DE1933375C3 - 25 Hydroxyverbindungen der Vitamin D Reihe, Verfahren zu ihrer Herstellung und 25 Hydroxycholecalciferol enthalten des Mittel - Google Patents

Description

O—C—R'

(IV)

(V)

in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe und R' eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe bedeutet, in einem geeigneten Lösungsmittel mit Ν,Ν'-Dibromdimethyihydantoin bis zur Lösung des Ν,Ν'-Dibromdimethylhydantoins umsetzt, die erhaltene Lösung abkühlt, das aufgefallene Dimethylhydantoin abfiltriert, das Filtrat zur Trockne einengt, den Rückstand in einem geeigneten Lösungsmittel aufnimmt und mit einer Lösung von Trimethylphosphit umsetzt, das Lösungsmittel abzieht, den erhaltenen Rückstand chromatographisch über ein Aluminiumoxid enthaltendes Absorptionsmaterial auftrennt und entweder

a) den aus der Verbindung der Formel IV erhaltenen Diester von Cholest-5,7-dien-3/J,25-diol in einem geeigneten Lösungsmittel mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert und Cholest-5,7-dien-3/J,25-< liol aas dem Reaktionsprodukt isoliert oder

b) den aus der Verbindung der Formel V erhaltenen 26-Norcholest-5,7-dien-25-oE-3/?^lester in einem geeigneten Lösungsmittel mit einer Methyl-Grignard-Verbindung umsetzt, das Reaktionsgemisch in eine kalte, wäßrige Ammoniumchloridlösung gibt, die Lösungsmittelschicht abtrennt und daraus Cholest-5,7-dien-3/J,25-diol isoliert und das erhaltene Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol der Formel III

HO

mit Ultraviolettlicht bestrahlt und die Bestrahlungsprodukte chromatographisch aufarbeitet.

6. Mittel, enthaltend 25-Hydroxycholecalciferol neben üblichen inerten und physiologisch verträglichen Träger- oder Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft neue 25-Hydroxyverbindungen der Vitamin-D-Reihe. Insbesondere betrifft die Erfindung die 25-Hydroxyverbindungen von Vitamin D₂ (Ergocalciferol) und von Vitamin D₃ (Cholecalciferol) der Formeln I und II

40

45

OH

CH₂

HO
25-Hydroxyergocalciferol

OH

(II)

HO

25-Hydroxycholecalciferol

Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Herteilung dieser Verbindungen.

Die antirachitische Wirkung von Vitaminen der D-Reihe, insbesondere von Ergocalciferol und Cholecalciferol, ist ebenso wie deren Verwendung als Zu- jätze zu Nahrungsmitteln bekannt.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die 25-Hydroxyderivate dieser Verbindungen, die den Formeln I und II entsprechen, eine größere biologische Wirkung aufweisen als die Stammverbindungen. Sie sind daher als Arzneimittel besonders wirksam, insbesondere zur Bekämpfung von rachitischen Erkrankungen.

Die neuen Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man Säugetiere, insbesondere i; Schweine, mit an Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol angereichertem Futter über einen längeren Zeitraum verabreicht, dann deren Blut sammelt, das Blutplasma isoliert, die Serumproteine des Blutplasmas abtrennt, die Serumproteine mit einem Methanol-Chloroform-Gemisch extrahiert, den gegebenenfalls in Chloroform angereicherten Extrakt wäscht und einengt, den Rückstand mit einem niedrig siedenden Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch aufnimmt und chromatographisch über Kieselsäure die entsprechende 25-Hydroxyverbindung von Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol abtrennt. Wenn auch in den folgenden Beispielen nur die biologische Bildung der 25-1 hydroxyverbindungen an kastrierten Ebern gezeigt wird, so ist diese Synthese nicht auf diese Tiere beschränkt, denn auch bei anderen Warmblütern, nämlich Hühnern, konnten diese Hydroxyderivate nach Verfuttern von Ergo- und Cholecalciferol im Blut nachgewiesen werden. Für eine praktische Gewinnung dieser neuen wirksamen Substanzen, kommen aber nur Säugetiere in Frage, da nur bei diesen eine Blutentnahme in größerem Maße ohne Schädigung der Tiere möglich ist. Es wurde weiter festgestellt, daß 25-Hydroxycholecalciferol durch Bestrahlen einer Lösung von Cholest-5,7-dien-3/J,25-diol mit Ultraviolettlicht und chromatographische Aufarbeitung des Bestrahlungsprodukts hergestellt werden kann,
i Cholest-5,7-dien-30,25-diol der Formel III

20

Formel

(V)

in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 16 Kohlenstoff atomen oder eine Phenylgruppe und R' eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phe nylgruppe bedeutet, in einem geeigneten Lösungsmittel mit Ν,Ν'-Dibromdimethylhydantoin bis zur Lösung des Ν,Ν'-Dibromdimethylhydantoins umsetzt, die erhaltene Lösung abkühlt, das ausgefallene Dimethylhydantoin abfiltriert, das Filtrat zur Trockne einengt, den Rückstand in einem geeigneten Lö- do sungsmittel aufnimmt und mit einer Lösung von Trimethylphosphit umsetzt, das Lösungsmittel abzieht, den erhaltenen Rückstand chromatographisch über ein Aluminiumoxyd enthaltendes Absorptionsmaterial auftrennt und entweder einem geeigneten Lösungsmittel mit Lithiumalu miniumhydrid reduziert und Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol aus dem Reaktionsprodukt isoliert, oder

b) den aus der Verbindung der Formel V erhaltenen 26-Norcholest-5,7-dien-25-on-3/i-ylester in einem geeigneten Lösungsmittel mit einer Methyl-Grignard-Verbindung umsetzt, das Reaktionsgemisch in eine kalte wäßrige Ammoniumchloridlösung gibt, die Lösungsmittelschicht abtrennt und daraus Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol isoliert.

Als Gruppen R und R' sind die niederen Alkylgruppen, insbesondere die Methylgruppe sowie die Phenylgruppe bevorzugt.

Das Verfahren wird durch folgendes Formelschema erläutert:

Il

O—C—R'

ο (

/ R —C —O

( γ

r T Y

HO

(Hl)

Il

O—C—R'

-OH

R — C — O

•\

(V)

R-C-O

(III)

HO

OH

HO

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von 25-Hydroxyergocalciferol.
biologisch

Es wurden vier kastrierte Eber gemischter Zucht nit einem Gewicht von 75 bis 91 kg mit Futter gefüttert, dem so viel in Wasser dispergierbares Vitamin D₂ zugesetzt worden war, daß je 450 g Futter 70 000 Internatiorfale Einheiten Vitamin D₂ vorhanden waren. Hierdurch wurde jedes Schwein täglich mit $00 0001. E. Vitamin D₂ gefuttert. Nach 26 Tagen dieser Fütterung wurde das Blut der Schweine gesammelt und sofort mit Vi ο des Volumens einer 0,1 m-Natriumoxalatlösung zur Verhütung des Koagulierens versetzt. Die Zellen wurden aus dem Blut abrxntrifugiert. Das erhaltene Plasma (4,1 1) wurde mit so viel Ammoniumsulfat versetzt, bis eine 70%ige Sättigung erreicht war. Das Plasma wurde bei 4° C 7 Tage stehengelassen, bis die Serumproteine ausgefällt waren. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren über 25 Minuten bei 25 000 U/Min, in einer Sharples-AS-Y6-P-Zentrifuge gesammelt und mit 6,61 eines Gemisches von Methanol und Chloroform im Verhältnis 2: l extrahiert und 24 Stunden stehengelassen. Anschließend wurden unter Rühren nochmals 2.21 Chloroform zugegeben. Das denaturierte Protein wurde durch Filtrieren über Glaswolle abgetrennt und mit weiteren 4,4 1 des Methanol-Chloroform-Gemisches extrahiert. Die vereinigten Filtrate wurden zu einer wäßrigen, methanolhaltigen Phase und einer Chloroformphase absitzen gelassen. Die wäßrige Phase wurde abgezogen und erneut mit 2 1 Chloroform extrahiert und erneut absitzen gelassen. Die Chloroformschichten wurden vereinigt, mit 101 Wasser gewaschen. 24 Stunden stehengelassen und in einem Rotationsschnellverdampfer eingeengt, bis 50 ml eines öligen, schwarzen Rückstandes erhalten wurden. Der Rückstand wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung getrocknet. Er wurde im Rotationsschnellverdampfer zürn Trocknen eingedampft und in 100 ml eines im wesentlichen aus n-Hcxan bestehenden Kohlenwasserstoffgemisches aus unmittelbar destillierten aliphatischen Naphthafraktionen mit einem Siedebereich von 65 bis 67° C (Skelly B) gelöst.

Zur Auftrennung der gewünschten Plasmafraktionen durch Chromatographie wurde zuerst ein radioaktives Auftrennungsprofil für das Plasma wie folgt aufgenommen:

Fs wurde radiochemisch reines ³H-Vitamin D₂ hergestellt, indem 1 g Vitamin D₂ mit 3.0 Ci tritiierter Essigsäure 2 Wochen stehengelassen wurde und das Produkt dreimal über eine Vielfachsäule mit Kieselsäure und einmal über eine Säule mit umgekehrter Phase bis zur Erzielung einer konstanten spezifischen Aktivität Chromatographien wurde. Das erhaltene ³H-Vitamin D₂ hatte eine spezifische Aktivität von 12001/Min./I.E. oder 8,6mc/mMol (vgl. P. Neville und H. F. D e L u c a in »Biochemistry«. Bd. 5 [1966], S. 2201, bezüglich der Säulen und der Bestimmung der radiochemischen Reinheit).

Es wurden 10 Ratten von je etwa 400 g Gewicht, die mit einer an Vitamin D armen Diät gemäß H Steenbock in »Science«. Bd. 58 (1923). S. 449. gefuttert worden waren, intraperitoneal mit 10 0001. E. ³H-Vitamin D₂ in 0.1 ml Äthanol behandelt. Nach 24 Stunden wurde durch Herzpunktierung Blut entnommen und zentrifugiert. Es wurden 40 ml Plasma erhalten. Das Plasma wir de mit einem Gemisch von Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1 gemäß B1 u η t u. a. in »Biochemistry«. Bd. 7 (1968), S. 3317. extrahiert. Der Chloroformextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in einem Schncllverdampfer zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit dem Kohlenwasserstoffgemisch wie vorher

ίο gelöst und mit dem aus dem Schweineblut erhaltenen Extrakt vermischt.

Der kombinierte Extrakt wurde in fünf gleiche Teile aufgeteilt und jeder Teil über eine Säule mit Kieseisäurefüllung gemäß Blunt a. a. O. chromatographiert. Das Radioaktivitätsprofil des Extrakts in einer derartigen Säule ist in der beigefügten F i g. 1 wiedergegeben, wobei das Maximum HI unverändertes Vitamin D₂ darstellt. Die Fraktionen von je 10 ml unter jedem Maximum wurden vereinigt und auf antirachitische Wirkung biologisch nach dem Reihentest gemäß der US-Pharmakopoe 1955 gegen Ratten geprüft. Die Fraktionen unter dem Maximum 1V (F i g. 1) waren etwa l,5mal aktiver als die Fraktionen unter dem Maximum 111, während die Fraktionen unter den Maxima I. II. IVa und V wenig oder keine biologische Aktivität besaßen.

Die Fraktionen des Maximums IV von den fünf Teilmengen wurden gesammelt, in einen Schnellverdampfer zur Trockne eingedampft und erneut auf einer Mehrfachsäule mit Kieselsäure gemäß Neville und D e L u c a a. a. O. chromatographiert, wobei jedoch die Mischkammer 250 ml des Kohlenwasserstofflösungsmittels (Skellysolve Bj und die Vorratskammer 400 ml eines Gemisches von 85% Diäth\läther im Kohlenwasserstoffgemisch enthielt. Sobald die Vorratskammer leer war, wurde sie mit 300 ml reinem Diäthyläther gefüllt. Das Elulionsprofil der kombinierten Fraktionen, in 5-ml-Fraktionen aufgeteilt, ist in F i g. 2 wiedergegeben, wobei das Maximum IVa immer noch auftritt.

Die Fraktionen 63 bis 98 wurden vereinigt, im Schnellverdampfer eingedampft und über einer Verteilungskolonne mit Celite (Diatomeenerde) wie folgt chromatographiert:

Es wurden 200 ml des Kohlenwasserstofflösungsmittels (Skelly B) mit dem gleichen Volumen eines Gemisches aus 80% Methanol und 20% Wasser äquilibriert. Es wurden 20 g Celite mit 15 ml der Methanolphase gemischt und trocken in Teilmengen von 2 err in einer Säule von 60 cm Höhe und 1 cm Durch messer gepackt. Die Oberphase wurde als mobiK Phase benutzt. Die kombinierten Fraktionen wurdet in 1 bis 3 ml der mobilen Phase auf die Säule gebracht und die Säule wurde mit der mobilen Phase entwickelt Es wurden 5-ml-Fraktionen gesammelt. Die Frak tionen 11 bis 17 wurden erneut vereinigt, zur Trockm eingedampft und auf einer gleichen Verteilungssaul erneut chromatographiert. Das Radioaktivitätsprofi auf dieser Seite ist in F i g. 3 wiedergegeben.

Die Radioaktivitätsbestimmungen wurden mi einem Flüssigkeits-Scintillationszähler (Packard Tn Carb Modell 3003) mit einem automatischen, äußere Standardisierungssystem durchgeführt. Die zu zäh lenden Proben wurden mit einem Luftstrom ζυ

Trockne eingedampft, in Toluol-Zähllösung aus 2 2,5-Diphenyloxazol und 100 mg 1.4-bis-[2-(4-methy 5-phenyloxazolyl)bcn7ol] je Liter Toluol gelöst un ausgezählt.

Identifizierung

Zur Identifizierung war es erforderlich, die als Maximum IV erhaltene Verbindung in den Tetramethylsilyläther zu überführen. Es wurden 30 g des isolierten Materials unter einem Strom von trockenem Stickstoff zur Trockne eingedampft. Es wurden einige Tropfen einer Reagenzlösung aus 10 ml trockenem Pyridin, 4 ml Hexamethyldisilazan und 2 ml Trimethylsilylchlorid zugefügt, die Lösung mit Stickstoff gespült und das Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln stehengelassen. Es wurden 3 ml des Kohlenwasserstofflösungsmittels (Skelly B) zugefügt und 2 ml 10%iger Schwefelsäure zugegeben. Das Gemisch wurde heftig gemischt und dann absitzen gelassen. Die Kohlenwasserstoffphase wurde über wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und über eine Kieselsäure enthaltende Säule gemäß L u η d u.a. in »Arch. Biochem. Biophysics«, Bd. 120 (1967), S. 513, chromatographiert. In den Röhrchen 19 bis 27 wurde die Silylätherverbindung (15 μg) gefunden, die durch Gaschromatographie als rein befunden wurde. Sie wurde zur Bestimmung des Massenspektrums verwendet.

Das Ultraviolettspektrum und die gaschromatographischen Werte ließen die Trien-Struktur des Vitamins D₂ m der Verbindung vermuten. Das Massenspektrum der Verbindung aus dem Maximum IV ergab intensive Maxima beim m/e-Wert 136 (C₉H_nO) und 118 (C₉Hi₀) aus dem Ring A einschließlich C₆ und C₇, die auch im Spektrum des Vitamins D₂ auftreten.

Das Massenspektrum der Verbindung aus dem Maximum IV zeigte ein ionisiertes Molekül bei m/e 412: 16 Masseneinheiten mehr als beim Vitamin D₂, was auf ein zusätzliches Sauerstoffatom hinweist. Durch ein hochauflösendes Massenspektrum wurde dieser Befund bestätigt, der die genaue Masse des Ions mit 412,3341 ergab, entsprechend der Zusammensetzung von C₂₈H₄₄O₂ (berechnet 412,3341). Die Lage des zusätzlichen Sauerstoff-Substituenten in der Seitenkette ergibt sich aus dem Vergleich der Spektren von Vitamin D₂ und der neuen Verbindung. Beide zeigen Maxima bei m/e 271 (C₁₉H₂₇O — 271,2065 gemäß der hochauflösenden Massenspektrometrie). Diese ergeben sich aus dem Verlust der gesamten Seitenkette durch die Spaltung der Bindung bei C₁₇ bis C₂₀. Außerdem enthielt das hochauflösende Spektrum der neuen Verbindung kleinere Maxima, die wahrscheinlich der Seitenkette selbst entsprechen, bei m/e 141.1255 (C₉H₁₇O) und 123,1181 (C₉H₁₅).

Ein Bruchstück der Masse 59 (C₃H₇O gemäß der hochauflösenden Massenspektrometrie) und die Abspaltung von 58 Masseneinheiten aus dem Molekülion zu einem Maximum bei m/e 354 (354,2900 — C₂₅H₃₈O) im Massenspektrum des Materials aus den Fraktionen IV, aber nicht im Spektrum des Vitamins D₂ ergaben einen Hinweis auf die Hydroxylfunktion bei C₂₅. Das erstere Maximum würde sich durch Spaltung der C_{24/ 25}-Bindung zum Ion (CH₂I₂ = OH( +) und das letztere durch eine Wasserstoffumlagerung unter Abspaltung der Acetonstruktur ergeben, was bei Homoallylalkoholen ein bekannter Prozeß ist.

Der Beweis für die Stellung der Hydroxylgruppe wurde aus dem Massenspektrum des Silyläthers der Verbindung aus dem Maximum IV erhalten, das ein Molekülion bei m/e 556 für einen Di-trimethylsilyläther und das erwartete starke Maximum bei m/e 131 (Grundmaximum) entsprechend der Struktur

C₆H₁₅SiO (CHj)₂C=O-Si(CHj)₃

durch hochauflösende Massenspektrometrie zeigte. Dieses Maximum, das auch im Spektrum der Trimethylsilylätherderivate von 25-Hydroxycholesterin und 25-Hydroxycholecalciferol auftritt, aber nicht in

ίο den Spektren der Sil>Kither von Vitamin D₂ oder D₃, macht die Lage der zusätzlichen Hydroxylfunktion am C₂₅-AtOm erforderlich.

Das Kernresonanzspektrum des Materials aus den Fraktionen des Maximums IV, das in CDC1₃-Lösung mit einem Varian Associates Modell HA-100-Spektrometer mit angeschlossenem Rechner für die Zeitmittlung wegen der kleinen Substanzmengen unter Verwendung von Tetramethylsilan als Vergleichsstandard aufgenommen wurde, unterstützte diese Schlußfolgerungen und ergab unabhängigen Beweismaterial für die angenommene Struktur der Verbindung gemäß Formel I. Es wurden die folgenden Werte als Λ-Werte in Teilen je Million Teile (ppm) gegenüber Tetramethylsilan (Λ = O) erhalten. Ein starkes Singulett bei ό 1,24 ppm kann den beiden Methylgruppen am C₂₅ zugeschrieben werden, während zwei DuplettsbeiaO.79(J = 6.5 Hz)und0,81 ppm(J = 7.0Hz) auf die restlichen Methylsubstituenten der Seitenketten an C₂₁ und C₂₈ zurückgeführt werden müssen.

Die Spektren von 25-Hydroxycholesterin und 25-Hydroxycholccalciferol zeigen ein Singulett für die Methylgruppen an C₂,, und C₂₇ in der gleichen Stellung (Λ 1.20 ppm). Es muß bemerkt werden, daß zwei Duplettsbeirt 0.87(J = 7.0 Hz)und Λ 0.98(J = 6.0Hz) im ursprünglichen Ergocalciferolspektrum in der neuen Verbindung nicht mehr vorliegen. Dieser Befund kann nur durch eine Hydroxylsubstitution am C₂₅ erklärt werden, da diese Dupletts zwei Methylgruppen entsprechen. Das verbleibende identifizierbare Kennzeichen ist das Singulett an der angularen C₁₈-Methylgruppe. Diese Werte lassen die Struktur der neuen Verbindung als 25-Hydroxyergocalciferol der Formel I erkennen.

Die hochauflösenden Massenspeklren wurden mit einem MS-9-Spektrometer der Associated Electrical Industries erhalten, der mit einem Rechner Scientific Data Systems Sigma-7 gekoppelt war.

Beispiel 2

Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol.

biologisch

Es wurden vier kastrierte Eber von 94 bis 118kj mit einem Normalfutter, das mit täglich 250000In ternationalen Einheiten (I.E.) Vitamin D, angerei chert war. 26 Tage gefüttert. Das Blut der Schweim wurde gesammelt und mit 1,6 1 0,1 m-Natriumoxalat lösung behandelt. Es wurden 6,8 1 Plasma erhalter Die Serumproteine wurden durch Zugabe von so vie Ammoniumsulfat zum Serum, daß eine Sättigung vo 65 bis 70% erreicht wurde, ausgefällt. Die Nicdei schlagbildung erfolgte durch Stehenlassen über 3 Tag bei 4° C. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugiere 25 Minuten bei 15 000 U/Min, gesammelt und mit 9 Methanol—Chloroform im Verhältnis 2:1 extrahiert" Der Gesamtextrakt aus diesem Verfahren wurde en geengt und auf 50 ml mit einem Kohlenwasserstof

»I Canadian J. Biochem. Physio!.. Bd. 37 (1959). S.911.

lösungsmittel, das hauptsächlich n-Hcxan enthielt und aus direkt destillierten aliphatischen N-"-hthas erhalten worden war (Skelly B) mit einem Siedebereich 60 bis 68⁰C vermischt und auf 100000 I. E. Vitamin-D-Wirkung biologisch im Ratten-Reihenversuch gemäß der US-Pharmakopoe 1955 geprüft.

Es wurden 20 ml des Extrakts auf eine chromatographische Absorptionssäule mit 25 g Kieselsäure von 58 cm Höhe und 1.5 cm Durchmesser gegeben. Die Säule wurde mit einem Äther-Skelly-B-Gemisch mit abfallender Konzentration eluiert, das dadurch erhalten wurde, daß 400 ml eines Gemisches aus 85% Äther in Skelly B aus einer Vorratskammer in einer Mischkammer, die anfangs 250 ml Skelly B enthielt, laufengelassen wurden. Nachdem 36 Fraktionen von 11 ml gesammelt worden waren, wurde in die Vorratskammer 250 ml reiner Äther gegeben Rs wurden weitere 30 Fraktionen von 11 ml gesammelt. Die Fraktionen 51 bis 60 wurden vereinigt und auf eine Verteilungssäule gegeben. Diese Säule wurde wie folgt aufgebaut: 20 g Celite (Diatomeenerde) wurden mit 15 ml einer stationären Phase aus 80% Methanol und 20% Wasser, äquilibriert mit einem gleichen Volumen Skelly B, vermischt. Etwa ² ₃ des Materials wurden in eine Glassäule von 1 cm Durchmesser gepackt. Die Fraktionen 51 bis 60 wurden in einer kleinen Menge mobiler Phase (Skelly B. äquilibriert mit Methanol—Wasser) auf die Säule gegeben und mit mobiler Phase eluiert, wobei Fraktionen von 5 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen 17 bis 21 wurden vereinigt. Der Rest von den 50 ml Ausgangsextrakt wurde in gleicher Weise chromatographiert und verteilt und die gleichen Fraktionen gesammelt.

In allen Fällen wurden die Fraktionen, die ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei 264 πΐμ in Diäthyläther hatten (r = 18 200) gesammelt und vereinigt.

Identifizierung

Durch das Ultraviolettspektrum und gaschromatographische Werte wurde das isolierte Material mit einer dem Vitamin D₃ ähnlichen Struktur in Zusammenhang gebracht. Durch eine hochauflösende Massenspektrometrie gemäß Beispiel ί wurden die Unterschiede der Struktur zwischen der neuen Verbindung und Vitamin D₃ aufgeklärt.

Das Molekulargewicht des isolierten Produkts betrug 400 (C₂₇H₄₄O₂, ein Cholecalciferol). Im Massenspektrum des isolierten Produkts und im Vitamin D, zeigt die Gegenwart eines Maximums bei me 271 (C₁₉H₂₇O) die Stelle der zweiten Hydroxylgruppe an der Seitenkette an. da das Fragment me 271 durch einen Verlust der Seitenkette durch Spaltung der Bindung bei C₁₇ bis C₂₀ auftritt. Außerdem könnte ein Maximum bei mc 59 (C₃H₇O) im Spektrum der isolierten Verbindung, aber nicht irn Spektrum des Vitamins D₃, durch eine Spaltung der Bindung bei C₂₄ — C₂₅ auftreten, wobei die Hydroxylgruppe am C₂₅ gebunden ist. Die Lage der Hydroxylgruppe am C₂₅ wurde mit dem Kernresonanzspektrum bei 100 MHz (gemessen in CDCl₃ mit Tetramethylsilan als Standard) gemäß Beispiel 1 verifiziert. Hierbei wurde ein starkes Singulett-Maximum bei ft 1,20 ppm (wie in 25-Hydroxycholesterin) und die Abwesenheit des Dupletts bei Λ 0.87 ppm wegen der sekundären C_2(l27-Methylgruppen wie im Cholecalciferol aufgefunden. Die anderen Besonderheiten des Kernresonanzspektrums, die beim Vitamin D₃ und der neuen Verbindung identisch sind, sind die folgenden:

Λ 0.58 ppm — Tetramethylsilan.
c) 0,54 ppm — Resonanz der C₁₈ — H_,-Gruppe. <) 0,93 ppm — Duplett der Ci — H,-Gruppe

(J = 6 Hz).

Λ 4,81.5,03 ppm — Maxima der C₁₉ — H₂-Gruppe. ή 6,02 ppm (J = 11,5 Hz). 6.24 ppm (J = 10,5 Hz) — Dupletts der Protonen in den Stellungen 6 und 7.

Beispiel 3

Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol,
synthetisch

A. Herstellung von Cholest-5.7-dien-3/i.25-diol
aus 3,25-Cholesteryldiacetat

Es wurden 100 mg 3.25-Cholesteryldiacetat in einem Gemisch aus 1.5 ml trockenem Benzol und 1,5 ml eines trockenen Kohlenwasserstoffgemisches, das hauptsächlich aus η-Hexan besteht und durch direkte Destillation von Naphthas hergestellt worden ist und einen Siedebereich von 60 bis 68° C hat (Skelly B), gelöst. Die erhaltene Lösung wurde zu 32 mg feinpulverisierlem N.N'-Dibromdimethylhydantoin in einem Reagenzglas zugegeben, das dann in ein Wasserbad von 72 bis 74 C eingetaucht wurde. Nach vollständiger Lösung des N.N'-Dibromdimethylhydantoins wurde die Lösung in Eis gekühlt. Der gebildete kristalline Niederschlag von Dimethylhydantoin wurde abfiltriert und zweimal mit je 1 ml kaltem Skelly B gespült. Die Spülfiüssigkeit und das Filtrat wurden zur Trockene unterhalb 40^cC unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,4 ml trockenem Xylol aufgenommen. Die Lösung wurde tropfenweise zusammen mit zweimal 0,1 ml Spülfiüssigkeit zu einer Lösung von 0.1 ml Trimethylphosphit in 0.3 ml Xylol gegeben, die auf etwa 130 bis 135° C gehalten worden war. Das erhaltene Gemisch wurde etwa 90 Minuten umgesetzt, während es auf der angegebenen Temperatur gehalten wurde und anschließend bei etwa 65" C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Der erhaltene Rückstand wurde in Skelly B gelöst und auf eine chromatographische Säule mit 25 g neutralem Aluminiumoxid der Aktivitätsstufe 1 gegeben. Die Säule wurde mit einem Gemisch aus Diäthyläthcr und Skelly B im Verhältnis 3: 1 und danach mit einem Gemisch der gleichen Lösungsmittel im Verhältnis 1 : 1 eluiert. Es wurden Fraktionen von 12 ml gesammelt. Die das Diacetat von Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol gemäß dem Ultraviolettspektrum (Maxima bei 272. 282 und 294 mu) enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft.

Es wurde die Diacctatverbindung erhalten, die ir 3 ml trockenem Äthyläther gelöst und mit einer klei nen Menge (10 mg) Lithiumaluminiumhydrid etw* 5 Minuten umgesetzt wurde. Die erhaltene Lösunj wurde mit mehreren gleichen Teilen Wasser zur Ent fernung anorganischer Bestandteile gewaschen, ge trocknet und der Äther unter vermindertem Prucl abgezogen. Der erhaltene Rückstand in einer Mengi von 18mg wurde als Cholest-5.7dien-3/l.25-diol mi folgenden Eigenschaften identifiziert:

F. 169 bis 17: C (au* wäßrigem Methanol). UV Spectrum: A_m„ 272. 282 und 294 πΐμ.

11000. Kemresona.nzspektrum:

C₁₈-H₃ ό 0,65 ppm,
C₁₉-H₃ ö 0,98 ppm,

C₂₁ — H₃ Λ 0,89 ppm (Duple«, J = 6,5 Hz),
ppm.

C_6-7 — H Λ 5,4 ppm (Multiplett).

Als Ausgangsmaterial können auch andere Ester als die 3,25-Diacetatverbindung eingesetzt werden. Die Estergruppen brauchen nicht in den Stellungen 3 und 25 gleich zu sein. Zum Beispiel kann 25-Benzoyloxy-cholesterylacetat in gleicher Weise als Ausgangsmaterial verwendet werden, wobei vergleichbare Ergebnisse erhalten werden. Im allgemeinen kann der Substituent in 3-Stellung am Steroidkern des Ausgangsmaterials eine Gruppe der Formel

R' — CO — O —

sein, in der R eine Alkylengruppe mil I bis 16 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe ist, und der Substituent. in der 25-Slellung kann eine Gruppe der Formel

R — CO -O-

sein, in der R' eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe ist.

An Stelle von Lithiumaluminiumhydrid kann z. B. auch alkoholisches Kalium oder Natriumhydroxid zur Reduktion verwendet werden.

B. Herstellung von Cholest-5,7-dien-.y,25-du'i
aus 26-Norcholest-5-en-25-on-3_li-ylacetat

Ultraviolettspektrum:

?._max 272, 282. 294 ηΐμ. ,_2Κ2
Infrarotspektrum:
?._max 1730, 1712cm"¹

11 000. Kernresonanzspektrum:

Q₈-H₃ 0 0.63 ppm
C₁₉-H₃ 0 0,95 ppm,
C₂₇-H₃ ή 2,12 ppm.
OCOCH₃ 6 2,02 ppm.

ίο Durch Gaschromatographie wurde gefunden, daß die einzige Verunreinigung aus dem Ausgangsmatcriai 26-Norcholest-5-en-25-on-3/J-ylacetat bestand.

Es wurden 245 mg des Rückstands, der etwa 180 mu der 5,7-Dien-Verbindung enthielt, in 3,5 ml trockenem

Benzol gelöst und zu einer Grignardreagenzlösun^ zugefügt, die durch Zugabe von 0,24 mg Methyljodiu in 2,5 m! trockenem Äther zu 72 mg Magnesiumdrehspänen erhalten worden war. Das Gemisch wurde 2,5 Stunden am Rückfluß erhitzt. 17 Stunder,

stehengelassen und anschließend zu einer kalter AmmoniumcMoridlösung zugegeben. Ls bildete ski eine wäßrige Schicht und eine Ätherschicht Di-. Ätherschicht wurde abgezogen, getrocknet und de: Äther verdampft. Der Ruckstand wurde mit Skdh Ii

verrieben und ergab nach dem Filtrieren 212 πη· eines amorphen Pulvers, das gemäß dem IJltiu viokttspektrum und der üaschromatographii: aus 140 mg Cholesl-5,7-dien-3,;,>5-diol bestand, während der Rest 25-Hydroxycholesterin war.

Mengen der Reaktionsteilnehmer, Temperaturen und Lösungsmittel können auch geändert werden, ohne daß die Ergebnisse erheblich voneinander abweichen, bs können auch andere Aufarbeitungs\ erfahren angewendet werden.

Es wurden 142 mg 26-Norcholcst-5-en-25-on-3^-ylacetat in einem Gemisch aus 2,2 ml trockenem Skelly B gelöst und zu 50 mg Ν,Ν'-Dibromdimethylhydantoin gegeben. Die Umsetzung wurde gemäß Verfahren A durchgeführt. Der erhaltene Rückstand wurde in 0,5 ml Xylol aufgenommen. Die Lösung wurde zusammen mit 0,3 ml Xylol-Spülflüsjigkut tropfenweise zu 0,15 ml Trimethylphosphit in 0,5 ml Xylol von etwa 130 bis 135° C gegeben. Das Gemisch wurde 90 Minuten bei dieser Temperatur umgesetzt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei etwa 65° C abgezogen.

Der erhaltene Rückstand wurde in Chloroform gelöst und auf jine chromatographische Säule mit 20 g neutralem Aluminiumoxid der Aktivitätsstufe 1 gegeben. Die Säule wurde mit Chloroform eluiert. Es wurden Fraktionen von 5,5 ml gesammelt. Das 26 - Norcholest - 5,7 - dien - 25 - on - 3f< - ylacetat wurde das den Fraktionen 10 bis 14 durch Eindampfen des Lösungsmittels gewonnen. Die Dienverbindung im Produkt wurde durch folgende spektroskopische Werte identifiziert: ta

. entsprechend der

Carbonylabsorption der Acetat- bzw.
Mcthylketon gruppen.

C. Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol aus Cholesl-5.7-dien-3,;.25-diol

Es wurden 106 mg des gemäß Verfahren B hergestellten Gemisches mit einem Gehalt von 70 mg Cholest-5,7-dien-3f(,25-diol in 4(X) ml Äther gelöst und unter einer Hochdruck-Quecksilberdampflampe (Hanau, Modell 654A) 3.5 Minuten bestrahlt. Die Bestrahlung wurde in einem Mantel um einen doppelwandigen, wassergekühlten Quarzfinger durchgeführt. Während der Bestrahlung wurde die Ätherlösung heftig gerührt und kontinuierlich mit Stickstoff ausgespült.

Die Bestrahlungsprodukte wurden in einer Vielfachsäule gemäß G.A. Fischer und J.J. Kabara in Anal. Biochem., Bd. 9 (1966), S. 303. mit 14 g wärmeaktivierter Kieselsäure (Bio-Rad, HA, Siebmaschengröße unter 0,044 mm der California Corp. for Biochemical Research. Los Angeles, California. USA) unter Verwendung von Äther-Skelly B im Verhältnis 1 :1 Chromatographien. Die Säule wurde mit einem Lösungsinittelgradienten eluiert, der dadurch hergestellt wurde, daß Äther in eine 250-ml Mischkammer einlaufen gelassen wurde, die Ursprung lieh mit der Lösung aus Äther und Skelly B in Verhältnis 1 : 1 gefüllt war. Es wurden Fraktionei von 2,8 ml gesammelt.

Durch Ultraviolettspektrometrie und Gaschroniatc graphic wurde gefunden, daß nur die Fraktionen 3 bis 38 25-Hydroxyprecholecakifcrol u._max 261 in; J₂₆₁ = 9000) enthielten. Diese Fraktionen wurde vereinigt und etwa 7 Tage bei Raumtemperatur unu einer Stickstoffatmosphäre stehengelassen. Danac

itte sich die Verbindung in 25-Hydroxycholecalferol mit folgenden Eigenschaften umgewandelt:

U ltraviolettspektrum:
/.„„.., 265 mti, F = 18000.

Kernresonanzspektrum:

C₂i — H₃ δ 0,90 ppm (Duplett, J = 8 Hz),
C₁₈ — H₃ δ 0,54 ppm,
C₂«,,27 — H₃ ό 1,22 ppm,
C₁₉ — H₂ 6 4,80 ppm und 5,00 ppm,
C_{6 7} — H ö 5,97 ppm (Duplett, J = 12 Hz),
6,25 ppm (Duplett, J = 12 Hz).

Molekulargewicht:

ίο Nach 6 Wochen Mangeldiät wurde den Ratten eine Dosis von 0,25 ng Vitamin D₃, D₃, 25-Hydroxyergocalciferol und 25-Hydroxycholecalciftrol in Baumwollsamenöl oral oder in 0,02 ml Äthanol intravenös verabreicht. Die Vergleichstiere erhielten lediglich Äthanol bzw. Baumwollsamenöl. Nach der in der folgenden Tabelle I aufgeführten Zeit wurden die Ratten getötet und gemäß J.E. ZuIl u.a., Science Bd 149 (1965), S. 182, der Calciumtransport an umgestülpten Eingeweidesäcken geprüft. Der Calciumtransport wird als Verhältnis ⁴⁵Ca (serumseitig)/* Ca (schleimhautseitig) ausgedrückt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben.

400,3340 (berechnet C₂₇H₄₄O₂ 400,3341).

Die höheren Fraktionen als Fraktion 38 enthielten 25-Hydroxytachystero^, 25-Hydroxycholestcrin und eine kleine Menge nicht umgesetztes 5,7-Dien. Die Fraktionen, die 25-Hydroxytachysterol₃ und unverändertes 5,7-Dien enthielten, wurden mit gleichartigen Fraktionen vereinigt, die aus einem zweiten Bestrahlungsansatz stammten und erneut 3,5 Minuten betrahlt. Es wurde chromatographisch über aktivierte Kieselsäure eine zusätzliche Ausbeute von 8 mg 25-Hydroxycholecalciferol erhalten.

Die Bestrahlung von 15 mg des 5,7-Diens, das gemäß A hergestellt worden war, über 2.5 Minuten gemäß der vorherigen Verfahrensweise ergab 2,4 mg 25-Hydroxyprecholecalciferol, das in der genannten Weise in 25-Hydroxycholecalciferol übergeführt wurde.

Beispiel 4
A. Heilversuch gegen Rachitis

Entwöhnte Jungratten wurden mit einer rachitogenen Diät gemäß Steeboch und Black. J. Biol. Chem., Bd. 64 (1925). S. 263, 21 Tage gefüttert. Die Diät wurde durch Zugabe von wasserlöslichen Vitaminen gemäß DeLuca u.a. in J. Nutr., Bd. 75 (1961), S. 175, modifiziert. Nach der M.angeldiät über 21 Tage wurde eine Einzeldosis von 4 I.E. Standard-Vitamin D₃ oder D₂ oder 25-Hydroxyergocalciferol oder 25-Hydroxycholecalciferol verabreicht. 7 Tage später wurden die Ratten gelötet und an den herauspräparierten Ellen und Speichen der Reihenversuch durchgeführt. Die biologische Wirkung wurde gemäß der US-Pharmakopoe, M.Auflage 1955, durchgeführt.

Während Vitamin D₃ und Vitamin D₂ nur Werte von 40 I.E. je μg ergaben, zeigte Hydroxyergocalciferol einen Wert von etwa 60 I.E. je ng und 25-Hydroxycholecalciferol einen Wert von 56 bis 60 I.E. je |ig (Syntheseprodukt 55 bis 60 I.E. je μg).

B. Calciumtransportversuch

Entwöhnte männliche Jungratten wurden in hängenden Drahtkäfigen gehalten und nach Belieben mit einer gereinigten Vitamin D-armen Mangelkost gemäß DeLuca a. a. O. gefüttert. Die Diät erzeugte keine Rachitis bei Ratten, rief aber in 3 bis 4 Wochen schwere Vitamin D-Mangelerscheinungen hervor, die durch einen niedrigen Ca^{+ +} Gehalt im Serum und durch vermindertes Wachstum gekennzeichnet sind (H. Steenbock und D. C. H e r t i η g, J. Nutr., Bd. 57 [1955], S. 449). Probe

Vergleich
Baumwollöl
Äthanol....

Vitamin D₃
Baumwollöl

Äthanol

Vitamin D₂

Äthanol

35

40 25-OH-Ergocalciferol
Äthanol

45 25-ÜH-Cholecalciferol
Baumwollöl

Äthanol,

4
6

3
4
6
8
12

3
4
6
8
12

12
24

4
6

Tierzahl

Transportverhältnis

0,66 ± 0,02 1,59 ± 0,17

0,74 ± 0,03 1,16 ± 0,06

1,01 ± 0,12 1,32 ± 0,10

1,40 ± 0,39 1,54 ± 0,36 1,88 ± 0.30 2,06 ± 0.12 3,35 ± 0,70

1,94 ± 0,41 2,09 ± 0,65 2,74 ± 0,49 3,51 ± 0,23 3,58 ± 0,59

0,89 ± 1,24 ±

0,04· 0.07

2,31 ± 0,50 2,33 ± 0.31

55

60

- ⁶S Aus den Werten ergibt sich, daß synthetisches odei natürliches 25-Hydroxycholecalciferol den Calcium transport in den Eingeweiden schneller als Vitamin D einsetzen läßt und daß 25-Hydroxyergocalciferol ii dieser Hinsicht dem Vitamin D₂ überlegen ist.

Mit 25-Hydroxycholecalciferol wurde ein weitere Versuch durchgeführt, wobei

a) das Inkubaüonsmedium aus 125 mMol Natriun ' chlorid, 3OmMoI Tris-Cl, 0,25 mMol CaCl₂ 2H₂O und 10 mMol Fruktosc bestand, das m HCl auf den pH-Wert 7,4 eingestellt und m einer Ca⁴⁵-Lösung auf etwa 10⁵ Impulse/Min./r Medium gebracht worden war,

309 638/:

bei

b) 1,5 Stunden Sauerstoff durch das Medium
37° C perlen gelassen wurde und

c) die Ratten intravenös mit 0,25 μg Vitamin D₃ oder 25-HydriDxycholecalciferol in 0,02 ml Äthanol behandelt wurden.

Die Vergleichstiere erhielten nur Äthanol. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II	Probe	Stunden	Tier	Transport
		nach	zahl	verhältnis
	Vergleich	Verab
25-OH-Cholecalciferol	reichung	12	1,25 ± 0,05
		4	1,74 ± 0,12
	3		(p < 0,01 über
			Vergleich)
		4	1,66 ± 0,13
	4	4	2,6 ± 0,4
Vitamin D3	6	4	2,3 ± 0,6
	10	4	1,01 ± 0,12
	4	4	1,32 ± 0,10
6	3	2,0 ± 0,3
10

	IO	25-OH-Cholecalciferol	ι C	synthetisch	Stunden	Tier	Serumgehall	η mg-%
	aus Schweinen			nach	zahl	Ca
Probe		Verab			± 0,1
	reichung	2	38	± 0,1
Vitamin D3	4	3	3,9	±0,4
	8	3	5,0	± 0,4
	12	4	6,6
16			± 0,3
	3	44	± 0,2
4	4	5,7	± 0,4
8	4	7,1	± 0,4
12	3	7,2	± 0.5
16	7	6,4	± 0,21
8	6	7,36
12

Aus der Tabelle III ergibt sich, daß 25-Hydroxyergo- bzw. -cholecalciferol die Knochenmobilisieiung und damit den Calciumgehalt im Blut schneller in Gang setzen als Vitamin D₂ bzw. Vitamin D₃. Hieraus ergibt sich, daß die neuen Verbindungen an Stelle von Vitamin D₂ bzw. D₃ als Nahrungsmittelzusatz überlegen sind.

C. Serum-Calciumspiegel

(Knochenmobilisierung)

Entwöhnten männlichen Jungratten wurde 11 bis 15 Tage bzw. 3 bis 4 Wochen eine Vitamin-D-Mangeldiät gemäß D e L u c a a. a. O. verabreicht, wobei jedoch Calcium fortgelassen wurde. Die Ratten wurden dann intravenös mit 2,5 μg Vitamin D₂, Vitamin D₃, 25-Hydroxyergocalciferol und 25-Hydroxycholccalciferol in 0,02 ml Äthanol behandelt. Vergleichstiere wurden nur mit Äthanol behandelt. Das Serum wurde nach den in Tabelle III angegebenen Zeiträumen gesammelt und gemäß Webster, Am. J. Clin. Pathol., Bd. 131 (1969), S. 330, auf Calcium geprüft. Die Versuche wurden doppelt ausgeführt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III	Probe	Stunden	Tier	Serumgehall	η mg-%
		nach	zahl	Ca i
	Vergleich	Verab			± 0,2
	reichung	6	3,7	± 0,4
Vitamin D2	0	4	4,0	± 0,5
	0	4	3,7	± 0,3
	4	4	3.7	± 0.3
	8	4	3,6	± 0,1
	12	3	4,2	± 0,3
25-OH-Ergocalciferol	16	6	5,7	± 0,3
	24	4	4,3	± 0,3
	4	5	4,6	± 0,3
	8	5	4,8	± 0,2
	12	4	5,1	± 0.4
16	6	6.0
24

D. Zusatz von 25-Hydroxycholecalciferol
zu Hühnerfutter

Es wurden Fütterungsversuche an Hühnern gemäß »Vitamin D in Pultry Feed Supplement First Action, Methods of Analysis«, A. O.A. C, S. 784 (1965), 10. Ausgabe, durchgeführt. Das aus Schweinen isolierte 25-Hydroxycholecalciferol wurde in einer Menge von 125 μg in 25 g Maisöl dispergiert und zur Fütterung verwendet. Nach dem Füttern wurden die Knochen der einzelnen Hühner gruppenweise geordnet und der Prozentsatz Asche in den von Feuchtigkeit und Fett freien Knochen als Einzelreaktion auf jede Dosierung bestimmt. Die Wirksamkeit des Präparats wurde aus der Aufzeichnung von Standardpräparaten abgeschätzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

Internationale
Hühnereinheiten*)

Futter

Körpergewicht

anfangs

am Ende

Knochenasche:, %
(Schienbein)

Vergleichsgruppe: nur Maisöl

0 I 35 I 116

Vergleichsgruppe: Vitamin D
als Vergleichsstandard zugesetzt

28,3

400	0,113	35	142	32,4
400	0,158	35	145	33,4
400	0,225	35	151	35,3
400	0,319	35	166	38,7
400	0,450	35	152	41,8

*) Internationale Hühnereinheiten = 0,025 μg Cholecalciferol.

19

Internationale Hühnereinheiien*)

Fortsetzung

Körpergewicht

20

Fuller

anfangs

am Ende

Knöthenasche, % (Schienbein)

Versuchsgruppe: 25-Hydroxycholecalciferol

in Maisöl

32,2 36,3 41,2

0,158	35	140
0,225	35	151
0,319	35	162

*) Internationale Hühnereinheiten = 0,025 \i% Cholecalciferol

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

Patentansprüche:

1. 25-Hydroxyergocalciferol.

2. 25-HydroxycholecalciferoL

3. Cholest-SJ-dien-S/US-diol.

4. Verfahren zur Herstellung von 25-Hydroxyergocalciferol bzw. 25-Hydroxycholecalciferol nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugetiere mit an Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol angereichertem Futter über einen längeren Zeitraum füttert, deren Blut sammelt, das Blutplasma isoliert, die Serumproteine des Blutplasmas abtrennt, die Serumproteine mit einem Methanol-Chloroformgemisch extrahiert, den gegebenenfalls in Chloroform angereicherten Extrakt wäscht und einengt, den Rückstand mit einem niedrigsiedenden Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch aufnimmt und chromatographisch über Kieselsäure die entsprechende 25-Hydroxyverbindung von Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol abtrennt.

5. Verfahren zur Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel