DE3590232C2

DE3590232C2 - 1,24-Dihydroxy- 22-Vitamin D3-Derivate, diese enthaltende Arzneimittel sowie Cholesterinderivate alsZwischenprodukte

Info

Publication number: DE3590232C2
Application number: DE19853590232
Authority: DE
Inventors: Hector Deluca; Nobuo Ikekawa; Yoko Tanaka
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-02-28
Publication date: 1992-09-17
Anticipated expiration: 2005-03-01
Also published as: US4588528A; GB8513721D0; IE851284L; JPH0576940B2; JPH0692989A; WO1985005622A1; AU4063985A; JPS61502257A; JPH0662664B2; DE3590232T; IE58286B1; FR2565227A1; GB2159520B; BE902528A; GB2159520A; FR2565227B1

Description

Die Erfindung betrifft neue 1,24-Dihydroxy-Δ²²-Vitamin D₃-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel. Ferner betrifft die Erfindung neue Cholesterinderivate, die bei der Herstellung der vorerwähnten Vitamin D₃-Derivate als Zwischenprodukte verwendbar sind.

Seit der Entdeckung, daß die aktive hormonale Form von Vitamin D bei der Stimulierung des intestinalen Calciumtransports, des intestinalen Phosphattransports und der Knochen-Calcium-Mobilisierung des 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃) ist, wurde ein bemerkenswertes Interesse für die chemische Synthese von Analogverbindungen dieser Verbindung entwickelt mit dem Ziel solche Analogverbindungen aufzufinden, die entweder eine erhöhte biologische Aktivität aufweisen oder spezielle Wirkungen bezüglich eines bestimmten Zielorgans aufweisen. Die wirksamsten Analogverbindungen, die bislang hergestellt wurden, sind 26,26,26,27,27,27-Hexafluor-1,25-dihydroxyvitamin D₃ (26,27,F₆- 1,25-(OH)₂D₃) (US-Patentschrift 43 58 406) und 24,24-Difluor-1,25- dihydroxyvitamin D₃ (24,24,F₂-1,25-(OH)₂D₃) (US-Patentschrift 42 01 881). Diese Verbindungen zeigen eine Wirksamkeit, die mindestens dem zehnfachen Wert der natürlichen Hormone entspricht. Alle anderen Modifizierungen der Seitenkette scheinen die biologische Aktivität zu verringern, mit Ausnahme der Ergosterol- Seitenkette, die eine Nichtsättigung an der Δ²²-Stellung und eine Methylgruppe an der 24S-Stellung aufweist. Diese Verbindung scheint in gleichem Maße wirksam zu sein bei der Bindung an den Küken-Intestinal-Cytosol-Rezeptor und bezüglich der biologischen Wirksamkeit gegenüber Säugetieren, zeigt jedoch nur ein Zehntel der Wirksamkeit bei Vögeln. Es ist somit von Interesse, verschiedene Analogverbindungen herzustellen, worin jede dieser Modifizierungen getrennt untersucht wird. Ferner ist die Tatsache von Interesse, daß 1,24-Dihydroxyvitamin D₃ (1,24-(OH)₂D₃) in gleichem Maße wie 1,25-(OH)₂D₃ wirksam ist bei der Bindung an den Küken-Intestinal-Rezeptor, jedoch bei der Verabfolgung in vivo 1,24-(OH)₂D₃ lediglich ein Zehntel der Wirksamkeit von 1,25-(OH)₂D₃ aufweist, und daß das 1,24S-Isomer noch weniger wirksam als das 1,24R-Isomer ist.

Mit der vorliegenden Erfindung werden nunmehr weitere Vitamin D-Derivate zur Verfügung gestellt, die hinsichtlich ihrer Wirksamkeit der dem sich aus vorstehendem Sachverhalt ergebenden Zielsetzung Rechnung tragen. Es handelt sich dabei um die im Anspruch 1 angegebenen Verbindungen. Sie stellen die trans-Isomeren von 1,24-Dihydroxy-vitamin D₃ (1,24-(OH)₂D₃) dar, worin eine Doppelbindung in die 22-Stellung und eine Hydroxylfunktion in der S- und R-Stellung am Kohlstoffatom 24 eingeführt wurde. Als erfindungsgemäß besonders bevorzugte Verbindungen gelten (22E,24S)-1,24-Dihydroxy-Δ²²-vitamin D₃ und (22E,24R)-1,24- Dihydroxy-Δ²²-vitamin D₃.

Beide Verbindungen weisen eine dem Vitamin D ähnliche, besonders ausgeprägte Wirksamkeit auf, wobei die 24-S-Verbindung die größere Wirksamkeit zeigt und sich der Wirksamkeit von 1,25-(OH)₂D₂ annähert.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gemäß dem nachstehenden Verfahrensschema hergestellt werden, auf das bei der nachfolgenden Beschreibung Bezug genommen wird. Die in dem Verfahrensschema und in der Verfahrensbeschreibung für die einzelnen Verbindungen verwendeten Numerierungen entsprechen einander.

Die in der nachfolgenden Beschreibung erwähnten physiko-chemischen Messungen wurden folgendermaßen durchgeführt: Schmelzpunkte wurden bestimmt mit einem Heißstufen-Mikroskop und wurden nicht korrigiert. UV-Spektren wurden in ethanolischer Lösung mit einem Shimadzu UV-200-Doppelstrahl-Spektrometer erhalten. ¹H-NMR-Spektren wurden mit einem Hitachi R-24A-Spektrometer, einem JEOL PS-100-Spektrometer oder einem JEOL FX-400-Spektrometer vermessen. Alle NMR-Spektren wurden in einer DCDl₃-Lösung mit Tetramethylsilan als interner Referenz aufgenommen. Massenspektren wurden mit einem Shimadzu LKB 9000S-Spektrometer bei 70 eV erhalten. Säulenchromatographie wurde durchgeführt mit Silikagel (Merck, 70-230 mesh). Präparative Dünnschichtchromatographie wurde an vorbeschichteten Platten aus Silikagel (Merck, Silicagel 60 F₂₅₄) durchgeführt. Die übliche Aufarbeitung betrifft die Verdünnung mit Wasser, Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, Waschen bis zur Neutralität, Trocknen über Magnesiumsulfat, Filtrieren und Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck.

Schema

Synthese 22-Hydroxy-23,24-dinorchol-1,4,6-trien-3-on (2)

Eine Lösung von 3β-Acetoxydinorcholensäure (1) (7,0 g, 18,04 mMol) in THF (20 ml) wurde Lithiumaluminiumhydrid (3,0 g, 78,95 mMol) zugesetzt. Dieses Gemisch wurde 14 Stunden bei 60°C gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurden Wasser und Ethylacetat vorsichtig zugesetzt. Das Filtrieren und Abziehen des Lösungsmittels ergab den Rückstand (5,2 g). Der Rückstand in Dioxan (140 ml) wurde mit Di chlordicyanbenzochinon (11,7 g, 51,54 mMol) unter Rückfluß für 14 Stunden behandelt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat wurde eingedampft, um einen Rückstand zu hinterlassen, der auf eine Säule von Aluminiumoxid (200 g) gegeben wurde. Die Eluation mit Dichlormethan lieferte das Trienon (2) (2,8 g, 47%): Schmelzpunkt 156-157°C (aus Ether). UVλ nm (ε): 299 (13 000), 252 (9200), 224 (12 000), ¹H-NMR (CDCl₃): 0,80 (3H, s, 18-H₃), 1,04 (3H, d, J=6 Hz, 21-H₃), 1,21 (3H, s, 19-H₃), 3,10-3,80 (3H, m, 22-H₂ und OH), 5,90-6,40 (4H, m, 2-H, 4-H, 6-H und 7-H), 7,05 (1H, d, J=10 Hz, 1-H), MS m/z: 326 (M⁺), 311, 308, 293, 267, 112.

22-Tetrahydropyranyloxy-23,24-dinorchol-1α,2α-epoxy-4,6-dien-3-on (3)

Der Alkohol (2) (2,7 g, 8,28 mMol) in Dichlormethan (50 ml) wurde mit Dihydropyran (1,5 ml, 16,42 mMol) und p-Toluolsulfonsäure (50 mg) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab das Rohprodukt. Zur einer Lösung dieses Produkts in MeOH (70 ml) wurden 30% H₂O₂ (4,8 ml) und 10% NaOH/NeOH (0,74 ml) zugesetzt und dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 14 Stunden gerührt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt, welches auf eine Säule aus Silikagel (50 g) gegeben wurde. Die Eluation mit Benzol-Ethylacetat (100 : 1) lieferte das Epoxid (3) (1,45 g, 41%): Schmelzpunkt 113-115°C (Hexan). UVλ nm(ε): 290 (22 000), ¹H-NMR (CDCl₃): 0,80 (3H, s, 18-H₃), 1,07 (3H, d, J=6 Hz, 21-H₃), 1,18 (3H, s, 19-H₃), 3,38 (1H, dd, J=4 und 1,5 Hz, 1-H), 3,55 (1H, d, J=4 Hz, 2-H), 3,30-4,10 (4H, m, 22-H₂ und THP), 4,50 (1H, m, THP), 5,58 (1H, d, J=1,5 Hz, 4-H), 6,02 (2H, s, 6-H und 7-H), MS m/z: 342 (M⁺-DHP), 324 (M⁺-THPOH), 309, 283, 85.

23,24-Dinorchol-5-en-1α,3β,22-triol-1,3-diacetat (4)

Lithium (3,25 g) wurde in kleinen Portionen bei -78°C unter Argonatmosphäre über einen Zeitraum von 30 Minuten flüssigem Ammoniak (130 ml) zugesetzt. Nach 1stündigem Rühren bei -78°C wurde das Epoxid (3) (1,33 g, 3,12 mMol) in wasserfreiem THF (100 ml) tropfenweise bei -78°C über einen Zeitraum von 30 Minuten zugegeben und dieses Gemisch wurde bei -78°C für 1 Stunde gerührt. Diesem Reaktionsgemisch wurde wasserfreies NH₃Cl (40 g) in kleinen Portionen bei -78°C über einen Zeitraum von 1 Stunde zugesetzt. Nach 1,5 Stunden wurde das Kühlbad entfernt und der größte Teil des Ammoniaks wurde mit durchperlendem Argon entfernt. Die übliche Aufarbeitung (Ether zur Extraktion) ergab das Rohprodukt (1,23 g). Dieses wurde mit Essigsäureanhydrid (3 ml) und Pyridin (4 ml) bei Raumtemperatur für 14 Stundenn behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt (1,3 g). Dieses Rohprodukt in Methanol (4 ml) und THF (5 ml) wurde mit 2 Tropfen 2M HCl bei Raumtemperatur für 2 Stunden behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ether zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt (1,1 g), welches auf eine Säule aus Silikagel (40 g) aufgegeben wurde. Die Eluation mit Benzol-Ethylacetat (10 : 1) lieferte das 1,3-Diacetat (4) (575 mg, 42%): Öl, ¹H-NMR (CDCl₃): 0,68 (3H, s, 18-H₃), 1,07 (3H, s, 19-H₃), 1,99 (3H, s, Acetyl), 2,02 (3H, s, Acetyl), 3,02- 3,72 (2H, m, 22-H₂), 4,79 (1H, m, 3-H), 4,98 (1H, m, 1-H), 5,46 (1H, m, 6-H), MS m/z: 372 (M⁺-CH₃COOH), 313, 312, 297, 279, 253.

1α,3β-Diacetoxy-23,24-dinorcholan-22-al (5)

Der 22-Alkohol (4) (550 g, 1,27 mMol) in Dichlormethan (20 ml) wurde mit Pyridiniumchlorchromat (836 mg, 3,85 mMol) und Natriumacetat (100 mg) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Diesem Reaktionsgemisch wurde Ether (100 ml) zugesetzt und dieses Gemisch wurde durch eine kurze Florisilsäule filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt, um einen Rückstand zu hinterlassen, welcher auf eine Silikagel (20 g) aufgegeben wurde. Die Eluation mit Benzol-Ethylacetat (20 : 1) lieferte den 22-Aldehyd (5) (448 mg, 82%): Öl, ¹H-NMR (CDCl₃): 0,70 (3H, s, 18-H₃), 1,07 (3H, s, 19-H₃), 1,09 (3H, d, J=7 Hz, 21-H₃), 1,99 (3H, s, Acetyl), 2,02 (3H, s, Acetyl), 4,79 (1H, m, 3-H), 4,98 (1H, m, 1-H), 5,45 (1H, m, 6-H), 9,45 (1H, d, J=4 Hz, 22-H), MS m/z: 310 (M⁺-2×CH₃COOH), 295, 253.

(22E)-1α,3β-Diacetoxy-cholesta-5,22-dien-24-on (6)

Einer Lösung des 22-Aldehyds (5) (420 mg, 0,977 mMol) in Dimethylsulfoxid (30 ml) wurde Isobutyrylmethylentriphenylphosphoran (2,03 g, 5,87 mMol) zugegeben. Dieses Gemisch wurde für 72 Stunden bei 95°C gerührt. Die übliche Aufarbeitung (Ether zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt, welches auf eine Säule aus Silikagel (10 g) augegeben wurde. Die Eluation mit Benzol-Ethylacetat (10 : 1) lieferte das Enon (6) (392 mg, 81%): Öl, ¹H-NMR (CDCl₃): 0,71 (3H, s, 18-H₃), 1,08 (3H, s, 19-H₃), 1,09 (9H, d, J=7 Hz, 21-H₃, 26-H₃ und 27-H₃), 1,99 (3H, s, Acetyl), 2,02 (3H, s, Acetyl), 4,79 (1H, m, 3-H), 4,98 (1H, m, 1-H), 5,45 (1H, m, 6-H), 5,96 (1H, d, J=16 Hz, 23-H), 6,65 (1H, dd, J=16 und 8 Hz, 22-H), MS m/z: 438 (M⁺-CH₃COOH), 378 (M⁺-2×CH₃COOH), 363, 335, 307, 253, 43.

(22E)-1α,3β-Diacetoxy-5α,8α-(3,5-dioxo-4-phenyl-1,2,4- triazolidino)-cholesta-6,22-dien-24-on (7)

Zu einer Lösung des Enons (6) (385 mg, 0,773 mMol) in Kohlenstofftetrachlorid (20 ml) wurde N-Bromsuccinimid (193 mg, 1,4 Äq) zugegeben und dieses Gemisch wurde unter Argonatmosphäre für 25 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf 0°C wurde der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde unterhalb von 40°C eingeengt, wobei ein Rückstand verblieb. Dieser Rückstand in THF (15 ml) wurde mit einer katalytischen Menge an Tetra- n-butylammoniumbromid bei Raumtemperatur für 50 Minuten behandelt. Sodann wurde zu diesem Reaktionsgemisch eine Lösung von Tetra-n-butylammoniumfluorid in THF (3,5 ml, 3,5 mMol) zugesetzt und dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat zur Extraktion) ergab ein rohes 5,7-Dien (380 mg). Dieses Dien in Chloroform (15 ml) wurde mit einer Lösung von 1-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion (95 mg, 0,54 mMol) in Chloroform (10 ml) bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab den Rückstand, welcher auf eine Silikagelsäule (10 g) aufgegeben wurde. Die Eluation mit Benzol-Ethylacetat (5 : 1) lieferte das Triazolin-Addukt (7) (191 mg, 37%): Öl, ¹H-NMR (CDCl₃): 0,83 (3H, s, 18-H₃), 1,01 (3H, s, 10-H₃), 1,08 (9H, d, J=7 Hz, 21-H₃, 26-H₃ und 27-H₃), 1,97 (3H, s, Acetyl), 1,98 (3H, s, Acetyl), 5,03 (1H, m, 1-H), 5,84 (1H, m, 3-H), 5,96 (1H, d, J=16 Hz, 23-H), 6,28 (1H, d, J=8,5 Hz, 6-H oder 7-H), 6,41 (1H, d, J=8,5 Hz, 6-H oder 7-H), 6,65 (1H, dd, J=16 und 8 Hz, 22-H), 7,20-7,60 (5H, m, -ph), MS m/z: 436 (M⁺-phC₂N₃O₂- CH₃COOH), 376 (436-CH₃COOH), 333, 305, 251, 43.

(22E,24R)- und (22E,24S)-1α,3β-Diacetoxy-5α,8α-(3,5-dioxo- 4-phenyl-1,2,4-triazolidino)-cholesta-6,22-dien-24-ol (9a und 8a)

Das Enon (7) (150 mg, 0,224 mMol) in THF (6 ml) und Methanol (6 ml) wurde mit Natriumborhydrid (17 mg, 0,448 mMol) bei Raumtemperatur für 10 Minuten behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ether zur Extraktion) ergab ein Rohprodukt (150 mg), welches der präparativen TLC unterworfen wurde (Benzol-Ethylacetat, 3 : 1, 7mal entwickelt). Das Band mit einem R_f-Wert 0,53 wurde abgestreift und mit Ethylacetat eluiert. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab den weniger polaren (24S)-24-Alkohol (8a) (43,2 mg, 28,7%): Schmelzpunkt 142-144°C (Ether-Hexan), MS m/z: 438 (M⁺-PhC₂N₃O₂-CH₃COOH), 420, 378 (438-CH₃COOH), 360, 363, 345, 335, 318, 109, 43. Das Band mit einem R_f-Wert 0,50 wurde abgestreift und mit Ethylacetat eluiert, um den höher polaren (24R)-24-Alkohol (9a) (64,8 mg, 43,1%) zu erhalten: Schmelzpunkt 140- 142°C (Ether-Hexan). Das Massenspektrum von (9a) war mit demjenigen von (8a) identisch.

(22E,24S)-1α,3β-Diacetoxy-5α,8α-(3,5-dioxo-4-phenyl- 1,2,4-triazolidino)-cholesta-6,22-dien-24-ol (+)-MTPA- Ester (8a)

Der 24-Alkohol (8a) (8,3 mg, 0,0123 mMol) in Pyridin (1 ml) wurde mit 3 Tropfen (+)-MTPA-Cl bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt. Die übliche Aufarbeitung (Ethylacetat) lieferte den MTPA-Ester (8b) (10,4 mg, 95%): ¹H-NMR (CDCl₃, 100 MHz): 0,85 (3H, s, 18-H₃), 0,88 (3H, d, J=7 Hz, 26-H₃), 0,92 (3H, d, J=7 Hz, 27-H₃), 1,04 (3H, d, J=7 Hz, 21-H₃), 1,08 (3H, s, 19-H₃), 2,03 (3H, s, Acetyl), 2,06 (3H, s, Acetyl), 3,27 (1H, m), 3,54 (3H, s, -OCH₃), 6,28 (1H, d, J=8 Hz, 6-H oder 7-H), 6,41 (1H, d, J=8 Hz, 6-H oder 7-H), 7,24-7,56 (5H, m, -ph).

(22E,24R)-1α,3β-Diacetoxy-5α,8α-(3,5-dioxo-4-phenyl-1,2,4- triazolidino)-cholesta-6,22-dien-24-ol-24-(+)-MTPA-Ester (9b)

Der 24-Alkohol (9a) (7,9 mg, 0,0117 mMol) wurde gemäß der Beschreibung für (8b) in den MTPA-Ester (9b) (9,3 mg, 89%) überführt: ¹H-NMR (CDCl₃, 100 MHz): 0,83 (3H, s, 18-H₃), 0,88 (6H, d, J=7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,04 (3H, d, J=7 Hz, 21-H₃), 1,08 (3H, s, 19-H₃), 2,03 (3H, s, Acetyl), 2,05 (3H, s, Acetyl), 3,27 (1H, m), 3,54 (3H, s, -OCH₃), 6,28 (1H, d, J=8 Hz, 6-H oder 7-H), 6,41 (1H, d, J=8 Hz, 6-H oder 7-H), 7,24-7,56 (5H, m, -Ph).

(22E,24S)-6β-Methoxy-3α,5-cyclo-5α-cholesta-22-en-24-ol- 24-(+)-MTPA-Ester (14b)

Der bekannte (24S)-24-Alkohol (14a) (10,1 mg, 0,0244 mMol) wurde gemäß der Beschreibung für (8b) in den (24S)-MTPA-Ester (14b) (8,2 mg, 54%) überführt: ¹H-NMR (CDCl₃, 100 MHz): 0,72 (3H, s, 18-H₃), 0,89 (3H, d, J=7 Hz, 26-H₃), 0,93 (3H, d, J=7 Hz, 27-H₃), 1,02 (3H, d, J=7 Hz, 21-H₃), 1,04 (3H, s, 19-H₃), 2,75 (1H, m, 6-H), 3,33 (3H, s, -OCH₃), 3,54 (3H, s, -OCH₃).

(22E,24R)-6β-Methoxy-3α,5-cyclo-5α-cholesta-22-en-24-ol- 24-(+)-MTPA-Ester (15b)

Der bekannte (24R)-24-Alkohol (15a) (11,0 mg, 0,0266 mMol) wurde gemäß der Beschreibung für (8b) in den (24R)-MTPA-Ester (15b) (9,4 mg, 56%) überführt: ¹H-NMR (CDCl₃, 100 MHz): 0,76 (3H, s, 18-H₃), 0,88 (6H, d, J=7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 1,04 (3H, d, J=7 Hz, 21-H₃), 1,05 (3H, s, 19-H₃), 2,77 (1H, m, 6-H), 3,36 (3H, s, -OCH₃), 3,57 (3H, s, -OCH₃).

(22E,24R)-Cholesta-5,7,22-trien-1α,3β,24-triol (10)

Das Triazolin-Addukt (9a) (15,0 mg, 0,0223 mMol) in THF (5 ml) wurde unter Rückfluß für 2 Stunden mit Lithiumaluminiumhydrid (5 mg, 0,132 mMol) behandelt. Diesem Reaktionsgemisch wurde Wasser zugesetzt und es wurde filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Rückstand verblieb, welcher der präparativen TLC unterworfen wurde (Benzol-Ethylacetat, 1 : 1, dreimal entwickelt). Das Band mit einem R_f-Wert 0,35 wurde abgestreift und mit Ethylacetat eluiert. Die Entfernung des Lösungsmittels lieferte das erfindungsgemäße 5,7-Dien (10) (3,3 mg, 36%), UVλ: 294, 282, 272, MS m/z: 414 (M⁺), 396, 381, 378, 363, 353, 335, 317, 287, 269, 251, 127, 109.

(22E,24S)-Cholesta-5,7,22-trien-1α,3β,24-triol (11)

Das Triazolin-Addukt (8a) (16,5 mg, 0,0245 mMol) wurde gemäß der Beschreibung für (10) in das ebenfalls der Erfindung entsprechende 5,7-Dien (11) (3,5 mg, 35%) überführt. Die UV- und MS-Spektren von (11) waren mit denjenigen von (10) identisch.

(22E,24R)-1α,24-Dihydroxy-Δ²²-vitamin D₃ (12)

Eine Lösung des (24R)-5,7-Diens (10) (3,3 mg, 7,97 mMol) in Benzol (90 ml) und Ethanol (40 ml) wurde mit einer Mitteldruck-Quecksilberlampe durch ein Vycor-Filter für 2,5 Minuten unter Eiskühlung und unter Argonatmosphäre bestrahlt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde unter Argonatmosphäre und unter Rückfluß erhitzt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab ein Rohprodukt, welches der präparativen TLC unterworfen wurde (Benzol-Ethylacetat, 1 : 1, dreimal entwickelt). Das Band mit einem R_f-Wert 0,40 wurde abgestreift und mit Ethylacetat eluiert. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck lieferte die Vitamin D₃-Analogverbindung (12) (0,59 mg, 18%). Diese wurde weiter durch Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie über eine Zorbax-SIL-Säule (4,6 mm×15 cm) bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min mit 2% Methanol in Dichlormethan als Eluationsmittel gereinigt. Die Retentionszeit von (12) betrug 5,2 Minuten. UVλ 265 nm, λ 228 nm, MS m/z: 414 (M⁺), 396, 378, 363, 360, 345, 335, 317, 287, 269, 251, 249, 152, 135, 109. ¹H-NMR (CDCl₃, 400,5 MHz): 0,57 (3H, s, 18-H₃), 0,87 (3H, d, J=6,7 Hz, 26-H₃), 0,92 (3H, d, J=6,7 Hz, 27-H₃), 1,04 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-H₃), 2,32 (1H, dd, J=13,7 und 6,6 Hz), 2,60 (1H, dd, J=13,4 und 3,4 Hz), 2,83 (1H, dd, J=12,6 und 4,0 Hz), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,43 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, bs, W_1/2=4,3 Hz, 19-H9, 5,33 (1H, bs, W_1/2=4,3 Hz, 19-H), 5,39 (1H, dd, J=15,2 und 7,1 Hz, 22-H), 5,51 (1H, dd, J=15,2 und 8,3 Hz, 23-H), 6,01 (1H, d, J=11,4 Hz, 6-H), 6,38 (1H, d, J=11,4 Hz, 7-H).

(22E,24S)-1α,24-Dihydroxy-Δ²²-vitamin D₃ (13)

Das (24S)-5,7-Dien (11) (3,5 mg, 8,45 mMol) wurde gemäß der Beschreibung für (12) in die Vitamin D₃-Form (13) (0,56 mg, 16%) umgewandelt. Die Retentionszeit von (13) unter der oben beschriebenen HPLC-Bedingung betrug 4,7 Minuten. Die UV- und MS-Spektren von (13) waren mit denjenigen von (12) identisch. ¹H-NMR (CDCl₃, 400,5 MHz): 0,57 (3H, s, 18-H₃), 0,87 (3H, d, J=6,7 Hz, 26-H₃), 0,92 (3H, d, J=6,7 Hz, 27-H₃), 1,05 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-H₃), 2,32 (1H, dd, J=13,7 und 6,6 Hz), 2,60 (1H, dd, J=13,4 und 3,4 Hz), 2,83 (1H, dd, J=12,6 und 4,0 Hz), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,43 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, bs, W_1/2=4,3 Hz, 19-H), 5,33 (1H, bs, W_1/2=4,3 Hz, 19-H), 5,37 (1H, dd, J=15,4 und 7,5 Hz, 22-H). 5,46 (1H, dd, J=15,4 und 8,3 Hz, 23-H), 6,01 (1H, d, J=11,4 Hz, 6-H), 6,38 (1H, d, J=11,4 Hz, 7-H).

Zur Bestimmung der Konfiguration an der C-24-Stellung wurden die 24-Alkohole 8a und 9a in die entsprechenden (+)-MTPA-Ester 8b und 9b überführt. Die ¹H-NMR-Spektren von 8b und 9b wurden mit denjenigen der (+)-MTPA-Ester 14b und 15b verglichen, welche von dem bekannten (24S)-24-Alkohol 14a bzw. dem (24R)-Isomeren 15a stammten. Die ¹H-NMR-Daten der Methylgruppen von 8b, 9b, 14b und 15b sind in Tabelle 1 gezeigt.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung und dem Verfahrensschema hervorgeht, weisen die Verbindungen 12 und 13 (Endprodukte) und die Verbindungen 10 und 11 (Zwischenprodukte) dieselbe charakteristische Steroid-Seitenkette auf.

Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, befinden sich die ¹H-NMR-Daten von C-22- und C-23-Protonen der (24R)-Vitamin D₃-Analogverbindung 12 und diejenigen des bekannten (24S)-Isomeren 13 in guter Übereinstimmung mit denjenigen des bekannten (24R)-Allylalkohols 15a bzw. dessen (24S)-Isomer 14a. Diese ¹H-NMR-Daten (wie sie in Tabelle 1 und Tabelle 2 gezeigt sind) bestätigen die Zuweisung der synthetischen Vitamin D₃-Analogverbindungen 12 und 13.

Tabelle 1

¹H-NMR (100 MHz)-Spektraldaten der Methylgruppen 8b, 9b, 14b und 15b

Chemische Verschiebunga)

Tabelle 2

¹H-NMR-Spektraldaten vom C-22- und C-23-Proton in 12, 13 (400 MHz) und 14a, 15a (360 MHz)

Chemische Verschiebunga)

Biologische Aktivität

Die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in Übereinstimmung mit den hinlänglich bekannten Verfahren gemäß nachstehender Angaben gemessen.

Ratten

Männliche Weanling-Ratten wurden von der Firma Holtzman (Madison, WI) bezogen und entweder mit einer Vitamin D-Mangeldiät von niedrigem Phosphorgehalt (0,1%) und hohem Calciumgehalt (1,2%) gefüttert gemäß der Beschreibung von Tanaka und DeLuca (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1974), 71, 1040) (Tabelle 3) oder mit einer Vitamin D-Mangeldiät von geringem Calciumgehalt (0,02%) und einem adäquaten Phosphorgehalt (0,3%) gemäß der Beschreibung von Suda et al (J. Nutrition (1970) 100, 1049) (Tabelle 4) für einen Zeitraum von 3 Wochen.

Bestimmung des Calciums und des anorganischen Phosphors im Serum

Serum-Calcium wurde durch Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt unter Verwendung von Proben, die in 0,1% Lanthanchlorid verdünnt waren. Das verwendete Instrument war ein Perkin-Elmer-Atomabsorptionsspektrometer Modell 403. Der anorganische Phosphor im Serum wurde nach dem Verfahren von Chen et al (Anal. Chem. (1956) 28, 1756) bestimmt.

Messung der Knochenasche

Die Messungen der Knochenasche wurde an Oberschenkelknochen durchgeführt. Das Bindegewebe wurde entfernt, die Oberschenkelknochen wurden nacheinander für 24 Stunden mit 100% Ethanol und anschließend für 24 Stunden mit 100% Diethylether unter Verwendung eines Soxhlet-Extraktors extrahiert. Der fettfreie Knochen wurde 24 Stunden getrocknet und in einem Muffelofen bei 650°C für 24 Stunden verascht.

Messung der intestinalen Calciumtransportaktivität

Der intestinale Calciumtransport wurde gemessen unter Verwendung des Verfahrens mit dem umgestülpten Duodenumbeutel gemäß der Beschreibung von Martin und DeLuca (Am. J. Physiol. (1969) 216, 1351).

Verdrängung von 1,25-(OH)₂-[26,27-³H]D₃ vom Küken-Intestinal- Cytosol-Rezeptorprotein durch eine der Verbindungen

Die Verdrängung von 1,25-(OH)₂-[26,27-³H]D₃ vom Küken-In testinal-Rezeptor wurde bestimmt nach dem Verfahren von Shepard et al (Biochem. J. (1979) 182, 55-69).

Die in diesen Messungen erhalten Ergebnisse sind in Fig. 1 und in den Tabellen 3 und 4 angegeben.

Tabelle 3

Anstieg der Konzentration von anorganischem Phosphor im Serum und von Knochenasche als Reaktion auf (22E,24R)-1,24-(OH)₂-Δ²²-D₃, (22E,24S)-1,24-(OH)₂-Δ²²-D₃ oder 1,25-(OH)₂D₃

Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Rachitis erzeugenden Diät während 3 Wochen gefüttert. Sie erhielten sodann 32,5 ρ Mol/Tag einer der Verbindungen aufgelöst in einem 0,1-ml-Gemisch von 95% Ethanol/Propylenglykol (5/95) subkutan täglich für einen Zeitraum von 7 Tagen. Ratten in einer Kontrollgruppe wurde der Träger verabreicht. Jede Gruppe umfaßte 6 bis 7 Ratten.

Tabelle 4

Anstieg des intestinalen Calciumtransports und der Serum-Calciumkonzentration als Reaktion auf (22E,24R)-1,24-(OH)₂-Δ²²-D₃, (22E,24S)-1,24-(OH)₂-Δ²²-D₃ oder 1,25-(OH)₂D₃

Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Vitamin D-Mangeldiät von geringem Calciumgehalt während 3 Wochen gefüttert. Sie erhielten sodann 32,5 ρ Mol/Tag einer der Verbindungen aufgelöst in einem 0,1-ml-Gemisch von 95% Ethanol/Propylenglykol (5/95) subkutan täglich für einen Zeitraum von 7 Tagen. Ratten in einer Kontrollgruppe erhielten den Träger. Jede Gruppe umfaßte 7 Ratten.

Fig. 1 demonstriert die Fähigkeit der beiden synthetischen 1,24-(OH)₂D₃-Isomeren zur Verdrängung von radioaktiv markiertem 1,25-(OH)₂D₃ aus dem Küken-Intestinal-Rezeptor. Die Ergebnisse demonstrieren, daß das 24S-Isomere in gleichem Maße wie das nicht markierte 1,25-(OH)₂D₃ wirksam ist bei der Verdrängung des radioaktiv markierten 1,25-(OH)₂D₃ von dem Rezeptor. Es zeigte sich, daß das 24R-Isomere etwa ein Zehntel der Aktivität von 1,25-(OH)₂D₃ oder des S-Isomers aufweist. Bei der Stimulierung des intestinalen Calciumtransports von Ratten auf einer Vitamin D-Mangeldiät geringen Calciumgehaltes ist es offensichtlich, daß kein Isomer 1,25-(OH)₂D₃ hinsichtlich dieser Kapazität gleichkommt (Tabelle 4). Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen, die bei dem Küken-Intestinal-Rezeptor erhalten wurden, worin das S-Isomer dem 1,25-(OH)₂D₃ hinsichtlich der Fähigkeit zur Verdrängung des radioaktiv markierten 1,25-(OH)₂D₃ aus dem Rezeptor gleichkam. Keines der Isomeren war bei den verabfolgten Dosen in der Lage, eine Knochencalcium-Mobilisierungsansprache hervorzurufen, wie durch die Anhebung des Serumcalciums von Ratten auf einer Diät mit geringem Calciumgehalt unterstrichen wird. Im Gegensatz dazu stimulierte 1,24-(OH)₂D₃ diese Ansprache auf ein minimales Maß bei dieser Dosierung.

Tabelle 3 veranschaulicht die Fähigkeit der Isomeren zur Mineralisierung des Oberschenkelknochens von rachitischen Ratten. Die verwendete Dosierung von 1,25-(OH)₂D₃ war voll in der Lage, den rachitischen Oberschenkelknochen innerhalb von 7 Tagen zu mineralisieren. Auf der anderen Seite war das R-Isomer nicht in der Lage, deutliche Knochenmengen bei diesem Dosierungsmaß zu mineralisieren, während die 24S-Verbindung weniger aktiv war als 1,25-(OH)₂D₃, jedoch deutlich wirksam war bezüglich dieser Fähigkeit.

Der Anstieg der Konzentration von anorganischem Phosphor im Serum bei Tieren auf einer Diät geringen Phosphorgehaltes ist eine kritische Ansprache bezüglich der Mineralisierung von Knochen. Es ist deutlich, daß alle drei Formen von Vitamin D die Konzentration des anorganischen Phosphors im Serum stimulierten; jedoch war keines der Isomeren bezüglich dieser Fähigkeit dem 1,25-(OH)₂D₃ gleich.

Die gemessene biologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen deutet auf ihre Verwendung bei physiologischen Zuständen, in denen eine dem Vitamin D ähnliche Wirksamkeit angezeigt ist. Das 1,24S-Isomere kann tatsächlich als eine sehr wirksame 1-hydroxylierte Form von Vitamin D betrachtet werden, welche dort Anwendung findet, wo eine vorzugsweise Wirksamkeit bezüglich der Intestinal- und Knochenmineralisierung im Gegensatz zur Knochenmobilisierung in Ordnung zu sein scheint.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder Kombinationen davon mit anderen Vitamin D-Derivaten oder anderen therapeutischen Mitteln können leicht verabfolgt werden als sterile parenterale Lösungen durch Injektion oder intravenöse Verabfolgung oder durch einen Ernährungskanal in der Form von oralen Dosierungen oder transdermal oder durch Suppositorien. Dosierungen von etwa 0,5 Mikrogramm bis etwa 25 Mikrogramm der Verbindungen pro Tag allein oder in Kombination mit anderen Vitamin D-Derivaten, wobei die Anteile der Verbindungen in der Kombination abhängig ist von dem speziellen Krankheitszustand, der angesprochen wird, und von dem Maß der gewünschten Knochenmineralisierung und/oder Knochenmobilisierung, sind allgemein wirksam zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Wenn auch die tatsächlich verwendete Menge der Verbindungen nicht kritisch ist, sollte in allen Fällen eine hinreichende Menge der Verbindung verwendet werden, um die Knochenmineralisierung zu induzieren. Überschüssige Mengen von etwa 25 Mikrogramm pro Tag von den Verbindungen allein oder in Kombination mit einem die Knochenmobilisierung induzierenden Vitamin D-Derivat sind allgemein nicht erforderlich, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen und mögen in der Praxis nicht ökonomisch zu sein. In der Praxis werden höhere Dosierungen verwendet, wo eine therapeutische Behandlung eines Erkrankungszustandes das gewünschte Ergebnis ist, während geringere Dosierungen allgemein zu prophylaktischen Zwecken verwendet werden, wobei zu verstehen ist, daß die spezifisch verabfolgte Dosierung in jedem gegebenen Fall eingerichtet wird in Übereinstimmung mit den speziell verabfolgten Verbindungen, der zu behandelnden Erkrankung, dem Zustand des Patienten und den anderen relevanten medizinischen Faktoren, welche die Aktivität des Arzneimittels oder die Ansprache des Patienten modifizieren können, wie es den Fachleuten auf diesem Gebiet vertraut ist.

Dosierungsformen der Verbindungen können durch Kombination mit nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Trägern, wie sie dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Derartige Träger können entweder Feststoffe oder Flüssigkeiten sein, beispielsweise Maisstärke, Lactose, Sucrose, Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl und Propylenglykol. Wenn ein fester Träger verwendet wird, kann die Dosierungsform der Verbindungen Tabletten, Kapseln, Pulver, Pastillen oder Tabletten (lozenges) sein. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, können Weichgelatinekapseln oder eine Sirup- oder Flüssigkeitssuspension, Emulsionen oder Lösungen die Dosierungsform sein. Die Dosierungsformen können ebenfalls Zusatzstoffe umfassen, wie Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel oder Emulgiermittel, Lösungspromotoren etc. enthalten. Sie können ebenfalls andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten.

Es versteht sich, daß auch die acylierten Derivate der Verbindungen 12 und 13 so wie oben beschrieben pharmazeutisch einsetzbar sind; sie werden in vivo in die Hydroxy-Derivate umgewandelt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in ihrer kristallinen Form erhalten werden durch Auflösung in einem geeigneten Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelsystem, z. B. in Methanol-Ether, Methanol-Hexan und anschließender Entfernung des Lösungsmittels durch Verdampfung oder durch andere bekannte Maßnahmen.

Claims

1. 1,24-Dihydroxy-Δ²²-Vitamin D₃-Derivate der allgemeinen Formel I worin R₁ und R₂ für Wasserstoff oder Hydroxyl stehen, mit der Maßgabe, daß, sofern R₁ Wasserstoff ist, R₂ Hydroxyl bedeutet, und umgekehrt, und R₃ und R₄ Wasserstoffatome oder Acylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen.

2. (22E,24R)-1,24-Dihydroxy-Δ²²-Vitamin D₃.

3. (22E,24S)-1,24-Dihydroxy-Δ²²-Vitamin D₃.

4. Cholesterin-Zwischenprodukte der allgemeinen Formel II worin R₁-R₄ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen.

5. (22E,24R)-Cholesta-5,7,22-trien-1α,3β,24-triol.

6. (22E,24S)-Cholesta-5,7,22-trien-1α,3β,24-triol.

7. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 bis 3 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.