido em 200 ml de acetato de etilo e lavado duas vezes com solução saturada de NaCl (2 x 200 ml), seco sobre MgSO^ anidro e concentrado in vacuo. 0 resíduo foi purificado sobre uma coluna de gel de sílica utilizando acetato de etilo a 30% em hexano de modo a obterem-se 1,5 g (71%) de (7).

¹H RMN: (400 MHz, CDCl₃): áppm 0,64 (3H, s, 18-H) , 0,88 (6H, dd, 26 e 27-CH₃), 0,93 (3H, S, 19-CH₃), 1,06 (3H, d, 21-CH ), 1,19 (3H, s, 28-CH₃), 3,55 (ÍH, m, 3α-Η), 5,36 (ÍH, d, 7-H), 5,42 (2H, m, 22 e 23-H), 5,52 (ÍH, d, 6-H).

UV (etanol) lambda : 282 nm.

24-hidroxi-vitamina D₂ (8)

Um grama (2,4 mmol) de (7) foi dissolvido em 250 ml de éter e benzeno (4:1) e irradiado, com agitação sob azoto, num recipiente de imersão de quartzo arrefecido com água, utilizando uma lâmpada de UV de média pressão Hanovia, durante 2 h. A solução foi concentrada in vacuo, redissolvida em 100 ml de etanol, e aquecida sob refluxo de um dia para o outro. A solução foi concentrada até à secura in vacuo e o resíduo foi purificado sobre uma coluna de gel de sílica utilizando acetato de etilo a 30% em hexano de modo a obterem-se 0,55 g (55%) de (8).

RMN: (400MHz, CDC1₃): Bppm0,57 (3H, s, 18-CH₃), 0,92 (6H, dd, 26 e 27-CH₃), 1,06 (3H, d, 21-CH.p , 1,20 (3H, s, 28-CH₃),

3,93 (ÍH, rn, 3-H), 4,79 (ÍH, m, (agudo), 19-H), 5,01 (ÍH, m, (agudo), 19-H), 5,43 (2H, m, 22 e 23-H), 6,02 (ÍH, d, 7-H), 6,22 (ÍH, d, 6-H) .

UV (etanol) lambda : 265 nm.

tosilato de 24-hidroxi-vitamina D₂ (9)

A uma solução de 0,55 g (1,3 mmol) de (8) dissolvidos em 5 ml de piridina anidra foram adicionados 0,6 g (3,2 mmol) de cloreto de tosilo. A mistura foi agitada sob azoto a 5°C durante 20 h. A mistura reaccional foi vertida dentro de 100 ml de solução saturada fria de NaHCC>₃ e extraída com éter (3 x 100 ml) . Os extractos orgânicos combinados foram lavados com solução de

HCl a 5% (2 x 200 ml), solução saturada de bicarbonato de sódio (2 x 200 ml) e solução saturada de NaCl (2 x 200 ml), secos sobre MgSO^ anidro e concentrados in vacuo de modo a obterem-se 0,62 g (84%) de (9).

•’-Η RMN: (400 MHz, CDC1₃) : íppm0,57 (3H, s, 18-CH₃) , 0,92 (6H, dd, 26 e 27-CH₃), 1,08 (3H, d, 21-CH₃), 1,24 (3H, s, 28-CH₃), 2,43 (3H, s, CH₃, (tosilato)), 4,69 (1H, m, 3-H), 4,77 (1H, m, (agudo), 19-H), 5,0 (1H, m, (agudo), 19-H), 5,42 (2H, m, 22 e

23- H), 6,03 (1-H, d, 7-H), 6,25 (1-H, d, 6-H), 7,31 e 7,83 (4H, d, aromático).

24- hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂ (10)

A uma solução de 0,6 g (1,06 mmol) de (9.) dissolvidos em 50 ml de metanol anidro foram adicionados 4,0 g de bicarbonato de sódio (0,047 mol). A mistura foi aquecida ao refluxo durante 6 h. A mistura reaccional foi concentrada in vacuo. Foi adicionada água (100 ml), seguido pala extracção com éter (2 x 200 ml). Os extractos etéreos combinados foram secos sobre MgSO^ e concentrados até à secura in vacuo de modo a obterem-se 450 mg (100%) de (10) sob a forma de um óleo.

la,24-di-hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂ (11)

Foi adicionado hidroperóxido de terc-butilo (870 μΐ (2,61 mmol); 3M em tolueno) a uma suspensão de 73 mg (0,66 mmol) de dióxido de selénio em 50 ml de diclorometano anidro sob azoto. A mistura foi agitada â temperatura ambiente sob azoto durante 3 h. Em seguida, foram adicionados 0,1 ml de piridina anidra, seguida por uma solução de 450 mg de (10), dissolvidos em 15 ml de diclorometano anidro. A mistura foi agitada sob azoto à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida foram adicionados 25 ml de solução de NaOH a 10% e a mistura foi extraída com éter (3 x 100 ml). Os extractos etéreos combinados foram lavados com solução de NaOH a 10% (2 x 100 ml), ãgua (2 x 100 ml), solução saturada de cloreto de sódio (2 x 100 ml), seca sobre MgS0₄ anidro e concentrada até à secura in vacuo. o resíduo foi purificado sobre uma coluna de gel de sílica utilizando uma mistura de acetato de etilo a 30% em hexano de modo a obterem-se 110 mg (24%) de (11).

^XH RMN: (400 MHZ, CDCl₃): 5ppm 0,55 (3H, S, 18-CH₃), 0,90 (6H, dd, 26 e 27-CH₃), 1,03 (3H, d, 21-CH₃), 1,19 (3H, S, 28-CH₃),

3,25 (3H, s, -OCH₃), 4,19 (1H, d, 6-H), 4,19 (1H, m, 1-H), 4,92 (2H, d, 7-H), 5,15 (1H, m, (agudo), 19-H), 5,2 (1H, m, (agudo), 19-H), 5,42 (2H, m, 22 e 23-H)).

5.6- cis e 5,6-trans-la,24-di-hidroxi-vitamina (12, 13)

110 mg (0,25 mmol) de la,24-di-hidroxi-3,5-ciclovitamina D2 (11) foram dissolvidos em 2,0 ml de dimetil-sulfóxido e 1,5 ml de ácido acético e aqueceu-se a 50°C, sob azoto, durante 1 h. A solução foi vertida sobre gelo e 50 ml de solução saturada de NaHC0₃· A mistura foi extraída com éter (3 x 100 ml), água (2 x 100 ml), solução saturada de cloreto de sódio (2 x 200 ml), seca sobre MgSO₄ anidro e concentrada in vacuo de modo a obterem-se 100 mg (93%) do produto bruto de (12) e (13).

5.6- cis-la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ (12)

A uma solução de (12) e (13) em 5 ml de acetato de etilo foram adicionados 20 mg (0,2 mmol) de anidrido maleico e a mistura foi agitada a 35°C durante 24 h sob azoto. A solução foi concentrada até à secura in vacuo. 0 resíduo foi purificado sobre uma coluna de gel de sílica utilizando acetato de etilo a 50% em hexano de modo a obterem-se 20 mg (22%) de (12) .

RMN: (400 MHz, CDCl₃): Sppm 0,57 (3H, s, 18-CH₃), 0,89 (6H, dd, 26 e 27-CH₃), 1,04 (3H, d, 21-CH₃), 1,21 (3H, s, 28-CH₃),

4,23 (1H, m, 3-H), 4,40 (1H, m, 1-H) , 5,0 (1H, m, (agudo), 19-Η) ,

5,33 (1H, m, (agudo), 19-H), 5,44 (2H, m, 22 e 23-H)), 6,01 (1H, d, 7-H), 6,37 (1H, d, 6-H).

UV (etanol) lambda : 265 nm.

KISX

Produção preferencial de la,24-(OH)com concentrações crescentes de substrato in vitro

Exemplo 3

Células hep 3B foram incubadas com la-OH-D₂, conforme descrito anteriormente, em concentrações finais de 1, 10 ou 100 nM (Experiência 1), e 1 ou 10 μΜ (Experiência 2) e a la,24-(OH)₂D₂ foi extraída e purificada. Os metabolitos la,24-(OH)₂D₂e 1,25-(OH)₂D₂ foram quantificados por meio de marca radioactiva recuperada (Experiência 1) ou por meio de espectrofotometria de disposição de fotodíodo (Experiência 2). Conforme mostrado na Tabela 1, a quantidade de la,24-(OH)₂D₂ aumentou relativamente à quantidade de 1,25-(OH)₂D₂, à medida que a concentração de substrato era aumentada. Isto indica que neste sistema a la,24-(OH)₂D₂ era o metabolito natural activo predominante da la-OH-D₂para concentrações de substrato mais elevadas.

TABELA 1

EXPERIÊNCIA	CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO	PRODUTO	FORMADO
1	nM	Proporção de la,24-(OH)₀D para 1,25-(OH)₂D₂ ^{2 2}
	1	1:	4
	10	1:	1
	100	1,5:	1
2	μΜ	Velocidade pmol por 10°	ϊ Produção, células/dia
		la,24-(OH)₂D₂	1,25-(OH)₂D₂
	1	4,9	* N.D.
	10	59	7,4

N.D. significa não detectãvel

Produção de let,24-(OH)em mulheres osteoporóticas administradas com la-OH-Dg

Exemplo 4

Um aumento na produção de la,24-(OH)₂D₂ relativamente a 1,25-(OH)₂D₂ foi também observado pelos presentes inventores em fêmeas humanasque receberam la-OH-D₂ como parte de uma investigação acerca daquela droga para o tratamento de osteoporose. A seguir quer a uma dose única de 2 jug de la-OH-D₂ quer a doses diárias de 8 /xg/dia durante uma semana, o sangue foi recolhido e analisado relativamente aos metabolitos la,24-(OH)₂D₂ e 1,25-(OH)₂D₂· Os lipidos foram extraídos do sangue, e os metabolitos foram purificados por meio de HPLC utilizando métodos padrão, e quantificados com o ensaio de radio-receptore produzido por Incstar (Stillwater, Minnesota) . Um dia depois de uma dose única de 2 jug, o nível de la,24-(OH)₂D₂ não era detectável, sendo o nível de 1,25-(OH)₂D₂ de aproximadamente 11 pg/ml. Pelo contrário, um dia a seguir à última dose de 8 jLtg, o nível de la,24-(OH)₂D₂ tinha um valor de 9 pg/ml, tendo o nível de 1,25-(OH)₂D₂um valor de 30 pg/ml

Afinidade da la,24-(QH)para o receptor de vitamina D

Exemplo 5

A afinidade da la,24-(OH)₂D₂ para o receptor de vitamina D (VDR) mamífero foi avaliada utilizando um equipamento (kit) comercialmente disponível de VDR de timo bovino e soluções padrão de 1,25-(OH)₂D₃ a partir de Incstar (Stillwater, Minnesota). A la,24-(OH)₂D₂ purificada foi quantificada por meio de espectrofotometrisa de disposição de fotodíodo e ensaiada no ensaio de radio-receptor. A ligação semi-máxima de la,24-(OH)₂D₂foi aproximadamente 150 pg/ml enquanto que a da la,25-(OH)₂D₂ foi de 80 pg/ml. DDeste modo, o VDR de timo bovino tinha uma afinidade duas vezes mais baixa para a la,24-(OH)₂D₂ do que para a la, 25-(OH) 2°3/ ° que indicava que a la,24-(OH)₂D₂ tinha uma actividade biológica potente.

Afinidade da la,24-(OH)₂P₂ para a proteína de ligagão ao soro da vitamina D

Exemplo 6

A afinidade da la,24-(OH)₂D₂ para a proteína de ligação ao soro de vitamina D (DBP) foi avaliada utilizando soro de ratazana deficiente em vitamina D, de acordo com métodos conhecidos nesta técnica. Os dados indicaram que a ligação a DBP da la,24-(OH)₂D₂ era pelo menos 1 000 vezes mais fraca do que para a 25-OH-D.. Em virtude da ligação forte da la,24-(OH)_D para o VDR e da ligação fraca para a DBP, este composto pode ser destinado a ser tomado pelas células alvo, possuindo deste modo uma potente actividade biológica. Para além disso, a ligação fraca pela DBP foi indicativa de uma remoção mais rápida, o que conduz a uma baixa toxicidade.

Deste modo, os ensaios anteriores demonstraram que a nova la,24-(OH)₂D₂ exibia um espectro de actividades distinto e único, momeadamente, potência biológica elevada e baixa toxicidade, o que distinguia, claramente, o composto dos da técnica anterior.

Ensaios Biológicos

Exemplo 7

Vinte mulheres osteoporóticas pós-menopausa são inscritas num estudo de marcação aberta. Os pacientes seleccionados possuem idades entre 55 e 75 anos, e exibem densidade mideral dos 2 ossos vertebrais L2-L3 entre 0,7 e 1,05 g/cm , conforme determinado por meio de medidas com um Densitómetro de Ossos LUNAR (Lunar Corporation, Madison, Wisconsin).

Quando da admissão ao estudo, todos os pacientes receberam a instrução de seleccionarem uma dieta diária contendo 400 a 600 mg de cálcio. A concordância com esta dieta é verificada em intervalos semanais por meio de registos alimentares de 24 horas e por meio de intervistas com cada paciente.

Todos os pacientes completam um período base de uma semana, um período de tratamento de cinco semanas, e um período de observação pós-tratamento de uma semana. Durante o período de tratamento, os pacientes auto-administraram oralmente la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ numa dose inicial de 0,5 /ig/dia relativamente à primeira semana, e em doses sucessivamente mais elevadas de 1,0, 2,0, 4,0 e 8,0 gg/dia em cada uma das quatro semanas seguintes. Todas as doses são administradas antes do pequeno almoço.

As químicas do sangue e da urina são verificadas numa base semanal ao longo de todo o estudo. As químicas principais do sangue incluem os níveis no soro, em jejum, de cálcio, fósforo, osteocalcina, creatinina, e de azoto de ureia no sangue. As químicas principais da urina incluem a excreção em 24 horas de cálcio, fósforo, e creatinina.

Os dados do sangue e da urina obtidos a partir deste estudo clínico indicam que este composto não afecta de modo adverso a função renal, conforme determinado por remoção de creatinina e níveis no sangue de azoto da ureia; nem faz aumentar a excreção urinária de hidroxiprolina, o que indica a ausência de qualquer efeito estimulante sobre a reabsorção óssea. 0 composto não tem efeito sobre quaisquer parâmetros do soro verificados rotineiramente, o que indica a ausência de efeitos metabólicos adversos.

Um efeito positivo da la,24-di-hidroxivitamina D₂ sobre a homeostase do cálcio é evidente a partir aumentos modestos nos níveis de cálcio urinários em 24 horas, o que confirma que o composto aumenta a absorção de cálcio intestinal, e a partir de aumentos nos níveis de osteocalcina no soro, o que indica que o composto estimula os osteoblastos.

Exemplo 8

É conduzido um estudo clínico com pacientes externos osteoporóticos põs-menopausa, possuindo idades entre 55 e 75 anos. 0 estudo envolve até 120 pacientes aleatorimente divididos em três grupos de tratamento e continua durante 24 a 36 meses. Dois dos grupos de tratamento recebem dosagens constantes de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ (u.i.d.; dois níveis de dose diferentes a, ou superiores a, 1,0 gg/dia) e o outro grupo recebe um placebo equivalente. Todos os pacientes mantêm uma tomada normal de cálcio dietético e abstêm-se da utilização de suplementos de cálcio. A eficácia é avaliada por meio de comparações pré- e pós-tratamento dos grupos de pacientes retivamente a (a) retenção total de cálcio no corpo, e (b) densidade mineral óssea radial e espinal, conforme determinada por absorciometria de duplo fotão (DPA) ou absorciometria de raios X de dupla energia (DEXA). A segurança é avaliada por meio de comparações da excreção urinária de hidroxiprolina, níveis de cálcio na urina e no soro, remoção de creatinina, azoto de ureia no sangue, e outras determinações de rotina.

Os resultados mostram que os pacientes tratados com la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ apresentam cálcio total no corpo, e densidades ósseas radiais e espinais, significativamente mais elevados relativamente a pacientes tratados com placebo. Os parâmetros de segurança verificados confirmam uma incidência insignificante de hipercalcemia ou hipercalciuria, ou de qualquer outro distúrbio metabólico, com a terapia por la,24-di-hidroxi-vitamina D₂·

Exemplo 9

É conduzido um estudo clínico com mulheres pós-menopausa saudáveis, possuindo idades entre 55 e 60 anos. O estudo envolve até 80 pacientes aleatorimente divididos em dois grupos de tratamento e continua durante 24 a 36 meses. Um dos grupos de tratamento recebe uma dosagem constante de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ (u.i.d.; um nível de dose a, ou superior a, 1,0 jug/dia) e o outro grupo recebe um placebo equivalente. O estudo é conduzido conforme indicado no Exemplo 2 anterior.

Os resultados mostram que os pacientes tratados com la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ apresentam perdas reduzidas de cálcio total no corpo, e das densidades ósseas radiais e espinais, relativamente aos valores da linha de base. Em contraste, os pacientes tratados com com placebo mostram perdas significativas nestes parâmetros relativamente aos valores da linha de base. Os parâmetros de segurança verificados confirmam a segurança da administração a longo prazo de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ neste nível de dose.

Exemplo 10

É conduzido um um ensaio clinico de doze meses, controlado com placebo, duplamente cego, com trinta homens e mulheres com com doença renal, os quais estão sendo submetidos a hemodiálise crónica. Todos os pacientes entram num oeríodo de controlo de 8 semanas, tempo durante o qual recebem uma dose de manutenção de Vitamina D₃ (400 Ul/dia). Depois deste período de controlo, os pacientes são divididos aleatoriamente em dois grupos de tratamento: um dos grupos de tratamento recebe uma dosagem constante de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ (u.i.d.; uma dosagem superior a 3,0 /xg/dia) e o outro grupo recebe um placebo equivalente. Ambos os grupos de tratamento recebem recebem uma dosagem de manutenção de Vitamina Dg, mantêm uma tomada normal de cálcio dietético e abstêm-se da utilização de suplementos de cálcio. A eficácia é avaliada por meio de comparações pré- e pós-tratamento dos dois grupos de pacientes retivamente a (a) medidas directas da absorção intestinal de cálcio (b) retenção total de cálcio no corpo, (c) densidade mineral óssea radial e espinal, e (d) determinações de cálcio no soro. A segurança é avaliada por meio de verificação dregular do cálcio no soro.

A análise dos dados clínicos mostra a la,24-di-hidroxi-vitamina D^ aumenta significativamente a absorção do cálcio, conforme determinado por meio de medidas directas utlizando uma técnica de duplo isótopo. Os pacientes tratados com este composto níveis normalizados de cálcio no soro, valores estáveis de cálcio total no corpo, e densidades ósseas radiais e espinais estáveis, relativamente aos valores da linha de base. Em contraste, os pacientes tratados com placebo mostram hipolcalcemia frequente, redução significativa do cálcio total do corpo e da densidade óssea radial e espinal. É observada uma incidência insignificante de hipocalcemia no grupo tratado.

Preparações de Medicamentos

Exemplo 11

É preparado um creme tópico através da dissolução de 1,0 mg de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ em 1 g de óleo de amêndoas. A esta solução são adicionados 40 g de óleo mineral e 20 g de cera de abelhas auto-emulsionável. A mistura é aquecida até á liquefacção. Depois da adição de 40 ml de água quente, a mistura ê bem misturada. 0 creme resultante contem aproximadamente 10 pg de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ por grama de creme.

Exemplo 12

É preparada uma pomada através da dissolução de 1,0 mg de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ em 30 g de óleo de amêndoas. A esta solução são adicionados 70 g de parafina mole branca, a qual tinha sido aquecida o estritamente necessário para a liquefacção. A pomada é bem misturada e deixada arrefecer. Esta pomada contem aproximadamente 10 /xg de la,24-di-hidroxi-vitamina por grama de pomada.

Exemplo 13

À pomada do Exemplo 12 são adicionados, com mistura cuidadosa, 0,5 g de adenosina e 2,0 g de base papaverina, ambas dissolvidas numa quantidade mínima de dimetil-sulfóxido. Os ingredientes adicionais estão presentes numa quantidade de cerca de 0,5% em peso (adenosina) e 2% em peso (base papaverina).

Exemplo 14

À pomada do Exemplo 12 são adicionados, com mistura cuidadosa, 10 000 U de Vitamina A, dissolvida numa quantidade mínima de óleo vegetal. A pomada resultante contem cerca de 100 U de Vitamina A por grama de pomada.

Exemplo 15

É preparada uma loção dermatológica através da dissolução de 1,0 mg de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ em 100 g de propileno-glicol seco. A loção é armazenada num frigorífico numa garrafa castanha e contem cerca de 10 ^g de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ por grama de loção.

Exemplo 16

Em 1 g de óleo de amêndoas são dissolvidos 0,2 mg de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂· À solução são adicionados 40 g de óleo mineral e 20 g de cera de abelhas auto-emulsionável, seguido pela adição de 40 ml de água quente. A mistura é bem misturada de modo a produzir um creme cosmético que contem aproximadamente 2 μ<3 de la,24-di-hidroxi-vitamina por grama de creme.

Exemplo 17

Ao creme cosmético preparado de acordo com o Exemplo 14 são adicionados 10 mg de adenosina. O creme é bem misturado e contem cerca de 0,1% em peso de adenosina.

Exemplo 18

É preparada uma pomada através da dissolução de 100 μ<3 de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ em 30 g de óleo de amêndoas. À solução assim produzida são adicionados 70 g de parafina mole branca, a qual tinha sido aquecida o estritamente necessário para a liquefacção. A pomada é bem misturada e deixada arrefecer. Esta pomada contem aproximadamente 1,0 μφ de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ por grama de pomada.

Exemplo 19

À pomada cosmética do Exemplo 12 são adicionados, com mistura cuidadosa, 200 U de Vitamina A, dissolvida numa quantidade mínima de óleo vegetal.

Exemplo 20

É preparada uma loção cosmética através da dissolução de 300 Mg de la,24-di-hidroxi-vitamina D em 100 g de propileno-glicol seco. A loção é armazenada num frigorífico numa garrafa castanha e contem cerca de 3,0 M9 de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ por grama de loção.

Teste Dermatológico

Exemplo 21

São avaliadas composições contendo la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ quanto à eficácia terapêutica da composição no tratamento tópico da dermatite (de contacto e ectópica). A composição avaliada é uma pomada que contem 10 Mg de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ por grama de pomada numa base petrolato-óleo de amêndoas. A composição de controlo é idêntica excepto que não contm o agente activo la,24-di-hidroxi-vitamina D₂· Os pacientes são tratados numa clínica para pacientes externos. Eles são intruídos para utilizarem a preparação duas vezes por dia.

A pomada é, tanto quanto possível, aplicada a uma única lesão, ou a uma área da doença. A pomada e o seu contentor são pesados antes do tratamento se iniciar e são voltados a pesar, com qualquer conteúdo não utilizado, no fim do tratamento.

A área da lesão tratada é estimada e registada, e a lesão é fotografada se requerido, juntamente com lesões de controlo adequadas. Estas últimas são, de preferência, lesões de dimensões semelhantes e na mesma fase de desenvolvimento.quer na vizinhança da lesão tratada, quer simetricamente contralateral. Os pormenores relevantes do procedimento fotográfico são registados de modo a serem reproduzidos quando as lesões são a seguir fotografadas (distância, abertura, ângulo, fundo, etc.). A pomada é aplicada duas vezes por dia e de preferência deixada descoberta. As lesões de control são deixadas por tratar, mas se isso não for possível, o tratamento nelas utilizado é registado.

São conduzidas avaliações do eritrema, formação de escamas e espessura, com intervalos semanais, por um médico, sendo a gravidade da lesão classificada de 0 a 3. A avaliação final é habitualmente levada a cabo ao fim de quatro a seis semanas de tratamento. Essas lesões tratadas com la,24-(OH)₂D₂têm valores mais baixos do que as lesões de controlo. É também observada uma incidência insignificante de hipercalcemia.

Diferenciação das Células Epidérmicas e Ensaio de Proliferação

Exemplo 22

São cultivados ceratinócitos humanos de acordo com modificações conhecidas do sistema originalmente descrito por Rheiwald e Green (Cell, 6; 331 (1975)). A la,24-di-hidroxi-vitamina D₂, dissolvida em etanol, é adicionada às células de modo a produzir-se uma variedade de concentrações entre 0,05 e 5 Mg/ml, em que a concentração de etanol não excede 0,5% v/v. As culturas de controlo são suplementadas com etanol numa concentração de 0,5% v/v.

A diferenciação e proliferação das células epidérmicas em cultura é examinada por meio de:

1.

Quantificação dos invólucros endurecidos.

*

2. Quantificação da densidade de células ligadas aos discos;

3. Verificação da actividade da transglutaminase; ou

4. Verificação da síntese de DNA pela incorporação de

...

H-timidma.

As culturas incubadas com la,24-di-hidroxi-vitamina D₂têm mais invólucros endurecidos, menos células ligadas, actividade de transglutaminase mais elevada, e síntese de DNA mais baixa do que as culturas de controlo.

Embora o presente invento tenha agora sido descrito e exernplifiçado com alguma especificidade, os peritos nesta técnica terão em consideração as varias modificações, incluindo variações, adições e omissões, que podem ser feitas em tudo o que foi descrito. Por conseguinte, é nossa intenção que estas modificações possam também ser englobadas pelo presente invento, e que o âmbito do presente invento seja unicamente limitado pela intrepretação mais ampla que legalmente possa estar de acordo com as reivindicações apensas.

Claims

ia. - utilização da la,24-di-hidroxi-vitamina D₂, caracterizada por o referido composto ser empregado para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de doenças induzidas pela deficiência em vitamina D.
2^â. - Utilização da la, 24-di-hidroxi-vitamina caracterizada por o referido composto ser empregado para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento da osteodistrofia renal.
3ã. - Utilização da la, 24-di-hidroxi-vitamina caracterizada por referido composto ser empregado para a preparação de um medicamento tópico para o tratamento de perturbações da pele.
4^. - Utilização da la, 24-di-hidroxi-vitamina D₂, caracterizada por o referido composto ser empregado para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de perturbações depletivas dos ossos.
5ã. - Composição farmacêutica profilática ou terapêutica para doenças provocadas por deficiência em vitamina D, caracterizada por compreender um veículo fisiologicamente aceitável e uma quantidade eficaz de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂·
6â. - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender uma quantidade eficaz para prevenir ou tratar a perda de massa óssea ou do conteúdo mineral dos ossos, num ser humano que sofre de ou que é predisposto a uma perturbação depletiva dos ossos, de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ em combinação com um excipiente fisiologicamente aceitável.
7â. - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender uma quantidade eficaz para estabilizar a densidade óssea espinal e radial, num ser humano que sofre de osteodistrofia renal, de la,24-di-hidroxi-vitamina D em combinação com um excipiente fisiologicamente aceitável.
8â. - Método para prevenir ou tratar a perda de massa óssea ou do conteúdo mineral dos ossos, num ser humano que sofre de ou que é predisposto a uma perturbação a perda de massa óssea ou do conteúdo mineral dos ossos, caracterizado por compreender a administração ao referido ser humano de uma quantidade de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ suficiente para prevenir a perda de massa óssea ou do conteúdo mineral dos ossos, sem causar hipercalcemia ou hipercalciuria.

ga. - Método para estabilizar ou aumentar a massa óssea, num ser humano que sofre de osteodistrofia renal, caracterizado por compreender a administração ao referido ser humano de uma quantidade de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ suficiente para estabilizar ou aumentar a massa óssea, sem causar hipercalcemia ou hipercalciuria.
10ã. - composição para utilização no tratamento de perturbações da pele, caracterizada por compreender um suporte para aplicação tópica e 1,24-di-hidroxi-vitamina D₂.

llã. - Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a quantidade de 1,24-di-hidroxi-vitamina D₂ se situar entre 0,01 jug e 10 μg.
12a. - Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por compreender ainda um agente de entre o grupo constituído por agentes indutores de epitelialização, cromanois, β-agonistas, agentes anti-inflamatórios e agentes ceratoplásticos.
13â. - Método para a preparação da la,24-di-hidroxi-vitamina D₂, caracterizado por compreender:

(a) a acetilação do ergosterol para formar o seu 3fi-acetato;

(b) a reacção com uma triazolinodiona e a ozonação para formar o acetato de 22-οχο-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-23,24-dinor-6-coleno-3fi-ilo;

(c) a adição de 3-metilbutan-2-ona ao acetato de 22-oxo-5a,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-23,24-dinor-6-coleno-3B-ilo para formar o acetato de (22E)-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-1,2-di-il)-colesta-6,22-dieno-24-ona-3fi-ilo;

(d) a adição de brometo de metilmagnésio ao acetato de (22E)-5a,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-colesta-6,22-dieno-24-ona-3B-ilo para formar o (22E)-5a,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-6,22-ergostadieno-3B,24-diol;

(e) a redução do (22E)-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l, 2-di-il) -6,22-ergostadieno-3B,24-diol para formar o 24-hidroxi-ergosterol;

(g) a irradiação do 24-hidroxi-ergosterol para formar a 24-hidroxi-vitamina D₂;

(h) a tosilação da 24-hidroxi-vitamina D₂ na presença de piridina seca para formar o 36-tosilato de 24-hidroxi-vitamina D₂;

(i) a solvólise do tosilato de 24-hidroxi-vitamina D₂ para formar a 24-hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂;

(j) a oxidação alílica da 24-hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂com dióxido de selénio para formar a la,24-di-hidroxi-ciclovitamina D₂; e (k) a hidrólise da la,24-di-hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂com uma mistura de dimetilsulfóxido e um ácido orgânico para formar uma mistura de 5,6-cis-la-hidroxi e 5,6-trans-la,24-di-hidroxi-vitamina D₂ e a formação de um produto de adição de Diels-Alder da 5,6-trans-la-hidroxi-vitamina D₂ para permitir a purificação de modo a obter-se a la,24-di-hidroxi-vitamina D₂·
14^. - Método para a preparação de la,24-di-hidroxi-vitamina D₂, caracterizado por compreender:

(a) a tosilação da 24-hidroxi-vitamina D₂ para formar o tosilato de 24-hidroxi-vitamina D₂;

(b) a metanólise do tosilato de 24-hidroxi-vitamina D₂ para formar a 24-hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂;

(c) a oxidação da 24-hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂ para formar a la,24-di-hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂; e (d) a hidrólise sequencial e a sujeição a uma reacção de

Diels-Alder da la,24-di-hidroxi-3,5-ciclovitamina D para formar a la, 24-di-hidroxi-vitamina D₂·
15 ^a. - Método para a preparação de acetato de 22-oxo-5a,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-23,24-dinor-6-coleno-3B-ilo, caracterizado por compreender a reacção do acetato de 22-οχο-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-1,2-ài-il)-23,24-dinor-6-coleno-3B-ilo com 3-metilbutan-2-ona na presença de butil-lítio e tetra-hidrofurano seco.
16^a. - Método para a preparação de (22E)-5a,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l, 2-di-il) -6,22-ergostadieno-3D,24-diol, caracterizado por compreender a reacção do acetato de 22-οχο-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-23,24-dinor-6-coleno-3B-ilo com um reagente de Grignard.
17ã. - Método para a preparação de 24-hidroxi-ergosterol, caracterizado por compreender a reacção do (22E)-5a,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-6,22-ergostadieno-3B,24-diol, com hidreto de alumínio e lítio na presença de tetra-hidrofurano seco.
18^a. - Método para a preparação de tosilato de 24-hidroxi-vitamina D , caracterizado por compreender a reacção do 24-hidroxi-ergosterol, com cloreto de tolueno-sulfonilo na presença de piridina seca.
19^a. - Método para a preparação de 6-metoxi-24-hidroxi-3,5-ciclovitamina D , caracterizado por compreender a solvólise do tosilato de 24-hidroxi-vitamina D₂, em metanol.
20ã. - Método para a preparação de 6-metoxi-la,24-di-hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂, caracterizado por compreender a oxidação alílica da 6-metoxi-24-hidroxi-3,5-ciclovitamina D , com dióxido de selénio.
21â. - Método para o tratamento de doenças depletivas dos ossos induzidas pela deficiência em vitamina D, caracterizado por compreender:

(a) a redução do ergosterol, sob condições tais e numa quantidade suficiente para produzir o 24-hidroxi-ergosterol;

(b) a irradiação do 24-hidroxi-ergosterol para produzir a 24-hidroxi-vitamina D₂;

(c) a hidroxilação da vitamina D₂, sob condições tais e numa quantidade suficiente para produzir a la,24-di-hidroxi-vitamina D₂;

(d) a purificação da la,24-di-hidroxi-vitamina D₂;

(e) a administração a um ser humano que sofre de uma doença depletiva dos ossos, de uma quantidade eficaz para prevenir ou inverter a perda de massa óssea ou do conteúdo mineral dos ossos de la,24-di-hidroxi-vitamina D , em mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitáo vel.
22^â. - Composto, caracterizado por ser o acetato de (22E)-5a,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-colesta-6,22-dieno-24-ona-3B-ilo.
23a. - composto, caracterizado por ser ο (22Ε)-5α,8α-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-6,22-ergostadieno-3B,24-diol.
24â. - Composto, caracterizado por ser o (22E)-5,7,22-ergostatrieno-3B,24-diol.

253. - composto, caracterizado por ser o 24-hidroxi-ergosterol.

263. - composto, caracterizado por ser o tosilato de 24-hidroxi-vitamina D₂·

273. - Composto, caracterizado por ser o 6-metoxi-24-hidroxi-3,5-ciclovitamina D₂.

283. - Método para a preparação da 24-hidroxi-vitamina D₂, caracterizado por compreender:

(a) a acetilação do ergosterol para formar o seu 3B-acetato;

(b) a reacção com uma triazolinodiona e a ozonação para formar o acetato de 22-οχο-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidino-l,2-di-il) -23,24-dinor-6-coleno-3B-ilo;

(c) a adição de 3-metilbutan-2-ona ao acetato de 22-oxo-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-23,24-dinor-6-coleno-3B-ilo para formar o acetato de (22E)-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l, 2-di-il) -colesta-6,22-dieno-24-ona-3B-ilo;

(d) a adição de brometo de metilmagnésio ao acetato de (22E)-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-colesta-6,22-dieno-24-ona-3B-ilo para formar o (22E)-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-6,22-ergostadieno-38,24-diol;

(e) a redução do (22E)-5α,8a-(4-fenil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidino-l,2-di-il)-6,22-ergostadieno-3B,24-diol para formar o 24-hidroxi-ergosterol; e (g) a irradiação do 24-hidroxi-ergosterol para formar a 24-hidroxi-vitamina D₂·
29a. - Alimento para mamíferos, caracterizado por compreender la,24-di-hidroxi-vitamina D₂, em que o consumo normal pelos mamíferos proporciona cerca de 0,01 a cerca de 1,0 /xg/kg/dia de la, 24-di-hidroxi-vitamina D₂·