DE2858802C2 - Arzneimittel zur unterdrueckung von tumorzellwachstum - Google Patents

Arzneimittel zur unterdrueckung von tumorzellwachstum

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel zur Unterdrückung des Tumorzellenwachstums, enthaltend neben einem üblichen pharmazeutischen Trägerstoff als Wirkstoff ein 15-oxidiertes Sterol.
Die Unterdrückung der Biosynthese von Sterolen sowohl in vivo als auch in vitro ist häufig erwünscht. Zum Beispiel ist es häufig erwünscht, die Bildung des Sterins Cholesterin in tierischen und menschlichen Organismen zu unterdrücken, wodurch der Serumcholesterinspiegel erniedrigt wird. Die Konzentration von Cholesterin im Blutserum ist mit einer Anzahl von Krankheiten, insbesondere Arteriosklerose, korreliert. Cholesterin leitet sich in Tieren von zwei Quellen ab: die erste ist die Aufnahme und Absorption des Nahrungs-Cholesterins, und die zweite ist die Biosynthese von Cholesterin in Acetat durch Zellen von zahlreichen Körperorganen, wie Leber, Eingeweide und Haut. Die Biosynthese von Cholesterin und anderen Sterolen aus Acetat im Körper umfaßt eine komplexe Reaktionsfolge; eine Stufe davon ist die Umwandlung von 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A in Mevalonsäure. Diese Reaktion wird als ein Hauptregulationspunkt in der normalen Biosynthese von Cholesterin in Zellen angesehen. Wenn die Biosynthese von Mevalonsäure in vivo gehemmt werden kann, wird die Produktion von Sterolen verringert; hierdurch können die Serumcholesterinspiegel gesenkt werden.
Abstract Nr. 1714 Fed. Proc. Am. Soc. Exp. Biol. 35 (1976) beschreibt die inhibierende Wirkung auf die Cholesterin-Biosynthese in L-Zellen und in Primärkulturen von Leberzellen von 15-oxidierten Sterolen, wie etwa 5a-Cholest-8(14)-en-3-β,15β-diol.
Tetrahedron Letters 42, S. 3775 bis 3778 (1976) und Tetrahedron Letters 49, S. 4401 bis 4404 (1976) beschreiben 5a-Cholest-8(14)-en-3β,15-diole.
Es ist angegeben, daß diese Diole, wenn sie mit Rattenleberhomogenat-Präparaten inkubiert werden, sich in Cholesterin umwandeln. Ebenfalls wird darauf hingewiesen, daß von einer Anzahl 15-oxidierter Sterole gezeigt wurde, daß sie potente Inhibitoren der Sterin-Biosynthese sind. Diese Angaben beziehen sich auf die Inhibierung der Sterin-Biosynthese in Zellkulturensystemen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß bestimmte 15-oxidierte Sterole, von denen zahlreiche neue Verbindungen sind, die Biosynthese von Mevalonsäure und Sterolen wirksam hemmen. Das Wachstum und die Teilung von Zellen höherer Organismen und bestimmter Mikroorganismen, wie Hefe und Pilze, umfaßt ebenfalls die Bildung von Sterolen. Dementsprechend kann durch die Hemmung der Biosynthese von Mevalonsäure und die dadurch bewirkte Verminderung der Sterolbildung die Hemmung des Wachstums von normalen und von Tumorzellen bewirkt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel zur Unterdrückung des Tumorzellenwachstums, enthaltend neben einem üblichen pharmazeutischen Trägerstoff als Wirkstoff ein 15-oxidiertes Sterol der allgemeinen Formel
in der bedeuten:
eine Sulfatgruppe oder ein Mg-, Na- oder K-Salz einer Sulfatgruppe;
R₄ eine C₁- bis C₆-Alkylgruppe;
R₅ eine C₁- bis C₂₀-aliphatische Gruppe, eine substituierte C₁- bis C₂₀-aliphatische Gruppe oder eine Phenylgruppe; und
n eine ganze Zahl von 2 bis 6, vorzugsweise von 2 bis 4,
wobei die bezüglich den R₁- und R₂-Substituenten möglichen α- oder β-stereoisomeren Formen eingeschlossen sind.
R₄ bedeutet vorzugsweise eine C₁- bis C₃-Alkylgruppe.
Die erfindungsgemäß eingesetzten 15-oxidierten Sterole können in Abhängigkeit von dem erwünschten speziellen Sterol nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Geeignete Zwischenprodukte zur Herstellung der erfindungsgemäßen Sterole sind 3β-Benzoyloxyverbindungen der allgemeinen Formel
Solche 3β-Benzoyloxyverbindungen können durch Hydrolyse in die entsprechenden 3-Hydroxyverbindungen umgewandelt werden. Die Reduktion, zum Beispiel mit Lithiumaluminiumhydrid, ergibt 3β,15-Diole.
Ein weiteres geeignetes Zwischenprodukt zur Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten 15-oxidierten Sterole sind 3β-Benzoyloxy,14α,15α- epoxy-Verbindungen der allgemeinen Formel
Diese Verbindungen können mit einem Reduktionsmittel zu den entsprechenden 3β,15α-Diolen umgesetzt werden.
Die obengenannten 15-oxidierten Sterolverbindungen können in Verabreichungseinheitsformen in Verbindung mit üblichen pharmazeutischen Trägerstoffen verabreicht werden. Geeignete Verabreichungseinheitsformen hängen etwa von der speziellen Wirkung ab, die mit den Sterolen erreicht werden soll.
Typische Verabreichungseinheitsformen umfassen orale Verabreichungsformen, wie Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulate oder oral verabreichbare Lösungen. Andere Verabreichungseinheitsformen umfassen sublinguale und bukkale Verabreichungsformen, äußerlich anwendbare Verabreichungsformen und parenterale Verabreichungsformen zur subcutanen, intramuskulären oder intravenösen Verabreichung.
Gewünschtenfalls können die 15-oxidierten Sterole in einfacher Weise zu Dosiseinheitsformen verarbeitet werden, die sich für die besondere Verabreichungsart eignen, wobei die Menge des aktiven Wirkstoffs jeder Dosiseinheit so gewählt ist, daß eine oder mehrere Einheiten für jede therapeutische Verabreichung erforderlich sind. Jede Dosiseinheit enthält vorzugsweise etwa 5 bis etwa 1000 mg einer oder mehrerer aktiven 15-oxidierten Sterolverbindungen.
Die Dosis des aktiven 15-oxidierten Sterols, das zur Erzielung einer erwünschten Wirkung erforderlich ist, variiert über einen weiten Bereich und hängt etwa von der Art des betreffenden verabreichten 15-oxidierten Sterols, der erwünschten Wirkung und der Verabreichungsart ab. Typischerweise beträgt eine geeignete Dosis etwa 0,1 bis etwa 140 mg aktives 15-oxidiertes Sterol pro Kilogramm Körpergewicht und Tag. Typischerweise wird eine geeignete 1 bis 4mal täglich verabreicht.
Geeignete pharmazeutische Träger- und Hilfsstoffe, die zur Formulierung von Verabreichungseinheiten verwendet werden können, sind bekannt. Wenn zum Beispiel das 15-oxidierte Sterol in Form einer festen Zusammensetzung, wie einer Tablette, verabreicht werden soll, kann das aktive 15-oxidierte Sterol mit einem pharmazeutischen Träger, wie Gelatine, Stärke, Laktose, Magnesiumstearat, Talkum oder Gummi arabicum vermischt werden. Tabletten können mit Sucrose oder mit anderen Verbindungen nach bekannten Methoden überzogen werden, um den Zerfall im Magen zu verzögern und dadurch eine verlängerte Wirkung über einen verlängerten Zeitraum zu gewährleisten.
Kapsel-Zubereitungen können durch Vermischen des aktiven 15-oxidierten Sterols mit einem inerten pharmakologisch verträglichen Füllstoff oder Verdünnungsmittel und Einfüllen des erhaltenen Gemisches in eine harte Gelatinekapsel oder in eine weiche Kapsel erhalten werden. Eine Sirup- oder Elixier-Zubereitung kann die aktiven 15-oxidierten Sterole zusammen mit einem Süßstoff, wie Sucrose, antiseptischen Verbindungen und/oder geeigneten Färbemitteln enthalten.
Äußerlich anwendbare Zubereitungen können durch Vermischen der aktiven 15-oxidierten Sterole mit geeigneten Salbengrundlagen hergestellt werden. Typische Salbengrundlagen sind Polyvinylalkohol oder wachsartige Polyäthylenglycole oder andere nichttoxische, lipophile Verbindungen oder Träger.
Eine parenteral verabreichbare Flüssigkeit ist herstellbar durch Auflösen oder Suspendieren des aktiven Wirkstoffs in einer sterilen Trägerflüssigkeit, wie Wasser oder Kochsalzlösung, einem nicht-flüchtigen flüssigen Polyäthylenglycol oder einem Öl pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, wie Dorschleberöl oder Olivenöl. Parenteral verabreichbare Flüssigkeiten können vorteilhafterweise ebenfalls bekannte Gleitmittel, Bakterizide und Fungizide, Tonizitätsanpassungsmittel, Lokalanästhetika oder Stabilisatoren beinhalten.
Der Mechanismus, nach welchem die aktiven 15-oxidierten Sterole wirken, ist nicht vollständig bekannt. Es ist jedoch gezeigt worden, daß die aktiven Verbindungen die Biosynthese von Sterolen aus Acetat hemmen, jedoch nicht die Biosynthese von Sterolen aus Mevalonsäure. Da Mevalonsäure ein wesentliches Zwischenprodukt im biochemischen Syntheseweg, bei welchem Sterole aus Acetaten gebildet werden, darstellt, ist es klar, daß die 15-oxidierten Sterole die Mevalonsäurebildung hemmen.
Es ist bekannt, daß eine Stufe in der Biosynthese von Sterolen aus Acetat die Umwandlung von 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A in Mevalonsäure umfaßt. Die Geschwindigkeit dieser Reaktion wird durch das Enzym HMG-CoA-Reduktase kontrolliert. Es wird angenommen, daß die erfindungsgemäß eingesetzten 15-oxidierten Sterole durch eine gewisse Einwirkung auf die HMG-CoA-Reduktase wirken, entweder durch Herabsetzen ihrer Aktivität oder durch Beschränken ihrer Menge in dem System durch Zerstörung oder Unterdrückung ihrer Bildung. Zellen, die sich dauernd teilen, wie Zellen der Epidermis, des sich entwickelnden Gehirns, Vertiefungen der Eingeweideschleimhaut und spontan entstehende Tumoren, synthetisieren Cholesterin in vivo mit relativ hohen Geschwindigkeiten; Zellen in der Interphase, wie Zellen des Muskels und des ausgewachsenen Gehirns tun dies nicht. Versuche mit Zellkulturen zeigen, daß die Zellteilung in vitro ebenfalls eine Cholesterinsynthese erfordert. Dementsprechend wirkt die Hemmung der Cholesterinbildung durch Blockieren der Biosynthese von Mevalonsäure auf die in vivo-Replikation von Zellen ein, die sich normalerweise in einem Teilungsstadium befinden. Die Unterdrückung der Cholesterinbildung durch das Blockieren der Biosynthese von Mevalonsäure bewirkt natürlich auch die Senkung der Serumcholesterinspiegel.
Die Beispiele erläutern die Erfindung; einschließlich bevorzugter Verfahren zur Herstellung zahlreicher aktiver 15-oxidierter Sterole.
Beispiel 1 Herstellung von 5α-Cholest-8(14)-en-3β-ol-15-on
3β-Benzoyloxy-5α-cholest-8(14)-en-15-on wurde entsprechend dem von Knight et al., J. Biol. Chem. Band 241, S. 1502 (1966) hergestellt. Der Schmelzpunkt, das Infrarotspektrum, die Elementaranalyse und das Massenspektrum des Produkts bestätigten seine Struktur. Das Produkt zeigte eine einzige Komponente bei der Dünnschichtchromatographie-Analyse in drei verschiedenen Systemen.
1,0 g 3β-Benzoyloxy-5α-cholest-8(14)-en-15-on wurden in 350 ml Äthanol gelöst. 20 ml Wasser und 60 ml konzentrierte Schwefelsäure wurden nach und nach zugegeben, und das erhaltene Gemisch wurde 12 Stunden unter Rückfluß erhitzt, gekühlt, unter vermindertem Druck auf ½ seines Volumens eingeengt und mit 1000 ml einer 0,5 m NaCl-Lösung verdünnt. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt und zweimal aus Aceton-Methanol- Wasser umkristallisiert.
Die Kristalle wurden in Aceton ausgelöst und in Gegenwart von Norite A 15 Minuten erwärmt. Die Lösung wurde durch Hyflo Super-Cel (Johns-Manville Corp.) filtriert, und das Super-Cel wurde mit Methanol (zweifaches Volumen des Acetons) gewaschen. Die Aceton- und Methanollösungen wurden vereinigt, und nach Zugabe von Wasser wurden 660 mg (83% Ausbeute) eines kristallinen Produkts gebildet, das gesammelt und im Vakuum getrocknet wurde. Bei dem Produkt handelte es sich um 5α-Cholest- 8(14)-en-3β-ol-15-on der Formel
und die Struktur des Produkts wurde durch Infrarot-(IR), Ultraviolettspektral-(UV), kernmagnetische Resonanzspektral- (NMR) und Massenspektral-(MS) Analysen bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzige Komponente bei der dünnschichtchromatographischen Analyse auf Silicagel G-Platten unter Verwendung von 10% Äther in Benzol und 35% Äthylacetat in Chloroform als Lösungsmittelsysteme.
Beispiel 2 Herstellung von 5α-Cholest-8(14)-en-3β,15-diolen
3,97 mMol 3β-Benzoyloxy-cholest-8(14)-en-15-on in 104 ml Äther wurden mit 16 mMol Lithiumaluminiumhydrid zwei Stunden bei Raumtemperatur reduziert. Das überschüssige Reagens wurde durch nach und nach erfolgende Zugabe von Äthylacetat, einer gesättigten Lösung von Ammoniumchlorid und Wasser zersetzt. Die Extraktion mit Äther ergab 2,6 g Produkt, das der Chromatographie auf einer aktivierten Kieselsäure-Säule (75×3 cm) unterworden wurde.
Unter Verwendung von Benzol-Äther (90 : 10) als Elutionsmittel wurden Fraktionen von jeweils 25 ml gesammelt. Es wurden 672 mg eines epimeren Diols, als Diol A bezeichnet, in den Fraktionen 250 bis 375 eluiert. Nach vierfachem Umkristallisieren aus Aceton-Wasser wurde bei der dünnschichtchromatographischen Analyse in drei verschiedenen Systemen eine Komponente festgestellt. 930 mg eines zweiten epimeren Diols, als Diol B bezeichnet, wurde in den Fraktionen 425 bis 650 eluiert. Nach dreifachem Umkristallisieren aus Aceton-Wasser zeigte die Verbindung eine einzige Komponente bei der dünnschichtchromatographischen Analyse in drei verschiedenen Systemen.
Die Elementar-, IR-, UV-, NMR-, MS- und röntgenkristallographischen Analysen bestätigten, daß die Diole A und B die nachstehend aufgeführte Struktur haben, wobei die 15-Hydroxygruppe des Diols A sich in der α-Position und die 15-Hydroxygruppe des Diols B in der β-Position befinden:
Beispiel 3 Herstellung von 3β-Hexadecanoyloxy-5α-cholest-8(14)-en-15-on
Hexadecanoylchlorid (2,2 g; 8,0 mMol) wurde zu einer Lösung von 5α-Cholest-8(14)-en-3β-ol-15-on (2,0 g; 5,0 mMol) in 10 ml wasserfreiem Pyridin gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde unter Rückfluß 1 Stunde unter einer Stickstoffatmosphäre erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch in Wasser gegossen und gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden nacheinander mit Wasser, kalter wäßriger 5prozentiger Chlorwasserstoffsäure, wäßrigem 5prozentigem Natriumcarbonat und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde der Silicagel-Säulenchromatographie (140 g; 250 bis 74 µm; 140 cm×2 cm) unterworfen. Unter Verwendung von Benzol als Elutionsmittel wurden 24 ml- Fraktionen (Durchflußrate 1,5 ml pro Minute) gesammelt. Die Inhalte der Fraktionen 9 bis 40 wurden vereinigt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus Aceton-Wasser umkristallisiert, wobei 3β-Hexadecanoyloxy-5α- cholest-8(14)-en-15-on (3,80 g; 59,5% Ausbeute) der Formel
erhalten wurden.
Die Struktur der Verbindung wurde durch IR-, NMR- und MS- Analysen bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzige Komponente bei den dünnschichtchromatographischen Analysen auf Silicagel G-Platten in drei verschiedenen Lösungsmittelsystemen (Benzol, 10% Äther in Benzol und Petroläther-Hexan-Essigsäure).
Beispiel 4 Herstellung von 3β-Hemisuccinoyloxy-5α-cholest-8(14)-en-15-on
Bernsteinsäureanhydrid (2,5 g; 24,9 mMol) wurde zu einer Lösung von 5α-Cholest-8(14)-en-3β-ol-15-on (2,0 g; 5,0 mMol) in 20 ml wasserfreiem Pyridin gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 5 Stunden unter Rückfluß unter einer Stickstoffatmosphäre erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch in 0,034 n Natriumchloridlösung gegossen und 5% Methylenchlorid enthaltender Äther (250 ml) zugegeben. Die abgetrennte Ätherphase wurde nacheinander mit kalter 5prozentiger Chlorwasserstoffsäure und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde dreimal aus Aceton-Wasser umkristallisiert. Die erhaltenen Kristalle wurden 20 Minuten mit Norite A in Aceton behandelt, durch Hyflo Super-Cel filtriert und Erniedrigen der Temperatur auf -78°C kristallisiert. Das erhaltene kristalline Produkt (1,8 g; 73% Ausbeute) erwies sich bei den IR-, NMR- und MS-Analysen als 3β-Hemisuccinoyloxy-5α-cholest-8(14)-en- 15-on der Formel
Die Verbindung zeigte bei den dünnschichtchromatographischen Analysen auf Silicagel G-Platten unter Verwendung von Methanol oder Äthanol als Entwickler lediglich eine Komponente.
Beispiel  Herstellung von 3α-Benzoyloxy-5α-cholest-8(14)-en-15-on
Eine Lösung von Diäthylazodicarboxylat (0,87 g; 5,0 mMol) in 5 ml Tetrahydrofuran wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von 5α-Cholest-8(14)-en-3β-ol-15-on (1,00 g; 2,5 mMol), Triphenylphosphin (1,97 g; 7,5 mMol) und Benzoesäure (0,61 g; 5,0 mMol) in 30 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gegeben. Nach 14stündigem Rühren wurde das Gemisch in Wasser gegossen und mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Der erhaltene hellgelbe Feststoff wurde der Silicagel-(100 g; 250 bis 53 µm)-Säulen-(60 cm×2,0 cm)- Chromatographie unterworfen. Unter Verwendung von Benzol als Elutionsmittel wurden 24 ml-Fraktionen (Durchflußrate 1,5 ml pro Minute) gesammelt. Die Inhalte der Fraktionen 40 bis 95 wurden vereinigt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus Aceton-Wasser kristallisiert, wobei kristallines 3α-Benzoyloxy-5α-cholest-8(14)-en-15-on erhalten wurde. Durch IR-, NMR- und MS-Analysen wurde die Struktur bestätigt als
Die Verbindung zeigte eine einzige Komponente bei den dünnschichtchromatographischen Analysen auf Silicagel G-Platten (Lösungsmittelsysteme: Benzol, 10% Äther in Benzol, 10% Äther in Hexan, 5% Aceton in Chloroform und 35% Äthylacetat in Chloroform).
Beispiel 6 Herstellung von 5α-Cholest-8(14)-en-3α-ol-15-on
Zu 3α-Benzoyloxy-5α-cholest-8(14)-en-15-on (500 mg; 1,00 mMol) in absolutem Äthanol (175 ml) wurde Wasser (10 ml) und konzentrierte Schwefelsäure (30 ml) gegeben. Nach dem Erhitzen des Gemisches unter Rückfluß während 24 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre wurde das Volumen auf etwa ½ des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck eingeengt und das Gemisch in Wasser gegossen. Das Gemisch wurde gründlich mit 5% Methylenchlorid enthaltendem Äther extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Der erhaltene hellgelbe Rückstand wurde zweimal aus Aceton-Wasser kristallisiert. Die Kristalle wurden in Aceton gelöst und in Gegenwart von entfärbendem Kohlenstoff (Norite A) 15 Minuten erwärmt. Die Lösung wurde durch Hyflo Super-Cel (Johns-Manville Corp.) filtriert, und das Super-Cel wurde mit Methanol gewaschen. Die Aceton- und Methanollösungen wurden vereinigt, und nach Zugabe von Wasser wurde ein kristallines Produkt (326 mg; 82% Ausbeute) gebildet, das gesammelt und im Vakuum getrocknet wurde. Durch IR-, NMR- und MS-Analysen wurde das Produkt als 5α-Cholest-8(14)-en-3α-ol-15-on mit der Strukturformel
bestätigt.
Die Verbindung zeigte eine einzige Komponente bei den dünnschichtchromatographischen Analysen auf Silicagel G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, 5% Aceton in Chloroform und 35% Äthylacetat in Chloroform) und bei den Gas-Flüssigkeits-chromatographischen Analysen auf 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur 270°C).
Beispiel 7 Herstellung von 5α-Cholest-8(14)-en-15α-ol-3-on
Zu Komponente 1 (180 ml) des "Biodynamics-(BMC Division)-Cholesterol- Auto-Test" wurde "Cholesterinoxidase" (5,5 ml; Komponente 3 des Cholesterol-Auto-Tests) gegeben und das erhaltene Gemisch wurde mit destilliertem Wasser (540 ml) verdünnt. 5α-Cholest-8(14)-en-3β,15α-diol (105 mg; 0,26 mMol) in Isopropanol (40 ml) wurde zugegeben, und das erhaltene Gemisch wurde unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C inkubiert.
Eine gesättigte Natriumchloridlösung (200 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde fünfmal mit 100 ml-Portionen Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wurde der Silicagel-(150 g; 210 bis 44 µm)-Säulen-(90×2,0 cm)-Chromatographie unter Verwendung von 10% Äther in Benzol als Elutionsmittel (Durchflußgeschwindigkeit 5 ml pro Minute) unterworfen. Es wurden 20 ml-Fraktionen gesammelt. Die Inhalte der Fraktionen 25 bis 45 wurden vereinigt und nach Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck aus Aceton-Wasser kristallisiert, wobei 5α-Cholest-8(14)-en-15α-ol-3-on (88 mg; 85% Ausbeute) der Formel
erhalten wurde.
Die Struktur der Verbindung wurde durch IR-, NMR- und MS-Analysen bestätigt. Die Verbindung zeigte eine einzige Komponente bei den dünnschichtchromatographischen Analysen auf Silicagel G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 10% Äther in Benzol, 35% Äthylacetat in Chloroform und 5% Aceton in Chloroform) und eine Reinheit von über 98% bei den Gas-Flüssigkeits-chromatographischen Analysen auf 3% OV-1- und 3% OV-17-Säulen (Säulentemperatur 270°C).
Beispiel 8 Herstellung von 5α-Cholest-8(14)-en-15-on-3β-pyridiniumsulfat
Pyridinschwefeltrioxid (5,0 g) wurde zu 5α-Cholest-8(14)-en-3β- ol-15-on (2,0 g; 5,0 mMol) in wasserfreiem Chloroform (50 ml; Äthanol-frei; getrocknet über einem Linde-Molekularsieb, Type 3A) gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Das überschüssige Reagens wurde abfiltriert, mit einer geringen Menge Chloroform gewaschen, und das Filtrat wurde in einem Trockeneis-Aceton-Bad auf -40°C abgekühlt und durch Hyflo Super-Cel (Johns-Manville Corp.) filtriert. Das Chloroform-Filtrat wurde mit Hexan versetzt, bis es wolkig wurde, wobei bei anschließender Kühlung auf 0°C ein weißer Niederschlag erhalten wurde. Dieses Material wurde abfiltriert und in einem Vakuumexsiccator 100 Stunden bei Raumtemperatur zur Entfernung sämtlicher Lösungsmittelspuren belassen. Das Produkt, 5α-Cholest-8(14)-en-15-on-3β-yl-pyridiniumsulfat (2,4 g; 86% Ausbeute) hatte die folgende Strukturformel, wie durch IR-, NMR- und MS-Analysen bestätigt wurde:
Das Produkt zeigte eine einzige Komponente bei den dünnschichtchromatographischen Analysen auf Silicagel G-Platten (Lösungsmittelsysteme: 25% Äthylacetat in Methanol und 25% Äthylacetat in Äthanol).
Beispiel 9 Herstellung von 5α-Cholest-8(14)-en-15-on-3β-yl-kaliumsulfat- (monohydrat)
5α-Cholest-8(14)-en-15-on-3β-yl-pyridiniumsulfat (1,0 g; 1,79 mMol) wurde in destilliertem Wasser (50 ml) bei Raumtemperatur gelöst, und eine wäßrige gesättigte Kaliumchloridlösung wurde langsam zu der gerührten Mischung zugegeben. Nach 15 Minuten wurde die erhaltene Suspension filtriert, mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumexsiccator mehrere Stunden getrocknet. Der erhaltene weiße Rückstand (0,85 g; 89%) wurde durch IR-, NMR- und MS-Analysen bestimmt als 5α-Cholest-8(14)-en- 15-on-3β-yl-kaliumsulfat-(monohydrat) mit der Formel
Beispiel 10 Herstellung von 5α-Cholest-8(14)-3,15-dion
Zu einer wasserfreien Methylenchloridlösung von 5α-Cholest- 8(14)-en-3β,15α-diol (0,4 g; 1,0 mMol in 20 ml) wurde eine Lösung von Chromtrioxid (3 g) in einer Mischung von wasserfreiem Methylenchlorid (40 ml) und wasserfreiem Pyridin (3 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten unter Stickstoff gerührt, mit Äther versetzt, und die Lösung wurde mit kalter 5prozentiger Chlorwasserstoffsäure und Wasser gewaschen. Die Lösung wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein Rückstand (0,35 g) erhalten wurde, der durch präparative Dünnschichtchromatographie (Kieselsäure; Lösungsmittel: Benzol) gereinigt wurde. Das Produkt wurde aus Aceton-Wasser umkristallisiert (Ausbeute: 0,332 g; 84%). Durch IR-, NMR- und MS-Analysen wurde gezeigt, daß es sich um 5α-Cholest-8(14)-3,15-dion der Formel
handelte.
Beispiel 11 Hemmung der Sterolbiosynthese in L-Zellen und in primären Kulturen von Mäuseleberzellen
Die Wirkung von zahlreichen 15-oxidierten Sterolen auf die Sterolbiosynthese in L-Zellen und in primären Kulturen von Mäuseleberzellen wurde im wesentlichen unter den im einzelnen bereits früher (A. A. Kandutsch und H. W. Chen, J. Biol. Chem., Band 248, S. 8408-8417 (1973) und A. A. Kandutsch und H. W. Chen, J. Biol. Chem., Band 249, S. 6057-6061 (1974)) beschriebenen Bedingungen geprüft.
Die primären Leberzellkulturen wurden aus 16 Tage alten (C57BL/6J)- Föten hergestellt und in serumfreiem, chemisch definiertem Medium, wie in den vorstehenden Literaturstellen beschrieben, wachsen gelassen. Die L-Zellen, eine Sublinie von NCTC Klin 929 Mäusefibroblasten, wurden in einem serumfreien, chemisch definierten Medium, wie in vorstehenden Literaturstellen beschrieben, wachsen gelassen. Diese L-Zellen sind transformierte Fibroblasten, die als bösartig angesehen werden, da sie als Tumoren wachsen, wenn sie in den Mäusestamm, von dem sie ursprünglich erhalten wurden, injiziert werden.
Die Herstellung der steroidhaltigen Medien, die Verfahren zur Bestimmung der Umwandlung von (1-¹⁴C)-Acetat in Deigitonin- präzipitable Sterole, Fettsäuren und CO₂ und die Methoden zur Messung von DNA, Protein und HMG-CoA-Reduktase wurden wie in den vorgenannten Literaturstellen beschrieben, durchgeführt. Die L-Zellkulturen wurden 4 Stunden mit den 15-oxidierten Sterolen (Sterinen) und ihren Derivaten vorinkubiert, dann wurde (1-¹⁴C)- Acetat in einer Konzentration von 4 µMol pro ml (4 µCi pro ml) zugegeben; oder die L-Zellkulturen wurden 5 Stunden bei den 15-oxidierten Sterolen inkubiert, bevor sie zur Bestimmung der mikrosomalen HMG-CoA-Reduktase-Aktivität geerntet wurden.
Die Bedingungen für die Inkubation der 15-oxidierten (15-sauerstoffhaltigen) Sterole oder ihrer Derivate in Leberzellkulturen waren ähnlich denen, wie sie für die L-Zellkulturen beschrieben wurden, mit der Ausnahme, daß die Kulturen mit den Testverbindungen 12 Stunden inkubiert wurden, bevor das markierte Acetat zugegeben wurde oder bevor sie für die Enzymbestimmung geerntet wurden.
Die Testverbindungen wurden über einen Bereich von mindestens vier Konzentrationen geprüft, und die Bestimmung wurde wiederholt, bis die zur Hervorrufung einer 50prozentigen Hemmung erforderliche Konzentration der Testverbindung sich auf dem steil abfallenden Teil eines Diagramms befand, in dem die Aktivität gegen die Konzentration aufgetragen war. Um jede mögliche Wirkungen von allgemeinen Unterschieden im Zellmetabolismus zu verringern, wurden die Raten der Sterolsynthese aus (1-¹⁴C)-Acetat berechnet als das Verhältnis von (¹⁴C)-Sterolen zu (¹⁴C)-Fettsäuren, wie dies in den vorstehend zitierten Publikationen von Kandutsch und Chen beschrieben ist.
In den nachstehend beschriebenen Versuchen mit den 15-oxidierten Sterolen hatte keine der Testverbindungen eine signifikante Wirkung auf die Einbauraten des markierten Acetats in Fettsäuren oder auf die Oxidationsrate zu Kohlendioxid. Das Fehlen eines Hemmeffekts auf die letztgenannten Parameter des Metabolismus zeigt ebenfalls, daß die 15-oxidierten Sterole und ihre Derivate im allgemeinen unter den Versuchsbedingungen nicht toxisch auf die Zellen wirken.
Beispiele von Wirkungen einer Anzahl oxidierter Derivate von Cholesterin (welche keine 15-oxidierten Sterole einschließen) auf die Sterolsynthese in diesen Zellkultursystemen sind in den vorstehend zitierten Artikeln von Kandutsch und Chen publiziert worden. Die zur Erzielung einer 50prozentigen Hemmung der Sterolbiosynthese erforderlichen Sterolkonzentrationen, wie sie von Kandutsch und Chen angegeben werden, sind wie folgt:
Zur 50prozentigen Hemmung der Sterolsynthese erforderliche Konzentration (µMol)
Es sollte beachtet werden, daß reines Cholesterin in Leberzellkultursystemen inaktiv ist. 25-Hydroxycholesterin war vor der vorliegenden Erfindung der stärkste Inhibitor der Sterolsynthese dieses Typs gewesen.
Die Ergebnisse von Studien einer Anzahl von 15-oxidierten Sterolen auf die Sterolsynthese in L-Zellkulturen und in primären Leberzellkulturen sind in Tabelle I zusammengestellt. Aus den Daten dieser Tabelle geht hervor, daß eine sehr große Anzahl der Verbindungen eine 50prozentige Hemmung der Sterolsynthese in den L-Zellen bei einer Konzentration von 10-6 m oder weniger bewirkt.
Da die Leber eine Hauptstelle für die Biosynthese von Cholesterin in tierischen Zellen darstellt, ist der Befund, daß eine beträchtliche Anzahl der Verbindungen hemmend auf die Sterolsynthese in Leberzellen wirkt, von besonderer Bedeutung.
Tabelle I
Zur 50prozentigen Hemmung der Sterolsynthese erforderliche Konzentration (µMol)

Claims (4)

1. Arzneimittel zur Unterdrückung des Tumorzellwachstums, enthaltend neben einem üblichen pharmazeutischen Trägerstoff als Wirkstoff ein 15-oxidiertes Sterol der allgemeinen Formel in der bedeuten: eine Sulfatgruppe oder ein Mg-, Na- oder K-Salz einer Sulfatgruppe; R₄ eine C₁- bis C₆-Alkylgruppe;
R₅ eine C₁- bis C₂₀-aliphatische Gruppe, eine substituierte C₁- bis C₂₀-aliphatische Gruppe oder eine Phenylgruppe; und
n eine ganze Zahl von 2 bis 6,
wobei die bezüglich den R₁- und R₂-Substituenten möglichen α- oder β-stereoisomeren Formen eingeschlossen sind.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 5α-Cholest-8(14)-en-3β,15β-diol enthält.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 5α-Cholest-8(14)-en-3β,15α-diol enthält.
4. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 5α-Cholest-8(14)-en-3β-ol-15-on enthält.
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