CH641352A5 - 15-(hydroxy-, acyloxy- oder oxo-)steroide enthaltende mittel zur hemmung der biosynthese der mevalonsaeure. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Mittel, welche bestimmte in 15-Stellung oxygenierte Steroide als 5 Wirkstoff enthalten und zur Hemmung der Biosynthese der Mevalonsäure, einschliesslich aller Effekte, die durch die Hemmung der Biosynthese der Mevalonsäure erzielt werden, verwendet werden sollen. Zu diesen Effekten gehören die Unterdrückung der Biosynthese von Sterinen und die da-lo durch verursachte Senkung des Serumcholesterinspiegels bei Menschen und Tieren sowie die Hemmung des Wachstums von Mikroorganismen und Zellen. Die erwähnten Wirkstoffe bewirken auch eine Zügelung des Appetits; man nimmt an, dass dieser Effekt mit ihrer Hemmwirkung auf die Bio-i5 synthese der Mevalonsäure und von daraus abgeleiteten Produkten, insbesondere von Cholesterin, zusammenhängt.

In manchen Fällen ist das Unterdrücken der Biosynthese von Sterinen entweder in vivo oder in vitro wünschenswert. So ist es häufig wünschenswert, die Bildung des Chole-20 Sterins bei Menschen und bei Tieren zu unterdrücken, wodurch der Serumcholesterinspiegel bei Mensch und Tier gesenkt wird.

Die Konzentration des Cholesterins im Blutserum geht mit einer Anzahl von Krankheiten, insbesondere der Arterio-25 sklerose einher. Die Arteriosklerose ist ein Zustand, bei welchem sich im Arteriensystem eine Plaquebildung bildet. Cholesterin und Cholesterinester sind die hauptsächlichsten Komponenten dieser Plaque. Obgleich die Herkunft dieser Krankheit nicht vollständig erkannt ist, nimmt man an, dass 30 ein erhöhter Serumcholesterinspiegel die Entwicklung und das Fortschreiten der Arteriosklerose begünstigt.

Das Cholesterin bei Mensch und Säugetieren hängt von zwei Quellen ab, nämlich von der Aufnahme und Absorption des Cholesterins aus der Nahrung und zweitens von der 35 Biosynthese des Cholesterins aus Acetaten durch Zellen verschiedener Organe des Körpers, wie z.B. der Leber, des Darmes und der Haut. Die Biosynthese des Cholesterins und anderer Sterine aus Acetat im Körper erfolgt durch eine komplexe Reihenfolge von Reaktionen, wobei eine dieser 40 Reaktionen die Überführung des 3-Hydroxy-3-methylglutaryl--Coenzyms A in Mevalonsäure ist. Diese Reaktion wird als Hauptsteuerungsstufe in der normalen Biosynthese des Cholesterins in den Zellen angesehen. Liesse sich die Biosynthese der Mevalonsäure in vivo verhindern, so liessen 45 sich auch das Auftreten von Sterinen und demzufolge der Serumcholesterinspiegel senken.

In der britischen Patentschrift Nr. 860 303 werden gewisse Aryloxycarbonsäureester, z.B. der Methylester der 2-(4'-Chlorphenoxy)-isobuttersäure, zur Senkung des Blut-50 Cholesterinspiegels vorgeschlagen. Diese Verbindung hat bei der klinischen Behandlung von Menschen eine gewisse Bedeutung erlangt, doch ist sie wegen verschiedener Gründe nicht so wirksam, wie dies gewünscht wird. Daher sind wirksamere Verbindungen zur Unterdrückung der Serumchole-55 sterinspiegel von grösstem Interesse und Wichtigkeit.

Obesität ist ebenfalls ein ernstes Problem in der Heilkunde. Ein Zusammenhang zwischen dem Übergewicht und einer gewissen Zahl von Krankheiten, insbesondere cardio-vaskuläre Erkrankungen, ist bestens bekannt. Viele Leute 60 finden es oft aus phychologischen oder anderen Gründen schwierig oder unmöglich, eine Diät zur Regulierung oder zur Senkung des Körpergewichtes einzuhalten. Aus diesem Grunde werden Techniken für das richtige und wirksame Zügeln des Appetits immer mehr benötigt.

65 Es wurde festgestellt, dass gewisse in 15-Stellung oxygenierte Steroide, von welchen manche neue Verbindungen darstellen, die Biosynthese der Mevalonsäure und von Sterinen wirksam hemmen. Mehrere wünschenswerte Wirkungen

3

641352

ergeben sich aus der Hemmung der Biosynthese der Mevalonsäure, einschliesslich das Unterdrücken der Bildung des Cholesterins bei Menschen und Tieren, so dass der Serumcholesterinspiegel gesenkt werden kann.

Überdies weiss man, dass das Wachsen und die Wucherung von Zellen höherer Organismen und gewisser Mikroorganismen, wie z.B. Hefe und Pilze, die Bildung von Sterinen begünstigen. Demgemäss ist die Hemmung der Biosynthese von Mevalonsäure und infolgedessen eine Verringerung der Sterinebildung wirksam bezüglich des Hemmes des Wachstums von sowohl normalen Zellen als auch von Tumorzellen. Überdies bewirkt die Hemmung der biologischen Synthese von Sterinen eine Hemmung des Wachstums gewisser Mikroorganismen, wodurch Pilz- und Hefeinfektionen bekämpft werden können.

Zusätzlich ihrer Rolle in der Sterinbiosynthese stellt die Mevalonsäure einen wichtigen Vorläufer verschiedener anderer wichtiger Bestandteile der Zellen dar. Wenngleich man im allgemeinen annimmt, dass Bakterien keine Sterine enthalten oder keine Sterine benötigen, erfordern ihr Wachstum und ihre Proliferation die Synthese der Mevalonsäure und von sich davon ableitenden Produkten. Demzufolge dürfte eine Hemmung der Mevalonsäure-Biosynthese ein bakterielles Wachstum verhindern.

Es wurde ferner festgestellt, dass in 15-Stellung oxyge-nierte Steroide und ihre Derivate ausgezeichnete Appetitzügler sind. Wenngleich man den Mechanismus, mit welchem die in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituen-ten tragenden Sterine den Appetit zu zügeln vermögen, nicht kennt, darf man annehmen, dass diese Wirkung in gewissem Masse mit der Mevalonsäure oder mit der die Sterinbiosynthese hemmenden Wirkung der erwähnten Steroide in Verbindung steht.

Gegenstand der Erfindung ist also ein Mittel zur Hemmung der Biosynthese der Mevalonsäure, welches als Wirkstoff mindestens ein Sterin der folgenden Formel:

enthält, deren Grundgerüst gesättigt oder ungesättigt ist und worin

0 0 0

Il II II

-OH, =0, -OR4, -OCR5, -OC(CH2)„COH,

eine Sulfatgruppe oder das Magnesium-, Natrium-, Kaliumoder Pyridiniumsalz einer Sulfatgruppe bedeutet;

O

II

R2 -OH, =0 oder -OCR5 bedeutet;

R3 a-Wasserstoff, ß-Wasserstoff oder eine a-Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet oder R3 fehlt, wenn eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 8 und 14 vorliegt;

R6 ein oder zwei Wasserstoff atome, je nach dem Sättigungsgrad des Grundgerüstes oder =0 oder -OH bedeutet;

R4 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffato-men, bedeutet, R5 eine aliphatische Gruppe mit 1 bis 20

Kohlenstoffatomen, eine substituierte aliphatische Gruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe bedeutet und n eine ganze Zahl von 2 bis 6, vorzugsweise von 2 bis 4, bedeutet.

5 Das Grundgerüst kann gesättigt oder ungesättigt sein; vorzugsweise ist eine Doppelbindung entweder zwischen den Kohlenstoffatomen 7 und 8 oder zwischen den Kohlenstoffatomen 8 und 14 vorhanden. Wenn eine Doppelbindung zwischen den Substituenten 8 und 14 vorhanden- ist, fehlt io natürlich R3. Wenn es möglich ist, dass die Substituenten Rt und R2 in mehr als einer räumlichen Lage vorliegen, können sie entweder in der a- oder in der ß-Stellung vorliegen. Von den Verbindungen der Formel 1 sind diejenigen neu, bei denen, falls eine Doppelbindung zwischen den Kohlen-15 Stoffatomen 8 und 14 vorhanden ist und Ri Hydroxyl bedeutet, R, nicht Hydroxyl bedeutet; falls R3 a-Methyl und Ri Hydroxyl bedeuten, R2 nicht Hydroxyl bedeutet; falls R3 a-Methyl und R4 Methoxy bedeuten, R2 nicht Oxo oder Hydroxyl bedeutet; und falls Rj und R2 Hydroxyl bedeuten, 20 keine Hydroxylgruppe an das Kohlenstoffatom 7 gebunden ist.

Das Mittel gemäss vorliegender Erfindung wird vorzugsweise in der Form von pharmazeutischen Präparaten dargeboten; diese Präparate enthalten einen pharmazeutisch un-25 bedenklichen Träger in Kombination mit einer nichttoxischen aber wirksamen Menge eines Steroids der Formel I. Diese pharmazeutischen Präparate können verwendet werden, um die Biosynthese der Mevalonsäure und die durch die Hemmung der Biosynthese der Sterine bedingten Effekte zu hem-30 men, z.B. um das Zellwachstum zu hemmen und den Serumcholesterinspiegel zu senken. Diese pharmazeutischen Präparate können auch zur Appetitzügelung verwendet werden.

Die Steroide der Formel I können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Nützliche Zwischenprodukte für die Her-35 Stellung der Sterine der Formel I sind 3ß-Benzoloxyverbin-

50 Diese 3 ß-BenzoyloxyVerbindungen können durch Hydrolyse in entsprechende 3 ß-HydroxyVerbindungen übergeführt werden. Die Reduktion, z.B. mit Lithiumaluminiumhydrid, ergibt 3ß,15-Diole.

Ein weiteres nützliches Zwischenprodukt bei der Herstel-55 lung der Sterine der Formel I sind 3ß-Benzoyloxy-14a,l5a--epoxyverbindungen der Formel:

641352

Diese Verbindungen können mit einem Reduktionsmittel umgesetzt werden, um die entsprechenden 3ß,15a-Diole herzustellen.

Die Steroide der Formel I können entweder als solche oder in Darreichungsformen in Kombination mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern verabreicht werden. Geeignete Darreichungsformen hängen etwas von dem speziellen Effekt ab, den man zu erzielen wünscht.

Typische Darreichungsformen für die orale Verabreichung sind Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulate und Lösungen. Andere Darreichungsformen sind für die sublinguale und bukkale Verabreichung, die topische Verabreichung und die parenterale Verabreichung, z.B. subkutan, intramuskulär oder intravenös, geeignete Präparate.

Gewünschtenfalls können die Steroide der Formel I bequem zu Dosiseinheiten verarbeitet werden, die sich für die spezielle Verabreichungsart eignen, wobei der Wirkstoffgehalt jeder Dosierungseinheit derart ist, dass eine oder mehrere Einheiten für jede therapeutische Verabreichung erforderlich sind. Jede Dosierungseinheit enthält vorzugsweise ca. 5 bis ca. 1000 mg Sterin der Formel I.

Die zur Erzielung eines gewünschten Effektes erforderliche Dosis der Steroide der Formel I ist innerhalb eines weiten Bereiches variabel und hängt etwas von der Art des speziellen verabreichten Steroids, dem gewünschten Effekt und der Art der Verabreichung ab. Im typischen Falle beträgt eine geeignete Dosierung ca. 0,1 bis ca. 140 mg Steroid der Formel I pro kg Körpergewicht und pro Tag. Im typischen Falle würde eine geeignete Dosis einmal bis viermal täglich verabreicht.

Geeignete pharmazeutische Träger, die zur Formulierung von Darreichungseinheiten verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Wenn das Steroid der Formel I z.B. in Form eines festen Präparates, wie einer Tablette, verabreicht werden soll, kann es mit einem pharmazeutischen Träger, wie Gelatine, Stärke, Lactose, Magne-siumstearat, Talkum, Gummiarabikum oder dgl., gemischt werden. Tabletten können unter Anwendung bekannter Verfahren mit Saccharose oder mit anderen Mitteln überzogen werden, um den Zerfall im Magen zu verzögern und somit eine protrahierte Wirkung während eines ausgedehnten Zeitraumes zu erzielen.

Kapselpräparate können erhalten werden, indem man die aktiven Steroide der Formel I mit einem inerten pharmazeutischen Füllstoff oder Verdünnungsmittel mischt und das resultierende Gemisch in eine harte Gelatinekapsel oder in eine weiche Kapsel füllt. Ein Sirup- oder Elixierpräparat kann die Verbindungen der Formel I zusammen mit einem Süssungsmittel, wie Saccharose, antiseptischen Verbindungen und/oder geeigneten Färbungsmitteln enthalten.

Präparate für die topische Anwendung können hergestellt werden, indem man die Verbindungen der Formel I mit geeigneten Salbengrundlagen vermischt. Im typischen Falle bestehen derartige Grundlagen aus Polyvinylalkohol, wachsartigem Polyäthylenglycol usw. oder anderen nichttoxischen lipophilen Mitteln oder Trägern.

Eine Flüssigkeit für die parenterale Verabreichung kann hergestellt werden, indem man den Wirkstoff in einem sterilen flüssigen Träger, wie Wasser oder Kochsalzlösung, ein nicht flüchtiges flüssiges Polyäthylenglycol oder ein Öl von pflanzlichem oder tierischem Ursprung, z.B. Dorschlebertran, Olivenöl usw., löst oder suspendiert. Flüssigkeiten für die parenterale Verabreichung können vorteilhaft auch bekannte Gleitmittel, Bakterizide und Fungizide, den Tonus einstellende Mittel, Lokalanästhetika, Stabilisatoren usw. enthalten.

Der Mechanismus, nach dem die Verbindungen der Formel I wirken, ist nicht ganz verständlich. Es wurde jedoch gezeigt, dass die aktiven Vebindungen die Biosynthese der Sterine aus Acetat hemmen, die Biosynthese der Sterine aus Mevalonsäure aber nicht hemmen. Da Mevalonsäure ein notwendiges Zwischenprodukt in dem biochemischen Prozess, mittels dessen Sterine aus Acetaten gebildet werden, darstellt, ist es klar, dass die Steroide der Formel I die Mevalon-säurebildung hemmen.

Es ist bekannt, dass eine Stufe in der Biosynthese der Sterine aus Acetat aus der Überführung von 3-Hydroxy-3--methylglutaryl-coenzym A (HMG-CoA) in Mevalonsäure besteht. Die Geschwindigkeit dieser Reaktion wird durch das Enzym HMG-CoA-Reduktase gesteuert. Es wird angenommen, dass die Steroide der Formel I wirken, indem sie die HMG-CoA-Reduktase in irgendeiner Weise beeinflussen, entweder durch Herabsetzung ihrer Aktivität oder durch Beschränkung ihrer Konzentration in dem System durch Zerstörung oder Unterdrückung ihrer Bildung.

Sich dauernd vermehrende Zellen, wie diejenigen der Epidermis, des sich entwickelnden Gehirns, der Vertiefungen der Darmschleimhaut und der spontanen Tumoren, synthetisieren Cholesterin mit relativ hoher Geschwindigkeit in vivo. Zellen in der Interphase, wie diejenigen der Muskeln und des reifen Gehirns, tun dies nicht. Tests mit gezüchteten Zellen beweisen, dass für die Zellteilung in vitro ebenfalls eine Cholesterinsynthese erforderlich ist. Demge-mäss beeinflusst die Hemmung der Cholesterinbildung durch Blockierung der Biosynthese von Mevalonsäure die Vermehrung in vivo von Zellen, die normalerweise in einem sich vermehrenden Zustand vorliegen. Natürlich hat die Unterdrückung der Cholesterinbildung durch Blockierung der Biosynthese von Mevalonsäure auch die Wirkung, dass der Serumcholesterinspiegel gesenkt wird.

Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugt Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, einschliesslich bevorzugte Ausführungsformen von Techniken für die Synthese von verschiedenen wirksamen, in 15-Stellung oxyge-nierten Steroiden. Die folgenden Beispiele erläutern auch die Wirkung solcher Steroide zur Hemmung der Biosynthese von Sterinen, einschliesslich der Hemmung bei Ratten in vivo unter Erzielung einer Verringerung des Serumcholesterin-spiegels. Diese Beispiele sind keineswegs einschränkender Natur, sondern mögen lediglich die verschiedenen Merkmale der vorliegenden Erfindung erläutern.

Herstellung der Wirkstoffe Beispiel 1

Herstellung von 5cc-Cholest-8(14)-en-3$-ol-15-on

3ß-Benzyloxy-5a-cholest-8(14)-en-15-on wurde nach den Angaben von Knight et al., J. Biol. Chem. Bd. 241, S. 1502 (1966) hergestellt. Die Schmelzpunktsbestimmung, das Infrarotspektrum, die Elementaranalyse und das Massenspektrum des Produktes bestätigten dessen Struktur. Das Produkt zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographieanalyse in drei verschiedenen Systemen.

1,0 g 3ß-Benzoyloxy-5a-cholest-8(14)-en-15-on wurden in 350 ml Äthanol gelöst. Dann wurden nacheinander 20 ml Wasser und 60 ml konzentrierte Schwefelsäure hinzugegeben und das erhaltene Gemisch während 12 Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt, hernach gekühlt, unter vermindertem Druck auf die Hälfte des Volumens eingeengt und mit einer 0,5 molaren Natriumchloridlösung (1000 ml) verdünnt. Der entstandene Niederschlag wurde gesammelt und zweimal aus einer Mischung von Aceton, Methanol und Wasser umkristallisiert.

Die Kristalle wurden in Aceton gelöst und in Gegenwart von Norit A während 15 Minuten erwärmt. Dann wurde

4.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

641352

die Lösung durch Hyflo Super-Cel (Johns-Manville Corp.) filtriert und das Super-Cel mit Methanol (doppeltes Volumen des Acetons) gewaschen. Die Aceton- und Methanollösungen wurden vereinigt und nach der Zugabe von Wasser erhielt man 660 mg (83 % Ausbeute) eines kristallinen Produktes, das gesammelt und im Vakuum getrocknet wurde. Das Produkt war das 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on der folgenden Formel:

Die Struktur dieses Produktes wurde durch Infrarotspektrum (I.R.), Ultraviolettspektrum-(U.V), magnetische Kern-resonanzspektrum-(N.M.R.) und Massenspektrum-(m.s.)-Ana-lysen bestätigt. Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographieanalyse auf Kieselgel-G-Platten unter Verwendung von Lösungsmittelsystemen, welche 10% Äther in Benzol und 35% Äthylacetat in Chloroform enthielten.

Beispiel 2

Herstellung von 5a.-Cholest-8(14)-en-3$,15-diolen

3,97 mMol 3ß-Benzoyloxy-cholest-8(14)-en-15-on in 104 ml Äther wurden mit 16 mMol Lithiumaluminiumhydrid während 2 Stunden bei Zimmertemperatur reduziert. Das überschüssige Reaktionsmittel wurde durch überschüssige Zugabe von Äthylacetat, einer gesättigten Amomniumchlorid-lösung und Wasser zersetzt. Durch Extraktion mit Äther erhielt man 2,6 g eines Materials, welches über einer aktivierten Kieselsäuresäule (75 X 3 cm) chromatographiert wurde.

Unter Verwendung einer Mischung von Benzol und Äther (Mischungsverhältnis 90:10) als Eluiermittel wurden Fraktionen von 25 ml Volumen gesammelt. 672 mg eines epimeren Diols, als Diol A bezeichnet, eluierte in den Fraktionen 250 bis 375. Nach viermaligem Umkristallisieren aus einer Mischung von Aceton und Wasser konnte eine Komponente bei der Dünnschichtchromatographieanalyse in drei verschiedenen Systemen beobachtet werden. 930 mg eines zweiten epimeren Diols, als Diol B bezeichnet, eluierten in den Fraktionen 425 bis 650. Nach dreimaligem Umkristallisieren aus einer Mischung von Aceton und Wasser zeigte die Verbindung eine einzelne Komponente bei der Dünn-schichtchromatographieanalyse in drei verschiedenen Systemen.

Elementar-, IR-, UV-, NMR-, MS- und kristallogra-phische Röntgenstrahlenanalysen bestätigten, dass die Diole A und B die folgende Struktur besitzen, wobei die 15-Hy-droxygruppe des Diols A in der a-Stellung und die 15-Hy-droxygruppe des Diols B in der ß-Stellung vorhanden waren. Die Formel war die folgende:

15 Beispiel 3

Herstellung von 5a,14$-Cholest-7-en-3$,15-diolen

Die Behandlung von 3ß-Benzoyloxy-cholesta-5,7-dien mit HCl-Gas in Chloroform gemäss Angaben von Knight et 2o al., J. Biol. Chem., Bd. 241, S. 1502 (1966) lieferte ein Produkt (Ausbeute 70%), welches bei 148 bis 150°C schmolz und eine Mischung von 2 Isomeren enthielt. Die Analyse mittels magnetischem Kernresonanzspektrum ergab, dass die Probe ungefähr 73% 3ß-Benzoyloxy-5a-cholesta-7,14-dien 25 enthielt.

75 g (148 mMol) dieses Materials wurden in 3000 ml wasserfreiem Äther auf dem Wasserbade unter gelindem Erwärmen gelöst. Die Lösung wurde in ein Eisbad gebracht und auf 18°C abgekühlt, worauf man eine Lösung von 63,6 g 30 m-Chlorperbenzoesäure in 400 ml Äther hinzugab. Das Gemisch wurde unter Rühren während 5 Stunden bei 0°C und hierauf während 24 Stunden bei — 15°C stehengelassen. Dann wurde das ausgefällte Material auf einem Filter gesammelt, mit kaltem Wasser gewaschen und aus einer Mischung 35 von Aceton und Wasser umkristallisiert, wobei man 3ß-Ben-zoyloxy-14a,15a-epoxy-5a-cholest-7-en (40,2 g; 52% Aus-

50 erhielt.

Die Struktur dieser Verbindung liess sich durch Infrarot-, magnetische Kernresonanz- und Massenspektrumanalyse bestätigen. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) über Kieselgel-55 -G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 35 % Äthylacetat in Chloroform und 10% Äther in Benzol).

Das 3ß-Benzoyloxy-14a,15a-epoxy-5a-cholest-7-en (2,0 g; 3,96 mMol) wurde in 20 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Dann versetzte man mit 200 ml trockenem Äther und 60 kühlte die Lösung auf 0°C. Hierauf wurden langsam 20 ml Bortrifluoridätherat eingerührt. Nach dem Stehenlassen während 30 Minuten bei 0°C unter wiederholtem Rühren wurde das Gemisch in Wasser gegossen und gründlich mit Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasser-65 freiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

1.96 g des so erhaltenen Rückstandes wurden über einer Kieselgelsäule unter Verwendung von zunehmenden Kon

641352

6

zentrationen, nämlich 0,5, 7,5 und 10% Äther in Benzol als Eluierlösungsmittel chromatographiert. Fraktionen von je 24 ml (16 Minuten pro Fraktion) wurden gesammelt. Der Inhalt der Fraktionen 70 bis 100 wurde gesammelt und der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand aus einer Mischung von Aceton und Wasser umkristallisiert, wobei man 860 mg 3ß-Benzoyloxy-5a,14ß-cholest-7--en-15-on in einer Ausbeute von 43% erhielt. Die Struktur dieses Zwischenproduktes wurde durch Infrarot-, magnetische, Resonanz- und Massenspektrumanalysen bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei den TLC-Ana-lysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 35% Äthylacetat in Chloroform, 10% Äther in Benzol und Benzol).

Das 3ß-Benzoyloxy-5a, 14ß-cholest-7-en- 15-on (2,33 g; 4,62 mMol) wurde in 150 ml wasserfreiem Äther gelöst und die Lösung mit 2,80 g (73,9 mMol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Das so erhaltene Gemisch wurde während 1 Stundé bei 25°C gerührt. Nach dem Kühlen des Gemisches auf 0°C wurde vorsichtig Eis hinzugegeben, um das überschüssige Hydrid zu zersetzen. Dann wurde das Gemisch in eine 0,34 molare wässrige Natriumchloridlösung gegossen und gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man 1,80 g eines weissen festen Produktes erhielt.

Die präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel PF (1 mm Dicke, Lösungsmittel: 20% Äther in Benzol; zweimal entwickelt) zeigte zwei Komponenten (Rf 0,22 und 0,34). Die Komponente Rt 0,22 wurde mit warmem Chloroform extrahiert, filtriert und aus einer Mischung von Aceton und Wasser umkristallisiert, wobei man 1,51 g 5a,14ß-Cholest-7-en-3ß,15ß-diol in einer Ausbeute von 81 % erhielt.

Die Komponente Rt 0,34 aus der präparativen Dünnschichtchromatographie wurde mit warmem Chloroform eluiert und aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man 167 mg 5a,14ß-Cholest-7-en-3ß,15a-diol (9% Ausbeute).

Beide Verbindungen zeigten eine einzelne Komponente bei den TLC-Analysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 35% Äthylacetat in Chloroform und 10% Äther in Benzol). Die Struktur beider Verbindungen wurde durch kristallographische Röntgenstrahlenmessungen, durch Infrarotspektren, magnetische Kernresonanzspektren und Massenspektren als wie folgt bestätigt:

Beispiel 4

Herstellung von 14a.-Methyl-5a,-cholest-7-en-3$-ol-15-on

3ß-Benzoyloxy- 14a-methyl-5a-cholest-7-en- 15-on wurde gemäss Angaben von Knight et al., J. Biol. Chem., Bd. 241, S. 1502 (1966) hergestellt. 1,00 g (1,92 mMol) dieses Materials in 190 ml Äthanol wurde mit 4,0 g Kaliumhydroxyd in 5 ml Wasser versetzt. Das entstandene Gemisch wurde während 1% Stunden in einer Stickstoffatmosphäre unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Nach dem Einengen des Volumens auf ungefähr die Hälfte des ursprünglichen Volumens 5 wurde das Gemisch in 1000 ml 0,86 molarem Natriumchlorid gegossen und gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der io entstandene Rückstand wird aus einer Mischung von Methan und Äther zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 0,760 g 14a-Methyl-5a-cholest-7-en-3ß-ol-15-on (95% Ausbeute) der folgenden Formel erhielt:

Das Grundgerüst dieser Verbindung wurde durch Infra-30 rot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrumanalysen bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei den Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, 35% Äthylacetat in Chloroform und 10% Äther in 35 Hexan) und bei Gaschromatographieanalysen über 3% OV-1-und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C).

Beispiel 5

40 Herstellung von 14a-Methyl-5a,-cholest-7-en-3$,15-diolen

3ß-Benzoyloxy-14a-methyl-cholest-7-en-15-on wird nach den Angaben von Knight et al., J. Biol. Chem., Bd. 241, S. 1502 (1966) hergestellt. 100 g dieses Materials wurden 45 mit 200 mg Lithiumaluminiumhydrid während 12 Stunden bei Zimmertemperatur reduziert. Das überschüssige Reaktionsmittel wurde durch Zugabe von Äthylacetat zersetzt. Dann wurde Wasser hinzugegeben und das entstandene Gemisch mit Äther extrahiert.

so Der beim Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene, ölige Rückstand wurde über einer aktivierten Kieselsäuresäule der Chromatographie unterworfen. Unter Verwendung einer Mischung von Benzol und Äther im MischunngsVerhältnis von 90:10 als Eluiermittel wurden Fraktionen von 16 ml Volu-55 men gesammelt. 26 mg eines Diols, als Diol A bezeichnet, wurden in den Fraktionen 9 bis 13 eluiert und aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei man 18 mg dieses Produktes erhielt. 46 mg eines zweiten Diols, als Diol B bezeichnet, wurden in den Fraktionen 18 bis 30 eluiert und aus Äthyl-60 acetat umkristallisiert, wobei man 26 mg des Produktes erhielt.

Die Elementaranalyse, das Massenspektrum, das magnetische Kernresonanzspektrum und das kristallographische Röntgenstrahlenspektrum bestätigten, dass die Diole der fol-65 genden Strukturformel entsprachen und zwar mit der 15-Hy-droxylgruppe des Diols A in der ß-Stellung und der 15-Hy-droxylgruppe des Diols B in der a-Stellung. Die Strukturformel war die folgende:

7

641352

CH.

HO

Beispiel 6

Herstellung von 14a,-Äthyl-5a,-cholest-7-en-3ß-ol-15-on und 3ß-Äthoxy-14a-äthyl-5a-cholest-7-en-15-on

10,0 g (24,9 mMol) 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on, hergestellt nach den Angaben von Beispiel 1, wurden in eine Lösung von Kalium-tert.-butoxyd, hergestellt durch Lösen von 17,3 g metallischem Kalium in 819 ml tert.-Butyl-alkohol, eingerührt. Dann wurden dem Reaktionsgemisch in einer Portion 127,4 ml Äthyljodid hinzugegeben und das Ganze während 1,75 Stundenweiter gerührt. Das Volumen des Reaktionsgemisches wurde hierauf unter vermindertem Druck auf ungefähr y3 des ursprünglichen Volumens eingeengt. Dann wurde Wasser hinzugegeben und das erhaltene Gemisch gründlich mit Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der entstandene Rückstand wurde einem mittleren Druck von 4,2 kg/cm2 (60 p.s.i.) unterworfen und unter Verwendung einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm)-Säule (100 cm X 2,5 cm) flüssig chromatographiert. Unter Verwendung von 10%igem Äther in Benzol als Eluiermittel wurden Fraktionen von 20 ml Volumen (Fliessgeschwindigkeit: 5 ml pro Minute) gesammelt.

Der Inhalt der Fraktionen 75 bis 88 wurde gesammelt und, nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck, dieses Material aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man 4,5 g 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-3ß--ol-15-on (42,2% Ausbeute) der folgenden Strukturformel:

HO'

Die Struktur dieser Verbindung wurde durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographie über Kieselgel-G-Platten unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, welches 10% Äther in Benzol und 35% Äthylacetat in Chloroform aufwies. Das gleiche galt bei der Gas-Flüssigkeitschromatographieanalyse über 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 250°C).

Der Inhalt der Fraktionen 25 bis 29 aus der unter mittlerem Druck erfolgten Kieselgelsäulenchromatographie wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man 2,1 g 3ß-Äthoxy-14a-äthyl-5a-cholest-7-en-15-on (Ausbeute 18,5%) der folgenden Strukturformel:

Die Struktur dieses Produktes wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschicht- und Gaschromatographie bei Anwendung der oben im Zusammenhang mit dem 3ß-Äthoxy-14a-äthyl-5a--cholest-7-en-15-on beschriebenen Techniken.

Beispiel 7

Herstellung von Bis-3ß,15oi-acetoxy-14a.-äthyl-5a-cholest-7-en und 3ß-Acetoxy-14a,-äthyl-5u-cholest-7-en-15ß-ol

2,0 g (4,6 mMol) 14a-Äthyl-5«-cholest-7-en-3ß-ol-15-on, hergestellt nach den Angaben von Beispiel 6, in 300 ml Äther wurden mit 3,0 g (79,1 mMol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt und dann vorsichtig mit Eis versetzt, um das nicht umgesetzte Hydrid zu zersetzen. Das so erhaltene Gemisch wurde dann in eine O,34n-Natriumchloridlösung gegossen und gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. 1,92 g dieses Rückstandes wurden aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 1,89 g (94,5% Ausbeute) eines weissen festen Produktes erhielt.

Das kristallisierte Material wurde bei einem mittleren Druck von 7 kg/cm2 (100 p.s.i.) unter Verwendung einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm)-Säule (118 cm X 1,5 cm) flüssig chromatographiert. Unter Verwendung von 10%

Äther in Benzol als Eluiermittel wurden Fraktionen von 20 ml Volumen (Fliessgeschwindigkeit: 5 ml pro Minute) gesammelt. Der Inhalt der Fraktionen 54 bis 78 wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 1,78 g eines weissen festen Materials (89% Ausbeute) vom Schmelzpunkt 171 bis 173°C erhielt. Dieses Material dürfte aus einer Mischung von 14a--Äthyl-5a-cholest-7-en-3ß,15a-diol (70%) und 14a-Äthyl--5a-cholest-7-en-3ß,15ß-diol (30%) bestehen.

Bei der Dünnschichtchromatographieanalyse über Kieselgel-G-Platten unter Verwendung von 3 verschiedenen Lösungsmittelsystemen (10% Äther in Benzol, 20% Äthylacetat in Petroläther und 35 % Äthylacetat in Chloroform) oder bei der Gaschromatographie der freien Sterine über 3% OV-1- bzw. 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C) konnte keine Aufspaltung der beiden Epimeren beobachtet werden.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

641352

8

2,00 g (4,65 mMol) des nach den obigen Angaben erhaltenen epimeren Gemisches in 15 ml Pyridin wurden mit 15 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Nach dem Stehenlassen während 24 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre bei Zimmertemperatur wurde das Gemisch in Wasser gegossen und gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden nacheinander mit Wasser, kalter wässriger 5% iger Salzsäure, 5%iger wässriger Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die erhaltene Ätherlösung wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man 2,34 g eines weissen Rückstandes erhielt.

Dieser weisse Rückstand, welcher zwei hauptsächliche Komponenten und zwei Spurenkomponenten bei der Dünnschichtchromatographieanalyse über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittel: Benzol) zeigte, wurde bei einem mittleren Druck von 4,2 kg/cm2 (60 p.s.i.) der Flüssigkeitschromatographie unterworfen und zwar unter Verwendung einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm)-Säule (100 cm X 2,5 cm). Unter Verwendimg von 1,25 % Äther in Benzol als Eluiermittel wurden Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml (Flüssigkeitsgeschwindigkeit: 5 ml pro Minute) gesammelt.

Der Inhalt der Fraktionen 41 bis 48 wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man 1,31 g Bis-3ß,15a-acet-oxy-14a-äthyl-5a-cholest-7-en (Ausbeute 54,8%) der folgenden Formel:

0-c-ch.

Das Grundgerüst dieses Produktes wurde durch Infra-rot-, magnetische Kernresonanz- und Massenspektrumanaly-sen bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei dünnschichtchromatographischen Analysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Äther in Benzol, 10% Äther in Hexan und 35% Äthylacetat in Chloroform) und bei der Gaschromatographie über 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur 270°C.)

Der Inhalt der Fraktionen 72 bis 90 aus der unter mittlerem Druck durchgeführten Flüssigkeitschromatographie wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 0,46 g 3ß-Acetoxy--14a-äthyl-5a-cholest-7-en-15ß-ol (Ausbeute 20,9%) der fol genden Formel:

oh ch0ch ch-z-c—0

erhielt.

Die Struktur wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographischen Analysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Äther in Benzol, 10% Äther in Hexan und 35% Äthylacetat in Chloroform) sowie bei der . Gas-FIüssig-Chromatographieanalyse über 3% OV-1 und 3 % OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C).

Beispiel 8

Herstellung von 14a.-Äthyl-5u-cholest-7-en-3$,15$-diol

0,50 g (1,06 mMol) 3ß-Acetoxy-14a-äthyl-5a-cholest-7--en-15ß-ol erhalten gemäss Angaben in Beispiel 7, in 50 ml Äther wurden mit 1,00 g (0,97 mMol) Lithiumaluminiumhydrid während 2 Stunden reduziert. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach den für die Gewinnung der 3ß,15--Diolen in Beispiel 7 beschriebenen Massnahmen behandelt, wobei man zu 0,44 g eines weissen festen Produktes gelangte. Nach dem Auskristallisierenlassen der weissen, festen Substanz aus einer Mischung von Aceton und Wasser erhielt man 0,42 g (93% Ausbeute) 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-3ß,15ß--diol. Analysen mittels Infrarotspektrum, magnetischem Kernresonanzspektrum und Massenspektrum bestätigen, dass dieses Produkt die folgende Strukturformel aufweist:

OH

Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol und 35% Äthylacetat in Chloroform) und bei der Gas-Flüssig-Chroma-tographieanalyse des Bis-3ß,15ß-trimethylsiloxyderivats über 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säplentemperatur: 250°C).

Beispiel 9

Herstellung von 3ß-Methoxy-14x-methyl-5a-cholest-7-en--15-on

11,0 g (21,8 mMol) 3ß-Benzoyloxy-5a-cholest-8(14)-en--15-on wurden in eine Lösung von Kalium-tert.-butoxyd, hergestellt durch Lösen von 18,4 g metallischem Kalium in 1000 ml tert.-Butylalkohol, eingerührt. Nach dem Rühren des Gemisches während 15 Minuten bei Zimmertemperatur wurde in einer Portion mit 110 ml Methyljodid versetzt und das Gemisch während weiteren 12 Stunden gerührt. Dann wurde Wasser hinzugegeben und das entstandene Gemisch gründlich mit Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der entstandene Rückstand wurde de/ Chromatographie über einer Aluminiumoxydsäule (400 g; neutrales Aluminiumoxyd, «Grade 1»; 140 cm X 2 cm) unterworfen. Bei Verwendung von Benzol als Eluiermittel wurden Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml (11.5 ml pro Minute) gesammelt.

Der Inhalt der Fraktionen 35 bis 46 wurde gesammelt und der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand aus einer Mi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

641352

schung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 5,63 g (60,3 % Ausbeute) 3ß-Methoxy-

Die Struktur dieser Verbindung wurde durch Infrarot-, magnetische Kernresonanz- und Massenspektrumsanalysen bestätigt. Die Reinheit betrug mehr als 98 % aufgrund der Gas-Flüssig-Chromatographieanalyse über 3 % OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 250°C). Überdies zeigte die Verbindung eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, 10% Äther in Hexan, 35% Äthylacetat in Chloroform und 20% Äthylacetat in Petroläther).

Der Inhalt der Fraktionen 10 bis 16 wurde gesammelt und der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand aus einer Mischung von Chloroform und Methanol zum Auskristallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man 1,65 g 3ß-Benzoyloxy--14a-methyl-5a-cholest-7-en-15-on (14,6% Ausbeute). Das Produkt zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Äther in Benzol und 10% Äther in Hexan).

Beispiel 10

Herstellung von 3$-Methoxy-14<a-methyl-5a.-cholest-7-en--2Jß-o/ und 3$-Methoxy-14a-methyl-5a-cholest-7-en-15a,-ol

2,0 g (52,7 mMol) Lithiumaluminiumhydrid wurden zu einer Lösung von 1,0 g (2,33 mMol) 3ß-Methoxy-14a-me-thyl-5a-cholest-7-en-15-on in 100 ml Äther hinzugegeben. Nach lstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt und dann langsam und vorsichtig mit Eis versetzt, um das nicht umgesetzte Hydrid zu zersetzen. Das so erhaltene Gemisch wurde dann in 300 ml einer O,34n-Natriumchloridlösung gegossen und anschliessend gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man 0,95 g eines farblosen Glases erhielt. Dieses Material wurde der präparativen Dünnschichtchromatographie über Kieselgel--PF-Platten (1 mm dick; Lösungsmittelsystem: 10% Äther in Benzol) unterworfen. Zwei Komponenten von R£ 0j36 und 0,24 wurden festgestellt.

Die weniger polare Komponente (Rf 0,36) wurde mit warmem Chloroform aus der Platte eluiert und lieferte nach dem Verdampfen des Lösungsmittels 410 mg 3ß-Methoxy--14a-methyl-5a-cholest-7-en-15ß-ol in einer Ausbeute von 40,8% in Form eines farblosen glasartigen Materials. Die polarere Komponente (Rr 0,24) wurde aus der Platte mit warmem Chloroform extrahiert und lieferte nach dem Verdampfen des Lösungsmittels 272 mg (Ausbeute 27,1%) 3ß--Methoxy-14a-methyl-5a-cholest-7-en-15a-ol in Form eines farblosen, glasartigen Materials.

Beide Verbindungen zeigten eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G--Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol und 35 % Äthylacetat in Chloroform) und bei Gas-Flüssig-Chro-5 matographieanalysen über 3 % 0V-1-und 3% OV-17-Säu-len (Säulentemperatur: 250°C). Analysen mittels Infrarot-, magnetischem Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigten das Grundgerüst dieser beiden Verbindungen in folgen-

Beispiel 11

Herstellung von 5a,-Cholest-8(14)-en-3$,7ç,15^-triol

5,0 g (9,91 mMol) 3ß-Benzoyloxy-14a,15a-epoxy-5a--cholest-7-en in 810 ml Äthanol wurden einer Lösung von 28 g Kaliumhydroxyd in 90 ml Wasser hinzugegeben und das erhaltene Gemisch während 5 Stunden unter Rückf luss 30 zum Sieden erhitzt. Nach dem Einengen des Materials auf ungefähr % des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck wurde das Gemisch in 1000 ml kaltes Wasser gegossen.

3,87 g des so erhaltenen Niederschlages wurden gesam-35 melt und in einer Kieselgel (130 g; 0,250 bis 0,074 mm)-Säule (60 cm X 2 cm) chromatographiert. Die Säule wurde nacheinander mit 200 ml Chloroform, einer Mischung von 200 ml Chloroform und Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 1:1 und schliesslich Äthylacetat eluiert. Fraktionen mit 40 einem Volumen von 20 ml wurden gesammelt.

Die Fraktionen 45 bis 100, welche das hauptsächliche Produkt enthielten, wurden gesammelt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft. Der entstandene Rückstand wurde dann aus einer Mischung von Aceton und 45 Wasser umkristallisiert, wobei man 2,20 g 5a-Cholest-8(14)--en-3ß,7^,15^-triol (Ausbeute 53%) der folgenden Strukturformel erhielt:

Die Struktur dieser Verbindung wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünn-65 Schichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 35 % Äthylacetat in Chloroform und Äthylacetat). Das Tris-trimethylsilylätherderivat dieser Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Gas-Flüssig-

641352

10

-Chromatographieanalysen über 3 % OV-1-und 3% OV-17--Säulen (Säulentemperatur: 250°C).

Beispiel 12

Herstellung von 5x-Cholest-8(14)-en-3,7,15-trion

300 mg (0,72 mMol) 5«-Cholest-8(14)-en-3ß,7£,15£-triol in 60 ml trockenem Methylchlorid wurde einer Suspension von 1,10 g (5,15 mMol) Pyridiniumchlorchromat in 30 ml trockenem Methylenchlorid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einer Stickstoffatmosphäre während 30 Minuten gerührt und hierauf in Äther gegossen. Die abgetrennte Ätherphase wurde nacheinander mit Wasser, kalter 5%iger Salzsäure, 5%iger Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die Ätherlösung wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Portionen des entstandenen gelben Rückstandes (266 mg) wurden über Kieselgel-G-Platten der Dünnschichtchromatographie unterworfen, wobei eine hauptsächliche Komponente (Lösungsmittelsysteme: 35 % Äthylacetat in Chloroform und 50% Äthylacetat in Benzol) festgestellt worden ist. Dieses Produkt wurde unter Verwendung einer Kieselgel-(0,032 bis 0,063 mm)-Säule (118 cm X 1,5 cm) der Flüssigkeitschromatographie bei mittlerem Druck von 4,2 kg/cm2 (60 p.s.i.) unterworfen. Unter Verwendung von 10% Äthylacetat in Chloroform als Eluiermittel wurden Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml (Fliessgeschwindigkeit: 5 ml pro Minute) gesammelt. Der Inhalt der Fraktionen 36 bis 40 wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man 170 mg (57 % Ausbeute) 5a-Cholest-8(14)-en-3,7,15-trion der folgenden Strukturformel:

Das obige Grundgerüst liess sich durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigen. Das Produkt zeigte eine einzelne Komponente bei der Gas-Flüs-sig-Chromatopraghieanalyse über einer 3% OV-l-Säule.

Eine ähnliche Analyse über einer 3% OV-17-Säule gab die Anwesenheit einer kleinen Menge Verunreinigungen (ungefähr 8%) als Schulter auf der distalen Seite des Haupt-peaks an.

Beispiel 13

Herstellung von 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-3ß,15a-diol

1,00 g (1,94 mMol) Bis-3ß,15a-acetoxy-14a-äthyl-5a--cholest-7-en in 100 ml Äther wurde mit 2,00 g (52,7 mMol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Nach dem Rühren des Gemisches während 3 Stunden bei Zimmertemperatur wurde es auf 0°C gekühlt und dann vorsichtig mit Eis versetzt, um das nichtumgesetzte Hydrid zu zersetzen. Das Gemisch wurde hierauf in eine 0,34 molare Natriumchloridlösung gegossen und gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert.

Die vereinigten Ätherextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. 0,79 g des so erhaltenen Rückstandes wurden aus einer Mischung von Aceton und Wasser umkristallisiert, wobei man 0,76 g (91,1% Ausbeute) 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-3ß,15a-diol der folgenden Strukturformel erhielt:

OH

GH„CH.

HO

Die Struktur dieser Verbindung wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, 35% Äthyls acetat in Chloroform) und bei der Gas-Flüssig-Chromato-graphieanalyse des Bis-3ß,l5a-trimethylsiloxyderivates über 3% OV-1- und 3% OV-17-Kolonnen (Kolonnentemperatur: 250°C).

Beispiel 14

Herstellung von 3ß-Acetoxy-14a-n-propyl-5a,-cholest--7-en-15-on

10,0 g (24,9 mMol) 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on wurden in eine Lösung von Kalium-tert.-butoxyd, hergestellt durch Lösen von 17,3 g metallischem Kalium in 819 ml tert.-Butylalkohol und anschliessendes Trocken über einem Linde-Typus 3A Molekularsieb, eingerührt. Dann wurden in einer Portion 140 ml n-Propyljodid in das Reaktionsgemisch gegossen und das ganze Gemisch hierauf während 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde hierauf unter vermindertem Druck auf ungefähr y3 seines ursprünglichen Volumens eingeengt. Dann wurde Wasser hinzugegeben und das entstandene Gemisch gründlich mit Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Der erhaltene Rückstand wurde unter Verwendung einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm; 910 g) -Säule (100 cm X 2,5 cm) der Flüssigkeitschromatographie bei mittleren Druck (4,2 kg/cm2) (60 p.s.i.) unterworfen. Dann wurde mit 5% Äther in Benzol als Eluiermittel eluiert und die Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml (Fliessgeschwindigkeit: 5 ml pro Minute) gesammelt. Der Inhalt der Fraktionen 102 bis 192 wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 4,5 g rohes 14a-n-Propyl-5a-cholest-7-en-3ß-ol--15-on (Ausbeute 41%) in Form eines weissen, kristallinen, festen Materials vom Schmelzpunkt 119 bis 123°C erhielt.

Dieses Produkt zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten in zwei verschiedenen Lösungsmittelsystemen (10%

Äther in Benzol und 35 % Äthylacetat in Chloroform), während die Gas-Flüssig-Chromatographieanalysen entweder auf

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

641352

einer 3% OV-1- oder 3% OV-17-Säule das Vorhandensein (ungefähr 10%) einer weniger polaren Komponente anzeigten.

5,0 g (11,3 mMol) rohes 14a-n-Propyl-5a-cholest-7-en--3(j-ol-15-on wurden in 50 ml Pyridin gelöst und die Lösung hierauf mit 50 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Nach dem Stehenlassen während 24 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre bei Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch in Wasser gegossen. Das entstandene Gemisch wurde gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden nacheinander mit Wasser, kalter wässriger Salzsäure, 5%iger wässriger Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die erhaltene Ätherlösung wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne'eingedampft.

5,2 g des so erhaltenen, weissen, festen Materials wurden unter Anwendung einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm; 910 g)-Säule (100 cm X 2,5 cm) der Flüssigkeitschromatographie bei mittlerem Druck von 4,2 kg/cm2 (60 p.s.i.) unterworfen. Unter Verwendung von Benzol als Eluiermittel wurden Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml (Fliessgeschwindigkeit: 5 ml pro Minute) gesammelt. Der Inhalt der Fraktionen 130 bis 178 wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 4,1 g (74%ige Ausbeute) 3ß-Acetoxy-14a-n-propyl-5a-cholest-7-en-15-on in Form von weissen Kristallen vom Schmelzpunkt 110 bis 111°C erhielt. Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Äther in Benzol, 10% Äther in Hexan und 35% Äthylacetat in Chloroform) und bei der Gas-Flüssig-Chromatographieanalyse über 3 % OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C). Analysen durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum bestätigten die folgende Strukturformel:

ch,-c-0'

Beispiel 15

Herstellung von 14x-n-Propyl-5a-cholest-7-en-3$-ol-15-on

300 mg (0,62 mMol) 3ß-Acetoxy-14a-n-propyl-5a-cho-lest-7-en-15-on wurden in 63,4 ml absolutem Äthanol gelöst und dann diese Lösung mit 3,35 ml 7,14n-Kaliumhydroxyd-lösung versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde während 2, Stunden in einer Stickstoffatmosphäre unter Rückfluss zum Sieden erhitzt und dann auf ungefähr die Hälfte des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck eingedampft und in Wasser gegossen. Das Gemisch wurde hierauf gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Das erhaltene, weisse, feste Material wurde aus einer

Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 264 mg (Ausbeute 96%) 14«-n-Propyl--5a-cholest-7-en-3ß-ol-15-on der folgenden Strukturformel erhielt:

Diese Strukturformel wurde bestätigt durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, 10% Äther in Hexan und 35 % Äthylacetat in Chloroform) und bei der Gas-Flüs-sig-Chromatographieanalyse des freien Sterins und seines Tri-methylsilylätherderivates über 3% OV-1- und 3% OV-17--Säulen (Säulentemperatur: 270°C).

Beispiel 16

Herstellung von Bis-3ß,15a,-acetoxy-14a-n-propyl-5a-cholest--7-en und 3ß-Acetoxy-14a,-n-propyl-5a-cholest-7-en-15$-ol

3,0 g (6,2 mMol) 14a-n-Propyl-5a-cholest-7-en-3ß-ol-15--on in 300 ml Äther wurden mit 6,0 g (158 mMol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Nach dem Rühren des Reaktionsgemisches während 2 Stunden bei Zimmertemperatur wurde es auf 0°C gekühlt und dann vorsichtig mit Eis versetzt, um das nicht umgesetzte Hydrid zu zersetzen. Das Gemisch wurde anschliessend in eine 0,34n-Natriumchloridlösung gegossen und gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert.

Die vereinigten Ätherextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, 2,59 g dieses Rückstandes wurden aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 2,53 g (Ausbeute 93%) eines weissen, festen Materials vom Schmelzpunkt 104,5 bis 105,5°C erhielt. Dieses Material dürfte eine Mischung von 14a-n-Propyl-5a-cholest-7-en-3ß,15a-dioI (64%) und 14a-n--Propyl-5a-cholest-7-en-3ß,15ß-diol (36%) gewesen sein.

Zu einer Lösung dieser Mischung der epimeren Diole (2,0 g; 4,50 mMol) in 15 ml trockenem Pyridin wurden 15 ml Essigsäureanhydrid hinzugegeben. Nach dem Stehenlassen in einer Stickstoffatmosphäre während 24 Stunden bei Zimmertemperatur wurde das Gemisch in Wasser gegossen und hierauf gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden nacheinander mit Wasser, kalter wässriger 5%iger Salzsäure, 5%iger wässriger Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen und anschliessend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Produkt wurde hierauf durch Eindampfen vom Lösungsmittel befreit, wobei man 2,32 g eines Rückstandes erhielt, welcher unter Verwendung von Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm; 910 g)-Säule (100 cm X 2,5 cm) der Flüssigkeitschromatographie bei mittlerem Druck von 4,2 kg/cm2 (60 p.s.i.) unterworfen wurde. Unter Verwendung von 1 % Äther in Benzol als Eluierlösungsmittel wurden Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml (Fliessgeschwindigkeit: 5 ml pro Minute) gesammelt!

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

641352

12

Der Inhalt der Fraktionen 40 bis 62 wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man 1,28 g (53,8% Ausbeute) Bis-3ß,15a-acetoxy-14a-n--propyl-5a-cholest-7-en in Form eines weissen, kristallinen, festen Materials vom Schmelzpunkt 128 bis 129°C.

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographie über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Äther in Benzol, 10% Äther in Hexan und 35 % Äthylacetat in Chloroform) und bei der Gas-Flüssig-Chromatographieanalyse über 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C). Die folgende Strukturformel liess sich durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigen:

Der Inhalt der aus der Kieselgelsäure entnommenen Fraktionen 78 bis 94 wurde gesammelt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft. Hierauf wurde der Rückstand aus einer Mischung von Aceton und Wasser auskristallisiert. Auf diese erhielt man 0,48 g (22% Ausbeute) 3ß-Acetoxy-14a-n-propyl-5a-cholest-7-en-15ß-ol vom Schmelzpunkt 103,5 bis 104,5°C. Das Infrarot-, magnetische Kernresonanz- und Massenspektrum haben die folgende Strukturformel bestätigt:

oh ch,-c-0

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G--Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Äther in Benzol, 10% Äther in Hexan und 35 % Äthylacetat in Chloroform) und bei den Gas-Flüssig-Chromatographieanalysen über 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C).

Beispiel 17

Herstellung von 14a,-n-Propyl-5a.-cholest-7-en-3ß,15'X-diol

200 mg (0,38 mMol) Bis-3a, 15a-acetoxy- 14a-n-propyl--5a-cholest-7-en in 50 ml Äther wurden mit 500 mg (13,2 mMol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Nach 3stündigem Rühren bei Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt und dann vorsichtig mit Eis versetzt, um das nicht umgesetzte Hydrid zu zersetzen. Das entstandene Gemisch wurde in eine 0,34n-Natriumchloridlösung gegossen und gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

146 mg des so erhaltenen Rückstandes wurden aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum auskristallisieren gebracht, wobei man 135 mg (80,4% Ausbeute) 14a-n-Pro-pyl-5a-cholest-7-en-3ß,15a-diol der folgenden Formel erhielt:'

OH

HO

Die Struktur dieser Verbindung wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei den Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Plat-ten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, Chloroform und 35 % Äthylacetat in Chloroform) und bei den Gas-Fliissig-Chromatographieanalysen des freien Sterins und dessen Bis-3ß,15a-dimethylsilyloxyderivat in 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C).

Beispiel 18

Herstellung von 14a-n-Propyl-5a.-cholest-7-en-3$,15$-diol

200 mg (0,41 mMol) 3ß-Acetoxy-14a-n-propyl-5a-cho-lest-7-en-15ß-ol in 50 ml Äther wurden mit 500 mg (13,2 mMol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Nach dem Rühren während 3 Stunden bei Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt und hierauf vorsichtig mit Eis versetzt, um das überschüssige Hydrid zu zersetzen. Das entstandene Gemisch wurde in eine 0,34n-Natriumchlorid-lösung gegossen und hierauf gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden über wassefreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

152 mg des so erhaltenen Rückstandes wurden aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 145 mg (Ausbeute 79%) 14a-n-Pro-pyl-5a-cholest-7-en-3ß,15ß-diol der folgenden Strukturfor mel erhielt:

0H

HO

Die Struktur dieser Verbindung wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

641352

(Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, Chloroform und 35 % Äthylacetat in Chloroform) und bei Gas-Flüssig-Chromatographieanalysen des freien Sterins und seines Bis-3ß,15a-trimethylsilyloxyderivats in 3% OV-1- und 3% OV--17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C).

Beispiel 18A

Herstellung von 3$-Hexadecanoyloxy-14a-äthyl-5a,-cholest--7-en-15tx-ol, 3 $-Hexadecanoyloxy-14a-äthyl-5<x-cholest-7--en-15ß-ol und Bis-3ft,15a,-hexadecanoyloxy-14a,-äthyl-5a,--cholest-7-en

4,40 g (10,2 mMol) eines Gemisches von 14a-Äthyl-5a--cholest-7-en-3ß,15a-diol und 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en--3ß,15ß-diol (ungefähres Mischungsverhältnis der 15a- und 15ß-Hydroxyepimeren von ungefähr 70:30, wie dies durch Gas-Flüssig-Chromatographieanalyse des 3ß-Trimethylsiloxy-derivats feststellbar war) in 22 ml trockenem Pyridin wurde mit 3,10 g (11,3 mMol) Hexadecanoylchlorid versetzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch während 1 Stunde in einer Stickstoffatmosphäre unter Riickfluss zum Sieden erhitzt und nach dem Kühlen auf Zimmertemperatur in Wasser gegossen.

Das erhaltene Gemisch wurde gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die organische Phase wurde nacheinander mit Wasser, kalter 0,6n-SaIz-säurelösung, 0,47 molarer Natriumcarbonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen und anschliessend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. 1 Teil des weissen Rückstandes (5,35 g), welcher nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhalten worden war, wurde durch Dünnschichtchromatographie über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittel: Benzol) analysiert. Dabei wurden 3 hauptsächliche Komponenten (Rf-Werte von 0,20, 0,45 und 0,79) festgestellt. Das Gemisch wurde bei einem mittleren Druck von 4,2 kg/cm2 (60 p.s.i.) über einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm; 910 g)-Säule (100 cm X 2,5 cm) chromatographiert. Unter Verwendung einer Mischung von Hexan und Benzol im Mischungsverhältnis von 10:90 als Eluiermittel wurden die Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml (Fliessgeschwindigkeit: 5 ml pro Minute) gesammelt.

Der Inhalt der Fraktionen 10 bis 23 wurde gesammelt und der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gewonnene Rückstand bei —40°C aus Aceton umkristallisiert. Auf diese Weise erhielt man 1,15 g (12% Ausbeute) Bis-3ß,15a--Hexadecanoyloxy-14a-äthyl-5a-cholest-7-en der folgenden Strukturformel:

ch3(ch2)li(co ioch3(ch2)i1(co

I

J oh ch2ch7

Der Inhalt der aus der Kieselgelsäule gewonnenen Fraktionen 117 bis 135 wurde gesammelt und der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand bei 15 —40°C aus Aceton umkristallisiert, wobei man 2,35 g (Ausbeute 34%) 3ß-Hexadecanoyloxy-14a-äthyl-5a-cholest-7-enr -15a-ol der folgenden Formel erhielt:

20

CH^CH^CO

ch2ch3

0c(CH2)i1(ch,

ch2ch3

Der aus der Kieselgelsäule gewonnene Inhalt der Fraktionen 52 bis 86 wurde gesammelt und der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand bei —40°C aus Aceton umkristallisiert. Auf diese Weise erhielt man 1,62 g (24% Ausbeute) 3 ß-Hexadecanoyloxy-14a-äthyl-5a--cholest-7-en-15ß-ol der folgenden Formel:

Die Strukturen sämtlicher drei Verbindungen wurden durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt. Sämtliche drei Verbindungen hatten eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographie-35 analyse über Kieselgel-G-Platten, wenn man verschiedene Lösungsmittelsysteme zur Anwendung brachte.

Beispiel 19

40 Herstellung von 3$-Hexadecanoyloxy-14a,-ät1iyl-5a.-cholest-

-7-en-15-on

581 mg (2,69 mMol) einer Lösung von Pyridiniumchlor-chromat in 5 ml trockenem Methylenchlorid wurden in einer 45 Portion einer Lösung von 300 mg (0,45 mMol) 3ß-Hexa-decanoyloxy-14a-äthyl-5a-cholest-7-en-15ß-ol hinzugegeben. Nach 30 minütigem Rühren in einer Stickstoffatmosphäre bei Zimmertemperatur (24°C) wurde das Gemisch in 400 ml Äther gegossen und nacheinander mit Wasser, kalter 0,6n-50 Salzsäure, 0,47 molarer Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die erhaltene Ätherlösung wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man 284 mg eines leicht gelben Rückstandes erhielt. Die Analyse durch 55 Dünnschichtchromatographie über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittel: Benzol) zeigte eine hauptsächliche Komponente (ungefähr 95 %) mit einem R,-Wert von 0,50.

Dieses Material wurde bei einem mittleren Druck von 7 kg/cm2 (100 p.s.i.) über einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 60 mm; 388 g)-Säule (118 cm X 1,5 cm) chromatographiert. Unter Verwendung von Benzol als Eluiermittel (Fliessgeschwindigkeit: 5 ml pro Minute) wurden die Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml gesammelt. Der Inhalt der Fraktionen 12 bis 35 wurde gesammelt und der nach dem Ver-65 dampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand aus einer Mischung von Aceton und Wasser umkristallisiert, wobei man 207 mg 3ß-Hexadecanoyloxy-14a-äthyl-5a-cholest-7--en-15-on (Ausbeute 89%) der folgenden Formel erhielt:

641352

14

0

ch3(ch2)ij(co

Diese Struktur wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographischen Analysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Hexan in Toluol, 10% Äther in Hexan und einer Mischung von Petroläther, Äther und Essigsäure).

Die Behandlung von 3ß-Hexadecanoyloxy-14a-äthyl-5a--cholest-7-en-15a-ol mit Pyridiniumchlorchromat unter identischen Bedingungen, wie sie oben beschrieben worden sind, lieferte das 3ß-Hexadecanoyloxy-14a-äthyl-5a-cholest--7-en-15-on mit gleichem Schmelzpunkt, Infrarotspektrum, magnetischem Kernresonanzspektrum, Massenspektrum und Dünnschichtchromatographieverhalten gemäss obigen Angaben für das 15-Keton, das sich aus der 15ß-HydroxyVerbindung ableitete.

Beispiel 20

Herstellung von 3$-Äthoxy-14oc-äthyl-5a-cholest-7-en-15-ole

1,0 g (2,19 mMol) 3 ß-Äthoxy- 14a-äthyl-5a-cholest-7-en--15-on in 100 ml Äther wurde mit 2,0 g (52,7 mMol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt und hierauf vorsichtig mit Eis versetzt, um das nicht umgesetzte Hydrid zu zersetzen. Das erhaltene Gemisch wurde in eine 0,35 molare Natriumchloridlösung gegossen und hierauf gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. 0,97 g des so erhaltenen Rückstandes wurden aus einer Mischung aus Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 0,94 g (Ausbeute 94%) einer Mischung von 3ß--Äthoxy-14a-äthyl-5a-cholest-7-en-15ß-ol und 3ß-Äthoxy--14a-äthyl-5a-cholest-7-en-15a-ol erhielt. Diese Mischung entsprach der folgenden Strukturformel, wie dies durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum nachweisbar war.

Die Analysen mittels Dünnschichtchromatographie über Kieselgel-G-Platten unter Verwendung von 5 verschiedenen Lösungsmittelsystemen und durch Gas-Flüssigkeitschroma-tographie über 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C) zeigten lediglich eine Komponente. Indessen zeigte die Analyse des Trimethylsilylätherderivates durch Gas-Flüssig-Chromatographie auf 3% OV-1- und 3%-OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 250°C) das Vorhandensein von zwei Komponenten.

5

Beispiel 21

Herstellung von 3$-Hexadecanoyloxy-5a-cholest-8(14)--en-15-on io 2,2 g (8,0 mMol) Hexadecanoylchlorid wurden zu einer Lösung von 2,0 g (5,0 mMol) 5«-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15--on in 10 ml trockenem Pyridin hinzugegeben und das erhaltene Gemisch während 1 Stunde in einer Stickstoffat-mosphäre unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Nach dem i5 Kühlen auf Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch ir. Wasser gegossen und hierauf gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltenem Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden nacheinander mit Wasser, kalter wässriger 5 %iger Salzsäurelösung, 5%iger wässriger Na-20 triumcarbonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.

Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde in einer Kieselgelsäule (140 g; 0,250 bis 0,074 mm Maschenweite; 140 cm X 2 cm) chromatogra-25 phiert. Unter Verwendung von Benzol als Eluiermittel wurden Fraktionen mit einem Volumen von 24 ml (Fliessgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute) gesammelt. Der Inhalt der Fraktionen 9 bis 40 wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck 30 aus einer Mischung von Aceton und Wasser und hierauf Aceton umkristallisiert. Auf diese Weise erhielt man 3,80 g (Ausbeute 59,5%) 3ß-Hexadecanoyloxy-5a-cholest-8(14)-en-

45 Die Struktur der Verbindung wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei dünn-schichtchromatographischen Analysen über Kieselgel-G-Plat-ten in drei verschiedenen Lösungsmittelsystemen, nämlich so Benzol, 10% Äther in Benzol und einer Mischung von Petroläther, Hexan und Essigsäure.

Beispiel 22

Herstellung von 3ß-Hemisuccinoyloxy-5a-cholest-8(14)-55 -en-15-on

2,5 g (24,9 mMol) Bernsteinsäureanhydrid wurden einer Lösung von 2,0 g (5,0 mMol) 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-- 15-on in 20 ml trockenem Pyridin hinzugegeben und das 60 erhaltene Gemisch in einer Stickstoffatmosphäre während 5 Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Nach dem Kühlen auf Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch in eine 0,034n-Natriumchloridlösung gegossen und diese Lösung hierauf 250 ml 5 % Methylenchlorid enthaltendem 65 Äther zugesetzt. Die abgetrennte Ätherphase wurde nacheinander mit kalter wässriger 5%iger Salzsäurelösung und Wasser gewaschen und hierauf über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.

15

641352

Der nach dem. Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde dreimal aus einer Mischung von Aceton und Wasser umkristallisiert. Die so erhaltenen Kristalle wurden mit Norite A in Aceton während 20 Minuten behandelt, durch Hyflo Super-Cel filtriert und durch Senken der Temperatur auf —78°C zum Auskristallisieren gebracht. Das so erhaltene kristalline Produkt, nämlich 1,8 g in einer Ausbeute von 73% entsprach gemäss Infrarot-, magnetischem Kernresonanz- und Massenspektrum dem 3ß-Hemi-succinoyloxy-5a-cholest-8(14)-en-15-on der folgenden Formel:

o o hocch2ch2Üo

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Silicagel-G-Plat-ten unter Verwendung entweder von Methanol oder Äthanol als Entwicklerlösungsmittel.

Beispiel 23

Herstellung von 5a,,14$-Cholest-7-en-15$-ol-3-on

Die Komponente 1 (200 ml) von «Bio-Dynamics (BMC Division) Cholesterol Auto Test» wurde mit «Cholesterol-oxidase» (6,0 ml; Komponente 3 des «Cholesterol AutoTest») versetzt und das entstandene Gemisch mit 600 ml destilliertem Wasser verdünnt. Dann gab man 126 mg (0,315 mMol) 5a,14ß-Cholest-7-en-3ß,15ß-diol in 35 ml Isopropanol hinzu und brütete das entstandene Gemisch un- . ter Schütteln während 7 Stunden bei 37°C. Dann wurde das Gemisch viermal mit jeweils 100 ml Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Ganze unter vermindertem Druck auf ungefähr 6 ml eingeengt.

Das erhaltene Material wurde über 6 Kieselgel-G-Plat-ten (750 dick) unter Verwendung von Äther als Entwicklerlösungsmittel der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Das gewünschte Produkt wurde hierauf aus den Platten mittels Chloroform eluiert und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 83,2 mg (Ausbeute 66%) 5a,14ß-Cholest-7-en-15ß-ol-3-on in Form von Nadeln vom Schmelzpunkt 90,5 bis 91,5°C erhielt. Durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrumanalysen wurde diesem Produkt die folgende Strukturformel zugewiesen:

0

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographie über einer Kieselgel-G--Platte (Lösungsmittel: Äther). Die Gas-Flüssig-Chromato-graphieanalyse des Trimethylsilylätherderivates auf einer 3% OV-17-Säule (Säulentemperatur: 250°C) ergab einen Reinheitsgrad von mindestens 98,9%.

Beispiel 24

Herstellung von 5a,14ß-Cholest-7-en-15a,-ol-3-on

Zur Komponente 1 (180 ml) von «Bio-Dynamics (BMC Division) Cholesterol Auto Test» wurde «Cholesterol oxi-dase» (5,5 ml; Komponente 3 des «Cholesterol Auto Test») hinzugegeben und das erhaltene Gemisch mit 540 ml destilliertem Wasser verdünnt. Hierauf wurden 105 mg (0,262 mMol) 5a,14ß-Cholest-7-en-3ß,15a-diol in 35 ml Isopropanol hinzugegeben und das erhaltene Gemisch unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Nach Sstündiger Bebrütung wurde die Lösung trübe. Dann wurden langsam weitere 10 ml Isopropanol hinzugegeben und die Inkubation während weiteren 2,25 Stunden durchgeführt. Das Gemisch wurde viermal mit jeweils 100 ml Chloroform extrahiert und die Extrakte wurden gesammelt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und auf ein Volumen von ungefähr 4 ml eingeengt.

Das so erhaltene Material wurde auf 6 Kieselgel-G-Platten (750 n dick) unter Verwendung von Äther als Ent-wickl^rlösungsmittel der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Das gewünschte Produkt wurde hierauf mittels Chloroform aus den Platten eluiert und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 75,3 mg (72% Ausbeute) 5a,14ß-Cholest-7-en-15a-ol-3-on in Form von feinen Nadeln vom Schmelzpunkt 121 bis 122°C erhielt. Durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum liess sich die Struktur dieses Produktes wie folgt festhalten:

OH

0

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographieanalyse über einer Kiesel-gel-G-Platte (Lösungsmittel: Äther). Die Gas-FIüssig-Chro-matographieanalyse des Trimethylsilylätherderivates in einer 3% OV-17-Säule (Säulentemperatur/ 250°C) zeigte einen Reinheitsgrad von mindestens 98,6%.

Beispiel 25

Herstellung von 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-15a-ol-3-on

Die Komponente 1 (250 ml) von «Bio-Dynamics (BMC Division) Cholesterol Auto Test» wurde mit «cholesterol oxidase» (16 ml; Komponente 3 des «Cholesterol Auto Test») versetzt und das erhaltene Gemisch mit 734 ml destilliertem Wasser verdünnt. Dann wurden 100 mg 14a--Äthyl-5a-cholest-7-en-3ß,15a-diol in 20 ml Isopropanol hinzugegeben und das erhaltene Gemisch unter Schütteln wäh-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

641352

16

rend 4% Stunden bei 37°C bebrütet. Hierauf wurde das Gemisch zweimal mit jeweils 100 ml Chloroform extrahiert und das Volumen der vereinigten Extrakte unter vermindertem Druck auf ungefähr 6 ml eingeengt.

Dieses Material wurde über Kieselgel-G-Platten (750 p, dick) unter Verwendung von Äther als Entwicklerlösungsmittel der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Das gewünschte Produkt wurde mittels Äther aus den Platten eluiert und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck zweimal aus einer Mischung von Äther und Methanol zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 85,3 mg (Ausbeute 85%) 14a-Äthyl-5a--cholest-7-en-15a-ol-3-on vom Schmelzpunkt 114 bis 115°C erhielt.

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Gas-Flüssig-Chromatographieanalyse über einer 3% OV-17-Säule (Säulentemperatur: 270°C). Durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum ergab sich die folgende Struktur für dieses Produkt:

ÔH

0

Beispiel 26

Herstellung von 3ß-Acetoxy-14a-n-butyl-5a-cholest-7-en--15-on

10,0 g (24,9 mMol) 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on wurden unter Rühren einer Lösung von Kalium-tert.-but-oxyd hinzugegeben, welche durch Lösen von 20,0 g metallischem Kalium in 1000 ml tert.-Butylalkohol erhalten worden war. Hierauf wurden in einer Portion 300 ml n-Butyl-jodid dem Reaktionsgemisch hinzugegeben und das Ganze während 12 Stunden bei Zimmertemperatur weiter gerührt. Hierauf wurden 400 ml Wasser hinzugegeben und das Gemisch zweimal mit jeweils 1000 ml Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 200 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man einen gelblichen Rückstand erhielt.

Dieser Rückstand wurde mit Essigsäureanhydrid und Pyridin behandelt und dann bei einem mittleren Druck von 4,2 kg/cm2 (60 p.s.i.) in einer Kieselgelsäule (0,032 bis 0,063 mm) chromatographiert, wobei man als Eluiermittel 10% Äther in Benzol verwendete. Nach dem Auskristallisierenlassen aus einer Mischung von Aceton und Wasser und nach dreimaliger chromatographischer Reinigung bei mittlerem Druck in einer flüssigen Säule erhielt man 900 mg eines Produktes. Nach dem Auskristallisierenlassen aus Aceton und Wasser erhielt man 850 mg 3ß-Acetoxy-14a-n--butyl-5a-cholest-7-en-15-on, in Form von weissen Nadeln.

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographie über Kieselgel-G-Platten in 8 verschiedenen Lösungssystemen, nämlich Äther, 35 % Äthylacetat in Chloroform, 20% Äther in Chloroform, 20% Äther in Benzol, 10% Äther in Benzol, Chloroform, Benzol und schliesslich 10% Hexan in Benzol, sowie bei Gas-Flüs-sig-Chromatographieanalysen über 3% OV-1- und 3%

OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 280°C). Durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum ergab sich die folgende Struktur:

chnch~ch_ch.

Beispiel 27

Herstellung von 14a,-n-Butyl-5oc-cholest-7-en-3$-ol-15-oh

Ein Gemisch von 150 mg 3ß-Acetoxy-14a-n-butyl-5a--cholest-7-en-15-on, 53 ml 93%iges Äthanol und 1,05 g KOH wurde während 1% Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Nach dem Einengen des Volumens auf ungefähr die Hälfte des ursprünglichen Volumens wurde das Gemisch in eine O,86n-Natriumchloridlösung (200 ml) gegossen und hierauf das so erhaltene Gemisch gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der so erhaltene Rückstand, nämlich 130 mg, wurde aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 120 mg (Ausbeute 87 %) feine Nadeln, bestehend aus 14a-n-Butyl-5a-cholest-7-en-3ß-ol-15-on, welches die fol gende Strukturformel aufwies:

CH0CH„CH0CH.

HO

erhielt.

Die Strukturformel konnte durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum bestätigt werden. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographieanalyse über Kieselgel-G-Platten in acht verschiedenen Lösungsmittelsystemen, nämlich Äther, 35 % Äthylacetat in Chloroform, 20% Äther in Chloroform, 20% Äther in Benzol, 10%

Äther in Benzol, Chloroform, Benzol und schliesslich 10% Hexan in Benzol. Der Reinheitsgrad lag über 99%, wie sich dies durch Gas-Flüssig-Chromatographieanalyse des Trimethylsilylätherderivates in 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C) feststellen liess.

Beispiel 28

Herstellung von Bis-3$,15a-acetoxy-14a,-n-butyl-5a-cholest--7-en und 3ß-Acetoxy-14a-n-butyl-5a-cholest-7-en-15ß-ol

6A1 mg (1,3 mMol) 3ß-Acetoxy-14a-n-butyl-5a-cholest--7-en-15-on in 30 ml Äther wurden mit 1,2 g (32 mMol)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Nach 3 Stunden wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt und dann vorsichtig mit Äthylacetat versetzt, um das nicht umgesetzte Hydrid zu zersetzen. Das erhaltene Gemisch wurde hierauf in 200 ml einer 0,86n-Natriumchloridlösung gegossen und zweimal mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert.

Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man 570 mg eines weissen Rückstandes erhielt. Dieses Material zeigte zwei Komponenten bei der dünnschichtchromatographischen Analyse über Silicagel-G-Platten (Lösungsmittelsystem: 10% Äther in Benzol).

570 mg dieses weissen Rückstandes wurden in 10 ml trockenem Pyridin gelöst und die Lösung hierauf mit 10 ml Essigäsäureanhydrid versetzt. Nach dem Stehenlassen bei Zimmertemperatur während 15 Stunden wurde das Reaktionsgemisch in Eis gegossen und das erhaltene Gemisch zweimal mit jeweils 200 ml 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden nacheinander mit Wasser, kalter ln-Salzsäurelösung, wässriger 5%iger Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

620 mg des so erhaltenen Rückstandes wurden bei mittlerem Druck über einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm)-Säule unter Verwendung von 1 % Äther in Benzol als Eluie-rungsmittel flüssig chromatographiert. Der Inhalt der Fraktionen, welche der erwarteten Mobilität des Diacetats entsprachen, wurde vereinigt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man Nadeln, bestehend aus Bis-3 ß, 15a-Acetoxy- 14a-n-butyl-5a-cholest-7-en, erhielt. Durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum ergab sich die folgende Strukturformel:

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Plat-ten in acht verschiedenen Lösungsmittelsystemen, nämlich Äther, 35% Äthylacetat in Chloroform, 20% Äther in Chloroform, 20% Äther in Benzol, 10% Äther in Benzol, Chloroform, Benzol und schliesslich 10% Hexan in Benzol.

Der Inhalt der Fraktionen mit dem erwarteten Fliessvermögen des Monoacetats wurde vereinigt und nach dem Verdampfen desLösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man feine Nadeln in einer Menge von 190 mg erhielt. Diese Nadeln bestanden aus 3ß-Acet-oxy-14a-n-butyl-5a-cholest-7-en-15ß-ol.

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographie über Kieselgel-G-Platten in acht verschiedenen Lösungsmittelsystemen (Äther, 35 % Äthylacetat in Chloroform, 20% Äther in Chloroform, 20% Äther in Benzol, 10% Äther in Benzol, Chloroform, Benzol und 10% Hexan in Benzol. Der Reinheitsgrad betrug mehr

17 641352

als 99%, wie dies durch Gas-Flüssig-Chromatographieana-lyse des Trimethylsilylätherderivates in einer 3% OV-17--Säule festgestellt werden konnte. Die folgende Strukturformel Hess sich durch Infrarotspektrum, magnetisches Kern-5 resonanzspektrum und Massenspektrum bestätigen.

Herstellung von 14a-n-Butyl-5a-cholest-7-en-3ß,15a-diol

20 200 mg (0,37 mMol) Bis-3ß,15a-Acetoxy-14a-n-butyl--5a-cholest-7-en in 30 ml Äther wurden mit 400 mg (10,5 mMol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Nach zweistündigem Stehenlassen bei Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt und hierauf vorsichtig Äthyl-25 acetat hinzugegeben, um das nicht umgesetzte Hydrid zu zersetzen. Das Gemisch wurde anschliessend in eine 0,86n-Natriumchloridlösung gegossen und zweimal mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat 30 getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

180 mg dieses Rückstandes wurden bei mittlerem Druck in einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm)-Säule unter Verwendung von 15 % Äther in Benzol als Eluiermittel flüs-35 sig chromatographiert. Der Inhalt der Fraktionen, welche der Mobilität des gewünschten Diols entsprachen, wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man « 128 mg Nadeln, welche aus 14a-n-Butyl-5a-cholest-7-en--3ß,15a-diol bestanden und der folgenden Strukturformel erhielt.

55 Die Struktur wurde durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten in acht verschiedenen Lösungsmittelsystemen und

60 zeigte einen Reinheitsgrad von über 99 % bei Gas-Flüssig-Chromatographieanalyse des Trimethylsilylätherderivates auf einer 3% OV-17-Säule (Säulentemperatur: 270°C).

Beispiel 30

65 Herstellung von 14a-n-Butyl-5a-cholest-7-en-3$,L5$-diol

100 mg (0,20 mMol) 3ß-Acetoxy-14a-n-butyl-5a-cho-lest-7-en-15ß-ol in 30 ml Äther wurden mit 200 mg (5,26

541352

mMol) Lithiumaluminiumhydrid versetzt. Nach zweistündigem Stehenlassen bei Zimmertemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt und hierauf vorsichtig Äthylacetat hinzugegeben, um das überschüssige Hydrid zu zersetzen. Das Gemisch wurde in eine 0,86 normale Natriumchloridlösung gegossen und zweimal mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

180 mg des so erhaltenen glasartigen Rückstandes wurden bei mittlerem Druck über einer Kieselgel (0,032 bis 0,063 mm)-Säule unter Verwendung von 15% Äther in Benzol als Eluiermittel flüssig chromatographiert. Der Inhalt der Fraktionen, welche der Mobilität des gewünschten Diols entsprachen, wurde gesammelt, und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhielt man 80 mg 14a-n-Butyl-5a-cho-lest-7-en-3ß,15ß-diol in Form eines weissen, amorphen, festen Materials, welches beim Behandeln in einer Mischung von Aceton und Wasser oder Methanol und Wasser nicht in kristalliner Form erhalten werden konnte.

Die Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei der Dünnschichtchromatographieanalyse über Kieselgel-G-Platten in acht verschiedenen Lösungsmittelsystemen und zeigte einen Reinheitsgrad von mindestens 98,5%, festgestellt durch Gas-Flüssig-Chromatographieanalyse des Trimethylsilylätherderivates in einer 3% OV-17-Säule (Säulentemperatur: 270°C). Die Strukturformel konnte durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum wie folgt bestätigt werden:

Beispiel 31

Herstellung von 3tx,-Benzoyloxy-5a-cholest-8(14)-en-15-on

Eine Lösung von 0,87 g (5,0 mMol) Diäthylazodicarb-oxylat in 5 ml Tetrahydrofuran wurde tropfenweise in eine Lösung von 1.00 g (2:5 mMol) 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol--15-on, 1,97 g (7,5 mMol) Triphenylphosphin und 0,61 g (5,0 mMol) Benzoesäure in 30 ml Tetrahydrofuran eingerührt. Nach 14stündigem Rühren wurde das Gemisch in Wasser gegossen und dann gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Das so erhaltene, hellgelbe, feste Material wurde in einer 100 g Kieselgel von ca. 0,25 bis 0,05 mm Maschen weite enthaltenden Säule (60 cm X 2,0 em) chromatographiert. Zur Eluierung wurde Benzol eingesetzt, wobei die Fraktionen mit einem Volumen von 24 ml (Fliessgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute) gesammelt wurden. Der Inhalt der Fraktionen 40 bis 95 wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man kristallines 3>a-BenzoyI-oxy-5a-cholest-8(14)-en-15-on. Durch Infrarotspektrum, ma-

18

gnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum ergab sich die folgende Strukturformel:

i5 Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Äther in Benzol, 10% Äther in Hexan, 5% Aceton in Chloroform und 35 % Äthylacetat in Chloroform).

20

Beispiel 32

Herstellung von 5a-Cholest-8(14)-en-3a-ol-15-on

500 mg (1,00 mMol) 3a-Benzoyloxy-5a-cholest-8(14)-en-25 -15-on in 175 ml absolutem Äthanol wurden mit 10 ml Wasser und 30 ml konzentrierter Schwefelsäure versetzt. Nach dem Erhitzen des Gemisches während 24 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre unter Rückfluss wurde das Volumen auf ungefähr die Hälfte seines ursprünglichen Umfan-3o ges unter vermindertem Druck eingeengt und der Rest dann in Wasser gegossen. Das Gemisch wurde hierauf gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden anschliessend unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. 35 Der erhaltene, hellgelbe Rückstand wurde zweimal aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht. Die Kristalle wurden in Aceton gelöst und in Gegenwart von Entfärbungskohle (Norite A) während 15 Minuten erwärmt. Dann wurde die Lösung durch Hyflo 40 Super-Cel (Johns-Manville Corp.) filtriert und das Super-Cel mit Methanol gewaschen. Die Aceton- und Methanollösungen wurden vereinigt und nach Zugabe von Wasser erhielt man 326 mg eines kristallinen Produktes (Ausbeute 82%). Dieses Produkt wurde gesammelt und im Vakuum getrock-45 net. Die Analyse durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum ergab als Produkt das 5a-Cholest-8(14)-en-3a-ol-15-on mit folgender Strukturformel:

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Plat-65 ten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, 5% Aceton in Chloroform und 35% Äthylacetat in Chloroform) und bei den Gas-Flüssig-Chromatographieanalysen auf 3 % OV-1-und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C).

19

641352

Beispiel 33

Herstellung von 3x-Benzoyloxy-14a-äthyl-5a-cholest-7--en-15-on

Eine Lösung von 1,74 g Azodicarbonsäurediäthylester (10,0 mMol) in 10 ml Tetrahydrofuran wurde tropfenweise in eine Lösung von 2,14 g (5,0 mMol) 14a-Äthyl-5a-choIest--7-en-3ß-ol-15-on, 3,93 g (15,0 mMol) Triphenylphosphin und 1,22 g (10,0 mMol) Benzoesäure in 60 ml trockenem Tetrahydrofuran eingerührt. Nach 14stündigem Rühren wurde das Gemisch in Wasser gegossen und hierauf gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Das entstandene, hellgelbe, feste Material wurde bei mittleren Druck von 7 kg/cm2 (100 p.s.i.) über einer Kieselgel (388 g; 0,032 bis 0,063 mm)-Säule (118 cm X 1,5 cm) flüssig chromatographiert. Unter Verwendung von Benzol als Eluiermittel wurden Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml (Fliessgeschwindigkeit: 1,5 ml pro Minute) gesammelt. Der Inhalt der Fraktionen 13 bis 50 wurde gesammelt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht, wobei man 2,45 g 3a-Benzoyloxy-14a-äthyl-5a-cholest-7-en-15-on (92% Ausbeute) erhielt.

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Äther in Benzol und 10% Äther in Hexan). Die Struktur wurde durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum wie folgt bestätigt:

L

Beispiel 34

Herstellung von 14a-Äthyl-5oc-cholest-7-en-3(X-ol-15-on

1,0 g (1,9 mMol) 3a-Benzoyloxy-14a-äthyl-5a-cholest-7--en-15-on in 190 ml absolutem Äthanol wurde einer Lösung von 4,0 g Kaliumhydroxyd in 10 ml Wasser hinzugegeben. Nach dem Erhitzen in einer Stickstoffatmosphäre während 2 Stunden unter Rückfluss wurde das Volumen des Gemisches unter vermindertem Druck auf ungefähr 100 ml eingeengt. Das Gemisch wurde hierauf in Wasser gegossen und dann gründlich mit 5 % Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der entstandene weisse Rückstand wurde aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskristallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man 0,72 g (89% Ausbeute) 14a-Äthyl--5 a-cholest-7-en-3 a-ol-15-on.

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, 5% Aceton in Chloroform und 35 % Äthylacetat in Chloroform)

und bei der Gas-FIüssig-Chromatographieanalyse auf 3 % OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Sâulentempeïatur: 270°C). Die Struktur wurde durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum wie folgt bestätigt:

ch2ch

Ho ---- -

Beispiel 35

20 Herstellung von 5a-ChoIest-8(14)-en~15a-ol-3-on

Die Komponente 1 (180 ml) von «Biodynamics (BMC Division) Cholesterol Auto Test» wurde mit «cholesterol oxidase» (5,5 ml; Komponente 3 des «Cholesterol Auto 25 Test») versetzt und das entstandene Gemisch mit 540 ml destilliertem Wasser verdünnt. Dann versetzte man mit 105 mg (0,26 mMol) 5a-Cholest-8(14)-en-3ß,15a-diol in 40 ml Isopropanol und brütete das erhaltene Gemisch unter Schütteln während 8 Stunden bei 37°C.

30 Hierauf versetzte man mit 200 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung und extrahierte das Gemisch 5mal mit jeweils 100 ml Chloroform. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne ein-35 gedampft.

Der entstandene Rückstand wurde über einer 150 g Kieselgel mit einer Maschenweite von 0,210 bis 0,044 mm enthaltenden Säule (90 cm X 2,0 cm) unter Verwendung von 10% Äther in Benzol als Eluiermittel (Fliessgeschwindigkeit: 40 5 ml pro Minute) chromatographiert. Die Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml wurden gesammelt. Der Inhalt der Fraktionen 25 bis 45 wurde vereinigt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus einer Mischung von Aceton und Wasser zum Auskri-45 stallisieren gebracht. Auf diese Weise erhielt man 88 mg (Ausbeute 85%) 5a-Cholest-8(14)-en-15a-ol-3-on der folgenden Strukturformel:

60 0

Die Struktur dieser Verbindung wurde bestätigt durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum. Die Verbindung zeigte eine einzelne Kom-65 ponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, 35% Äthylacetat in Chloroform und 5% Aceton in Chloroform) und einen Reinheitsgrad von über 98% bei

641352

20

Gas-Flüssig-Chromatographieanalysen über 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur: 270°C).

Beispiel 36

Herstellung von 5a-Ckolest-8(14)-en-15-on-3ß-yl--pyridiniumsulfat

5,0 g Pyridin-schwefeltrioxyd wurden zu 2,0 g (5,0 mMol) 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on in 50 ml trockenem Chloroform, welches äthanolfrei und über einem Linde-Molekular-sieb vom Typus 3A getrocknet worden war, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde hierauf während 3 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Das überschüssige Reaktionsmittel wurde durch Filtrieren entfernt, mit wenig Chloroform gewaschen und das Filtrat in einem aus Trockeneis und Aceton bestehenden Bade auf —40°C gekühlt und durch Hyflo Super-Cel (Johns-Manville Corp.) filtriert. Dann wurde das Chloroformfiltrat so lange mit Hexan versetzt, bis es trübe wurde, worauf man auf 0°C kühlte. Auf diese Weise gelangte man zu einem weissen Niederschlag. Dieses Material wurde durch Filtrieren gesammelt und in einen Vakuumexsikkator während 100 Stunden bei Zimmertemperatur eingelegt, um sämtliche Spuren des Lösungsmittels zu entfernen. Das Produkt, nämlich 2,4 g 5«-Cholest-8(14)--en-15-on-3ß-yl-pyridiniumsulfat, (Ausbeute 86%) besass die folgende Strukturformel, wie dies durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektram und Massenspektrum festgestellt wurde.

,N -OSO'

Dieses Produkt zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Plat-ten (Lösungsmittelsysteme: 25 % Äthylacetat in Methanol und 25% Äthylacetat in Äthanol).

Beispiel 37

Herstellung von 5oc-Cholest-8(14)-en-15-on-3$-yl--kaliumsulfat (Monohydrat)

1,0 g (1,79 mMol) 5a-Cholest-8(14)-en-15-on-3ß-yl--pyrimidiniumsulfat wurde in 50 ml destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur gelöst und dann unter Rühren langsam eine wässrige gesättigte Kaliumchloridlösung hinzugegeben. Nach 15 Minuten wurde die entstandene Suspension filtriert, mit Wasser gewaschen und in einem Vakumm-exsikkator während einigen Stunden getrocknet. Der in einer Menge von 0,85 g erhaltene weisse Rückstand (Ausbeute 89%) wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum als 5a-Cholest-8(14)-en-15--on-3ß-yl-kaliumsulfat der folgenden Strukturformel:

bestätigt.

Beispiel 38 Herstellung von 5a-Cholest-8(14)-3,15-dion

0,4 g (10 mMol) 5a-Cholest-8(14)-en-3ß,15a-diol, in 20 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, wurden einer Lösung von 3 g Chromtrioxyd in einer Mischung von 40 ml trockenem Methylenchlorid und 3 ml trockenem Pyridin zugesetzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch in einer Stickstoffatmosphäre während 15 Minuten gerührt, dann mit Äther versetzt und die Lösung mit kalter 5 %iger Salzsäure und mit Wasser gewaschen. Die Lösung wurde mit Magne-siumsulfat getrocknet, filtriert und bei vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man 0,35 g eines Rückstandes erhielt, den man durch präparative Dünnschichtchromatographie (über Kieselsäure mit Benzol als Lösungsmittel) reinigte. Das Produkt wurde aus einer Mischung von Aceton und Wasser umkristallisiert, wobei man 0,332 g der gewünschten Verbindung in einer Ausbeute von 84% erhielt. Die Richtigkeit der folgenden Strukturformel:

0

welche dem 5a-Cholest-8(14)-3,15-dion entspricht, wurde durch Infrarot-, magnetisches Kernresonanz- und Massenspektrum bestätigt.

Beispiel 39

Herstellung von 14a-Äthyl-5a,-cholest-7-en-15-oxo-3$-yl--kaliumsulfat (Monohydrat)

In eine Lösung von 500 mg (0,85 mMol) 14a-Äthyl--5a-cholest-7-en-15-on-3ß-yl-pyridiniumsulfat in 25 ml destilliertem Wasser wurde eine wässrige gesättigte Lösung von 15 ml Kaliumchlorid langsam eingerührt. Die Suspension wurde dann während 10 Minuten gerührt, filtriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und während einigen Stunden im Vakuumexsikkator getrocknet. 148 mg eines weissen Rückstandes (Ausbeute 87 %) Hessen sich durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum als 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-15-on-3ß-yl-kalium-sulfat (Monohydrat) der folgenden Formel:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

21

641352

ch„ch.

bestätigen.

Beispiel 40

Herstellung von 14a,-Äthyl-5a-cholest-7-en-15-on-3$-yl--pyridiniumsulfat

1,0 g (2,33 mMol) 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-3ß-ol-15-on wurde in 25 ml trockenem Chloroform, welches äthanolfrei und über einem Linde-Molekularsieb vom Typus 3A getrocknet worden war, gelöst. Dann versetzte man mit 2,5 g Pyridin-Schwefeltrioxyd und rührte das Gemisch während 3 Stunden bei Zimmertemperatur. Das überschüssige Reaktionsmittel wurde durch Filtrieren entfernt und mit wenig Chloroform gewaschen. Das Filtrat wurde hierauf in einem Bad aus Trockeneis und Aceton auf —40°C gekühlt und durch Hyflo Super-Cel (Johns-Manville Corp.) filtriert. Dann wurde das Chloroformfiltrat so lange mit Hexan versetzt, bis die Flüssigkeit trübe war. Nach dem Kühlen auf 0°C wurde der ausgefällte weisse Niederschlag durch Filtrieren gesammelt und während 100 Stunden in einen Vakuumexsikkator bei Zimmertemperatur gebracht, um sämtliche Spuren des Lösungsmittels zu beseitigen. Auf diese Weise erhielt man 1,2 g des gewünschten Produktes in einer Ausbeute von 88%. Durch Infrarotspektrum, magnetisches Kernresonanzspektrum und Massenspektrum Hess sich diese Verbindung als 14a-ÄthyI-5a-cholest-7-en-15-on-3ß-yl-pyri-diniumsulfat bestätigen, welchem die folgende Struktur zu zuschreiben ist:

ch.ch.

0

II

(n -oso

3

Diese Verbindung zeigte eine einzelne Komponente bei Dünnschichtchromatographieanalysen über Kieselgel-G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 25 % Äthylacetat in Methanol und 25 % Äthylacetat in Äthanol).

Pharmakologische Untersuchung a. Wirkung von 3$-Hexadecanoyloxy-5a-cholest-8(14)--en-15-on und 3$-Hemisuccinoyloxy-5a-cholest-8(14)-en-15--on auf den Serum-Cholesterinspiegel von Ratten

Männliche Ratten vom Sprague-Dawley-Stamm wurden mit Purina-Rattenfutter ad libidum gefüttert. Die Ratten wurden während des Testes und während einer Dauer von mindestens 4 Tagen vor Beginn des Testes von 7 Uhr früh bis 6 Uhr abends am Licht und von 6 Uhr abends bis 7 Uhr früh im Dunkel gehalten.

5 mg 3ß-Hexadecanoyloxy-5a-cholest-8(14)-en-15-on, gelöst in 0,25 ml Triolein, nachstehend als «Palmitatester» bezeichnet, oder 5 mg 3ß-Hemisuccinoyloxy-5a-cholest--8(14)-en-15-on, in 0,25 ml Triolein mit Hilfe eines dicht verschlossenen Homogenisators aus Glas suspendiert, nachstehend als «Hemsuccinatester» bezeichnet, wurden einmal täglich um die Mittagszeit herum den jeweiligen 8 bzw. 6 Ratten subkutan verabreicht. 8 Kontrolltiere erhielten täglich Injektionen von 0,25 ml Triolein.

Die Kontrolltiere hatten ein anfängliches mittleres Körpergewicht von 163,5 g [± 5,6, was die übliche mittlere Fehlerquelle bedeutet und nachstehend als S.E.M. bezeichnet wird.] Die Ratten, denen man den Palmitatester und den Hemisuccinatester verabreichte, hatten ein anfängliches durchschnittliches Körpergewicht von 178,5 g (± 5,5, S.E.M.) bzw. 170,0 g (± 4,7, S.E.M.).

Es wurden periodisch aus den Ratten Blutproben entnommen und die Serumcholesterinkonzentrationen jeweils doppelt nach der Methode von Abell et al., J. Biol. Chem., Bd. 195, S. 357 bis 366 (1966) gemessen. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle I.

Da die Gruppen von Ratten bezüglich des Serumcho-lesterinspiegels vor Beginn des Experimentes nicht ausgesucht worden waren, waren die anfänglichen Durchschnittswerte der Serumcholesterinspiegel für die Triolein-, Palmitatester- bzw. Hemisuccinatestergruppen nicht identisch. Ungeachtet dieses Umstandes ergibt sich aus der Tabelle I in eindeutiger Weise eine signifikante Abnahme des Serumcholesterinspiegels nach 3-, 6-, 9- und 12tägigen Behandlungen sowohl mit dem Palmitatester als auch dem Hemisuccinatester, verglichen mit dem durchschnittlichen Wert für die gleichen Ratten vor Beginn der Verabreichung der Wirksubstanzen. Im Gegensatz dazu zeigten die Ratten, welche täglich Injektionen von Triolein erhielten, keine beachtenswerte Änderung des Serumcholesterinspiegels. Überdies war der mittlere Wert des Serumcholesterinspiegels in den Palmi-tat- und Hemisuccinatestergruppen nach 12tägiger Behandlung wesentlich niedriger als der entsprechende mittlere Wert des Serumcholesterinspiegels der mit Triolein behandelten Ratten.

Die Wirkungen des Palmitatesters und des Hemisuc-cinatesters auf den Serumcholesterinspiegel bei einzelnen Ratten wurden gleichfalls analysiert. Die Tabelle I zeigt die mittleren Werte der prozentuellen Senkung des Serumcholesterinspiegels, verglichen mit den anfänglichen Werten bei den gleichen Ratten, und zeigt auch die Verschiedenheiten bei diesen Werten. Eine signifikante Senkung des Serumcholesterinspiegels wurde bei sämtlichen Ratten in beiden Gruppen beobachtet. Das prozentuelle Senken des Cholesterinspiegels nach 12tägiger Behandlung mit dem Palmitatester lag im Bereiche von 22,7 bis 48,9%. Die prozentuelle Senkung des Serumcholesterinspiegels nach 12tägiger Behandlung mit dem Hemisuccinatester lag im Bereiche von 28,5 bis 46,3%.

Die Analyse der Serumsterine bei Ratten nach 12tägiger Behandlung mit entweder dem Palmitatester oder dem Hemisuccinatester durch Gas-Flüssig-Chromatographie (3 % OV-1- auf Gas-Chrom Q) ergab keine wahrnehmbare Anreicherung (< 1 %) von anderen Sterinen als Cholesterin.

Es bestanden auch keine signifikanten Unterschiede im Wachstum der täglich mit 5 mg Palmitatester oder Hemisuccinatester behandelten Ratten, verglichen mit den Ratten, welche nur Triolein verabreicht erhielten. Die durchschnittliche prozentuelle Gewichtszunahme innerhalb der ganzen Testperiode bei den Palmitat-, Hemisuccinat- und Trioleingruppen lag bei (d= S.E.M.) 40,5 ± 4,6, 40,7 ± 1,6 bzw. 43,6 ± 3,3.

Man konnte auch keinen beachtenswerten Unterschied

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

641352

22

zwischen den mittleren Werten des Lebergewichtes von mit Triolein behandelten Ratten (9,6 g ± 0,4, S.E.M.) und den mit Hemisuccinatester behandelten Ratten (10,6 g ± 0,4,

S.E.M.) beobachten. In ähnlicher Weise bestand auch kein signifikanter Unterschied zwischen den mittleren Werten 5 der Lebergewichte, ausgedrückt als Prozentsatz des gesamten Körpergewichtes, zwischen den mit Triolein behandelten Ratten (4,09% zt 0,08, S.E.M.) und den mit Hemisuccinatester behandelten Ratten (4,36% ± 0,08, S.E.M.).

TABELLE I

Wirkungen von Triolein, 3ß-Hexadecanoyloxy-5a-cholest-8(14)-en-15-on (Palmitatester) und 3$-Hemisuccinoyloxy-5a--cholest-8(14)-en-15-on (Hemisuccinatester) auf die Serum-Cholesterinspiegel bei Ratten

Serum-Cholesterin - mg pro 100 ml % Abnahme

(Durchschnitt ± S.E.M.) (Durchschnitt ± S.E.M.)

Tag

Triolein

Palmitatester

Hemisuccinatester

Palmitatester

Hemisuccinatester

0

82,6 zfc 2,3

91,6 zfc 2,6

89,1 zfc 2,6

—

—

3

79,6 ± 2,5

74,9 ± 3,9

78,6 ± 2,4

18,2 zfc 3,3

13,5 =fc 4,4

6

76,4 zfc 3,0

75,8 ± 5,0

72,5 dt 1,9

15,7 zfc 4,4

18,1 zfc 4,1

9

82,1 zt 2,0

77,9 zfc 5,9

72,3 dt 1,6

14,5 zt 2,9

18,4 ± 3,5

12

79,4 ± 2,2

61,4 dt 3,9

58,8 zfc 2,8

33,2 dt 2,7

33,9 zfc 2,9

Die mittleren Werte der Lebergewichte der mit Triolein behandelten Ratten (9,6 g ± 0,4, S.E.M.) unterschieden sich von jenen der mit dem Palmitatester behandelten Ratten (11,4 g ± 0,5, S.E.M.). In ähnlicher Weise unterschied sich auch der mittlere Wert der Lebergewichte, ausgedrückt in Prozentwerten des gesamten Körpergewichtes, der mit dem Triolein behandelten Ratten (4,09% ± 0,08, S.E.M.) vom durchschnittlichen Wert der mit dem Palmitatester behandelten Ratten (4,53 % ± 0,09, S.E.M.)

B. Man arbeitet im allgemeinen gemäss den Angaben im Abschnitt A, wobei man 5 mg 3ß-Äthoxy-14a-äthyl-5a--cholest-7-en-15-on in 0,25 ml Triolein einmal täglich den verschiedenen 8 Ratten subkutan verabreichte. 8 Kontrolltiere erhielten täglich Injektionen von 0,25 ml Triolein. Die Kontrolltiere besassen ein anfängliches durchschnittliches Körpergewicht von 143,7 g (zfc 6,3. S.E.M.), während die mit dem Steroidketon behandelten Ratten ein anfängliches durchschnittliches Körpergewicht von 141,8 g (rt 2,9, S.E.M.) aufwiesen.

In ähnlicher Weise wurden 2 mg 5a-Cholest-8(14)-en--3ß-ol-15-on in 0,2 ml Olivenöl bzw. 5,0 mg davon in 0,5 ml Olivenöl einmal täglich einer jeden Gruppe der Ratten subkutan verabreicht. Die 2 mg-Dosis wurde 12 Ratten verabreicht, während eine gleiche Gruppe von Ratten täglich

Injektionen von 0,2 ml Olivenöl injiziert bekamen. Jeweils 30 6 Ratten wurden mit 5 mg-Dosierungen behandelt, während 6 Kontrolltiere täglich Injektionen von 0,5 ml Olivenöl erhielten. Die bei diesem Test verwendeten Ratten hatten ursprünglich ein Gewicht von 110 bis 190 g.

Die durchschnittlichen Serumcholesterinwerte für die 35 Vergleichs- und Experimentiertiere finden sich in Tabelle II. Beachtenswerte Senkungen des Serumcholesteringehaltes, verglichen mit den Kontrollratten, konnten bei jenen Ratten beobachtet werden, welchen man täglich subkutane Injektionen von in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Sub-40 stituenten tragenden Sterinen subkutan injiziert hatte. Der durchschnittliche Serumcholesterinspiegel in den mit Olivenöl und mit Triolein behandelten Tieren war während der Versuchsdauer nicht stark verschieden. Der durchschnittliche Prozentsatz an Senkung des Serumcholesterinspiegels bei den 45 einzelnen Ratten, welche mit 14a-Äthyl-15-keton (Tag 27 vs. Tag 0) behandelt wurden, lag im Bereiche von 12,1 bis 34,9%. Der Durchschnittswert betrug 25,0% (zfc 2,3 S.E. M.).

Bezüglich des Wachstums der Ratten, welche mit in 50 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterinen, und solchen, welche mit Triolein oder Olivenöl behandelt worden waren, bestanden keine nennenswerte Unterschiede.

23

641352

TABELLE II

Wirkungen von 3$-Äthoxy-14a-äthyl-5u.-cholest-7-en-15-on und 5a-Cholest-8(14)-en-3fi-ol-15-on auf den Serum-Cholesterinspiegel von Ratten

Serum-Cholesterin mg pro 100 ml (Durchschnitt ± S.E.M.)

Tag

Triolein

3ß-Äthoxy-14tt-

-äthyl-5a-cho-

lest-7-en-15-on

% Abnahme (bezogen auf mit Triolein behandelten Ratten)

0

-2

88,9 zfc 2,2

89,1 ± 2,2

—

i?

6

81,2 dt 2,8

77,3 ± 2,1

4,8

10

82,9 zfc 3,0

80,1 zt 2,3

3,4

15

81,6 zfc 3,5

78,5 dz 3,3

3,8

21

82,6 dz 3,8

73,1 dz 2,3

11,5

27

81,8 zfc 3,3*

66,8 zfc 2,6

18,3

Tag

Olivenöl (0,2 ml)

5a-Cholest-(8-(14)-en-3ß-ol-15--on (2 mg)

% Abnahme (bezogen auf mit Olivenöl behandelten Ratten)

3

73,7 zfc 2,9

64,5 zfc 2,5

12

Tag

Olivenöl (0,5 ml)

5a-Cholest-8-(14)-en-5ß-ol-15--on (5 mg)

% Abnahme (bezogen auf mit Olivenöl behandelten Ratten)

3

79,5 dz 5,8

59,6 ± 2,2

22

* Die Werte dieser Durschschnittszahl und S.E.M. wurden berechnet, nachdem eine Ratte entfernt worden war, welche am gleichen Tage einen sehr niedrigen Serumcholesteringehalt (55,3 mg pro 100 ml) zeigte. Der Einschluss dieses Wertes ergab einen durchschnittlichen Serumcholesterinspiegel von 78,5 ±4,2 (S.E.M.).

C. Männliche Ratten vom Sprague-Dawley-Stamm wurden in den Sprague-Dawley-Farmen in Madison (Wisconsin) käuflich erworben. Dann wurden die Ratten von 7 Uhr früh bis abends um 5,30 Uhr am Tageslicht und von 5,30 abends bis 7 Uhr früh im Dunkeln gehalten und mit einem chole-sterinfreien Testfuttermittel (United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio) während 13 Tagen gefüttert, bevor man die Experimente begann. 6 Tage vor der experimentellen Periode, wurden Blutproben zur Bestimmung der Serumcholesterinkonzentration entnommen und bezogen auf die Resultate dieser Analysen, wurden die Ratten in drei Gruppen mit ungefähr gleicher durchschnittlicher Serumcholesterinkonzentration aufgeteilt. Die Ratten wurden hierauf individuell in metabolischen Käfigen (Econo-Metabolism Units, Maryland Plastics, New York, New York) während 6 Tagen vor Beginn der Experimentierperiode eingesperrt. Die Tiere wurden hierauf während der ganzen Experimentierperiode dem oben erwähnten Tag-Nacht-Zyklus unterworfen.

Die einzelnen Tiere wurden täglich während der Versuchsdauer gewogen. Die Futteraufnahme durch die einzelnen Ratten wurde in ähnlicher Weise täglich bestimmt.

Eine nennenswerte Verschmutzung des Futters oder eine

Verunreinigung desselben durch Fäkalien oder durch Urin war wegen der Beschaffenheit der metabolischen Käfige und der verwendeten Futterbehälter unmöglich.

Blutproben wurden aus der Schwanzvene zwischen 8.15 5 Uhr und 9.15 Uhr vormittags entnommen, wobei nie mehr als ungefähr 0,5 ml Blut entnommen wurde. Das Serum wurde durch Zentrifugieren des Blutes unter Verwendung von Sure-Sep Junior (General Diagnostics, Division of Warner Lambert Company, Morris Plains, New Jersey) während io 20 Minuten bei 2.000 bis 2.500 Umdrehungen pro Minute in einer Zentrifugiervorrichtung (Dynac, Clay Adams Model 0091) gewonnen. Die Serumcholesterinkonzentration wurde durch Modifizieren des «Cholesterol Auto Test (Bio-Dynamics, BMC Division)», beschrieben in Bio-Dynamics/ i5 bmc Cholesterol Instruction (revised December, 1975) getestet

500 mg 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on, erhalten und gereinigt gemäss den Angaben in Beispiel 1, wurden in kleinen Mengen zu 500 g «Cholesterol Free Test Diet» in 2o einem verschlossenen 2 Liter-Glaskolben eingebracht. Nach jeweiliger Zugabe des Sterins zum Futter wurde die Flasche gründlich geschüttelt und gedreht. Das so erhaltene 0,1 % 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on enthaltende Futtermittel wurde bei 4°C gelagert. Vor dem Verfüttern wurde diese 25 Diät auf Zimmertemperatur (d.h. ungefähr 25°C) erwärmen gelassen.

Die Ratten wurden in drei Gruppen aufgeteilt, welche wie folgt bezeichnet wurden:

1) Ad libitum-Grappe — 6 Ratten bei freiem Zugang zu 3o cholesterinfreier Testdiät.

2) Keton-Gruppe — 7 Ratten mit freiem Zugang zu cholesterinfreier Testdiät, welche 0,1% 5«-Cholest-8(14)--n-3ß-ol-15-on enthielt.

3) Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Keton-35 grappe — 7 Ratten mit Zugang zu der «Cholesterol Free

Test Diet», jedoch nur in einer Menge, welche durch die einzelnen Gegenpartner in der Ketongrappe am vorangehenden Tage konsumiert worden war.

Bei Beginn der Versuchsperiode waren die durchschnitt-« liehen Serumcholesterinkonzentrationen (mg pro 100 ml Serum zfc S.E.M.) für die drei Gruppen die folgenden:

Ad libitum Keton

Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongrappe

71,4 ± 2,4 71,2 dz 0,9

69,0 zfc 2,9

Bei Beginn der Testperiode betragen die durchschnitt-50 liehen Körpergewichtswerte (dz S.E.M.):

Ad libitum 125,3 zt 4,4

Keton 130,4 zfc 4,4 Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der ss Ketongrappe 128,0 zt 4,0

Somit wurden die Gruppen bezüglich des durchschnittlichen Körpergewichtes und der durchschnittlichen Serumcholesterinkonzentration gründlich vermischt.

Das in der Diät nach den obigen Angaben verabreichte 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on zeigte eine ausgesprochene Wirkung bezüglich der Senkung der Serumcholesterinkonzentration. Der durchschnittliche Serumcholesterinspiegel (mg pro 100 mg Serum) von Ratten, welche im Futtermittel « 0,1% 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on erhielt, nahm von einem anfänglichen Wert von 71,2 am 4. Tage bis auf einen Wert von 50,1 und am 8. Tage der Experimentierperiode bis auf einen Wert von 36,9 ab. Die durchschnittlichen

641352

24

Werte der Serumcholesterinkonzentration in der ad libitum Gruppe und der in gleicher Weise wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe gefütterten Gruppe veränderte sich während der Versuchsperiode nicht nennenswert. Diese Werte finden sich in der Tabelle III.

TABELLE III Serumcholesterinkonzentration (mg pro 100 ml)

Tag

0

4

8

Ad libitum

71,4 zfc

2,4

69,9

zt 2,7

70,5

zt 2,4

Keton

71,2 =fc

0,9

50,1

zt 2,3

36,9

dz 3,3

Gleiche Fütte-

69,0 d=

2,9

71,8

dz 4,2

74,9

±4,5

rung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

Die Werte bezüglich der Serumcholesterinspiegel für die drei Gruppen, ausgedrückt in Prozent des Wertes des anfänglichen Spiegels (am Tage 0) bei den einzelnen Ratten nach 4 und 8 Tagen finden sich in der Tabelle IV. Dabei konnte keine nennenswerte Veränderung in der Serumcholesterinkonzentration in der ad libitum-Grappe und in der in gleicher Weise wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe gefütterten Gruppe (nachstehend «pair-fed group» bezeichnet) festgestellt werden.

Der durchschnittliche Wert des Prozentsatzes an Serumcholesterinspiegel am Tage 4 und am Tage 8 der Testperiode, bezogen auf die ursprünglichen anfänglichen Werte, betrug 70,5% bzw. 51,8%.

TABELLE IV

Serumcholesterinkonzentration Prozentsatz der anfänglichen Spiegelwerte bei einzelnen Ratten

Ad libitum

Keton

Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

Tag 4

98,9 zfc 6,3

70,5 zfc

3,6

96,1 zfc 8,1

Tag 8

99,0 dz 2,2

51,8 =t

4,4

109,1 dz 6,1

Die durchschnittliche tägliche Futteraufnahme an den Tagen 2 bis 7 durch die Ratten in den drei Gruppen war die folgende:

Ad libitum 15,5 g

Keton 6,6 g Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe 6,2 g

Das Gewicht der täglichen Futteraufnahme der Ratten in sämtlichen drei Gruppen findet sich in der Tabelle V. Wie daraus hervorgeht, war die Futteraufnahme der Ratten bei einem 0,1 % Keton enthaltenden Futtermaterial wesentlich geringer als bei Ratten in der ad libitum-Gruppe.

Die Veränderung im durchschnittlichen Körpergewicht der Ratten in den drei Gruppen während der ganzen Versuchsperiode findet sich in der Tabelle VI. Der durchschnittliche Wert für die ad libitum-Gruppe stieg von 125,3 g bei Beginn des Versuchs auf 166,3 g bei Ende des Experimentes. Der durchschnittliche Wert für die Ketongruppe nahm von einem anfänglichen Wert von 130,4 g bei Ende des Experimentes bis auf 117,3 g ab. Der durchschnittliche Wert für die «pair-fed group» nahm in ähnlicher Weise von einem Anfangswert von 128,0 g auf einen Endwert von 113,6 g bei Ende des Experimentes ab.

Die durchschnittliche prozentuale Abnahme des Körpergewichtes von den anfänglichen Werten bei den einzelnen Ratten in den drei Gruppen findet sich in der Tabelle VII. Die Werte geben an, dass die im Körpergewicht der Tiere festgestellten Änderungen bei der Verfütterung einer keton-haltigen Diät einer Unterdrückung der Futteraufnahme zuzuschreiben war. Die «pair-fed»-Tiere (welche lediglich jene Futtermittel erhielten, welche durch die mit Keton behandelten Tiere konsumiert worden waren) zeigten eine ähnliche Körpergewichtsveränderung wie die mit Keton behandelten Tiere. Dass die beachtenswerte Abnahme in den Serumcholesterinkonzentrationen in den mit dem Keton behandelten Ratten nicht einer Reduktion der Futteraufnahme zuzuschreiben war, ergibt sich eindeutig aus dem Umstand, dass der Serumcholesterinspiegel der «pair-fed group» (deren Futteraufnahme und Körpergewichtswerte praktisch ähnlich waren wie bei den mit Keton behandelten Tieren) keine Abnahme während der Beobachtungsdauer zeigte.

TABELLE V Futteraufnahme

Tag Ad libitum Keton Gleiche Fütte rung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

0

12,2 dz 0,7

10,4 zt 0,7

14,2

1

15,1 dz 0,6

5,1 zfc 0,3

10,2

2

15,1 dz 0,5

7,1 zfc 0,3

5,0

3

14,5 zt 0,7

5,5 zfc 0,3

7,1

4

13,7 zfc 1,3

7,1 dz 0,5

5,4

5

16,7 dz 0,7

5,8 dz 0,5

7,0

6

16,8 zt 0,5

6,6 dz 0,5

5,8

7

16,1 dz 0,4

7,5 dz 0,5

6,9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

25

641352

TABELLE VI Körpergewicht

Tag

Ad libitum

Keton

Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

0

125,3 dz 4,4

130,4 zfc

4,4

128,0 dz 4,0

1

123,2 ± 4,3

126,6 zfc

4,8

128,9 zfc 2,5

2

131,1 zt 4,5

121,4 zfc

4,4

128,1 zfc 2,2

3

138,2 zt 4,4

120,6 zfc

4,6

122,9 zfc 2,8

4

141,5 zfc 3,2

118,5 zfc

4,0

121,3 zfc 2,3

5

147,0 zt 5,1

119,4 zfc

4,3

117,7 zfc 2,2

6

155,7 zfc 4,7

118,9 zfc

4,8

117,4 zfc 2,5

7

162,0 ± 4,6

116,5 zfc

4,9

114,6 dz 2,4

8

166,3 zfc 4,6

117,3 zfc

4,7

113,6 zfc 3,2

TABELLE VII

Prozentuale Gewichtsveränderung seit Beginn bei den einzelnen Ratten

Tag Ad libitum Keton Gleiche Fütte rung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

1

- 1,7 dz

0,4

+1

rn

1

0,7

+ 1,1 dz

1,7

2

+ 4,6 dz

0,6

- 7,0 dz

0,7

+ 0,4 dz

1,8

3

+ 10,3 ±

0,7

- 7,7 dz

0,7

- 3,8 dz

1,0

4

+12,3 zfc

1,9

- 9,1 zfc

0,7

- 5,0 zfc

1,4

5

+17,4 zfc

1,6

- 8,5 dz

0,5

- 7,7 dz

1,6

6

+24,3 dz

0,9

- 8,7 dz

1,0

- 8,0 dz

1,7

7

+ 30,1 dz

1,3

-10,8 dz

1,3

-10,2 dz

1,8

8

+ 31,7 zfc

1,9

-10,2 dz

0,9

—11,1 dz

1,7

D. Hemmung der Sterinbiosynthese in L-Zellen und in Primärkiilturen von Mäuseleberzellen

Die Wirkung von verschiedenen in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterinen auf die Sterinbiosynthese in L-Zellen und in Primärkulturen von Mäuseleberzellen wurden im wesentlichen unter den ausführlich von [A.A. Kandutsch und H. W. Chen, J. Biol. Chem., Bd. 248, S. 8408 bis 8417 (1973) und A.A. Kandutsch und H.W. Chen, J. Biol. Chem., Bd. 249, S. 6057 bis 6061 (1974)] gemachten Bedingungen getestet.

Die primären Leberzellkulturen wurden aus 16 Tage alten (57 BL/6J) Foeten hergestellt und in einem chemisch definierten, serumfreien Medium, wie es in den obigen Publikationen beschrieben ist, wachsen gelassen. Die L-Zellen, eine Unterlinie des NCTC Klons von 929 Mäuse-Fibro-blasten, wurden in einem in den obigen Publikationen chemisch definierten, serumfreien Medium wachsen gelassen. Diese L-Zellen sind transformierte Fibroblasten, welche als bösartig angesehen werden, da sie als Tumore weiter wachsen, wenn sie in Mäusestämme injiziert werden, aus welchen sie anfänglich erhalten worden waren.

Die Herstellung der steroidhaltigen Medien, die Massnahmen für das Testen der Überführung von [1-14C]-Acetat in durch Digitonin-ausfällbare Sterine, von Fettsäuren und C02 und die Methoden zum Messen von DNA, Protein und HMG-CoA-Reductase waren dieselben wie in den erwähnten publizierten Artikeln. L-Zellenkulturen wurden mit dem in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterinen und deren Derivaten während 4 Stunden preinkubiert und hierauf wurde das [1-14C] -Acetat in einer Konzentration von 4 [JiMol pro ml (4 |i.Ci pro ml) hinzugegeben. Die L-Zellkulturen wurden auch während 5 Stunden mit den in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterinen vor deren Gewinnung zur Bestimmung der HMG-CoA-Reductase-Aktivität der Mikrosomen inkubiert.

Die Bedingungen für die Inkubation der in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterine oder deren Derivate mit Leberzellenkulturen waren ähnlich, wie jene, welche für die L-Zellenkulturen beschrieben worden sind mit dem Unterschied, dass die Kulturen mit den Testverbindungen während 12 Stunden inkubiert wurden, bevor das markierte Acetat hinzugegeben worden war oder bevor sie aus dem Enzymtest gewonnen worden waren.

Die Testverbindungen wurden in mindestens vier Konzentrationen getestet und die Testversuche solange wiederholt, bis die Konzentration der Testverbindung, welche zur Erzeugung einer 50% igen Hemmung erforderlich war, an dem steil geneigten Teil einer Kurve, die durch Auftragen der Aktivität in die Konzentration erhalten wurde, feststellbar war. Um eventuelle Wirkungen allgemeiner Unterschiede im Zellularmetabolismus zu vermindern, wurde die Sterinsynthese aus [1-14C]-Acetat berechnet als das Verhältnis von [14C]-Sterinen zu [14C]-Fettsäuren, wie dies in den beiden Artikeln von Kandutsch und Chen beschrieben wird.

In den Versuchen mit den in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterinen, wie sie weiter unten wiedergegebenen sind, zeigte keine der Testverbindungen eine signifikante Wirkung auf die Geschwindigkeit, mit welcher das markierte Acetat in Fettsäuren einverleibt oder zu Kohlendioxyd oxydiert wurde. Dieses Nichtvorhandensein einer Hemmwirkung auf die letzteren Parameter des Metabolismus zeigte auch, dass die in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterine und deren Derivate im allgemeinen in bezug auf die Zellen unter den beobachteten Bedingungen nicht toxisch waren.

Beispiele der Wirkungen auf eine Zahl von sauerstoffhaltigen Derivaten von Cholesterin (nicht einschliesslich der in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten aufweisenden Sterine) auf die Sterinsynthese in diesen Zellkultursystemen sind in den beiden genannten Artikeln von Kandutsch und Chen publiziert worden. Die Sterinkonzen-trationen, welche erforderlich sind, um eine 50%ige Hemmung der Sterinbiosynthese herbeizuführen, wie dies durch Kandutsch und Chen berichtet wird, waren die folgenden:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

«541352

26

Konzentrationen (\lM, erforderlich für eine 50%ige Hemmung der Sterinsynthese

L-Zellkul-turen

Primärkulturen, von Leberzellen

Cholesterin

—

> 5 200

Cholest-5-en-3 ß-ol-22-on

1,7

37,0

Cholest-5-en-3 ß,22a-diol

3,7

6,0

Cholest-5-en-3 ß,25-diol

0,07

1,0

Dabei ist zu bemerken, dass reines Cholesterin selbst im Leberzellenkultursystem inaktiv ist. 25-Hydroxycholesterin war vor der Offenbarung der vorliegenden Erfindung der beste Inhibitor in der Sterinsynthese.

Die Resultate der Studien der Wirkung einer gewissen Zahl von in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterinen bei der Sterinsynthese in L-Zellen und in Primärkulturen der Leberzellen finden sich in der Tabelle VIII. Wie die in der Tabelle angegebenen Werte zeigen, verursacht eine sehr grosse Zahl von Verbindungen eine 50%ige Hemmung der Sterinsynthese in den L-Zellen bei einer Konzentration von 10~6 Mol oder weniger. 14a--Äthyl-5a-cholest-7-en-3ß,15a-diol verursacht eine 50%ige Hemmung der Sterinsynthese in den L-Zellen bei einer Konzentration von 5 X 18~8Mol. 14a-Äthyl-5a-cholest-7--en-15a-ol-3-on und 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-3a-ol-15-on sind ausserordentlich aktiv, indem sie im wesentlichen eine 100% ige Hemmung der Sterinsynthese bei einer Konzentration von IO-7 Mol ergeben.

Da Leber ein Hauptfaktor der Biosynthese von Cholesterin in tierischen Zellen darstellt, ist die Feststellung,

dass eine signifikante Zahl der Verbindungen in bezug auf die Sterinsynthese in Leberzellen hemmend wirkt, von besonderer Bedeutung. Dabei ist zu erwähnen, dass 14a-Äthyl--5a-cholest-7-en-3ß,15a-diol diebezüglich besonders wirksam ist und eine 50%ige Hemmung der Sterinsynthese bei einer Konzentration von 6 X 10~8 Mol verursacht, was wesentlich niedriger ist als der bisher berichtete niedrigste . Wert von 10-6 Mol für 25-Hydroxycholesterin.

TABELLE VIII

Konzentrationen (\xM ),erforderlich für eine 50%ige Hemmung der Sterinsynthese

L-Zellkul- Primärkulturen turen von Leberzellen

5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-

io -15-on 0,1 5a-Cholest-8(14)-en-3ß,15ß-

-diol 1,8

5a-Cholest-8(14)-en-3 ß, 15a-

„ -diol 3,7

5a-Cholest-8(14)-en-3 ß,7£,-

15^-tiol 5,0

20 5a-Cholest-8(14)-en-3a-ol-15-

-on 0,5 3 ß-Hemisuccinoyloxy-5 a-

-cholest-8(14)-en-15-on 3,2

3 ß-Hexadecanoyloxy-5a-25-cholest-8(14)-en-15-on >16

5a, 14ß-Cholest-7-en-3 ß, 15ß-

-diol 1,0 30 5a,14ß-Cholest-7-en-3ß,15a-

-diol 3,2

5a,14ß-Cholest-7-en-15ß-ol-

-3-on 0,25 35 5a,14ß-ChoIest-7-en-15a-ol-

-3-on 2,0

m 14a-Methyl-5a-cholest-7-en-

-3ß-ol-15-on 0,3

14a-Methyl-5a-choIest-7-en-

-3ß-15ß-diol 0,5

14a-Methyl-5'a-cholest-7-en-

45 -3ß-15a-diol 0,3

3 ß-Methoxy-14a-methyl-5a-

-cholest-7-en-15-on 20,0

3 ß-Methoxy- 14a-methyl-5a-

50 -cholest-7-en-15ß-ol 1,4 3 ß-Methoxy-14a-methyl-5 a-

-cholest-7-en-15a-ol 0,3

4,0 10,3 31,0

4,8

2,5 7,5

4,5

1.8

3,5

1.9

14a-Äthyl-5 a-cholest-7-en-

-3ß,15ß-dioI 0,4 0,8

14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-

-3ß,15a-diol 0,05 0,06 60 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-

-3ß-ol-15-on 0,3 2,1

3 ß-Äthoxy-14a-äthyl-5a-

-cholest-7-en-15-ol 0,7 4,3

65 3 ß-Äthoxy-14a-äthyl-5a-

-cholest-7-en-15-on >22,0 —

27

641352

TABELLE VIII (Fortsetzung)

TABELLE IX

L-Zellkul-turen

Primärkulturen von Leberzellen

14a-Äthyl-5a-cholest-7-en--15a-ol-3-on < 0,1*

14a-Äthyl-5a-cholest-7-en--3a-ol-15-on < 0,1*

3 ß-Hexadecanoyloxy- 14a-

-äthyI-5a-cholest-7-en-15a-ol 7,0 3 ß-Hexadecanoyloxy- 14a--äthyI-5a-cholest-7-en-15ß-ol > 15,0 3 ß-Acetoxy- 14a-äthyl-5 a-

-cholest-7-en-15 ß-ol 0,03

14a-n-Propyl-5a-cholest-7-

-en-3ß,15ß-diol 4,1

14a-n-Propyl-5 a-cholest-7-

-en-3ß,15'a-diol 1,1

14a-n-Propyl-5a-cholest-7-

-en-3ß-ol-15-on 3,4

14a-n-Butyl-5a-cholest-7-

-en-3ß,15a-diol 5,0

14a-n-Butyl-5 a-cholest-7-

-en-3ß,15ß-diol 4,4

14a-n-Butyl-5a-choIest-7-

-en-3 ß-ol-15-on 8,3

* eine im wesentlichen 100%ige Hemmung konnte bei dieser Konzentration beobachtet werden.

E. Reduktion in HMG-CoA-Reduktase in Zellen durch in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragende Sterine

Eine gewisse Zahl von in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterinen wurde gleichfalls bezüglich ihrer Wirkung auf die Aktivität und/oder den Spiegel der Enzyme HMG-CoA-Reductase (3-Hydroxy-3--methylglutaryl-Coenzym-A-Reductase) in den L-Zellen und in den Leberzellen getestet. Wie zuvor festgestellt wurde, besitzt dieses Enzym eine katalytische Wirkung auf die Reduktion des 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyms-A unter Bildung der Mevalonsäure, einem wesentlichen Zwischenprodukt in der Biosynthese von Sterinen und einer Anzahl anderer wesentlicher Verbindungen in den Zellen.

Unter Anwendung der Angaben gemäss Kandutsch und Chen in im obigen Beispiel erwähnten Artikel wurden die Konzentrationen von verschiedenen in 15-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten tragenden Sterinen, welche erforderlich waren, um den Spiegel der Aktivität von HMG--CoA-Reductase um 50% zu reduzieren, in den Zellen der L-Zellen in Kultur und der primären Kulturzellen von Leberzellen bestimmt. Die bei diesen Testen erhaltenen Werte finden sich in der folgenden Tabelle IX.

Konzentrationen (\xM), erforderlich für eine 50%ige Verringerung der Aktivität von HMG-CoA-Reduktase in:

L-Zellkul- Primärkultu-turen ren von

Leberzellen l0 5'a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on

0,3

4,0

5a-Cholest-8(14)-en-3 ß, 15ß-diol

2,5

16,1

5'a-Cholest-8(14)-en-3ß,7£,15£--triol

1,9

18,0

15 5a,14ß-Cholest-7-en-3ß,15ß-diol

4,5

6,0

5'a,14ß-Cholest-7-en-3ß,15a-diol

6,7

12,5

14a-Methyl-5'a-cholest-7-en-3 ß--ol- 15-on

0,3

2,8

14a-Methyl-5a-cholest-7-en-3ß,-20 lSß-diol

1,2

4,3

14a-Methyl-5a-cholest-7-en-3ß,-15a-diol

0,3

2,0

3ß-Methoxy-14a-methyl-5a-25 -cholest-7-en-15ß-ol

3,7

3,5

3 ß-Methoxy-14a-methyl-5 a--cholest-7-en-15a-ol

3,0

1,6

3 ß-Acetoxy-14a-äthyl-5 a-cholest-30 -7-en-15ß-ol

0,13

14a-Ethyl-5a-cholest-7-en-3 ß--ol- 15-on

1,9

2,1

3 ß-Hemisuccinoyloxy-5a-cholest--8(14)-en-15-on

3,0

Es geht bei einem Vergleich der in der Tabelle IX wiedergegebenen Daten mit den Daten in derTabelle XIII eindeutig hervor, dass bei manchen, wenn auch nicht allen 40 Verbindungen die erforderlichen Konzentrationen zur Verursachung einer 50%igen Reduktion im Spiegel der Enzymaktivität für HMG-CoA-Reductase in den Zellen jenen sehr ähnlich sind, welche zur Erzielung einer 50%igen Hemmung der Sterinbiosynthese erforderlich sind.

F. In Anlehnung an das Experiment gemäss Abschnitt C wurde ein weiterer Versuch unternommen, in welchem das 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on in die «Cholesterol Free Test Diet» bei einer Konzentration von 0,2% einverleibt wurde.

Bei Beginn der Experimentierdauer betrugen die durchschnittlichen Körpergewichtswerte in Gramm (± S.E.M.) für die drei Gruppen:

45

Ad libitum Keton

Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

141.2 ± 6,6

152.3 ± 5,5

153,2 ± 6,4

6o Bei Beginn der Experimentierperiode waren die durchschnittlichen Serumcholesterinkonzentrationen (mg pro 100 ml Serum ± S.E.M.) für die drei Gruppen.

Ad libitum Keton

Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

74,3 ± 3,9 80,5 ± 2,8

91,4 ± 3,6

641352

28

Wie aus den obigen Angaben hervorgeht, waren die Gruppen in diesem speziellen Experiment nicht besonders ausgesucht und zwar insbesondere bezüglich der anfänglichen durchschnittlichen Serumcholesterinkonzentrationen. Ungeachtet dieses Umstandes besass das der Diät zugegebene 5a-Cholest-8(14)-en-15-on-3ß-ol eine ausgesprochene Wirkung auf die Serumcholesterinkonzentration.

Die Resultate dieses Experimentes finden sich in der Tabelle X. Wie daraus hervorgeht, nahm der durchschnittliche Serumcholesterinspiegel (mg pro 100 ml Serum) der Ratten, denen 0,2% 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on in der Diät verabreicht wurden, von einem anfänglichen Wert von 80,5 auf einen solchen von 73,2 am Tage 4, auf 32,2 am Tage 7 und auf 30,3 am Tage 9 ab. Der durchschnittliche Serumcholesterinspiegel der ad libitum-Gruppe stieg sehr langsam am Tage 3, war aber praktisch während der ganzen Experimentierperiode unverändert. Bei diesem Versuch blieb aber die durchschnittliche Serumcholesterinkonzentration in der «pair-fed group» während des ganzen Versuches nicht unverändert. Die Serumcholesterinkonzentration fiel von einem Anfangswert von 91,4 auf 62,9 am Tage 7 und auf 55,1 am Tage 9, was wohl ein Resultat der ausgesprochenen Futterrestriktion in diesem Versuch sein dürfte.

TABELLE X

Serumcholesterinkonzentration (mg pro 100 ml)

Tag

Ad libitum

Keton

Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

0

74,3 ± 3,9

80,5 ± 2,8

91,4 dt 3,6

4

80,1 ± 3,9

73,2 ± 3,0

91,8 =t 6,0

7

81,2 ± 3,2

32,2 ± 5,9

62,9 ± 4,5

9

81,8 ± 1,6

30,3 ± 6,2

55,1 ± 6,5

Die Werte in bezug auf den Serumcholesterinspiegel für die drei Gruppen als Prozentsatz des Wertes des anfänglichen Spiegelwertes (Tag 0) in den einzelnen Ratten nach 4, 7 bzw. 9 Tagen finden sich in der Tabelle XI.

TABELLE XI

Serumcholesterinspiegel-Prozentsatz des anfänglichen Spiegels in den einzelnen Ratten

Tag

Ad libitum

Keton

Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

4

109,9 ± 6,1

91,6 dt 4,3

101,0 ±4,1

7

111,1 =t 7,4

40,6 ± 7,9

70,2 ± 5,3

9

111,9 ± 6,0

37,9 ± 8,8

60,9 ± 8,0

Die Änderungen in den durchschnittlichen Körpergewichten für die Ratten in den drei Gruppen während dieser Studie finden sich in der Tabelle XII. Der Durchschnittswert für die ad libitum-Gruppe stieg von 141,2 g bei Beginn des Experimentes auf 178,2 g bei Ende des Experimentes. Der mittlere Wert für die Ketongruppe nahm von 152,3 g bei Beginn auf 122,3g bei Beendigung des Experiments ab. Der durchschnittliche Wert für die «pair-fed group» nahm in ähnlicher Weise von 153,2 g bei Beginn auf 114,4 g bei Beendigung des Experimentes ab.

TABELLE XII Körpergewicht (g)

Tag Ad libitum Keton Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

0

141,2 ±

6,6

152,3 ± 5,5

153,2 ±

6,4

1

143,5 ±

7,1

151,3 ± 4,7

157,2 ±

8,0

2

149,7 ±

7,3

145,4 ± 4,9

152,9 ±

7,6

3

153,0 ±

7,9

139,0 ± 4,8

145,1 ±

7,4

4

161,5 ±

6,5

137,4 ± 4,9

139,0 ±

7,0

5

165,4 ±

6,6

134,5 ± 4,5

133,1 ±

6,7

6

170,4 ±

6,6

130,7 ± 5,1

127,6 ±

3,9

7

177,3 ±

7,1

127,7 ± 5,2

120,1 ±

3,9

8

178,2 ±

7,8

122,3 ± 5,8

114,4 ±

4,0

Wie die Werte in der Tabelle XIII ergeben, war die Futteraufnahme der Ratten bei der 0,2% Keton enthaltenden Diät wesentlich geringer als jene der Ratten in der ad libitum-Gruppe.

TABELLE XIII Tägliche Futteraufnahme (g)

Tag

Ad libitum

Keton

Gleiche Fütterung wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe

0

12,4 ± 1,3

7,2 ±

0,6

13,6 ± 1,4

1

13,2 ± 1,4

4,4 ±

1,1

3,8 ± 0,9

2

14,0 ± 1,6

4,8 ±

0,4

4,3 ± 0,4

3

16,5 ± 0,4

+1

00

0,2

4,5 ± 0,4

4

15,1 ± 0,8

5,5 ±

0,4

4,5 ± 0,4

5

16,7 ± 0,5

5,5 ±

0,3

5,3 ± 0,4

6

17,8 ± 0,3

5,4 ±

0,2

5,4 ± 0,3

7

14,5 ± 1,1

5,1 ±

0,2

5,1 ± 0,2

8

15,9 ± 0,7

4,3 ±

0,6

4,9 ± 0,3

Am 8. Tage des Experimentes konnte festgestellt werden, dass vier der Ratten in der Ketongruppe Diarrhöe aufwiesen. Eine dieser Ratten starb am folgenden Tage. Zwei andere Ratten dieser Gruppe zeigten am 9. Tage einen dünnen Kot.

G. Es wurde ein weiteres Diätexperiment mit 5a-Cho-lest-8(14)-en-3ß-ol-15-on mit 7 Wochen alten Mäusen durchgeführt. Fünf Mäuse wurden mit dem Keton in einer Menge von 0,2% in einer Diät gefüttert, welche im wesentlichen während 8 Tagen keine tierischen Sterine aufwies. Fünf s

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

29

641352

Vergleichsmäuse, welche wie die Vergleichstiere aus der Ketongruppe gefüttert worden waren, wurden mit der gleichen Diät gefüttert, doch ohne dass das Keton hinzugegeben worden war. Die durchschnittliche Plasmacholesterin-konzentration in der Ketongruppe nach 8tägigem Experiment betrug 35,8 (zfc 3,6, S.E.M.) mg pro 100 ml Plasma, während der entsprechende Wert für die Vergleichsgruppe bei 114,4 (=fc 3,4, S.E.M.) lag. Dabei ist festzuhalten, dass ein praktisch gleichmässiges Füttern an Mäusen dieses Alters wegen der kleinen Mengen an einzunehmendem Futter sehr schwierig ist, so dass man genaue Bestimmungen durchführen muss. Die Ketongruppe zeigte eine durchschnittliche

Abnahme des Körpergewichts innerhalb der Versuchsperiode von 5,9 g (± 0,1, S.E.M.). Die Vergleichstiere, welche ohne Keton gefüttert wurden, zeigten eine durchschnittliche Abnahme des Körperpgewichts von 2,4 g (zfc 0,1, S.E.M.). s Zwei andere sauerstoffhaltige Sterine, nämlich 25-Hydroxycholesterin und 7-Ketocholesterin, denen man eine starke Hemmwirkung auf die Synthese von Sterinen in L-Zellen in Kulturen und in den Primärkulturen von Mäuseleberzellen zuschrieb, zeigten, dass sie keine nennenswerte io senkende Wirkung auf das Plasmacholesterin in Mäusen zeigten. (A.A. Kandutsch, H.-J. Heiniger und H.W. Chen, Biochimica et Biophysica Acta, 486, 260-272, 1977).

Claims (5)

1. 641352
2. 2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff eine Verbindung der Formel I mit einer Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 8 und 14 enthält, worin Rj Hydroxyl bedeutet, R2 jedoch nicht Hy-droxyl bedeutet; oder R3 a-Methyl bedeutet und Ri Hydroxyl darstellt, R2 jedoch nicht Hydroxyl bedeutet; oder

   Rs a-Methyl bedeutet und Rj Methoxy darstellt, R2 jedoch nicht Oxo oder Hydroxyl bedeutet; oder Rj und R2 Hydroxyl bedeuten, an das Kohlenstoffatom 7 jedoch keine Hydroxylgruppe gebunden ist.

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Mittel zur Hemmung der Biosynthese der Mevalonsäure, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff eine Verbindung der Formel:

   enthält, deren Grundgerüst gesättigt oder ungesättigt ist und worin o o o II Ii II

   Ri -OH, =0, -0R4( -OCR5, -OC(CH2)nCOH,

   eine Sulfatgruppe oder das Magnesium-, Natrium-, Kaliumoder Pyridiniumsalz einer Sulfatgruppe bedeutet;

   O

   II

   R2 -OH, =0 oder -OCR5 bedeutet;

   R3 a-Wasserstoff, ß-Wasserstoff oder eine a-Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet oder R3 fehlt, wenn eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 8 und 14 vorliegt;

   R6 ein oder zwei Wasserstoffatome, je nach dem Sättigungsgrad des Grundgerüstes, oder =0 oder -OH bedeutet;

   R4 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet; R5 eine aliphatische Gruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine substituierte aliphatische Gruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe bedeutet und n eine ganze Zahl von 2 bis 6 bedeutet, wobei die Substituen-ten Rj und R2, falls sie von =0 verschieden sind, in der a-oder in der ß-Stellung vorliegen.
3. 3 ß-Äthoxy- 14a-äthyl-5a-cholest-7-en-15a-ol, 3 ß-Methoxy--14a-methyl-5a-cholest-7-en-15a-ol, 14a-Äthyl-5a-cholest--7-en-3ß-ol-15-on, 14a-Äthyl-5a-cholest-7-en-3ß,15a-diol oder 14a-Äthyl-5a-cholest-7en-15a-ol-3-on verwendet.

   3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   dass es als Wirkstoff mindestens eines der folgenden Sterine enthält: 5a-Cholest-8(14)-en-3ß-ol-15-on, 5a-Cholest-8(14)--en-3ß,15ß-diol, 5a-Cholest-8(14)-en-3ß,15a-diol, 5a,14ß--Cholest-7-en-3ß,15a-diol, 5a,14ß-Cholest-7-en-3ß,15ß-diol, 14a-Methyl-5a-cholest-7-en-3 ß-ol- 15-on, 14a-Methyl-5 a--cholest-7-en-3ß,15ß-diol, 14a-Methyl-5a-choIest-7-en-3ß,-15a-diol, 3ß-Methoxy-14a-methyl-5a-cholest-7-en-15-on,
4. 4. Mitel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff ein Steroid enthält, das eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 8 und 14 hat und bei dem der Substituent R3 fehlt.
5. 5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   dass es als Wirkstoff ein Steroid enthält, das eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 7 und 8 hat.