CH642071A5

CH642071A5 - 25-hydroxycholecalciferol-26,23-lacton.

Info

Publication number: CH642071A5
Application number: CH716380A
Authority: CH
Inventors: Hector F Deluca; Heinrich K Schnoes; Joseph K Wichmann
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 1979-01-26
Filing date: 1980-01-17
Publication date: 1984-03-30
Also published as: JPS56500045A; AU529072B2; IE49369B1; IL59162A; NL8020035A; AU5494880A; GB2042549A; NZ192603A; IE800142L; IL59162A0; WO1980001565A1; FR2447377B1; BE881358A; FR2447377A1; US4223131A; GB2042549B

Description

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PATENTANSPRUCH 25-Hydroxycholecalciferol-26,23-lacton.

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft eine Verbindung, die durch eine Vitamin-D-ähnliche Wirksamkeit charakterisiert ist.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Derivat von Vitamin D.

Ganz besonders betrifft die Erfindung 25-Hydroxychole-calciferol-26,23-lacton.

Die Fähigkeit der D-Vitamine, die Serum-Calciumkon-zentrationen zu erhöhen und das Knochenwachstum zu steigern, ist bekannt und die Verwendung dieser Vitamine als Nahrungsmittelzusätze hat sich durchgesetzt.

Es ist auch bekannt, dass diese Vitamine, um wirksam zu sein, in vivo metabolisiert werden müssen, um die physiologischen Funktionen, mit denen sie in Verbindungen stehen, zum Ausdruck zu bringen. Das Vitamin wird zunächst in der Leber hydroxyiiert unter Bildung von 25-Hy-droxyvitamin-D, von dem man annimmt, dass es den hauptsächlichen im Blutstrom zirkulierenden Metaboliten darstellt. Diese Verbindung wird anschliessend weiter in der Niere hydroxyiiert unter Bildung von la,25-Dihydroxy-vitamin-D oder 24,25-Dihydroxyvitamin-D. Die la-hydroxy-lierte Form des Vitamin D wird im allgemeinen als die physiologisch wirksame oder hormonelle Form des Vitamins und als verantwortlich für die sogenannten Vitamin-D-arti-gen Wirksamkeiten angesehen, wie die gesteigerte intestinale Absorption von Calcium und Phosphat, die Mobilisierung der Knochenmineralien und die Zurückhaltung von Calcium in den Nieren. Es verbleibt jedoch die Möglichkeit, dass ein weiterer Metabolismus des la,25-Dihydroxyvitamin-D erforderlich ist, um irgendeine oder alle diese Reaktionen hervorzurufen.

Stand der Technik

In der Patentliteratur oder anderer Literatur finden sich Hinweise auf verschiedene Vitamin-D-Derivate. Vergleiche beispielsweise die US-Patentschriften Nr.: 3 565 924, gerichtet auf 25-Hydroxycholecalciferol; 3 697 559, gerichtet auf 1,25-Dihydroxycholecalciferol; 3 741 996, gerichtet auf la-Hydroxycholecalciferol; 3 907 843, gerichtet auf la-Hy-droxyergocalciferol; 3 715 374, gerichtet auf 24,25-Dihy-droxycholecalciferol; 3 739 001, gerichtet auf 25,26-Dihy-droxycholecalciferol; 3 786 062, gerichtet auf 22-Dehydro--25-hydroxychoIecaIciferol; 3 847 955, gerichtet auf 1,24,25-Trihydroxycholecalciferol; 3 906 014, gerichtet auf 3-Deoxy--1 «-hydroxycholecalcif eroi.

Darstellung der Erfindung

Es wurde nun ein neues Derivat von Vitamin D gefunden, das eine Vitamin D-artige Wirksamkeit entwickelt und von dem man annimmt, dass es eine metabolisch wirksame Form des Vitamins sein kann, die für einige der vorstehend genannten biologischen Reaktionen verantwortlich ist. Dieses Derivat wurde identifiziert als 25-Hydroxycholecalci-ferol-26,23-lacton (oder 23,25-Dihydroxy-26-carboxy-vitamin--Dj-y-lacton). Die Bildung dieser Verbindung in hohen Ausbeuten aus Vitamin D3 stimmt mit der Annahme überein,

dass sie möglicherweise eine metabolisch wirksame Form des Vitamins ist, die verantwortlich ist für einige der biologischen Reaktionen, die durch Vitamin D hervorgerufen werden.

Bester Weg zur Ausführung der Erfindung

Die Isolierung und Charakterisierung des Vitamin-D-Derivats (Metabolit) der Erfindung wurde durchgeführt unter

Verwendung in einem Falle von Plasma von Küken, die in ihrer Nahrung einen normalen Gehalt an Vitamin D3 erhalten hatten, und im zweiten Falle von Plasma von Küken, denen grosse Dosierungen von Vitamin D3 verabreicht worden waren.Die jeweiligen Isolierungs- und Identifizierungs-verfahren, die durchgeführt wurden, sind in den nachstehenden Beispielen aufgeführt.

Beispiel 1

Isolierung und Charakterisierung des Metaboliten aus Plasma von Küken, die mit Erhaltungsmengen an Vitamin D3 aufgezogen wurden.

Vierundzwanzig Liter Kükenblut wurden aus 8 Wochen altem «Bratgeflügel» (A-G Coop, Arcadia, Wisconsin) gewonnen, das Erhaltungsmengen von Vitamin Ds in seiner Nahrung erhalten hatte (@ 1000 IE Vitamin D3 pro Pound Nahrung). Bei der Gewinnung wurden zur Verhinderung der Gerinnung 10 Vol.-% 0,1 m Natriumoxalat, pH 7,0, zugesetzt. Das Blut wurde in einem De Laval Blutseparator abgeschieden unter Bildung von 16 Liter Plasma.

Das Plasma wurde in 1-Liter-Ansätzen nach folgender Arbeitsweise extrahiert:

Plasma wurde 1 Stunde unter Rühren bei 70°C erwärmt und anschliessend 1 Stunde bei 13 000 UpM in einer Beck-man-J-21C-Zentrifuge, ausgerüstet mit einem JA-14-Rotor (Beckman Instruments, Inc.) zentrifugiert. Das gewonnene Pellet wurde in 400 ml destilliertem Wasser suspendiert und 1 Stunde bei 4°C mit 800 ml Methanol und 400 ml Chloroform extrahiert. Vierhundert Milliliter Chloroform wurden anschliessend zugesetzt, die Chloroformschicht wurde entfernt und die wässrige Phase mit weiteren vierhundert Milliliter Chloroform gewaschen. Aus den vereinten Chloroformphasen wurde das Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt.

Der gesamte Chloforormextrakt wurde in 500 ml Hexan und 500 ml 10% Wasser in Methanol unter Schütteln während 1 Stunde aufgeteilt. Fünfhundert Milliliter Chloroform wurden anschliessend zu der Wasser-Methanol-Phase gefügt. Die Chloroformphase wurde gewonnen und die wässrige Phase wurde mit 500 ml Chloroform zweimal gewaschen. Die vereinten Chloroformphasen wurden konzentriert und zur anschliessenden Chromatografie verwendet.

Der konzentrierte Chloroformextrakt wurde in vier Ansätzen auf einer 3 X 30 cm Sephadex-LH-20- (ein Hydroxy-propylätherderivat eines Polydextrans, Handelsprodukt der Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J.) Säule chromatografiert, mit 9:1:1 Hexan:Chloroform:Methanol eluiert. Die Säulenfraktionen wurden unter Anwendung der kompetitiven Proteinbindungs-Radioassaymethode von Haddad et al. (Arch. Biochem. Biophys. 182, 390, 1977) bewertet und der Bindungspeak, der in der 618 bis 807 ml Region eluierte, wurde gepoolt und konzentriert.

Die vereinten Fraktionen aus diesem Peak wurden weiter chromatografiert in drei Ansätzen an einer 2 X 55 cm Sephadex-LH-20-Säule, eluiert mit 70:30 Chloroform:Hexan. Die Fraktionen wurden wie vorstehend bewertet und die bindenden Fraktionen, die im 24,25-Dihydroxyvitamin-D3 [24,25-(OH)2D3] Gebiet (252 bis 318 ml) eluierten, wurden gepoolt und konzentriert.

Diese gepoolte Fraktion wurde weiter in drei Ansätzen chromatografiert an einer 1 X 58 cm Sephadex-LH-20--Säule, eluiert mit 9:1:1 Hexan:Chloroform:Methanol. Die Fraktionen wurden wie vorstehend bewertet und solche die im 25,26-Dihydroxyvitamin-D3 [25,26-(OH)2D3] Gebiet (133 bis 162 ml) eluierten, wurden gepoolt und konzentriert.

Eine Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC) wurde an diesem Bestandteil durchgeführt unter Verwendung eines Waters Modell ALP/6PC 204-Instruments (Waters

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Associates, Milford, Mass.), ausgerüstet mit einem Modell 440 Absorbansdetektor, der bei 254 mm überwachte und einer 0,46 X 25 cm Partisil ODS- (Octadecylsilan, gebunden an Siliziumdioxid, Handelsprodukt der Whatman, Inc., Clif-ton, New Jersey) Säule, eluiert mit 25% Wasser in Methanol. Die Fraktionen wurden bewertet und der bindende Peak, der dem UV-(254 nm) Absorptionspeak entsprach, eluierend von 25,5 bis 28,5 ml, wurde gepoolt. Diese Komponente wurde einer weiteren HPLC an einer 0,46 X 25 cm Mikroteilchen-Siliziumdioxidgelsäule (Waters Associates) unterzogen, eluiert mit 8% Isopropanol in Hexan. Die Fraktionen wurden wie vorstehend bewertet und die einzige bindende Komponente [und Haupt-UV-(254 nm) Absorptionspeak] eluierend von 14,5 bis 16,5 ml, wurde gepoolt. Diese Fraktion wurde erneut chromatografiert unter Verwendung des gleichen Systems und der einzige UV-Absorptionspeak wurde gesammelt.

Die UV-Spektren der gesammelten Verbindung in Äthanol ergaben Xmax = 264 nm, Xmin = 229 nm, OD^/OD^g = 1,40. Eine Masse von 8 [ig wurde unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 18 600 und eines Molekulargewichts von 428 berechnet.

Die Massenspektrometrie der Verbindung ergab folgende Ionen und Intensitäten: m/e 428, 27,6%, M+; m/e 410, 4,1%, M+-H20; m/e 395, 12%, M+-H20-CH3; m/e 271; 4,5%, M+-Seitenkette; m/e 253, 9,3%, M+-Seitenkette-H20; m/e 136, 100%, A-Ring + C-6, C-7 und C-19; m/e 118, 94%, A-Ring und C-6, C-7, C-19-H20.

Die hochauflösende Massenspektrometrie des Molekülions der Verbindung ergab ein Gewicht von 428,2901 für eine Formel von C27H40O4 (berechnetes Gewicht = 428,2926).

Das Trimethylsilylderivat der Verbindung wurde herge-' stellt aus 1 (ig unter Verwendung von 30 X Pyridin und 25 X N,0-Bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid bei 55°C während 40 Minuten. Das Reaktionsgemisch wurde direkt der Massenspektrometrie unterzogen und ergab: m/e 572, 20%, M+; m/e 482, 15%, M+-HOTMS; m/e 467,10%, M+-HOTMS-CH3; m/e 208, 34%, A-Ring-Fragment; m/e 118, 100%, A-Ring-Fragment-HOTMS.

Beispiel 2

Isolierung des Metaboliten aus Plasma von Küken, denen grosse Dosierungen an Vitamin D3 verabreicht wurden.

Einundsiebzig, 10 Wochen alten männlichen Küken wurden intramuskulär 105 IE Vitamin-D3 in 50 X (X = 0,001 cc) Äthanol täglich während drei Tagen verabreicht. Es wurden ihnen anschliessend 107 IE Vitamin D3 intramuskulär in vier Dosierungen in 50 X Äthanol verabreicht. Fünf Tage nach der letzten Dosierung wurden die Küken durch Herzpunktur ausgeblutet unter Verwendung einer geringen Menge an Heparin zur Vermeidung der Gerinnung. Das Blut wurde unmittelbar zentrifugiert unter Bildung von 1100 ml Plasma.

Das Plasma wurde in etwa 400-ml-Ansätzen mit 800 ml Methanol und 400 ml Chloroform extrahiert. Nach lstündi-gem Stehen bei 4°C wurden weitere 400 ml Chloroform zugesetzt und die Chloroformphase wurde gesammelt. Die wässrige Phase wurde mit 400 ml Chloroform gewaschen und die vereinten Chloroformphasen wurden durch Verdampfen des Lösungsmittels zur Chromatografie konzentriert.

Der gesamte konzentrierte Extrakt wurde an einer 3 X 30 cm Sephadex LH-20 Säule chromatografiert, eluiert mit 9:1:1 Hexan:Chloroform:Methanol. Die Fraktionen wurden wie vorstehend bewertet und die bindende Komponente, die im Gebiet von 608 bis 931 ml eluierte, wurde gepoolt und konzentriert. Dieser Peak wurde anschliessend an einer 2 X 55 cm Sephadex LH-20 Säule chromatografiert, eluiert mit 70:30 Chloroform:Hexan. Die Fraktionen wurden bewertet und die bindende Komponente, die im 240 bis 258 ml Gebiet eluierte, wurde gepoolt und konzentriert. Diese Fraktion wurde einer HPLC an einer 0,46 X 25 cm Partisil-5 ODS-Säule unterzogen, eluiert mit 25 % Wasser in Methanol. Der Haupt-UV- (254 nm) Absorptionspeak wurde gesammelt (18-22,5 ml) und erneut unter Verwendung des gleichen Systems chromatografiert. Die UV- (254 nm) absorbierende Substanz wurde weiter gereinigt durch HPLC an einer 0,46 io X 25 cm Mikroteilchensiliziumoxidgel-Säule, eluiert mit 8% Isopropanol in Hexan. Die UV- (254 nm) absorbierende Verbindung, die von 15-17 ml eluierte, wurde gesammelt und erneut an dem gleichen System gereinigt.

Die UV-Spektren dieser und in gleicher Weise herge-15 stellter Proben ergaben Xrnax = 264 nm, Xmln = 228 nm, OD264/OD228 = 1,51. Eine Gesamtmasse von 56 (ig wurde erhalten, berechnet unter Annahme von e = 18 600.

Die hochauflösende Massenspektrometrie an dieser Verbindung ergab: m/e 428, 27,6%, M+ (27H40O4); m/e 410, 20 4,1%, M+-H20; m/e 395, 12%, M+-H20-CH3; m/e 271, 4,5%, M+-Seitenkette; m/e 253, 9,3%, M+-Seitenkette-H20; m/e 136, 100%, A-Ring+; m/e 118, 94%, A-Ring+H20.

Die Massenspektren des TMS-Derivats der Verbindung (hergestellt wie vorstehend beschrieben) ergaben: m/e 572, 25 20%, M+; m/e 482, 15%, M+-HOTMS; m/e 467, 10%, M+-HOTMS-CH3; m/e 208, 34%, A-Ring+; m/e 118, 100%, A-Ring+-HOTMS.

Die UV-Spektren und Massenspektren der isolierten Verbindung, sowie die Massenspektren des TMS-(Trimethyl-30 silyl) Derivats waren identisch mit denen der Verbindung, die aus dem Plasma der Küken erhalten wurde, die mit Erhaltungsmengen an Vitamin D3 aufgezogen wurden, was anzeigt, dass bei jeder Isolierung die identische Verbindung gewonnen wurde.

35 Die Verbindung wurde erneut durch HPLC an Siliziumdioxidgel, wie vorstehend beschrieben, gereinigt und das Protonen NMR wurde in CDC13-Lösung auf einem 270-Megahertz-Instrument aufgenommen. Das erhaltene Spektrum war identisch mit dem von 25-Hydroxyvitamin-D3 40 (25-OH-D3) mit der Ausnahme folgender Resonanzen: 5 4,46, m, IH, C-23-H; 8 1,56, s, 3H, C-27-H3; 8 1,09, d, J=6,3 Hz, sH, C-21-H3; 8 0,63, s, 3H, C-18-H3.

Ein Fourier-Transform-Infrarotspektrum (FT-IR) wurde von dieser Verbindung an einem Nicolet-7199-FT-IR-Instru-45 ment (Nicolet Instrument Corp., Madison, Wis.) aufgenommen. Das erhaltene Spektrum war sehr ähnlich dem eines Vitamin-D3-Spektrums mit Ausnahme einer intensiven Ab-sorbanz bei 1787 cm-1, die ein Anzeichen für ein y-Lacton darstellt.

so Das Methyllactolprodukt des TMS-Derivats der Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen von 1 [ig (TMS)2-Verbindung mit 25 X 0,01 m MeLi in Diäthyläther bei Raumtemperatur während 1 Stunde. Das Reaktionsgemisch wurde mit 50 X Wasser abgeschreckt und zweimal mit 200 X 55 Methylenchlorid extrahiert. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC an einer 0,4 X 25 cm Siliziumdioxidgelsäule gereinigt, eluiert mit 5% Äthylacetat in Hexan. Die UV-(254 nm) absorbierende Verbindung (eluiert aus 30 bis 42 ml) wurde gesammelt und der Massenspektrometrie un-60 terzogen. Folgende diagnostische Ionen des Methyllactols wurden erhalten: m/e 588, 4,4%, M+; m/e 570, 7,3%, M+-H20; m/e 528, 1,5%, M+-HOAc; m/e 498, 2%, M+-HOTMS; m/e 208, 33%, A-Ring+; m/e 118, 100%, A-Ring+-HOTMS.

65 Das Methyllactol wurde wie vorstehend silyliert und die Massenspektren ergaben folgende diagnostische Ionen: m/e 660,. 12,7%, M+; m/e 645, 1,8%, M+-CH3; m/e 570, 4%, M+-HOTMS; m/e 555, 2%, M+-HOTMS-CH3; m/e 528,

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10%, M+-AcOTMS; m/e 208, 54%, A-Ring+; m/e 118, 100%, A-Ring+-HOTMS.

Die einzige Struktur, die mit sämtlichen vorstehenden spektralen Daten, d.h. der UV-, IR-, NMR- und Massenspektrometrie im Einklang steht, ist das 25-Hydroxychole-calciferol-26,23-lacton oder 3ß,25-Dihydroxy-9,10-seco--5,7,10(19)-cholestatrieno-26,23-lacton.

Die erfindungsgemässe Verbindung kann durch folgende Formel charakterisiert werden:

intrajugular 50 X Äthanol (Kontrolle) oder 50 X Äthanol, enthaltend 300 ng 25-Hydroxy-cholecalciferol-26,23-lacton verabreicht.

12 Stunden nach der Verabreichung wurden die Ratten 5 geköpft und das Blut wurde gesammelt. Es wurde sofort zentrifugiert und 0,1 ml Serum wurden mit 1,9 ml 0,1 % Lanthanchlorid-Lösung verdünnt. Die Serum-Calcium-Kon-zentrationen wurden bestimmt unter Verwendung eines Atom-Absorptions-Spektrometers Modell 403 (Perkin-Elmer, io Norwalk, Conn.). Die erhaltenen Ergebnisse sind im folgenden tabellarisch dargestellt:

Serumcalcium (mg/100 ml)

15 Ratte Nr.

Kontrolle

Ratte Nr.

Lacton

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4,52

1

4,33

20 ^

4,26

2

4,48

3

3,94

3

4,67

4

4,20

4

4,84

25 5

4,39

5

4,72

6

4,70

6

5,01

7

4,50

7

4,63

Männliche Ratten (Holtzman Co., Madison, Wis.) wurden einzeln in hängende Drahtkäfige gesetzt und ad libitum mit Nahrung und Wasser versehen. Sie wurden drei Wochen mit der gereinigten Nahrung mit niedrigem Calciumgehalt, beschrieben von Suda et al. [J. Nutr. 100, 1049-1050 (1970)] gefüttert. Den Ratten wurde jeweils in Gruppen von sieben

30 Durchschn. ± S.D. 4,36 ± 0,25 Durchschn. ± S.D. 4,67 ± 0,22

Die Calciumspiegel der mit Lacton dosierten Ratten unterschieden sich beträchtlich von denen der Kontrollen mit P < 0,05, was zeigt, dass das 25-Hydroxycholecalciferol-35 -26,23-lacton eine Vitamin D-artige Wirksamkeit bei der Mobilisierung des Calciums aus Knochen aufweist.

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