DE3247836C2

DE3247836C2 -

Info

Publication number: DE3247836C2
Application number: DE3247836A
Authority: DE
Inventors: Seiichi Hino Tokio/Tokyo Jp Ishizuka; Junji Kanagawa Jp Kubo
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1981-12-29
Filing date: 1982-12-23
Publication date: 1991-08-08
Also published as: DE3247836A1; US4511564A; FR2518881A1; FR2518881B1; CH652929A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Senkung der Serumcalciumkon zentration von Warmblütern. Es wurde gefunden, daß sich die Serumkonzentration bei Warmblütern durch Verabreichen von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactonen gegebenen falls in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern senken läßt.

Von 1α,25-Dihydroxycholecalciferol, 1α-Hydroxychole calciferol, 1α,24-Dihydroxycholecalciferol und dgl. ist es bekannt, daß sie sich zur Behandlung von Osteoporose, Osteomalazie und dgl. eignen. Nachteilig an der Verabreichung dieser Verbindungen ist, daß sie bei Verabreichung in großen Dosen Nebenwirkungen entfalten, z. B. eine Hyperkalzämie verursachen.

Calcitonin ist bekanntlich ein Arzneimittel zur Bekämpfung der Hyperkalzämie und dgl., nachteilig daran ist jedoch, daß es nicht oral verabreichbar ist.

Vor kurzem wurde aus Rattenserum 1α,25-Dihydroxyvitamin- D₃-26,23-lacton isoliert und als neuer Metabolit von 1α-Hydroxyvitamin-D₃ bzw. 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃ identifiziert (vgl. "Arch. Biochem. Biophs." Band 204 Seiten 387-391 (1980) und "FEBS LETTERS", Band 134, Seiten 207-211 (1981)).

Das 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton wurde ferner aus dem Serum von Hühnern, Ratten bzw. Schweinen isoliert und als solches identifiziert (vgl. "Biochemistry", Band 18, Seiten 4775-4780 (1979), "Biochemical and Biophysical Research Communication", Band 89, Seiten 286-293 (1979) und "Biochemical and Biophysical Research Communication", Band 93, Seiten 149-154 (1980)).

Unter Bezugnahme auf Berichte über die biologische Aktivität des 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactons berichten WO 80/01565 und WO 81/500045, daß bei Ratten, die mit einer Vitamin-D₃-Mangeldiät gefüttert worden waren und 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- lacton erhielten, eine Messung der Serumcalciumkonzen tration 12 h nach der Verabreichung das 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-lacton die Serumcalciumkonzentration erhöht hat und daß es folglich hinsichtlich der Förde rung der Knochencalciummobilisierung eine ähnliche Aktivität besitzt wie Vitamin D.

Bezüglich 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton gibt es bisher keine Berichte über dessen durch konkrete pharmakologische Daten belegte biologische Aktivität.

Nach umfangreichen Untersuchungen und Feldstudien bezüglich der biologischen Aktivität von 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-lacton hat es sich gezeigt, daß bei Gabe von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton an Ratten mit Vitamin D₃-Mangel und Bestimmung der Serumcalcium konzentration 48-96 h nach einer Verabreichung der Serumcalciumspiegel weit unter den Erwartungen liegt.

In gleicher Weise konnte geklärt werden, daß auch das 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton den Calcium spiegel in gleicher Weise senkt. Schließlich wurde als neuer Metabolit 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-peroxylacton isoliert und identifiziert. Auch diese Verbindung senkt die Serumcalciumkonzentration in gleicher Weise.

Insbesondere wurde gefunden, daß 25-Hydroxyvitamin-D₃- 26,23-lacton und seine Derivate den Serumcalciumspiegel senken, oral verabreicht werden können und sich zur Bekämpfung von auf eine Gabe von 1α,25-Dihydroxychole calciferol und dgl. zurückzuführenden Hyperkalzämie eignen.

Die Erfindung betrifft folglich ein Arzneimittel zur Senkung der Serumcalciumkonzentration bei Warmblütern, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Streckmittel eine pharmazeutisch wirksame Menge mindestens eines 25-Hydroxyvitamin-D₃- 26,23-lactons der Formel:

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt und X für -O- oder -O-O- steht, enthält.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert werden. Im einzelnen zeigt

Fig. 1 den Einfluß von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- lacton auf den intestinalen Calciumtransport;

Fig. 2 den Einfluß von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- lacton auf die Serumcalciumkonzentration und

Fig. 3 und 4 bzw. 5 und 6 den Einfluß von 1α,25- Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton bzw. 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-peroxylacton auf den intesti nalen Calciumtransport bzw. die Serumcalcium konzentration.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden 25-Hydroxyvitamin-D₃- 26,23-lactone lassen sich durch die Formel I mit den aaO definierten Resten wiedergeben.

25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton der Formel I mit X gleich -O- entspricht der folgenden Formel I-1

worin R für ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyl gruppe steht. Beispiele für solche Verbindungen sind 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton und 1α,25-Dihydroxy vitamin-D₃-26,23-lacton.

25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton ist eine bekannte Verbindung, die aus dem Serum von mit Vitamin-D₃ über sättigten Ratten, Hühnern, Schweinen und dgl. isoliert und als gebildeter Metabolit identifiziert wurde (vgl. "FEBS LETTERS", Band 134, Seiten 207-211 (1981), "Biochemistry", Band 18, Seiten 4775-4780 (1979) und "Biochemical and Biophysical Research Communication", Band 89, Seiten 286-293 (1979)).

Die genannte Verbindung erhält man auch durch chemische Synthese. Es gibt einige bekannte Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung. Bei eindem dieser Ver fahren erhält man die betreffende Verbindung bei spielsweise durch Umsetzung eines Aldehyds der Formel:

mit Aceton unter Bildung einer entsprechenden β-Hydroxy ketonverbindung und anschließende Cyanhydrinsynthese (vgl. "Tetrahedron Letters", Band 21, Seiten 4667- 4670 (1980)). Bei einem anderen Verfahren wird eine aus Ergosterin gewonnene Aldehydverbindung als Aus gangsmaterial eingesetzt (vgl. "Journal of Organic Chemistry", Band 46, Seiten 3422-3428 (1981)).

25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton besitzt ein asymmetrisches Kohlenstoffatom in 25-Stellung und 23-Stellung. Er findungsgemäß kann (können) die 25-Stellung und/oder die 23-Stellung R-Konfiguration und/oder S-Konfiguration (bei Gemischen in beliebigem Verhältnis) zeigen. Von sämtlichen derartigen Verbindungen eignet sich das natürliche 23(S),25(R)-25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton besonders gut, da es sehr günstige physiologische Wirkungen entfaltet.

1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton stellt eine bekannte Verbindung dar, die aus dem Serum von Ratten oder Hunden als Metabolit von verabreichtem 1α-Hydroxyvitamin-D₃ bzw. 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃ isoliert wurde (vgl. "Arch. Biochem. Biophs." Band 204, Seite 387-391 (1980)).

1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton erhält man auch durch Inkubieren von 25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton mit einem Homogenat von Hühnerleber (vgl. "FEBS LETTERS", Band 134, Seiten 207-211 (1981)).

1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton erhält man ferner durch chemische Synthese, ausgehend von einem Ergosterin derivat mit einer Hydroxylgruppe in 1α-Stellung der Formel:

entsprechend "Journal of Organic Chemistry", Band 46, Seiten 3422-3428 (1981). Ferner erhält man es unter Verwendung einer Aldehydverbindung der Formel:

als Ausgangsmaterial bei dem in "Tetrahedron Letters", Band 21, Seiten 4667-4670 (1980) beschriebenen Ver fahren.

Weiterhin erhält man es durch 1α-Hydroxylierung von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton entsprechend "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.", Band 75, Nr. 5, Seiten 2080-2081 (1978).

Wie im Falle von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton besitzt auch das 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton ein asymmetrisches Kohlenstoffatom in 25-Stellung und 23-Stellung. Erfindungsgemäß kann (können) die 25- Stellung und/oder 23-Stellung R-Konfiguration und/oder S-Konfiguration (bei Mischungen in beliebigem Verhältnis) zeigen. Von sämtlichen Verbindungen wird das natürliche 23(S),25(R)-1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23- lacton wegen seiner günstigen biologischen Aktivität bevorzugt.

25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactone der Formel I mit X gleich -O-O- entsprechen der Formel:

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt. Beispiele für solche Verbindungen sind 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-peroxylacton und 1α,25- Hydroxyvitamin-D₃-26,23-peroxalacton. Bei diesen Ver bindungen handelt es sich um neue Verbindungen mit γ-Peroxylactonstruktur in der Seitenkette. 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-peroxylacton erhält man auf folgende Weise: Zunächst wird in üblicher bekannter Weise, z. B. durch orale Verabreichung oder intravenöse oder intra muskuläre Injektion an Ratten, Hühner, Schweine und dgl. Vitamin-D₃ bzw. 25-Hydroxyvitamin-D₃ in toxikologisch zulässiger Dosis verabreicht. Etwa 3 bis 10 Tage nach der Verabreichung wird dann die gewünschte Verbindung als Metabolit des verabreichten Vitamin-D₃ bzw. 25- Hydroxyvitamin-D₃ aus dem aus Vollblut der Ratten, Hühner, Schweine und dgl. gesammeltem Serum extrahiert. Schließlich wird sie durch Säulenchromatographie auf einer Sephadex® LH-20-Säule oder durch Hochdruck- Flüssigchromatographie isoliert.

1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-peroxylacton erhält man als Metabolit von 1α-Hydroxyvitamin-D₃ bzw. 1α,25- Dihydroxyvitamin-D₃ entsprechend dem für 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-lactonen beschriebenen Isolier- und Extraktionsverfahren.

Aus Gründen ihrer pharmakologischen Wirkungen und chemi schen Stabilität werden von den genannten 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-lacton das 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- lacton und insbesondere das 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃- 26,23-lacton bevorzugt. Von den 1α,25-Dihydroxyvitamin- D₃-26,23-lacton und 23(S),25(R)-1α,25-Dihydroxyvitamin- D₃-26,23-lacton werden diejenigen bevorzugt, deren Konfiguration an den Kohlenstoffatomen in 23- und 25-Stellungen den natürlichen Arten entspricht, bevorzugt. Das genannte 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton und seine Derivate vermögen die Serumcalciumkonzentration bei Warmblütern zu senken. Darüber hinaus gewährleisten 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- lacton und seine Derivate eine hohe toxikologische Sicherheit, da es sich bei den genannten Verbindungen um in vivo aus Warmblütern gewonnene Metaboliten handelt. Folglich eignen sich die erfindungsgemäß eigesetzten Verbindungen in höchst wirksamer Weise zur Bekämpfung von auf abnorm hohe Serumcalciumkonzentrationen bei Warmblütern auftretenden Erkrankungen. Auch im Falle, daß eine mögliche abnormale Zunahme des Serumcalcium spiegels bei Warmblütern vorhersehbar ist, kann man sich der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf eine Verhütung einer solchen Abnormalität bedienen.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen eignen sich insbesondere zur Bekämpfung von auf hohe Serum calciumspiegel zurückzuführenden Erkrankungen, bei spielsweise von auf eine Verabreichung von 1α-Hydroxy vitamin-D₃, 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃, 1α,24-Dihydroxy vitamin-D₃ und dgl. zurückzuführenden Hyperkalzämie, einer auf maligne Tumore zurückzuführenden Hyperkalzämie, von Hyperparathyroidismus und Behcet′scher Krankheit.

Von der Erfindung sollte Gebrauch gemacht werden in Fällen, in denen vitamin-D-resistente Patienten die Ver abreichung großer Dosen Vitamin-D₃ benötigen oder wenn bei Patienten mit malignen Tumoren hohe Calciumspiegel zu befürchten sind.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können an Warmblüter, wie Schweine, Rinder, Ziegen, Schafe, Pferde, Hunde, Katzen und dgl. sowie Menschen verabreicht werden.

Die Verabreichung von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton und seiner Derivate erfolgt in pharmazeutisch wirksamer Menge, z. B. 1-1000 ng/d · kg Körpergewicht, zweck mäßigerweise 5-200 ng/d · kg Körpergewicht.

Die 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactone können ein- oder mehrmals pro Tag, z. B. zwei- oder dreimal pro Tag, ver abreicht werden. Die Verabreichungszeitpunkte und -mengen werden je nach dem Zustand des erkrankten Tiers oder Menschen von Fall zu Fall durch den Tierarzt bzw. Arzt festgelegt.

Die 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactone können auf den verschiedensten üblichen Verabreichungswegen, z. B. oral oder parenteral, wie intramuskulär, intravenös, subkutan, mittels Suppositorien und insbesondere oral verabreicht werden. Vorzugsweise werden die 25-Hydroxyvitamin-D₃- 26,23-lactone und ihre Derivate in Form von Mischungen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Streckmitteln verabreicht. Infolge ihrer spezifischen pharmako logischen Wirkung hinsichtlich einer Senkung der Serum calciumkonzentrationen eignen sich die ein 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-lacton enthaltenden Arzneimittel gemäß der Erfindung insbesondere zur Senkung der Serumcalcium spiegel.

Pharmazeutisch akzeptable Träger sind beispielsweise Ethanol, Pflanzenöle, wie Mais, Oliven-, Baumwollsaat-, Kokosnuß-, Mandel- oder Erdnußöl, Fischleberöl, Ölester, wie Polysolvate 80, die sich zur Zubereitung flüssiger Arzneimittel eignen, Kakaobutter, Fettsäuretriglyceride und dgl., die sich zur Herstellung von bei Körpertemperatur schmelzenden festen Arzneimitteln eignen, Calciumcar bonat, Kartoffelstärke, Alginsäuren, Lactose und dgl., die sich zur Zubereitung von bei Körpertemperaturen nicht- schmelzenden Arzneimitteln eignen, sowie organische Säureester, wie Propylenglykol, Polyethylenglykol und Ethyloleat, die bei der Zubereitung wäßriger oder nicht-wäßriger Lösungen oder Suspensionen zum Einsatz gebracht werden können.

Die Arzneimittel gemäß der Erfindung können Antioxida tionsmittel, wie Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxy anisol und Hydrochinon enthalten. Diese Antioxidations mittel dienen zum Stabilisieren der in den Arzneimitteln enthaltenen und gegenüber Oxidation, Licht oder Wärme instabilen 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactone. Ferner können die in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln enthaltenen 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactone beispielsweise mit Hilfe von α-, β- oder γ-Cyclo dextrin oder methyliertem γ-, β- oder γ-Cyclodextrin in Einschlußverbindungen oder Clathrate überführt worden sein.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in Form von Dosiereinheiten oder Einheitsdosen, wie Tabletten, Pillen, mit Zucker überzogenen Tabletten, Pulvern, Granulaten, Hart- oder Weichgelatinekapseln, bukkalen Tabletten, Suppositorien und Injektionslösungen, vor zugsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln, Pulvern und Granulaten, bereitgestellt werden.

Die Arzneimittel, insbesondere in Form von oral zu ver abreichenden Zubereitungsformen, wie Hart- oder Weich gelatinekapseln, Pulvern und Granulaten, enthalten 0,05-10, zweckmäßigerweise 0,25-2 µg 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-lacton.

Von den in Arzneimitteln gemäß der Erfindung verwend baren 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton und seinen Deri vaten werden 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton und 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton, insbesondere 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton und vornehmlich 23(S),25(R)-1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton bevorzugt.

Erfindungsgemäß benutzte Wirkstoffe lassen sich wie folgt herstellen.

A) Herstellung von 23(S),25(R)-25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton

Männliche, entwöhnte Wistar-Ratten werden 8 Wochen lang ad libitum mit normalem vitamin-D₃-haltigem Futter (Ca: 1,0%; P: 1,0%; D₃: 2000 IU/kg) gefüttert. Danach erhalten die 150 Ratten im Abstand von 3 Tagen zweimal eine intramuskuläre Gabe von 4×10⁵ IU-Vitamin-D₃ in 100 µl Ethanol. Drei Tage nach der zweiten Dosis werden die Ratten mit Ether betäubt, worauf ihnen aus der Bauchaorta Blut abgenommen wird. Die gewonnenen 600 ml Serum werden mit demselben Volumen Wasser verdünnt und danach mit 2 Volumina eines 1 : 1-Chloroform/Methanol- Gemisches extrahiert. Der Chloroformextrakt des Serums wird auf einer 1,5×25 cm Sephadex® LH-20-Säule chromatographiert. Als Eluiermittel dient ein 65 : 35- Gemisch aus Chloroform und n-Hexan. Die 24,25-(OH:)₂D₃- Fraktion aus der Sephadex® LH-20-Säule wird danach in einem handelsüblichen Gerät einer Hochdruckflüssig chromatographie unterworfen. Das Chromatographiegerät enthält eine 4,6×250 mm Zorbax Sil®-Säule, Eluiert wird mit 9% Isopropanol in n-Hexan bei einer Strömungs geschwindigkeit von 1 ml/min. Die 25-OH-D₃-26,23-Lacton fraktion wird unter Verwendung desselben Lösungsmittels erneut chromatographiert. Das hierbei erhaltene 23(S), 25(R)-25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton wird durch Hochdruck-Flüssigchromatographie unter Verwendung einer Zorbax Sil®-Säule weitergereinigt. Eluiert wird hierbei mit 1,5% Methanol in Dichlormethan bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min.

B) Herstellung von 23(S),25(R)-1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton

Ein 10 kg schwerer Beagle-Rüde erhält oral 2 mg 1α- Hydroxyvitamin-D₃ in 20 ml einer 0,2igen Triton X-100®- Lösung. Acht Stunden nach der Verabreichung wird der Hund mit 5-Ethyl-5-(1-methylbutyl)-barbitursäure betäubt. Danach wird ihm aus der Kopfschlagader Blut abgenommen. Die aus dem Blut gewonnenen 600 ml Serum werden mit demselben Volumen Wasser verdünnt und danach mit 2 Volumina eines 1 : 1-Chloroform/Methanol-Gemischs extrahiert. Der erhaltene Serumextrakt wird auf einer 1,5×25 cm Sephadex® LH-20-Säule chromatographiert. Eluiert wird mit einem 75 : 23 : 2-Gemisch aus Chloroform, n-Hexan und Methanol. Die aus der Sephadex® LH-20-Säule gewonnene 1α,24,25-Trihydroxyvitamin-D₃-Fraktion wird unter Verwendung einer Zorbax Sil®-Säule einer Hochdruck- Flüssigchromatographie unterworfen. Eluiert wird mit 3,5% Methanol in Dichlormethan bei einer Strömungsge schwindigkeit von 1 ml/mm. Die 1α,25-Dihydroxyvitamin- D₃-26,23-lactonfraktion aus der Hochdruck-Flüssig chromatographie wird unter denselben Bedingungen erneut einer Hochdruck-Flüssigchromatographie unterworfen. Das hierbei erhaltene 23(S),25(R)-1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃- 26,23-lacton wird unter Verwendung einer Zorbax Sil®-Säule durch Hochdruck-Flüssigchromatographie weitergereinigt. Eluiert wird mit 18% Isopropanol in n-Hexan bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min.

C) Herstellung von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-peroxylacton

1. Männliche, entwöhnte Wistar-Ratten werden 8 Wochen lang ad libitum mit normalem, vitamin-D₃-haltigem Futter (Ca: 1,0%; P: 1,0%; Vitamin-D₃: 2000 IU/kg) gefüttert. Danach erhalten die 300 Ratten eine intramuskuläre Gabe von 4×10⁵ IU Vitamin-D₃ in 100 µl Ethanol. Drei Tage später erhalten sie eine neue intramuskuläre Gabe von 4×10⁵ IU Vitamin-D₃ in 100 µl Ethanol. Drei Tage nach der zweiten Dosis werden die Ratten mit Ether betäubt. Danach wird ihnen aus der Bauchaorta Blut abgenommen. Das Blut wird sofort zentrifugiert, wobei 1200 ml Serim erhalten werden. Die 1200 ml Serum werden mit demselben Volumen Wasser verdünnt, worauf das Ganze 30 min lang mit 2 Volumina eines 1 : 1-Chloroform/Methanol- Gemischs extrahiert wird. Nach dem Eindampfen der Chloroformphase wird der Verdampfungsrückstand durch Ethanolazeotropie getrocknet und einer Chromato graphie unterworfen. Der Chloroformextrakt der Serum probe wird auf einer 1,5×25 cm Sephadex® LH-20-Säule chromatographiert. Eluiert wird mit einem 65 : 35- Chloroform/n-Hexan-Gemisch.

Die 24,25-Dihydroxyvitamin-D₃-Fraktionen aus der Säule werden getrennt gesammelt und eingeengt. Danach wird die 24,25-Dihydroxyvitamin-D₃-Fraktion mittels eines handelsüblichen Geräts mit 4,6×250 mm Zorbax Sil®- Säule einer Hochdruck-Flüssigchromatographie unter worfen. Eluiert wird mit 9% Isopropanol in n-Hexan bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min.

Das Eluat wird kontinuierlich durch UV-Absorptions spektralphotometrie bei 264 nm überwacht. Die Eluat teile mit UV-Absorptionspeaks werden getrennt aufge fangen. Der Haupt-UV-Absorptionspeak des Eluats zwischen 25-OH-D₃ und 24,25-(OH)₂D₃ zeigt ein UV- Absorptionsspektrum des typischen Vitamin-D-cis- trien-Absorptionsmaximum bei 264 nm und ein Minimum bei 228 nm. Diese Fraktion wird mittels einer 4,6×250 mm Zorbax Sil®-Säule einer Hochdruck- Flüssigchromatographie unterworfen. Eluiert wird mit 1,5% Methanol in Dichlormethan bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min. Das erhaltene 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-peroxylacton wird sofort nach der Eluierlage von 25-OH-D₃ eluiert. Dieser Metabolit wird mittels einer Zorbax Sil®-Säule durch Hochdruck-Flüssigchromatographie weitergereinigt. Eluiert wird hierbei mit 9% Isopropanol in n-Hexan bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min. Es wird unmittelbar vor der Eluierlage von 23(S),25(R)- 25-OH-D₃-26,23-Lacton oder 24,25(OH)₂D₃ eluiert.

2. Die spektralen Daten der erhaltenen Verbindungen sind:

a) UV-Spektrum:
λ_max: 264 nm
λ_min: 228 nm
b) Massenspektrum (m/e): 412, 400, 372, 354, 339, 313, 271, 253, 136, 118.
c) FD-Massenspektrum: Molekularionenpeak: 444
d) Fourier-Übergangsinfrarotspektrum (FT-IR- Spektrum: Ein spezifischer Peak tritt bei 1733 cm^-1 auf. Er entspricht der Absorption eines δ-Lactons.

Die Ergebnisse bestätigen, daß es sich bei der erhaltenen Verbindung um 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- peroxalacton handelt.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1 Pharmakologische Wirkungen von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactonen 1. Einfluß von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactonen auf den intestinalen Calciumtransport und die Serumcalciumkonzentration

a) Männliche, entwöhnte Wistar-Ratten werden 6 Wochen lang ad libitum mit einer Vitamin-D₃-Mangeldiät niedrigen Calciumgehalts gefüttert. Nach 6 Wochen erhalten die jeweils etwa 100 g wiegenden fünf Ratten eine intravenöse Gabe von 500 ng des gemäß erhaltenden 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- lactons, 250 ng 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃ und 500 ng 25-Hydroxyvitamin-D₃, jeweils gelöst in 0,2 ml 0,2%iger Triton X-100®-Lösung. Nach Tötung der Ratten werden der intestinale Calciumtransport und die Serumcalciumkonzentration bestimmt. Der intestinale Calciumtransport wird entsprechend De Luca und Mit arbeitern in "Am. J. Physiol.", Band 216, Seiten 1351-1359 (1969) bestimmt. Die Ermittlung der Serumcalciumkonzentration erfolgt nach der OCPC- Methode in "Am. J. Chlin. Pathol.", Band 45, Seiten 290-296 (1966).

Die Meßergebnisse bezüglich des intestinalen Calcium transports sind in Fig. 1 und bezüglich der Serum calciumkonzentration in Fig. 2 graphisch dargestellt.

b) Derselbe Versuch, wie unter a) beschrieben, wird mit 125 ng des gemäß B) erhaltenen 1α,25- Dihydroxyvitamin-D₃-25,23-lactons und 125 ng 1α,25- Dihydroxyvitamin-D₃ durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 und 4 graphisch dargestellt.

c) Dieselben Versuche, wie unter a) beschrieben, werden mit 125 ng des gemäß C) erhaltenen 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-peroxylactons und 125 ng 1α,25- Dihydroxyvitamin-D₃ durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 und 6 graphisch dargestellt.

Die Fig. 1, 3 und 5 zeigen, daß die erfindungs gemäß einsetzbaren 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- lactone den intestinalen Calciumtransport schwach stimulieren.

Die Fig. 2, 4 und 6 zeigen, daß die erfindungs gemäß einsetzbaren 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- lactone den Serumcalciumspiegel senken.

2. Dosis-Ansprechverhältnis zwischen 25-OH-D₃-26,23- lactonen und dem intestinalen Calciumtransport bzw. Serumcalciumspiegel

a) Sechs Wochen nach der Fütterung mit einer Vitamin-D- Mangeldiät niedrigen Calciumgehalts werden die Ratten in Gruppen zu drei bzw. fünf eingeordnet. Jede Ratte erhält dann eine einzige intravenöse Gabe von 25-OH-D₃-26,23-Lacton in 0,2 ml einer 0,2%igen Triton X-100®-Lösung. Vergleichsratten erhalten lediglich eine Gabe des Trägers. 8 bzw. 24 h später werden die Ratten geköpft, worauf in der geschilderten Weise der intestinale Calciumtransport und die Serumcalciumkonzentration ermittelt werden. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle I. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.E.M. ange geben. Signifikant unterschiedlich von den Ver gleichsversuchen: a;p<0,05, b;p<0,01 und c;p<0,001.

Tabelle I

b) Derselbe Versuch, wie unter a) beschrieben, wird mit 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton durch geführt. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle II.

Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.E.M. darge stellt. Signifikant unterschiedlich von den Ver gleichsversuchen: a;b<0,05, b;b<0,01 und c;b<0,001.

Tabelle II

Die Tabellen I und II zeigen, daß diejenige Dosis eines erfindungsgemäßen 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23- lactons, die den intestinalen Calciumtransport stimuliert, den Serumcalciumspiegel senkt.

3. Einfluß von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactonen auf 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃

a) Mit einem einen niedrigen Calciumgehalt aufweisenden Vitamin-D₃-Mangelfutter gefütterte Ratten werden in vier Gruppen zu je fünf Ratten eingeteilt.

Danach erhalten sie eine erste intravenöse Gabe von 500 ng 25-OH-D₃-26,23-Lacton in 0,2 ml 0,2%iger Triton X-100®-Lösung bzw. lediglich den Träger. 8 h später erhalten sie auf demselben Verabreichungs weg eine zweite Dosis von 250 ng 1α,25-(OH)₂D₃ in 0,2 ml 0,2%iger Triton X-100®-Lösung bzw. lediglich den Träger. 15 h nach der zweiten Dosis werden die Versuchstiere getötet, worauf in der geschilderten Weise die intestinale Calciumtransportaktivität und die Serumcalciumkonzentration ermittelt werden. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle III. Die Ergebnisse sind als Mittel ± S.E.M. angegeben. Signifikant unterschiedlich von den Vergleichsver suchen: a;b<0,001.

Tabelle III

b) Sechs Wochen mit einem einen niedrigen Calciumge halt aufweisenden Vitamin-D₃-Mangelfutter gefütterte Ratten werden in vier Gruppen zu jeweils fünf Ratten eingeteilt. Sie erhalten eine erste intra venöse Gabe von 125 ng 1α,25-(OH)₂D₃-26,23-Lacton in 0,2 ml 0,2%iger Triton X-100®-Lösung bzw. ledig lich den Träger. 12 h später erhalten sie auf dem selben Verabreichungsweg eine zweite Gabe von 125 ng 1α,25-(OH)₂D₃ in 0,2 ml 0,2%iger Triton X-100®-Lösung bzw. lediglich den Träger. 12 h nach der zweiten Dosis werden die Versuchstiere getötet, worauf in der geschilderten Weise die intestinale Calcium transportaktivität und die Serumcalciumkonzentration bestimmt werden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt. Die Ergeb nisse sind als Mittelwert ± S.E.M. angegeben. Signifikant unterschiedlich von den Vergleichsversuchen: a;b<0,01 und b;p<0,001.

Tabelle IV

Aus den Tabellen III und IV geht hervor, daß 1α,25- Dihydroxyvitamin-D₃ die Serumcalciumspiegel beträchtlich erhöht. Im Gegensatz dazu senken die erfindungsgemäß einsetzbaren 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactone die Serumcalciumkonzentration erheblich.

Ferner zeigen die Tabellen, daß bei vorheriger Verab reichung von 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton (vor dem 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃) der Anstieg des Serumcalcium spiegels infolge 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-Gabe unter Kontrolle gebracht werden kann.

4. Erhöhung der Calciumausscheidung mit dem Urin durch 1α,25-(OH)₂D₃-26,23-lacton

Männliche, entwöhnte rht-Wistar-Ratten werden sechs Wochen lang mit einem einen niedrigen Calciumgehalt auf weisenden Vitamin-D-Mangelfutter gefüttert. Nach Ligatur der Harnröhre erhält jede der fünf Ratten eine intra venöse Injektion von 125 ng 1α,25-(OH)₂D₃-26,23-Lacton in 0,2 ml 0,2%iger Triton X-100®-Lösung bzw. lediglich den Träger. 24 h später werden die Ratten getötet, worauf aus ihren Blasen der Urin gesammelt wird. Die Bestimmung der Urincalciumkonzentration erfolgt nach der OCPC (O-Cresolphthaleinkomplexon)-Methode. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle V.

Tabelle V

Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.E.M. angegeben. Signifikant unterschiedlich von den Vergleichsversuchen: a;b<0,05 und b;p<0,001.

Aus Tabelle V geht hervor, daß das erfindungsgemäß ein setzbare 1α,25-(OH)₂D₃-26,23-Lacton die Calciumaus scheidung mit dem Urin erhöht.

Beispiel 2 Zubereitung von Weichgelatinekapseln

1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton wird in einer solchen Menge in einem Fettöl gelöst, daß eine ölige Lösung einer Konzentration von 7 µg/ml erhalten wird. Die Kapselhülle besteht aus 100 Gew.-Teilen Gelatine, 20 Gew.-Teilen Glycerin, 0,2 Gew.-Teil Ethylpara hydroxybenzoat, 0,2 Gew.-Teil Propylparahydroxybenzoat, 0,5 Gew.-Teil 1-Parasulfonylazo-2-naphthol-6-sulfon säure, Dinatriumsalz und 80 Gew.-Teilen gereinigten Wassers. Das Ganze wird durch Erwärmen aufgeschmolzen und zu Kapseln verarbeitet. Unter Verwendung der auf einer Kapselmaschine hergestellten Kapseln werden Weichgelatinekapseln mit jeweils 1 µg 1α,25-Dihydroxy vitamin-D₃-26,23-lacton hergestellt.

Claims

1. Arzneimittel zur Senkung der Serumcalciumkonzen tration bei Warmblütern, dadurch gekennzeichnet, daß es gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Streckmittel eine pharmazeutisch wirksame Menge mindestens eines 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lactons der Formel: worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyl gruppe darstellt und X für -O- oder -O-O- steht, enthält.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton enthält.

3. Arzneimittel nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es 23(S),25(R)-1α-25-Dihydroxyvitamin-D₃- 26,23-lacton enthält.

4. Arzneimittel nach einem oder mehreren der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer Dosiereinheit für das 25-Hydroxy vitamin-D₃-26,23-lacton vorliegt.

5. Arzneimittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer oral zu verabreichenden Dosiereinheit vorliegt.

6. Arzneimittel nach einem oder mehreren der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,25 bis 2 µg 25-Hydroxyvitamin-D₃-26,23-lacton enthält.