DE1933375B2 - 25-hydroxyverbindungen der vitamind-reihe, verfahren zu ihrer herstellung und 25-hydroxycholecalciferol enthaltendes mittel - Google Patents
25-hydroxyverbindungen der vitamind-reihe, verfahren zu ihrer herstellung und 25-hydroxycholecalciferol enthaltendes mittelInfo
- Publication number
- DE1933375B2 DE1933375B2 DE19691933375 DE1933375A DE1933375B2 DE 1933375 B2 DE1933375 B2 DE 1933375B2 DE 19691933375 DE19691933375 DE 19691933375 DE 1933375 A DE1933375 A DE 1933375A DE 1933375 B2 DE1933375 B2 DE 1933375B2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- vitamin
- hydroxycholecalciferol
- fractions
- ppm
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Ο—C-R'
thiumaluminiumhydrid reduziert und Cholesl 5,7-dien-3/*,25-diol aus dem Reaktionspro
dukt isoliert oder
b) den aus der Verbindung der Formel V erhal tenen26-Norcholest-5,7-dien-25-on-3/i-yleste
in einem geeigneten Lösungsmittel mit eine Methyl-Grignard-Verbindung umsetzt, da:
Reaktionsgemisch in eine kalte, wäßrige Am moniumchioridlösung gibt, die Lösungsmit
telschicht abtrennt und daraus Cholest 5.7-dien-3/i.25-diol isoliert und das erhaltene
Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol der Formel II!
OH
(HD
HO
mit Ultraviolettlicht bestrahlt und die Bestrahlungsprodukte chromatographisch aufarbeitet
6. Mittel, enthaltend 25-Hydroxycholecalciferol
neben üblichen inerten und physiologisch verträglichen Träger- oder Hilfsstoffen.
35 Die Erfindung betrifft neue 25-Hydroxyverbindun
gen der Vitamin-D-Reihe. Insbesondere betrifft die Erfindung die 25-Hydroxyverbindungen von Vitamin
D2 (Ergocalciferol) und von Vitamin D, (Cholecalciferol)
der Formeln I und II
40
45
in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 16 Kohlen-Stoffatomen oder eine Phenylgruppe und R' eine
Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe bedeutet, in einem geeigneten
Lösungsmittel mit Ν,Ν'-Dibromdimethylhydantoin bis zur Lösung des N,N '-Di oromdimethylliydantoins
umsetzt, die erhaltene Lösung abkühlt, das aufgefallene Dimethylhydantoin abfiltriert, das
Filtrat zur Trockne einengt, den Rückstand in einem geeigneten Lösungsmittel aufnimmt und mit
einer Lösung von Trimcthylphosphit umsetzt, das Lösungsmittel abzieht, den erhaltenen Rückstand
chromatographisch über ein Aluminiumoxid enthaltendes Absorptionsmaterial auftrennt
und entweder
a) den aus der Verbindung der Formel IV erhaltenen Diester von Cholest-5,7-dien-3/>'.25-dio!
in einem geeigneten Lösungsmittel mit Li-
CH,
HC)
25-Hydroxyergocalciferol
25-Hydroxyergocalciferol
Γ OU
CH,
HO
25-HvdroxvcholecaIciferol
Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Her-.tellung
dieser Verbindungen.
Die antirachitische wirkung von Vraminen der D-Reihe, insbesondere von Ergocalciferol und Cholecalciferol,
ist ebenso wie deren Verwendung als Zusätze zu Nahrungsmitteln bekannt.
Es wurde überraschenderweise festgestellt dp 6 die
25-Hydroxyderivate dieser Verbindungen, die den Formeln 1 und II entsprechen, eine größere biologische
W lrkung autweisen als die Stammverbindun°en Sie sind daher als Arzneimittel besonders wirksam, insbesondere
zur Bekämpfung von rachitischen Erkrankungen.
Die neuen Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man Säugetiere, insbesondere
Schweine, mit an Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol angereichertem Futter über einen längeren Zeitraum
verabreicht, dann deren Blut sammelt, das Blutplasma
isoliert, die Serumproteine des Blutplasmas abtrennt
die Serumproteine mit einem Methanol-Chloroform-Gemisch
extrahiert, den gegebenenfalls in Chloroform angereicherten Extrakt wäscht und einengt, den Rückstand
mit einem niedrig siedenden Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch aufnimmt und chromatographisch
über Kieselsäure die entsprechende 25-Hydroxy verbindung von Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol
abtrennt. Wenn auch in den folgenden Heispielen nur die biologische Bildung der 25-Hydroxy-
verbindungen an kastrierten Ebern gezeigt wird, so ist diese Synthese nicht auf diese Tiere beschränkt,
denn auch bei anderen Warmblütern, nämlich Hühnern, konnten diese Hydroxyderivate nach Verfüttern
von Ergo- und Cholecalciferol im Blut nachgewiesen werden. Für eine praktische Gewinnung dieser neuen
wirksamen Substanzen, kommen abtr nur Säugetiere
in Frage, da nur bei diesen eine Blutentnahme in größerem Maße ohne Schädigung der Tiere möglich ist.
Es wurde weiter festgestellt, daß 25-Hydro.xycholecalciferol
durch Bestrahlen einer Lösung von Cholest-5.7-dien-3p'.25-diol
mit Ultraviolettlicht und chromatographische Aufarbeitung des Bestrahlungsprodukts
hergestellt werden kann.
Cholest-5.7-dien-3,y.25-dioi der Formel 111
—ς-O H
HO
ist eine n. u,- Verbindung. Sie kann dadurch hergestellt
werden, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel
O -O-C-R
(ivi
C = O
(V)
in der R eine Alkylgruppc mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen oder eine Pheny!gruppe und R' eine Alkylgruppc
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenyigruppe bedeutet, in einem geeigneten Lösungsmiltel
mit N.N'-Dibromdimethylhydantoin bis zur Lösung des N.N'-Dibromdimethylhydantoins umsetzt.
die erhaltene Lösung abkühlt, das ausgefallene Dimethylhydantoin ahfillriert. das Filtrat zur Trockne
einengt, den Rückstand in einem geeigneten Losungsmitlel
aufnimmt und mit einer Lösung von I iimcthylphosphit umsetzt, das I.ösungsmitlcl ab/ichl.
den erhaltenen Rückstand chromatographisch über ein Alimiiniumoxyd enthaltendes Absorptionsmaterial
auftrennt und entweder
al den aus der Verbindung der Formel IV erhaltenen
Diester von Cholcst-5.7-dien-3,;.25-diol in
einem geeigneten Lösungsmittel mit Lilhiumaluminiuinhydrid
reduziert und Cholest-5.7-dien-.y'.25-diol aus dem Reaktionsprodukt isoliert.
oder
b) den aus der Verbindung der Formel V erhaltenen 26-Norcholcst-5.7-dicn-25-on-.V-y lostet" in einem
geei;1. "ton Lösungsmittel mil einer Meihyl-Gri-(
>o gnard-Verbindung umsetzt, das Reaklionsgemisdi
in eine kalte wäßrige Ammoniumchloridlösung
gibt, die Lösuiigsmittelschichi abtrennt und daraus
Cholcsl-5.7-dien-3,;.25-diol isoliert.
Als Gruppen R und R' sind die niederen Alkylgruppen. insbesondere die Melhylgruppc sowie die Phenylgnippc
bevorzugt.
5
Das Verfahren wird durch folgendes Formclschcma erläutert:
Das Verfahren wird durch folgendes Formclschcma erläutert:
O
S- O -C-R'
S- O -C-R'
il ,
R—C—O
(IV)
— c—ο
(V)
O R--C
HO
Ii ,
R—C —O
O (- -O —C R'
OH
(HD
HO
(III)
HO
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele
niiher erläutert.
Herstellung von 25-Hydroxyergocaleiferol.
biologisch
biologisch
IEs wurden vier kastrierte Eber gemischter Zucht
mit einem Gewicht von 75 bis 91 kg mit Futter gefüttert, dem so viel in Wasser dispergierbares Vitamin
D2 zugesetzt worden war, daß je 450 g Futter 70 000 Internationale Einheiten Vitamin D2 vorhanden
waren. Hierduich wurde jedes Schwein täglich mit 500 000 I. E. Vitamin D2 gefüttert. Nach 26 Tagen
dieser Fütterung wurde das Blut der Schweine gesammelt und sofort mit '/io des Volumens einer 0.1 m-Natriumoxalatlösung
zur Verhütung des Koagulierens versetzt. Die Zellen wurden aus dem Blut abzentrifugiert.
Das erhaltene Plasma (4,1 1) wurde mit so viel Ammoniumsulfat versetzt, bis eine 70%ige Sättigung
erreicht war. Das Plasma wurde bei 4 C 7 Tage stehengelassen, bis die Serumproteine ausgefällt waren.
Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren über 25 Minuten bei 25 000 U/Min, in einer Sharplcs-AS-Y6-P-Zentrifuge
gesammelt und mit 6.6 1 eines Gemisches von Methanol und Chloroform im Verhältnis
2:1 extrahiert und 24 Stunden stehengelassen. Anschließend wurden unter Rühren nochmals 2.21
Chloroform zugegeben. Das denaturierte Protein wurde durch Filtrieren über Glaswolle abgetrennt und
mit weiteren 4.4 1 des Methanol-Chloroform-Gemisches
extrahiert. Die vereinigten Filtrate wurden zu einer wäßrigen, melhanolhaltigen Phase und einer
Chloroformphase absitzen gelassen. Die wäßrige Phase wurde abgezogen und erneut mit 2 1 Chloroform extrahiert
und erneut absitzen gelassen. Die Chloroformschichten wurden vereinigt, mit 10 1 Wasser gewaschen.
24 Stunden stehengelassen und in einem Rotationsschnellverdampfer eingeengt, bis 50 ml eines öligen,
schwarzen Rückstandes erhalten wurden. Der Rückstand wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung getrocknet.
Er wurde im Rotationsschnellverdampfer /.um Trocknen eingedampft und in 100 ml eines
im wesentlichen aus η-Hexan bestehenden Kohlenwasserstoffgemisches aus unmittelbar destillierten aliphatischen
Naphthafraktionen mit einem Siedebereich von 65 bis 67 C (Skelly B) gelöst.
Zur Auftrennung der gewünschten Plasmafraktionen durch Chromatographie wurde zuerst ein radioaktives
Auftrennungsprofi! für das Plasma wie folgt aufgenommen:
Es wurde radiochemisch reines 3H-Vitamin D2 hergestellt,
indem 1 g Vitamin D2 mit 3,0 Ci tritiierter
Essigsäure 2 Wochen stehengelassen wurde und das Produkt dreimal über eine Vielfachsäule mit Kieselsäure
und einmal über eine Säule mit umgekehrter Phase bis zur Erzielung einer konstanten spezifischen
Aktivität chromatographiert wurde. Das erhaltene 3H-Vitamin D2 hatte eine spezifische Aktivität
von 12001/Min./I.E. oder 8,6mc/mMol (vgl. P. Neville
und H. F. D e L.u c a in »Biochemistry«, Bd. 5 [1966], S. 2201, bezüglich der Säulen und der Bestimmung
der radiochemischen Reinheit).
Es wurden 10 Ratten von je etwa 400 g Gewicht,
die mit einer an Vitamin D armen Diät gemäß
H. Steenbockin »Science«, Bd.58 (1923), S.449.
gefüttert worden waren, intraperitoneal mit 10 0001. E.
Η-Vitamin D2 in 0,1 ml Äthanol behandelt. Nach
24 Stunden wurde durch Herzpunktierung Blut entnommen und zentrifugiert. Es wurden 40 ml Plasma
erhallen. Das Plasma wurde mit einem Gemisch von Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1 gemäß
Blunt u. a. in »Biochemistry«, Bd. 7 (1968), S. 3317.
extrahiert. Der Chloroformextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in einem Schnellvcrdampfcr
zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit dem KolilcnwasserstolTgemisch wie vorher
gelöst und mit dem aus dem Schweineblut erhaltenen Extrakt vermischt.
Der kombinierte Extrakt wurde in fünf gleiche Teile aufgeteilt und jeder Teil über eine Säule mit Kieselsäurefüllung
gemäß Blunt a. a. O. chromatogra-
is phiert. Das Radioaktivitätsprofil des Extrakts in einer
derartigen Säule ist in der beigefügten F i g. 1 wiedergegeben, wobei das Maximum III unverändertes Vitamin
D, darstellt. Die Fraktionen von je 10 ml unter jedem Maximum wurden vereinigt und auf antirachitische
Wirkung biologisch nach dem Reihentest gemäß der US-Pharmakopoe 1955 gegen Ratten geprüft.
Die Fraktionen unter dem Maximum IV(F ig. 1) waren etwa 1.5mal aktiver als die Fraktionen unter
dem Maximum III. während die Fraktionen unter den Maxima I, II. IVa und V wenig oder keine biologische
Aktivität besaßen.
Die Fraktionen des Maximums IV von den fünf Teilmengen wurden gesammelt, in einen Schnellverdampfer
zur Trockne eingedampft und erneut auf einer Mehrfachsäule mit Kieselsäure gemäß Neville
und De L u c a a. a. O. chromatographierl, wobei jedoch
die Mischkammer 250 ml des Kohlenwasscrstofflösungsmiltels (Skellysolve B) und die Vorratskammer
400 ml eines Gemisches von 85% Diäthyl-
äther im Kohlenwasserstoffgemisch enthielt. Sobald
die Vorratskammer leer war. wurde sie mit 300 m! reinem Diäthyläther gefüllt. Das Elutionsprofil der
kombinierten Fraktionen, in 5-ml-Fraktionen aufgeteilt,
ist in F i g. 2 wiedergegeben, wobei das Maximum IVa immer noch auftritt.
Die Fraktionen 63 bis 98 wurden vereinigt, im Schiicüverdampfer eingedampft und über einer Verteilungskolonne
mit Celitc (Diatomecnerde) wie folgt chromatographiert:
Es wurden 200 ml des KohlenwasserstofflösungsinittHs
(Skelly B) mit dem gleichen Volumen eines Gemisches aus S0"n Methanol und 20% Wasser äquilibrien.
Es wurden 20 g Celitc mit 15 ml der Methanolphase gemischt und trocken in Teilmengen von 2 cm
in einer Säule von 60 cm Höhe und 1 cm Durchmesser gepackt. Die Oberphasc wurde als mobile
Phase benutzt. Die kombinierten Fraktionen wurden in 1 bis 3 ml der mobilen Phase auf die Säule gebracht,
und die Säule wurde mit der mobilen Phase entwickelt.
Es wurden 5-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 11 bis 17 wurden erneut vereinigt, zur Trockne
eingedampft und auf einer gleichen Verteilungssäule erneut chromatographiert. Das Radioaktivitätsprofil
auf dieser Seite ist in F i g. 3 wiedergegeben.
Die Radioaktivitätsbestimmungen wurden mil einem Flüssigkeits-Scintillationszähler (Packard Tri-Carb
Modell 3003) mit einem automatischen, äußeren Standardisierungssystem durchgeführt. Die zu zählenden
Proben wurden mit einem Luftstrom zur Trockne eingedampft, in Toluol-Zähllösiing aus 2 g
2.5-Diphenyloxazol und 100 mg l,4-bis-[2-(4-m?lhyl·
5-phenyloxazolyl)benzol] je Liter Toluol eelöst und
ausgezählt.
309 507/551
Identifizierung
Zur Identifizierung war es erforderlich, die als
Maximum IV erhaltene Verbindung in den Tctramc-Ihylsilyläthcr
zu überführen. Es wurden 30 g des isolierten Materials unter einem Strom von trockenem
Stickstoff zur Trockne eingedampft. Es wurden einige Tropfen einer Reagenzlösung aus 10 ml trockenem
Pyridin, 4 ml Hexamethyldisilazan und 2 ml Trimethylsilylchlorid
zugefügt, die Lösung mit Stickstoff gespült und das Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur
im Dunkeln stehengelassen. Es wurden 3 ml des Kohlenwasserstofflösungsmittels (Skclly B) zugefügt
und 2 ml 10%iger Schwefelsäure zugegeben. Das Gemisch wurde heftig gemischt und dann absitzen
gelassen. Die Kohlenwasserstoffphase wurde über wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und
über eine Kieselsäure enthaltende Säule gemäß L u η d
u.a. in »Arch. Biochem. Biophysics«. Bd. 120 (1967), S. 513, Chromatographien. In den Röhrchen 19 bis
27 wurde die Silylätherverbindung (15 |xg) gefunden,
die durch Gaschromatographie als rein befunden wurde. Sie wurde zur Bestimmung des Massenspektrums
verwendet.
Das Ultraviolettspektrum und die gaschromatographischen Werte ließen die Trien-Struktur des Vitamins
D2 in der Verbindung vermuten. Das Massenspektrum der Verbindung aus dem Maximum IV
ergab intensive Maxima beim m/<?-Wert 136 (C9H12O)
und 118 (C9H10) aus dem Ring A einschließlich C6
und C7, die auch im Spektrum des Vitamins D2
auftreten.
Das Massenspektrum der Verbindung aus dem Maximum IV zeigte ein ionisiertes Molekül bei m/e
412; 16 Masseneinheiter. mehr als beim Vitamin D2.
was auf ein zusätzliches Sauerstoffatom hinweist. Durch ein hochauflösendes Massenspektrum wurde
dieser Befund bestätigt, der die genaue Masse des Ions
mit 412.3341 ergab, entsprechend der Zusammensetzung von C28H44O2 (berechnet 412,3341). Die Lage
des zusätzlichen Sauerstoff-Substituenten in der Seitenkette ergibt sich aus dem Vergleich der Spektren
von Vitamin D2 und der neuen Verbindung. Beide zeigen Maxima bei m/e 271 (C19H27O — 271,2065 gemäß
der hochauflösenden Massenspeklrometrie). Diese ergeben sich aus dem Verlust der gesamten Seitenkette
durch die Spaltung der Bindung bei C17 bis
C20. Außerdem enthielt das hochauflösende Spektrum der neuen Verbindung kleinere Maxima, die wahrscheinlich
der Seitenkette selbst entsprechen, bei m/e 141,1255 (C9H17O) und 123.1181 (C9H15).
Ein Bruchstück der Masse 59 (C3H7O gemäß der
hochauflösenden Massenspektrometrie) und die Abspaltung
von 58 Masseneinheiten aus dem Molekülion zu einem Maximum bei m/e 354 (354,2900 —
C25H38O) im Massenspektrum des Materials aus den
Fraktionen IV, aber nicht im Spektrum des Vitamins D2 ergaben einen Hinweis auf die Hydroxylfunktion
bei C25. Das erstere Maximum würde aich
durch Spaltung der C^js-Bindung zum Ion (CH2J2
= OH(+) und das letztere durch eine Wasserstoffumlagerung unter Abspaltung der Acetonstruktur ergeben,
was bei Hotnoallylalkoholen ein bekannter Prozeß ist
Der Beweis für die Stellung der Hydroxylgruppe wurde aus dem Massenspektriim des Silyläthers der
Verbindung aus dem Maximum IV erhalten, das ein Molekülion bei m/e 556 für einen Di-trimethylsilyläthcr
und das erwartete starke Maximum bei m/e 131
(Grundmaximum) entsprechend der Struktur
C6H15SiO (CHj)2C=C)-Si(CHj)J
durch hochauflöscnde Massenspektrometrie zeigte.
Dieses Maximum, das auch im Spektrum der Trimethylsilylälherderivale
von 25-Hydroxycholesterin und 25-HydroxycholecalciferoI auftritt, aber nicht in
ίο den Spektren der Silyläther von Vitamin D2 oder D3.
macht die Lage der zusätzlichen Hydroxylfunktion am C25 Atom erforderlich.
Das Kernresonanzspektrum des Materials aus den Fraktionen des Maximums IV, das in CDC!3-Lösung
mit einem Varian Associates Modell HA-100-Spektromcler
mit angeschlossenem Rechner für die Zeitmittlung wegen der kleinen Substanzmengen unter
Verwendung von Tetramcthylsilan als Vcrgleichsstandard
aufgenommen wurde, unterstützte diese Schlußfolgerungen und ergab unabhängigen Beweismaterial
für die angenommene Struktur der Verbindung gemäß Formel I. Es wurden die folgenden Werte
als Λ-Werte in Teilen je Million Teile (ppm) gegenüber Tctramethylsilan (A = O) erhalten. Ein starkes
Singulett bei A 1.24 ppm kann den beiden Methylgruppen
am C25 zugeschrieben werden, während zwei DuplettsbeirtO.79(J
= 6.5 Hz)und0,81 ppm (J = 7.0Hz)
auf die restlichen Methylsubstituenten der Scitcnketten an C21 und C28 zurückgeführt werden müssen.
Die Spektren von 25-Hydroxycholesterin und 25-Hydroxycholecalcifcrol
zeigen ein Singulett für die Methylgruppen an C26 und C27 in der gleichen Stellung
(A 1,20 ppm). Es muß bemerkt werden, daß zwei
DuplcUsbcinO.87(J = 7,0 Hz)und.) 0.98(J = 6.0Hz)
im ursprünglichen Ergocalciferolspcktrum in der neuen Verbindung nicht mehr vorliegen. Dieser Befund
kann nur durch eine Hydroxylsubstitution am C25 erklärt
werden, da diese Dupletts zwei Methylgruppen entsprechen. Das verbleibende identifizierbare Kennzeichen
ist das Singulett an der angularen C18-Methylgruppe. Diese Werte lassen die Struktur der neuen
Verbindung als 25-HydroxycrgocalcifcroI der Formel
I erkennen.
Die hochauflöscnden Massenspektren wurden mit einem MS-9-Spektrometer der Associated Electrical
Industries erhalten, der mit einem Rechner Scientific
Data Systems Sigma-7 gekoppelt war.
Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol.
biologisch
Es wurden vier kastrierte Eber von 94 bis 118 kg
mit einem Normalfutter, das mit täglich 250 000 Internationalen Einheiten (I.E.) Vitamin D3 angereichert
war, 26 Tage gefüttert. Das Blut der Schweine wurde gesammelt und mit 1,61 0,1 m-Natriumoxalatlösung
behandelt Es wurden 6,8 1 Plasma erhalten. Die Serumproteine wurden durch Zugabe von so viel
Ammoniumsulfat zum Serum, daß eine Sättigung von 65 bis 70% erreicht wurde, ausgefällt. Die Niederschlagbildung
erfolgte durch Stehenlassen über 3 Tage bei 4° C. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren
25 Minuten bei 15 000 U/Min, gesammelt und mit 9 1 Methanol—Chloroform im Verhältnis 2:1 extrahiert*).
Der Gesamtextrakt aus diesem Verfahren wurde eingeengt und auf 50 ml mit einem Kohlenwasserstoff-
*) Canadian J. Biochem. PhysioU Bd. 37 (1959), S. 911.
lösungsmittel, das hauptsächlich η-Hexan enthielt und
aus direkt destillierten aliphatischen Naphthas erhalten worden war (Skelly B) mit einem Siedcbercich
60 bis 68 C vermischt und auf 100000 I.E. ViI-amin-D-Wirkung
biologisch im Ratlcn-Rcihenvcrsuch gemäß der US-Pharmakopoe 1955 geprüft.
Its wurden 20 ml des Extrakts auf eine chroinalographischc
Absorplionssäule mit 25 g Kieselsäure von 58 cm Höhe und 1.5 cm Durchmesser gegeben. Die
Säule wurde mit einem Äiher-Skelly-B-Gemisch mit
abfallender Konzentration eluiert, das dadurch erhalten wurde, daß 400 ml eines Gemisches aus 851Vo
Äther in Skelly B aus einer Vorratskammer in einer Mischkammer, die anfangs 250 ml Skelly B enthielt,
laufengelassen wurden. Nachdem 36 Fraktionen von 11 ml gesammelt worden waren, wurde in die Vorratskammer
250 ml reiner Äther gegeben. Es wurden weitere 30 Fraktionen von 11 ml gesammelt. Die Fraktionen
5! bis 60 wurden vereinigt und auf eine Verteilungssäule gegeben. Diese Säule wurde wie folgt aufgebaut:
20 g Celite (Diatomeenerde) wurden mit 15 ml einer stationären Phase aus 80% Methanol
und 20Vo Wasser, äquilibriert mit einem gleichen Volumen Skelly B. vermischt. Etwa 2 , des Materials
wurden in eine Glassäule von 1 cm Durchmesser gepackt. Die Fraktionen 51 bis 60 wurden in einer
kleinen Menge mobiler Phase (Skelly B. äquilibricrl mit Methanol—Wasser) auf die Säule gegeben und
mit mobiler Phase eluiert, wobei Fraktionen von 5 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen 17 bis 21
wurden vereinigt. Der Rest von den 50 ml Ausgangsextrakt wurde in gleicher Weise chromatographiert
und verteilt und die gleichen Fraktionen gesammelt.
In allen Fällen wurden die Fraktionen, die ein Ultraviolett Absorptionsmaximum bei 264 ιτίμ in Diäthylather
hatten (,· = 18 200) gesammelt und vereinigt.
Identifizierung
Durch das Ultraviolettspektrum und gaschromatographische
Werte wurde das isolierte Material mit einer dem Vitamin D3 ähnlichen Struktur in Zusammenhang
gebracht. Durch eine hochauflösende Massenspektrometric gemäß Beispiel 1 wurden die
Unterschiede der Struktur zwischen der neuen Verbindung und Vitamin D3 aufgeklärt.
Das Molekulargewicht des isolierten Produkts betrug 400 (C27H44O2. ein Cholecalciferol). Im Massenspektrum
des isolierten Produkts und im Vitamin D3 zeigt die Gegenwart eines Maximums bei
m/e 271 (C19H27O) die Stelle der zweiten Hydroxylgruppe
an der Seitenkette an, da das Fragment m/e 271 durch einen Verlust der Seitenkette durch
Spaltung der Bindung bei C17 bis C20 auftritt. Außerdem
könnte ein Maximum bei m/e 59 (C3H7O) im
Spektrum der isolierten Verbindung, aber nicht im Spektrum des Vitamins D3, durch eine Spaltung
der Bindung bei C24 — C25 auftreten, wobei die
Hydroxylgruppe am C25 gebunden ist. Die Lage der
Hydroxylgruppe am C25 wurde mit dem Kernresonanzspektrum
bei 100 MHz (gemessen in CDCl3 mit Tetramethylsilan als Standard) gemäß Beispiel 1
verifiziert. Hierbei wurde ein starkes Singulett-Maximum
bei b 1.20 ppm (wie in 25-Hydroxycholesterin)
und die Abwesenheit des Dupletts bei h 0,87 ppm wegen der sekundären C26 27-Methylgruppen wie im
Cholecalciferol aufgefunden. Die anderen Besonderheiten des Kernresonanzspektrums, die beim Vitamin
D3 und der neuen Verbindung identisch sind, sind die folgenden:
<) 0,58 ppm — Tetramethylsilan.
Λ 0,54 ppm Resonanz der C18 — H,-Gruppe.
Λ 0.93 ppm - Duplett der C21 — H,-Gruppe
(./ = 6 Hz).
<) 4,81,5,03 ppm —■ Maxima der C19 — H2-Gruppe.
Λ 6,02 ppm (J = 11.5 Hz), 6,24 ppm (J = 10,5 Hz)
Dupletts der Protonen in den Stellungen
6 und 7.
Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol,
synthetisch
synthetisch
A. Herstellung von Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol
aus 3.25-Cholcsteryldiacetat
aus 3.25-Cholcsteryldiacetat
Es wurden 100 mg 3,25-Cholesteryldiacetai in
einem Gemisch aus 1,5 ml trockenem Benzol und 1,5 ml eines trockenen Kohlenwasserstoffgemisches.
das hauptsächlich aus η-Hexan besteht und durch direkte Destillation von Naphthas hergestellt worden
ist und einen Siedebereich von 60 bis 680C hat (Skelly B), gelöst. Die erhaltene Lösung wurde zu
32 mg feinpulverisiertem N.N'-Dibromdimcthylhydantoin
in einem Reagenzglas zugegeben, das dann in ein Wasserbad von 72 bis 74" C eingetaucht wurde.
Nach vollständiger Lösung des N.N'-Dibromdimethylhydantoins
wurde die Lösung in Eis gekühlt. Der gebildete kristalline Niederschlag von Dimethylhydantoin
wurde abfiltriert und zweimal mit je 1 ml kaltem Skelly B gespült. Die Spülflüssigkeit und das
Fillrat wurden zur Trockene unterhalb 40 C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand
wurde in 0.4 ml trockenem Xylol aufgenommen. Die Lösung wurde tropfenweise zusammen mit zweimal
0.1 ml Spülflüssigkcit zu einer Lösung von 0.1 ml TrimethylphoNpliit in 0.3 ml Xylol gegeben, die auf
etwa 130 bis 135 C gehalten worden war. Das erhaltene Gemisch wurde etwa 90 Minuten umgesetzt,
während es auf der angegebenen Temperatur gehalten wurde und anschließend bei etwa 65° C unter vermindertem
Druck zur Trockne eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wurde in Skelly B gelöst und auf eine chromatographische Säule mit 25 g
neutralem Aluminiumoxid der Aktivitätsstufe I gegeben. Die Säule wurde mit einem Gemisch aus Diäthyläther
und Skelly B im Verhältnis 3. ΐ und danach mit einem Gemisch dergleicnen Lösungsmittel
im Verhältnis 1 · 1 eluiert. Es wurden Fraktionen von 12 ml gesammelt. Die das Diacetat von ChoJest-5,7-dien-3f)'.25-diol
gemäß dem Ultraviolettspektrum (Maxima bei 272. 282 und 294 mμ) enthaltenden
Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft.
Es wurde die Diacetatverbindung erhalten, die in 3 ml trockenem Äthyläther gelöst und mit einer kleinen
Menge (10 mg) Lithiumaluminiumhydrid etwa 5 Minuten umgesetzt wurde. Die erhaltene Lösung
wurde mit mehreren gleichen Teilen Wasser zur Entfernung anorganischer Bestandteile gewaschen, getrocknet
und der Äther unter vermindertem Druck abgezogen. Der erhaltene Rückstand in einer Menge
von 18 mg wurde als Cholest-5,7-dien-3/?,25-diol mit
folgenden Eigenschaften identifiziert:
F. 169 bis 1710C (aus wäßrigem Methanol), UV-Spektrum:
).max 272, 282 und 294 πΐμ.
29^7
'282 UOOO. Kernresonanzspektrum;
t „ι
Q8 — H3 ι) 0.65 ppm.
Qs — H3 Λ 0,98 ppm,
C21 — H3 Λ 0,89 ppm (Duplett. J = 6.5 Hz),
C26.27 — H3 Λ 1,20 ppm,
C67 — H Λ 5,4 ppm (Multiple«).
Als Ausgangsmaterial können auch andere Ester als die 3,25-Diacetatverbindung eingesetzt werden.
Die Estergruppen brauchen nicht in den Stellungen 3 und 25 gleich zu sein. Zum Beispiel kann 25-Benzoyloxy-cholesterylacetat
in gleicher Weise als Ausgangsmaterial verwendet werden, wobei vergleichbare
Ergebnisse erhalten werden. Im allgemeinen kann der Substituent in 3-Slellung am Steroidkern des
Ausgangsmaterials eine Gruppe der Formel
R' CO O -
sein, in der R eine Alkylengruppe mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe ist. und der
Substituent in der 25-Stellung kann eine Gruppe der Formel
R' — CO — O —
sein, in der R' eine Ajkylgruppe mil I bis 6 Kohlenstoffatomen
oder eine Phenylgruppe ist.
An Stelle von Lithiumaluminiumhydrid kann z. B. auch alkoholisches Kalium oder Natriumhydroxid
zur Reduktion verwendet werden.
B. Herstellung von Cholest-5,7-dien-3/7.25-diol
aus 26-Norcholest-5-en-25-on-3/i'-ylacetat
aus 26-Norcholest-5-en-25-on-3/i'-ylacetat
Kemresonanzspektrum:
C18-H3 Λ 0,63 ppm,
C«~~H3 Λ 0,95 ppm,
C27 — H3 d 2,12 ppm,
OCOCH3 Λ 2,02 ppm.
C«~~H3 Λ 0,95 ppm,
C27 — H3 d 2,12 ppm,
OCOCH3 Λ 2,02 ppm.
ίο Durch Gaschromatographie wurde gefunden, dai
die einzige Verunreinigung aus dem Ausgangsmate rial 26-Norcholest-5-en-25-on-3/i-ylacetat bestand.
Es wurden 245 mg des Rückstands, der etwa 180 ms
der 5,7-Dien-Verbindung enthielt, in 3.5 ml trockenen-Benzol
gelöst und zu einer Grignardreagenzlösum zugefügt, die durch Zugabe von 0,24 mg Methyljodic
in 2,5 ml trockenem Äther zu 72 mg Magnesiumdrehspänen
erhalten worden war. Das Gemisch wurde 2,5 Stunden am Rückfluß erhitzt, 17 Stunden
stehengelassen und anschließend zu einer kalten Ammoniumchloridlösung zugegeben. Es bildete sich
eine wäßrige Schicht und eine Ätherschicht. Die Ätherschicht wurde abgezogen, getrocknet und der
Äther verdampft. Der Rückstand wurde mit Skelly B verrieben und ergab nach dem Filtrieren 212 ms
eines amorphen Pulvers, das gemäß dem Ultraviolettspektrum und der Gaschromatographie aus
140 mg Cholest-5.7-dien-3/i,25-diol bestand, während
der Rest 25-Hydroxycholesterin war.
Mengen der Reaktionsteilnehmer. Temperaturen und Lösungsmittel können auch geändert werden,
ohne daß die Ergebnisse erheblich voneinander abweichen. Es können auch andere Aufarbeitungsverfahren
angewendet werden.
Es wurden 142 mg 26-NorchoIest-5-en-25-on-3/i-ylacetat
in einem Gemisch aus 2,2 ml trockenem Skelly B gelöst und zu 50 mg Ν,Ν'-Dibromdimethylhydantoin
gegeben. Die Umsetzung wurde gemäß Verfahren A durchgeführt. Der erhaltene Rückstand
wurde in 0,5 ml Xylol aufgenommen. Die Lösung wurde zusammen mit 0,3 ml Xylol-Spülflüssigkeit
tropfenweise zu 0,15 ml Trimethylphosphit in 0,5 ml Xylol von etwa 130 bis 135° C gegeben. Das Gemisch
wurde 90 Minuten bei dieser Temperatur umgesetzt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem
Druck bei etwa 65° C abgezogen.
Der erhaltene Rückstand wurde in Chloroform gelöst und auf eine chromatographische Säule mit
20 g neutralem Aluminiumoxid der Aktivuätsstufe I gegeben. Die Säule wurde mit Chloroform eluierl.
Es .wurden Fraktionen von 5,5 ml gesammelt. Das 26 - Norcholest - 5,7 - dien - 25 - on - 3// - ylacetat wurde
das den Fraktionen 10 bis 14 durch Eindampfen des Lösungsmittels gewonnen. Die Dienverbindung
im Produkt wurde durch folgende spektroskopischc Werte identifiziert:
Ultraviolettspektruni:
/„„«272. 282, 294ma.,2S2 = 11000.
Infrarotspektrum: („
Infrarotspektrum: („
'■ma* 1730. 1712 cm"1, entsprechend der
Carbonylabsorplion der Acetat- bzw.
Mclhylketongruppcn.
Carbonylabsorplion der Acetat- bzw.
Mclhylketongruppcn.
C. Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol
aus Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol
aus Cholest-5,7-dien-3/i,25-diol
Es wurden 106 mg des gemäß Verfahren B hergestellten Gemisches mit einem Gehalt von 70 mg
Cholest-5,7-dien-3/f.25-diol in 400 ml Äther gelöst
und unter einer Hochdruck-Quecksilberdampflampe (Hanau. Modell 654A) 3,5 Minuten bestrahlt. Die
Bestrahlung wurde in einem Mantel um einen doppclwandigen. wassergekühlten Quarzfinger durchgeführt.
Während der Bestrahlung wurde die Ätherlösung heftig gerührt und kontinuierlich mit Stickstoff ausgespült.
Die Bestrahlungsprodukte wurden in einer Vielfachsäule gemäß G. A. Fischer und J. J. Kabara
in Anal. Biochem., Bd. 9 (1966). S. 303, mit 14 g wärmeaktivierter Kieselsäure (Bio-Rad. HA. Siebmaschengröße
unter 0.044 mm der California Corp. for Biochemical Research, Los Angeles. California.
USA) unter Verwendung von Äther-Skelly B im Verhältnis 1 : 1 chromatographiert. Die Säule wurde
mit einem Lösungsmittelgradienten eluiert. der dadurch hergestellt wurde, daß Äther in eine 250-ml-Mischkammcr
einlaufen gelassen wurde, die ursprünglich mit der Lösung aus Äther und Skelly B im
Verhältnis 1 : I gefüllt war. Es wurden Fraktionen von 2.8 ml gesammelt.
Durch Ullravioleltspektrometrie und Gaschromatographie
wurde gefunden, daß nur die Fraktionen 33 bis 3S 25-Hydroxyprecholecaleiferol (.:„lil( 1u\ my..
,·,,,, = 90001 enthielten. Diese Fraktionen wurden
vereinigt und etwa 7 Tage hei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre stehengelassen. Danach
hatte sich die Verbindung in 25-Hydroxycholecalciferol
mit folgenden Eigenschaften umgewandelt:
Ultraviolettspektrum:
/.„,« 265 mo, f = 18000.
/.„,« 265 mo, f = 18000.
Kernresonanzspektrum:
C21 — H3 Λ 0,90 ppm (Duplett, J = 8 Hz).
C18 — H3 6 0,54 ppm,
C26.27 — H3 ή 1,22 ppm,
C19 — H2 ό 4,80 ppm und 5,00 ppm. Q.7 — H 6 5,97 ppm (Duplett, J = 12 Hz). 6,25 ppm (Duplett. J = 12 Hz).
C26.27 — H3 ή 1,22 ppm,
C19 — H2 ό 4,80 ppm und 5,00 ppm. Q.7 — H 6 5,97 ppm (Duplett, J = 12 Hz). 6,25 ppm (Duplett. J = 12 Hz).
Molekulargewicht:
400,3340 (berechnet C27H44O2 400.3341).
400,3340 (berechnet C27H44O2 400.3341).
Die höheren Fraktionen als Fraktion 38 enthielten 25-Hydroxytachysterol3, 25-Hydroxycholesterin und
eine kleine Menge nicht umgesetztes 5.7-Dien. Die Fraktionen, die 25-Hydroxytachystcrol3 und unverändertes
5,7-Dien enthielten, wurden mit gleichartiaen Fraktionen vereinigt, die aus einem zweiten Bestrahlungsansatz
stammten und erneut 3.5 Minuten bestrahlt. Es wurde chromatographisch über aktivierte
Kieselsäure eine zusätzliche Ausbeute von 8 me 25-Hydroxycholecalciferol erhalten.
Die Bestrahlung von 15 mg des 5,7-Diens. das gemäß A hergestellt worden war, über 2.5 Minuten
gemäß der vorherigen Verfahrensweise ergab 2.4 mn 25-Hydroxyprecholecalciferol, das in der genannten
Weise in 25-Hydroxycholecalciferol überecführt wurde.
A. Heilversuch gegen Rachitis
Entwöhnte Jungratten wurden mit einer rachitogenen Diät gemäß Steeboch und Black I Biol
Chem., Bd. 64 (1925), S. 263, 21 Tage gefüttert. Die Diät wurde durch Zugabe von wasserlöslichen Vitaminen
gemäß DeLuca u.a. in J. Nmr.. Bd. 75 (1961), S. 175, modifiziert. Nach der Mangeldiät
über 21 Tage wurde eine Einzeldosis von 4 I.E. Standard-Vitamin D3 oder D2 oder 25-Hydroxyergocalciferol
oder 25-Hydroxycholecalciferol verabreicht. 7 Tage später wurden die Ratten getötet und
an den herauspräparierten Ellen und Speichen der Reihenversuch durchgeführt. Die biologische Wirkung
wurde gemäß der US-Pharmakopoe, K.Auflage 1955, durchgeführt.
Während Vitamin D3 und Vitamin D2 nur Werte
von 40 I.E. je μg ergaben, zeigte Hydroxyergocalciferol
einen Wert von etwa 60 I.E. je txg und
25-Hydroxycholecalciferol einen Wert von 56 bis 60 I.E. je μg (Syntheseprodukt 55 bis 60 I.E. je |Ag).
B. Calciumtransportversuch Entwöhnte männliche Jungratten wurden in hängenden
Drahtkäfigen gehalten und nach Belieben mit einer gereinigten Vitamin D-armen Mangelkost
gemäß DeLuca a. a. O. gefüttert. Die Diät
erzeugte keine Rachitis bei Ratten, rief aber in 3 bis 4 Wochen schwere Vitamin D-Mangelerscheinungen
hervor, die durch einen niedrigen Ca++- Gehalt im Serum uuu Jurch vermindertes Wachstum
gekennzeichnet sind (H. Steenbock und D. C Herting, J. Nutr., Bd. 57 [1955], S. 449).
Nach 6 Wochen Mangeldiät wurde den Ratten eine Dosis von 0,25 μg Vitamin D3, D2, 25-Hydroxyergocaleiferol
und 25-Hydroxycholecalciferol in Baumwollsamenöl oral oder in 0,02 ml Äthanol intravenös
verabreicht. Die Vergleichstiere erhielten lediglich Äthanol bzw. Baumwollsaroenöl. Nach der in der
folgenden Tabelle I aufgeführten Zeit wurden die Ratten getötet und gemäß J. E. ZuIl u. jl, Science
Bd. 149 (1965), S. 182, der Calciumtransport an umgestülpten
Eingeweidesäcken geprüft. Der Calciumtransport wird als Verhältnis 45Ca (serumsiitigV^Ca
(schleimhautseitig) ausgedrückt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben.
Probe | Vergleich | Stunden | Tier | Transport | |
Baumwollöl | nach | zah | verhältnis | ||
Äthanol | Verab | ||||
Vitamin D3 | reichung | ||||
20 | Baumwollöl | ||||
6 | 0,66 ± 0,02 | ||||
Äthanol | 4 | 1,59 ± 0,17 | |||
25 | Vitamin D2 | 5 | 0,74 ± 0,03 | ||
Äthanol | 12 | 4 | 1,16 ± 0,06 | ||
24 | 4 | 1,01 ± 0,12 | |||
30 | 4 | 4 | 1,32 ± 0,10 | ||
6 | |||||
5 | 1,40 ± 0,39 | ||||
3 | 5 | 1,54 ± 0,36 | |||
3S | 25-OH-Ergocalciferol | 4 | 4 | 1,88 ± 0,30 | |
Äthanol | 6 | 5 | 2,06 ±0,12 | ||
8 | 5 | 3,35 ± 0,70 | |||
12 | |||||
40 | |||||
5 | 1,94 ± 0,41 | ||||
25-OH-Cholecalciferol | 3 | 5 | 2,09 ± 0,65 | ||
Baumwollöl | 4 | 5 | 2,74 ± 0,49 | ||
45 | 6 | 5 | 3,51 ± 0,23 | ||
Äthanol... | 8 | 5 | 3,58 ± 0,59 | ||
12 | |||||
6 | 0,89 ± 0,04 | ||||
50 | 12 | 4 | 1,24 ± 0,07 | ||
24 | 5 | 2,31 ± 0,50 | |||
4 | 4 | 2,33 ± 0,31 | |||
6 | |||||
Aus den Werten ergibt sich, daß synthetisches ode natürliches 25-Hydroxycholecalciferol den Calcium
transport in den Eingeweiden schneller als Vitamin D einsetzen läßt und daß 25-Hydroxyergocalciferol it
dieser Hinsicht dem Vitamin D2 überlegen ist.
Mit 25-Hydroxycholccalciferol wurde ein weitere
Versuch durchgeführt, wobei
a) das Inkubationsmedium aus 125 mMol Natrium chlorid, 30 mMol Tris-Cl. 0.25 mMol CaCl2
2H2O und 10 mMol Fruktose bestand, das mi HCl auf den pH-Wert 7.4 eingestellt und mi
einer Ca45-Lösung auf etwa 105 Impulse/Min./m
Medium gebracht worden war,
b) 1,5 Stunden Sauerstoff durch das Medium bei 37° C perlen gelassen wurde und
c) die Ratten intravenös mit 0,25 μg Vitamin D3
oder 25-HydroxychoIecalciferol in 0.02 ml Äthanol behandelt wurden.
Die Vergleichstiere erhielten nur Äthanol. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.
Stunden | Tier- | Tran->port- | |
nach | zah! | \erhallnis | |
Prcbc | Verab | ||
reichung | 12 | 1.25 ± 0.05 | |
Vergleich | 4 | 1.74 ± 0.12 | |
25-OH-ChoIecalriferol | 3 | (p < 0.01 über | |
Vergleich) | |||
4 | 1.66 ±0.13 | ||
4 | 4 | 2.6 ± 0.4 | |
6 | 4 | 2.3 - 0.6 | |
10 | 4 | 1.0! ■ 0.12 | |
Vitamin D3 | 4 | 4 | 1.32 ± 0.10 |
6 | 3 | 2.0 f 0.3 | |
10 | |||
Stunden | Tier | Serumjzehall | π mg-"« | |
nach | zahl | Ca ι | ||
Probe | Verab | ± 0.1 | ||
reichung | 2 | 3.8 | ± 0.1 | |
Vitamin D3 . . . | 4 | 3 | 3.9 | ± 0.4 |
8 | 3 | 5,0 | ± 0.4 | |
12 | 4 | 6,6 | ||
16 | ± 0.3 | |||
25-OH-ChoIecalciferol | 3 | 4.4 | ± 0.2 | |
aus Schweinen .. . | 4 | 4 | 5.7 | i 0.4 |
8 | 4 | 7.1 | ± 0.4 | |
12 | 3 | 7.2 | ± 0.5 | |
16 | 7 | 6.4 | ± 0.21 | |
synthetisch | 8 | 6 | 7.36 | |
12 | ||||
Aus der labeile III ergibt sich, daß 25-Hydro\yergo-
bzw. -cholecalciferol die Knochenmobilisierung und damit den Calciumgehalt im Blut schneller in
Gang setzen als Vitamin D2 bzw. Vitamin D3. Hieraus
ergibt sich, daß die neuen Verbindungen an Stelle von Vitamin D2 bzw. D3 als Nahrungsmittelzusatz
überlegen sind.
C. Serum-Calciumspiegcl
(Knochenmobilisierung I
Entwöhnten männlichen Jungratten wurde 11 bis
15 Tage bzw. 3 bis 4 Wochen eine Vitamin-D-Mangeldiät gemäß De L u ca a.a.O. verabreicht, wobei ^
jedoch Calcium fortgelassen -".!rde. Hie R:·.1.!.·:1. "'irden
dann intravenös mit 2.5 ^g Vitamin D,. Vitamin
D3, 25-1 Iydroxyergocalcifcrol und 25-H\droxycholecalciferol
in 0.02 ml Äthanol behandelt. Vergleichsliere wurden nur mit Äthanol behandelt. Das
Serum wurde nach den in Tabelle III angegebenen Zeiträumen gesammelt und gemäß Webster. Am.
J. Clin. Pathol... Bd. 131 (1969). S. 330. auf Calcium
geprüft. Die Versuche wurden doppelt ausgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.
laoelle III | Probe | Stunden | 8 | licr- | Scrim | ilcIi.iI |
nach | 12 | AlIlI | ( .ι in | Uli!-" ι | ||
Vergleich | Verab | 16 | ||||
reichung | 24 | 6 | 3.7 | : 0.2 | ||
0 | 4 | 4 | 4.0 | - 0.4 | ||
0 | 8 | 4 | \7 | : 0.5 | ||
Vitamin D2 4 | 12 | 4 | 3.7 | r 11.3 | ||
16 | 4 | 3.6 | - 0.3 | |||
24 | 3 | 4.2 | - 0.1 | |||
6 | S.7 | - 0.3 | ||||
4 | 4.3 | - 0.3 | ||||
25-OH-Ergocalciferol | 5 | 4.(> | j 0.3 | |||
5 | 4.,S | ι 0.3 | ||||
4 | 5.1 | - 0.2 | ||||
6 | 6.0 | . 0.4 | ||||
D. Zusatz von 25-Hydroxycholecalciferol
zu Hühnerfutter
zu Hühnerfutter
Es wurden Fütterungsversuche an Hiihi·>ri^ gemäß
»Vitamin D in Pultry Feed Supplement 1 n«t Action.
Methods of Analysis-..X-O-A-C >. Ίν 1Ί 965). 10. Ausgabe,
durchgeführt. Das aus Schweinen isolierte 25-Hydroxycholecalciferol wurde in einer Menge
\on 125 jig in 25 g Maisöl dispergiert und zur Fütterung
\erwendet. Nach dem Füttern wurden die Knochen der einzelnen Hühner gruppenweise geordnet
und der Prozentsatz Asche in den von Feuchtigkeit und Fett freien Knochen als Einzelreakiion auf
jede Dosierung bestimmt. Die Wirksamkeit des Präparats wurde aus der Aufzeichnung von Standardpräparaten
abgeschätzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden 7;ä>elle IV aufgeführt.
liner- I
nan. Mule
Hühneieinhcilen " I
nan. Mule
Hühneieinhcilen " I
■■•j 111(1 11
I ullci
I ullci
Kürpcrjjewicht
anfangs
am 1-iule
Knocheii-
a>chc. "ι.
!.Schienbein I
Verglciclisgruppe: nur Maisöl
0 35 j 116 ! 28.3
Vergleichsgruppc: Vitamin D
als Verglcichsstandard zugesetzt
als Verglcichsstandard zugesetzt
('S
400 | 0.113 | 35 | 142 | 32.4 |
400 | 0.158 | 35 | M5 | 33.4 |
400 | 0.225 | 35 | 151 | 35.3 |
400 | 0.319 | 35 | 166 | 38.7 |
400 | 0.450 | 35 | 152 | 4I.S |
imu ii.iiiKiialc I liiliiiciciiiliciieii = (1.0-5 m
< hiiliviihil'iTnl
19
I 933 375
Fortseizuns
Internationale Hühnereinheiten*!
;ig KX) g
Futter
Körpergewicht
anfangs
am Ende
Knochenasche. °'u (Schienbein)
Versuchsgruppe: 25-Hydroxycholecalciferol
in Maisöl
0.158 | 35 | 140 | 32.2 |
0.225 | 35 | 151 | 36.3 |
0.319 | 35 | 162 | 41,2 |
*l Internationale Hühnereinheiten = 0.025 ;ig Cholecalciferol
Aus den vorstehenden Werten wurde geschätzt, daß jedes Gramm des mit öl verdünnten 25-Hydroxycholecalciferols
wenigstens 206 Internationalen Hübnereinheiten Vitamin D3 entsprach. Es ist somit wirksamer
als Vitamin D3in Hühnerfutterzusätzen und kann allgemein als Ersatz Tür Vitamin D verwendet werden
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. 25-Hydroxyergocalciferol.
2.25-Hydroxycholecalciferol.
3. Cholest-SJ-dien-S/^S-diol.
4. Verfahren zur Herstellung von 25-Hydroxyergocalciferol bzw. 25-Hydroxycholecalciferol nach
Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugetiere mit an Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol
angereichertem Futter über einen längeren Zeitraum füttert, deren Blut sammelt, das
Blutplasma isoliert, die Serumproteine des Blutplasmas abtrennt, die Serumproteine mit einem
Methanol-Chloroformgemisch extrahiert, den gegebenenfalls in Chloroform angereicherten Extrakt
wäscht und einengt, den Rückstand mit einem niedrigsiedenden Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch
aufnimmt und chromatographisch über Kieselsäure die entsprechende ?n 25-Hydroxyverbindung von Ergocalciferol bzw.
Cholecalciferol abtrennt.
5. Verfahren zur Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US74123968A | 1968-07-01 | 1968-07-01 | |
US78963868A | 1968-12-09 | 1968-12-09 | |
US80954169A | 1969-03-24 | 1969-03-24 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1933375A1 DE1933375A1 (de) | 1970-01-08 |
DE1933375B2 true DE1933375B2 (de) | 1973-02-15 |
DE1933375C3 DE1933375C3 (de) | 1973-09-20 |
Family
ID=27419270
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19691933375 Expired DE1933375C3 (de) | 1968-07-01 | 1969-07-01 | 25 Hydroxyverbindungen der Vitamin D Reihe, Verfahren zu ihrer Herstellung und 25 Hydroxycholecalciferol enthalten des Mittel |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE1933375C3 (de) |
FR (1) | FR2012069B1 (de) |
GB (1) | GB1261291A (de) |
IT (1) | IT1052283B (de) |
NL (2) | NL150682B (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2012167A1 (de) * | 1969-03-17 | 1970-10-01 | The Upjohn Co., Kalamazoo, Mich. (V.St.A.) | Pf 17.03.69 V.St.v.Amerika 807929 Neue Steroide und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3822254A (en) * | 1973-05-21 | 1974-07-02 | Hoffmann La Roche | Synthesis of 25-hydroxycholesterol |
US3856780A (en) * | 1973-06-18 | 1974-12-24 | T Narwid | Synthesis of 25-hydroxycholesterol and derivatives thereof |
US4448721A (en) * | 1982-09-20 | 1984-05-15 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Hydroxyvitamin D2 compounds and process for preparing same |
-
1969
- 1969-06-30 FR FR6922028A patent/FR2012069B1/fr not_active Expired
- 1969-06-30 GB GB3301669A patent/GB1261291A/en not_active Expired
- 1969-06-30 IT IT3832169A patent/IT1052283B/it active
- 1969-06-30 NL NL6910023A patent/NL150682B/xx not_active IP Right Cessation
- 1969-07-01 DE DE19691933375 patent/DE1933375C3/de not_active Expired
-
1976
- 1976-08-09 NL NL7608841A patent/NL7608841A/xx not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2012167A1 (de) * | 1969-03-17 | 1970-10-01 | The Upjohn Co., Kalamazoo, Mich. (V.St.A.) | Pf 17.03.69 V.St.v.Amerika 807929 Neue Steroide und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2012069A1 (de) | 1970-03-13 |
DE1933375A1 (de) | 1970-01-08 |
FR2012069B1 (de) | 1973-06-08 |
GB1261291A (en) | 1972-01-26 |
IT1052283B (it) | 1981-06-20 |
NL7608841A (nl) | 1976-11-30 |
NL6910023A (de) | 1970-01-05 |
NL150682B (nl) | 1976-09-15 |
DE1933375C3 (de) | 1973-09-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3248900C2 (de) | ||
DE2400931C2 (de) | ||
DE2012167C2 (de) | 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat und Verfahren sowie Zwischenprodukte zu seiner Herstellung | |
EP0637299B1 (de) | 20-methyl-substituierte vitamin d-derivate | |
DE2526981C3 (de) | lalpha^4-Dihyaroxycholecalciferol-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Mittel | |
DE2259661A1 (de) | 1 alpha-hydroxycholecalciferol und verfahren zu dessen herstellung | |
WO1992012963A1 (de) | 23-oxa-derivate in der vitamin-d-reihe, verfahren zu ihrer herstellung, diese derivate enthaltende pharmazeutische präparate sowie deren verwendung als arzneimittel | |
DE3590232C2 (de) | 1,24-Dihydroxy- 22-Vitamin D3-Derivate, diese enthaltende Arzneimittel sowie Cholesterinderivate alsZwischenprodukte | |
DE3933034A1 (de) | 24-homo-vitamin-d-derivate, verfahren zu ihrer herstellung | |
DE3490215C2 (de) | ||
DE2821242A1 (de) | 15-oxidierte sterinverbindungen und deren verwendung zur hemmung der biosynthese von sterinen | |
CH652725A5 (de) | Zwischenprodukte fuer die herstellung eines vitamin d(3)-derivates. | |
DE69712086T2 (de) | Vitamin d derivate | |
DE69634483T2 (de) | Verwendung von 19-nor-vitamin-d-verbindungen zur vorbeugung von hyperphosphatemie bei nierenkrankheiten | |
DE2838092C3 (de) | 1&alpha; -Hydroxy-24-oxovitamin D&darr;3&darr;, Verfahren zu seiner Herstellung, dabei verwendete Vorläufer und Verwendung von 1&alpha; -Hydroxy-24-oxovitamin D&darr;3&darr; | |
DE1933375C3 (de) | 25 Hydroxyverbindungen der Vitamin D Reihe, Verfahren zu ihrer Herstellung und 25 Hydroxycholecalciferol enthalten des Mittel | |
CH653995A5 (de) | 2beta-fluorcholecalciferole. | |
DE3243150A1 (de) | Trihydroxy-vitamin-d(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts)-verbindungen | |
DE3315877A1 (de) | N-oxide von pyridyl-carbonsaeureestern, ein verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel, die diese verbindungen enthalten | |
DE2515142A1 (de) | Mittel zur prophylaxe von artheriosklerose | |
US3772361A (en) | Processes for preparing 25-hydroxycholecalciferol | |
CH642071A5 (de) | 25-hydroxycholecalciferol-26,23-lacton. | |
DE2812741A1 (de) | Vitamin d tief 3 -derivate, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel | |
DE1468681C3 (de) | 17beta-Tetrahydropyranyloxy verbindungen der Androstanreihe sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und Heilmittel | |
DE4200783C2 (de) | (5Z,7E,22E)-(1S,3R,24S)-24-Benzyl-9,10-secochola-5,7,10(19),22-tetraen-1,3,24-triol, Verfahren zur Herstellung und Pharmazeutische Präparate |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |