DE2838092C3

DE2838092C3 - 1α -Hydroxy-24-oxovitamin D↓3↓, Verfahren zu seiner Herstellung, dabei verwendete Vorläufer und Verwendung von 1α -Hydroxy-24-oxovitamin D↓3↓

Info

Publication number: DE2838092C3
Application number: DE2838092A
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Hino Tokyo Bannai; Takao Niki
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1977-09-07
Filing date: 1978-08-31
Publication date: 1981-04-30
Also published as: CH643827A5; GB2006216A; GB2006216B; JPS5822479B2; FR2412568B1; FR2412568A1; DE2838092A1; JPS5441856A; FR2421882A1; DE2838092B2; US4199577A; FR2421882B1

Description

10

Das neue la-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ läßt sich durch folgende Strukturformel

R²O

(D

QH

R¹O

worin Rj und R2, die gleich oder verschieden sein können, für Wasserstoffatome oder die Hydroxylgruppe schützende Gruppen stehen können, in einem inerten organischen Lösungsmittel mit UV-Strahlen bestrahlt, das jeweils erhaltene Reaktionsprodukt isomerisiert und gegebenenfalls die die Hydroxylgruppe schützenden Gruppen eliminiert.

3. 1«,3jS-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien und dessen Derivate der Formel:

R²²O

R¹¹O

worin Rn und R22, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome, Acylgruppen mit mindestens drei Kohlenstoffatomen, Trialkylsilylgruppen oder 2-cyclische Äthergruppen darstellen.

4.1 a,3^-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien.

5. Arzneimittel für Warmblüter, enthaltend 1a-Hydroxy-24-oxovitamin-D3 als Wirkstoff.

Die Erfindung betriflt ein neues la-Hydroxy-24-oxovitamin Dj, neue Vorläufer desselben, l«,3/?-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder dessen Derivate mit geschützter Hydroxylgruppe sowie ein Verfahren zur Herstellung des neuen la-Hydroxy-24-oxovitamin D3. Ferner betrifft die Erfindung Arzneimittel für Warmblüter mit wirksamen Mengen an dem neuen !«-Hydroxy-24-oxovitamin D₃, sowie dessen Verwendung zur Steuerung des Calciumstoffwechsels bei Warmblütern.

wiedergeben.

Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß das neue la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 in höchstwirksamer Weise den Calciumstoffwechsel von Warmblütern zu steuern vermag. In der diesbezüglichen Wirkung ist das neue la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 dem bekannten Vitamin D3 weit überlegen (vgl. die später folgenden Tierversuche).

Das la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 gemäß der Erfindung steilt eine neue, bislang in der Literatur noch nicht beschriebene Verbindung dar. Ebenso wenig sind bisher ein Verfahren zu dessen Herstellung bzw. dessen biologische Aktivitäten bekannt geworden.

Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß das neue la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 infolge seiner Struktureigenschaften nämlich Anwesenheit einer Hydroxylgruppe in Ια-Stellung und einer Oxogruppe in 24-Stellung, zu einer rascheren Intestinal-Calciumabsorption und einer erhöhten Calciumkonzentration im d-a) Blut führt und darüber hinaus stärkere Wirkungen bei

der Knochenresorption und Heilung von Rachitis zeigt als la,25-Dihydroxy-oder la-Hydroxy-vitamin D₁.

Aus der DE-OS 25 18 842 und 25 26 981 geht zwar bereits hervor, daß bei Vitaminen der D-Reihe eine la-Hydroxygruppe und die Anwesenheit von Sauerstoff in 24- oder 25-SteIlung die pharmakologische Wirkung bzw. biologische Aktivität des betreffenden Vitamin D-Derivats erhöhen. Aus »Steroids« Bd. 30, Nr. 2, S. 245 bis 257 (1977) ist es bekannt, daß die Bindungsaffinität der Vitamin·Dj-Analogen zu Intestinal-la-25-(OH)₂D_r Bindungsprotein in Beziehung zur biologischen bzw. pharmakologischen Aktivität der betreffenden Verbindung steht. Das erfindungsgemäße la-Hydroxy-24-oxovitamin Dj hat sich nun hinsichtlich seiner pharmakologisch bzw. biologischen Aktivität bei dem in »Steroids«, Band 30. Nr. 2, S. 247, Zeile 14 bis 248. Zeile 7 beschriebenen Bindungstest den aus der genannten DE-OS bekannten

1«,25-(OH)₂-D₂bzw.la,24-(OH)2-D)

als weit überlegenerwiesen.

Das neue la-Hydroxy 24-oxovitamin Dj und dessen neue Vorläufer, nämlich la,3|3-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder dessen Derivate mit geschützter Hydroxylgruppe eignen sich ferner als Zwischenprodukte bei der Herstellung von la,24-Dihydroxy-vitamin D₃(vgl.US-PS40 22 891).

Erfindungsgemäß ist es nun gelungen, la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 und dessen Vorläufer herzustellen.

Das loc-Hydroxy-24-oxovitamin D3 erhält man durch Bestrahlen von la,3$-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder dessen Derivaten mit geschlitzter Hydroxylgruppe der Formel:

R¹O

R²O

(D

b) Mit Hydroxylgruppen
Ätherbindungen bildende Gruppen

Hierbei handelt es sich um Trialkylsilylgruppen, z. B. Trimethylsilyl- oder Dimethyl-tert.-butylsilylgruppen oder cyclische Äthergruppen, wie 2-Tetrahydropyranyl- oder 2-Tetrahydrofuranylgruppen.

Von den genannten Schutzgruppen werden Acyigruppen am meisten bevorzugt

Von den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen loi,3j3-Dihydroxy-24-oxocholesta-S,7-dien oder dessen Derivaten mit geschlitzter Hydroxylgruppe (Formel 1) stellen die in la- und 30-Stellung geschützte Hydroxylgruppen aufweisenden 24-Oxocholesta-5,7-diene der Formel

worin Ri und R2, die gleich oder verschieden sein können und für ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylschutzgruppe stehen, mit UV-Strahlen in einem inerten organischen Lösungsmittel, anschließende Isomerisierung und gegebenenfalls Eliminierung der Hydroxylschutzgruppe(n).

Die erfindungsgemäß verwendete Ausgangsverbindung(en) la-3j3-Dihydroxy-24-oxocholestra-5,7-dien oder dessen Derivate läßt (lassen) sich ohne Schwierigkeiten aus Fucosterin über 24-Oxocholesterin und la,2a-Epoxycholesta-4,6-dien-3,24-dion-24-ketal in hoher Ausbeute herstellen. Dieses Verfahren ist einem Verfahren zur Herstellung von anderen Zwischenprodukten bei der Herstellung von loc,25-Dihydroxy\ hämin Ds bildenden la,25-Dihydroxycholesterin oder \&3ß,25-TrihydroxychoIesta-5,7-dien weit überlegen.

Von 1a,3/?-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder dessen Derivaten mit geschützter Hydroxylgruppe der Formel (1) läßt sich das 24-Oxocholesta-5,7-dien mit geschützten Hydroxylgruppen in la- und 3j?-Stellung (R' und R² stellen in der Formel (1) Hydroxylschutzgruppen dar) ohn° weiteres durch Bromieren von 24-Oxocholesta-5-en-24-ketal mit geschützten Hydroxylgruppen in 1*- und 3j3-Stellung zu dem allylbromierten Derivat, anschließende Entbromierung (dehydrobromination) und abschließende Eliminierung der Schutzgruppen herstellen. Auch die Verbindung der Formel (1), in der beide Reste R' und R² für Wasserstoffatome stehen, kann ohne Schwierigkeiten durch Eliminieren der Schutzgruppen aus dem genannten doppeltgeschützten Hydroxy-5,7-dien-Derivat hergestellt werden. In der Formel (1) können, wie bereits erwähnt, die Reste R¹ und R² gleich oder verschieden sein und für Wasserstoffatome oder zum Schutz der Hydroxylgruppen geeignete Gruppen stehen. Als Hydroxylschutzgruppen kann man sich üblicher Hydroxylschutzgruppen für Cholesterine bedienen. Im folgenden werden einige Beispiele hierfür angegeben:

a) Acylgruppen

Vorzugsweise handelt es sich hierbei um die Reste gegebenenfalls nitro-, halogen- oder allsOXysubstituier- bo ter aliphatischer Carbonsäuren mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen) oder gegebc. .onfalls nitro·, halogen- oder alkoxysubstituierter anj.ridii.si.ner Carbonsäuren, z. B. um Acetyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Pivaloyl-, Pentanoyl-, Chloracetyl-, Bromacetyl-, Benzoyl-, p-Brombenzoyl-, p-Nitrobenzoyl-, Äthylbenzoyl- oder Toluoylgruppen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Acetyl-, Benzoyl-, Propanoyl- oder Pivaloylf ruppen.

R¹²O

(1-a)

R¹¹O

worin R" und R¹², die gleich oder verschieden sein können und jeweils für ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe mit mindestens 3 Kohlenstoffatomen, eine Trialkylsilylgruppe oder eine 2-cyclische Äthergruppe stehen, neue Verbindungen dar. Diese neuen Verbindungen bzw. Vorläufer des 1 «-Hydroxy-24-oxovitamin D3 können nicht nur erfindungsgemäß eis Ausgangsmaterial sondern auch als wertvolles Zwischenprodukt bei der Herstellung von 1flc,24-Dihydroxy- vitamin D3 verwendet werden.

Erfindungsgemäß wird la,3^-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder ein geschützt? Hydroxylgruppen aufweisendes Derivat hiervon (Formel 1) zunächst in einem inerten organischen Lösungsmittel mit UV-Licht bestrahlt.

Zu diesem Zweck bedient man sich einer UV-Strahlung einer Wellenlänge im Bereich von etwa 200 — 360, vorzugsweise von 260 — 310 nm. Als Lösungsmittel eignen sich Kohlenwasserstoffe oder halogenierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol, Brombenzol. Chlorbenzol, Nitrobenzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder 1,2-Dibromäthan, Äther, wie Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylcellosolve oder Phenylcellosolve oder Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Hexanol oder Cyclohexanol.

Die Bestrahlung mit UV-Strahlen erfolgt bei einer Temperatur von —20 bis +80°, vorzugsweise von —10 bis +20⁰C in sauerstoff freier Atmosphäre, z.B. in Argon- oder Stickstoffatmosphäre.

Durch die Bestrahlung mit UV-Strahlen kommt es zu einer Spaltung zwischen der 9- und 10-Stellung der als Ausgangsmaterial verwendeten 5,7-Dien-Verbindung, wobei man lot-Hydroxy-24-oxoprovitamin D₃ bzw. ein geschützte Hydroxylgruppen aufweisendes Derivat hiervon erhält.

Das gebildete Provitamin D3 wird erfindungsgemäß zu 1 «-Hydroxy-24-oxovitamin D3 oder einem geschützte Hydroxylgruppen aufweisenden Vitamin D₃ der Formel (2) isomerisiert.

Die Temperatur während der Isomerisierung für das Fortschreiten der Umsetzung ist nicht von wesentlicher Bedeutung. Das Gleichgewicht zwischen Provitamin D3 oder dem geschützte Hydroxylgruppen aufweisenden Derivat desselben und dem Vitamin D3 oder dessen Derivat mit geschützten Hydroxylgruppen hängt von der Temperatur ab. Hierbei ist eine Tendenz festzustellen, daß letztere mengenmäßig steigen und gleichzeitig die Geschwindigkeit der Umwandlung ersterer in letzterer mit fallender Temperatur langsamer wird. Folglich kann die Temperatur unter Beachtung des Gleichgewichtswerts und des Umwandlungsgrades in geeigneter Weise gewählt werden. Somit ist also die Temperatur als solche für das Fortschreiten der Umsetzung nicht notwendigerweise von Bedeutung.

Im Hinblick auf den Gleichgewichtswert und den Umwandlungsgrad bedient man sich bei der Isomerisierung in der Praxis einer Temperatur von 10° bis 120°C. In der Regel wird die Isomerisierung vorzugsweise in einem inerten organischen Lösungsmittel, bei dem es sich um dasselbe Lösungsmittel handeln kann, wie es auch bei der Bestrahlung mit UV-Strahlung verwendet wird, durchgeführt. Die Isomerisierungsreaktion braucht nicht zwangläufig nach Beendigung der bei der Bestrahlung mit UV-Strahlen ablaufenden Umsetzung, d. h. nach Beendigung der Strahleneinwirkung, begonnen zu werden, sie kann vielmehr parallel mit der Bestrahlung zur Umwandlung des während der Bestrahlung gebildeten Provitamins D3 zu dem Vitamin D3 ablaufen gelassen werden. Wenn als Ausgangsverbindung la,3/?-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien (Verbindung der Formel (1), worin R¹ und R² beide Wasserstoffatome darstellen) verwendet wird, erhält man la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 der Formel (2). Wenn ein Derivat mit geschützter (geschützten) Hydroxylgruppe(n) der Formel (1), worin mindestens einer der Reste R¹ und R² für eine Hydroxylschutzgruppe steht, verwendet wird, erhält man durch sukzessive Eliminierung der Hydroxylschutzgruppe(n) la-Hydroxy-24-oxovitamin Dj.

Wenn als Schutzgruppe eine Acylgruppe vorgesehen ist, besteht die Eliminierung der Schutzgruppe(n) vorzugsweise in einer Spaltung in einem alkalischen Alkohol, z.B. NaOH/Methanol oder NaOH/Äthanol. Die Entacylierung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von -10° bis +50⁰C während 30 min bis 40 h.

Die mit den Hydroxylgruppen über Ätherbindungen verbundenen Schutzgruppen können ohne weiteres durch Inberührungbringen mit einer Säure, z. B. verdünnter Salzsäure, eliminiert werden.

Das in der geschilderten Weise erhaltene ia-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ der Formel (2) läßt sich durch Säulenchromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie, Hochdruck/Flüssigchromatographie oder Umkristallisieren isolieren und reinigen.

Das erhaltene 1 α-Hydroxy-24-oxovitamin D3 besitzt wie die später beschriebenen Tierversuche zeigen, eine hohe pharmazeutische Wirksamkeit hinsichtlich der Förderung der Intestinal-Calciumabsorption und einer Erhöhung der Calciumkonzentration im Blut

Folglich eignet sich also das erfindungsgemäß hergestellte la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 als bei durch einen anormalen Calciumstoffwechsel hervorgerufenen Erkrankungen verwendbares Arzneimittel.

Eine geeignete Dosierung des neuen la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 bei klinischer Applikation beträgt auf Grund durchgeführter pharmakologischer Tests etwa 0,04 bis 0,4 jig (etwa 96 bis 960 pMol pro kg Körpergewicht des Warmblüters).

Das erfindungsgemäße la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 läßt sich bei folgenden Erkrankungen in der Humanoder Tiermedizin zum Einsatz bringen:

Vitamin D abhängige Rachitis, renale Osteodystrophie, Hypoparathyroidismus, Osteoporose, Osteomalazie, Behcetsche Krankheit, auf schlechter Absorption beruhende Syndrome, durch Leberzirrhose induzierte Hypocalcämie, durch Steatorrhoe induzierte Hypocalcämie, durch Vitamin D resistente Rachitis induzierte Hypocalcämie und anormalen Calcium- und Phosphorstoffwechsel, bedingt durch Erkrankungen oder Fehlleistungen der Leber, der Niere, des Gastrointestinaltrakts oder der Epithelkörperchen (Parathyreoide) sowie verwandte Knochenerkrankungen.

Das la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 kann in Arzneimitteln in Kombination mit anderen den Calciumstoffwechsel regulierenden Mitteln verwendet werden. So kann es beispielsweise zur Behandlung von Behcetscher Krankheit in Kombination mit Calcitonin zum Einsatz gelangen.

Geeignete Verabreichungswege sind der orale, bukkale und parenterale, nämlich intramuskuläre, subkutane, intravenöse und intrarektale Verabreichungsweg. Geeignete Dosierformen sind beispielsweise gepreßte Tabletten, beschichtete Tabletten, Hartgelatinekapseln oder weiche elastische Gelatinekapseln, äthanolische Lösungen, ölige Lösungen und wäßrige Suspensionen.

Das Lösungsmittel für ölige Lösungen kann aus einem Pflanzenöl, z. B. Mais-, Baumwollsaat-, Kokosnuß-, Mandel- oder Erdnußöl, einem Fischleberöl oder einem öiigen Ester, z. B. Polysorbat 80, bestehen.

Zur intrarektalen Verabreichung kann das la-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ zu einem Arzneimittel mit einer Supositcriengrundlage, wie Kakaobutter oder einem sonstigen Triglyzerid, formuliert werden. Zur Verlängerung der Haltbarkeit des Arzneimittels kann ein Antioxidationsmittel, z. B. Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hydrochinon, mitverwendet werden.

Das la-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ gemäß der Erfindung kann im Futter für Haustiere zugemischt werden. Das die betreffende Verbindung enthaltende Futter für Haustiere kann in einer solchen Menge verabreicht werden, daß es bei der Verhinderung einer Hypocalcemie bei Kühen bei oder nahe dem Zeitpunkt der Verfütterung oder bei der Verhinderung einer Hypocalcemie von Haustieren ohne Anzeichen einer Hypocalcemie nicht-toxisch ist Wenn ein solches Futter an Geflügel während des Eierlegens verfüttert wird, ist εε möglich, die Ablage von weichschaligen Eiern zu verhindern. Dies stellt ein weiteres charakteristisches Merkmal des erfindungsgemäßen la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 dar.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Die Kernresonanzspektren werden mit Hilfe handelsüblicher Kernresonanzspektrometer in Deuterochloroform (CDCI3) unter Verwendung von Tetram ethylsilan als internem Standard ermittelt Auch die Massenspektren und hochauflösenden Massenspektren werden mit Hilfe eines handelsüblichen Geräts bestimmt Die UV-Spektren werden mit Hilfe eines handelsüblichen Spektralfotometers unter Verwendung äthanolischer Lösungen aufgenommen. Die Fließpunkte (Fp) werden mittels eines Mikroskops mit beheizbarem Block

bestimmt. Die hierbei ermittelten Werte werden nicht korrigiert.

Beispiel 1

10 mg eines la,3|S-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-diens werden in so viel Diäthyläther, der nach einer Behandlung zur Entfernung jeglichen Sauerstoffs zur Reinigung destilliert worden war, gelöst, daß 500 ml Lösung erhalten werden. Danach wird die Lösung 2 min lang bei einer Temperatur von 5° C in einer Argonatmo-Sphäre mittels einer 200-W-Hochdruckquecksilberlampe mit UV-Licht bestrahlt Danach wird ein Teil der Lösung abgezweigt und auf sein UV-Spektrum hin untersucht. Hierbei ist eine Absorption bei 262 - 263 nm feststellbar. Diese kann auf ein Provitamin D3 zurückzuführen sein. Nach beendeter Umsetzung wird der Äther bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck abgeraucht. Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird mit 100 ml Benzol versetzt, worauf durch zweistündiges Erhitzen des Gemisches unter Argonatmosphäre auf Rückflußlemperatur eine Isomerisierungsreaktion ablaufen gelassen wird. Nach beendeter Isomerisierung wird das Benzol unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 10 mg eines fahlgelben Feststoffs erhalten werden. Das erhaltene Reaktionsprodukt wird mittels präparativer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Silikagelträgers mit Silbernitrat (und dreimaliger Entwicklung mit Methanol/Chloroform) getrennt Hierbei erhält man Bänder, die durch Bestrahlen mit UV Strahlung nachgewiesen werden. Aus dem letzten polaren Band erhält man 2,1 mg eines Feststoffs. Dieses als la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 identifizierte Produkt besitzt folgende Eigenschaften:

UV-Spektrum:

(nm): 264(ε=18 300)
¹ (nm): 228.

35

Massen-Spektrum (m/e):
414 (M ⁺ ), 396 (M-18)
378 (M-18x2)

Kernresonanz-Spektrum (CDCI3 + Aceton db), ύ (ppm): 0,54 (3H, s, C-18, CH₃)

1.1 (6H, d, J = 7 Hz, 26,27-CH₃),

4.2 (IH, b, C-I-H oderC-3-H),
4,4 (IH. b, C-3-H oderC-1-H),

5.0 (IH. m. C-19-H),

5.3 (IH, m, C-19-H),

6.1 (1H, d, J = 11 Hz, C-6 oder C-7-H).

6.4 (1H, dj-l 1 Hz, C-6 oder C-7-H).

Die Symbole s, d, b und m bedeuten Siglett, Doublett, breites und Multiplett

Hochauflösendes Massen-Spektrum:
Gefunden: 414.3132 (M⁺);
erforderlich: 41431338 (C₂₇H₄₂O₃)

Aus dem am stärksten polaren Band werden 3 mg 1 a,3/?-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien gewonnen.

Beispiel 2

500 ml einer benzolischen Lösung mit 13 mg la,3/J-Diacetoxy-24-oxocholesta-5,7-dien, dessen Benzolanteil nach einer Behandlung zur Befreiung von Sauerstoff durch Destillation gereinigt worden war, werden 2 min lang bei einer Temperatur von 10° C unter Argonatmosphäre mit der in Beispiel 1 verwendeten Hochdruckquecksilberlampe mit UV-Strahlen bestrahlt Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktionsprodukt

40

45

50

55

60 durch 2,5stündiges Erhitzen unter Argonatmosphäre auf Rückflußtemperatur isomerisiert. Danach wird das Benzol größtenteils abgedampft. Nach Zusatz von 3 ml einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung und 3 ml Benzol wird das Gemisch 24 h lang bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre stehengelassen.

Danach wird das Reaktionsprodukt mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetalschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen, getrocknet und durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird entsprechend Beispiel 1 getrennt und gereinigt, wobei 2,2 mg la-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ derselben Eigenschaften, wie sie das Reaktionsprodukt des Beispiels 1 aufweist (mit Ausnahme des hochauflösenden Massen-Spektrums, das etwas anders ist) erhalten werden. Das hochauflösende Massen-Spektrum des Reaktionsprodukts des vorliegenden Beispiels beträgt 414.3140 (M +).

Beispiel 3

500 ml einer Lösung von 15 mg la.,3/?-Dibenzoyloxy-24-oxochoIesta-5,7-dien in Diäthyläther werden unter Argonatmosphäre 1.5 min lang mit UV-Strahlen bestrahlt. Nach beendeter Umsetzung wird der Äther bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck abgedampft Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird mit 100 ml Benzol versetzt, worauf das Gemisch zur Durchführung der Isomerisierungsreaktion 2 h lang unter Argonatmosphäre auf Rückflußtemperatur erhitzt wird. Nach beendeter Umsetzung wird der Großteil des Benzols unter vermindertem Druck abgedampft, worauf der Verdampfungsrückstand mit 20 ml einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung, 1 ml Methanol und 1 ml Benzol versetzt wird. Nun wird das Gemisch 4 h lang bei einer Temperatur von 40⁰C einer Alkoholyse unterworfen, danach mit Wasser verdünnt und schließlich mit Äthylacetat extrahiert.

Die Äthylacetatschicht wird mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und durch Verdampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. Hierbei erhält man einen hellgelben öligen Rückstand.

Der ölige Rückstand wird mit Hilfe der präparativen Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines silbernitrathaltigen Silikagelträgers entsprechend Beispiel 1 getrennt und gereinigt wobei 1,8 mg la-Hydroxy-24-oxovitamin D_s der folgenden Eigenschaften erhalten werden:

UV-Spektrum: λ*!':""¹ (nm): 264(ε = 18.500)
X™^m' (nm). ?2S

Hochauflösendes Massen-Spektrum:
4143129(M')

Die sonstigen Eigenschaften entsprechen den Produkteigenschaften des Beispiels 1.

Beispiel 4

20 mg loc3/}-Dipivaloyl-24~oxocholesta-5,7-dien werden in 500 ml Diäthyläther/Äthanol-Gemisch (Volumenverhältnis: 450 :50), das nach einer Behandlung zur Befreiung von Sauerstoff durch Destillation gereinigt worden war, gelöst Danach wird die Lösung 2 min lang bei einer Temperatur von 12° C unter einer Argonatmosphäre mit UV-Strahlen bestrahlt Nach der Umsetzung wird der Diäthyläther unter vermindertem Druck

abgedampft. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird mit 200 ml Benzol versetzt und während 2,5 h bei Rückflußtemperatur einer Isomerisierung unterworfen. Schließlich werden große Teile des Benzols und Äthanols sorgfältig unter vermindertem Druck abgedampft, wobei 20 mg eines öligen Rückstands erhalten werden. Dieser ölige Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Silbernitrat enthaltenden Silikagelträgei's (der viermal mil Methanol/Chloroform entwikkelt wird) getrennt, wobei letztlich 3,8 mg einer Verbindung mit einem Absorptionspeak im

UV-Spektrum,AlT" (nm)264(s= 17.000)

isoliert werden. Das isolierte Produkt wird mit 3 ml einer 5%igen methanoüschen Kaüumhydroxidlösung und 3 ml Benzol gemischt, und 24 h lang bei einer Temperatur von 35° C unter einer Argonatmosphäre stehengelassen.

Danach wird das Reaktionsprodukt mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird entsprechend Beispiel 1 gereinigt und getrennt, wobei 2,1 mg la-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ derselben physikalischen Eigenschaften, wie sie das Reaktionsprodukt des Beispiels 1 aufweist, erhalten werden.

Beispiel 5

30

500 mg Diäthylätherlösung mit 10 mg I<x,3j3-Ditoluoyl-24-oxocholesta-5,7-dien wird unter einer Argonatmosphäre bei einer Temperatur von 10° C 50 see lang mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt. Nach der Umsetzung wird der Diäthyläther größtenteils unter vermindertem Druck abgedampft, worauf der Verdampfungsrückstand mit 200 ml Benzol versetzt und durch 2,5stündiges Erhitzen auf Rückflußtemperatur unter einer Argonatmosphäre einer lsomerisierungsreaktion unterworfen wird. Schließlich wird ein Großteil des Benzols sorgfältig unter vermindertem Druck abgedampft, worauf der erhaltene Verdampfungsrückstand mit 1.5 ml einer 5%igen methanoüschen Kaüumhydroxidlösung und 1,5 ml Benzol gemischt wird. Danach wird die Mischung 19 h lang bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre stehengelassen. Nach der Extraktion wird das Reaktionsprodukt in der in Beispiel 1 geschilderten Weise getrennt und gereinigt, wobei 1,1 mg la-Hydroxy-24-oxovitamin D₁ derselben Eigenschäften, wie sie das Reaktionsprodukt des Beispiels 1 aufweist, erhalten werden.

Beispiel 6

55

20 mg la,3/?-Di(trimethylsilyIoxyl)-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 500 ml Benzol gelöst, worauf die Lösung unter einer Argonatmosphäre 2 min lang bei einer Temperatur von 13° C mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt wird. Nach der Umsetzung wird sukzessive durch 2stündiges Erhitzen auf Rückflußtemperatur to unter einer Argonatmosphäre eine Isomerisierung durchgeführt Hierauf wird ein großer Teil des Benzols unter vermindertem Druck abgedampft worauf 40 ml Äthylacetat und 20 ml Eiswasser mit einigen Tropfen verdünnter Salzsäure zugegeben werden. Darauf wird das Reaküonsgemisch kräftig gerührt

Die Äthylacetatschicht wird nun abgetrennt, wiederholt mit Wasser gewaschen und getrocknet worauf das Äthylacetat unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der hierbei erhaltene Rückstand wird entsprechend Beispiel 1 behandelt, wobei 0,9 mg la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 derselben Eigenschaften, wie sie das Reaktionsprodukt des Beispiels 1 aufweist, erhalten wird.

Beispiel 7

Einfluß von 1 oc-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ auf die
Förderung der Intestinal-Calciumabsorption:

Entwöhnte männliche Wistar-Ratten werden 4 Wochen lang lediglich mit einer einen niedrigen Calciumgehalt aufweisenden Vitamin D-Mangeldiät gefüttert. Nach Feststellung einer D-Avitaminose erhalten die Ratten eine intraperitoneale Gabe von 0,25 uglV-e. la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 in 95%igem Äthanol. Nach einer bestimmten Anzahl von Stunden werden die Ratten getötet, worauf das Duodenum entnommen und die Calciumabsorption nach der Methode des umgestülpten Gedärmsacks ermittelt wird. Die Inkubation erfolgt mit einem Intestinaltrakt einer Länge von etwa 5 cm bei einer Temperatur von 37°C während 90 min unter 120maligem Schütteln pro min in Gegenwart von Sauerstoff. Nach der Reaktion werden die Radioaktivitätsgrade der Inkubationsmedien außerhalb und innerhalb des umgestülpten Gedärmsacks bestimmt, indem 0,2 ml jeden Inkubationsmediums in eine Phiole gefüllt, 12 ml' des einen Szintillator enthaltenden Cocktails zugegeben und dann die Radioaktivität mit Hilfe eines Flüssigszintillationszählers ermittelt wird. Das Verhältnis der Radioaktivität der serösen Membranseite, d. h. des Inneren des umgestülpten Gedärmsacks, zu der der mukösen Membranseite, d. h. des äußeren Inkubationsmediums, dient als Index für die Calciumabsorption.

Die Zusammensetzung des Inkubationsmediums und des Cocktails sind folgende:

65 Inkubationsmedium
NaCl
Fruktose

125 mM,
1OmM.

Tris(hydroxymethyl)aminomeihan 30 mM.

CaCI.- 0,25 mM,

⁴⁵CaCl; 10μΟ/1

Cocktail	1200 ml
Toluol	800 ml
Äthylcellosolve	8g
2.5-Diphenyloxazol
2,2-p-Phenylenbis(5-phenyl-

oxazol)

300 mg

Die Ergebnisse sind in F i g. 1 dargestellt Neben den erfindungsgemäß erzielten Ergebnissen sind auch noch die Ergebnisse eines Blindversuchs und eines Beispiels, bei dem an Stelle des la-Hydroxy-24-oxovitamin Di eine äquivalente Menge Vitamin D3 verabreicht wird, angegeben. Bei jedem Versuch werden 5 Ratten verwendet.

In F i g. 1 entsprechen die schwarzen Punkte · den Ergebnissen des Blindversuchs, die weißen Punkte ^c dem Versuch, bei dem Vitamin D3 in einer Menge von 2^) μg/kg intraperitoneal verabreicht werden und die weißen Dreiecke Δ, dem Versuch bei dem la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 in einer Menge von Ip μ^/kg intraperitoneal verabreicht wird. Ferner unterscheiden sich die in F i g. 1 mit ** bezeichneten Beispiele signifikant vom Blindversuch um ρ< 0,01. Die mit *** bezeichneten Beispiele unterscheiden sich um ρ < 0,001.

Den Ergebnissen der Fig. 1 ist klar und deutlich zu entnehmen, daß die Intestinal-Calciumabsorption durch la-Hydroxy-24-oxovitamin Ü3-Gabe weit rascher erfolgt als bei Vitamin Di-Gabe.

Beispiel 8

Knochencalcium mobilisierende Aktivität
von l«-Hydroxy-24-oxovitamin D3

la-Hydroxy-24-oxovitamin D3 wird an in entsprechender Weise wie in Beispiel 7 gefütterte Ratten intraperitoneal in einer Menge von 2,5 μg/kg verabreicht. Vorgegebene Stunden später wird den Ratten Blut entnommen, worauf der Calciumgehalt im Plasma bestimmt wird. Da die Menge an aus den Gedärmen absorbiertem Calcium vernachlässigbar ist (der Calciumgehalt der Diät beträgt 0,003%), läßt sich die Zunahme des Calciumgehalts im Plasma als die aus dem Knochengewebe mobilisierte Calciummenge betrachten.

Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse sind in Fi g. 2 dargestellt. Die verschiedenen Zeichen besitzen dieselbe Bedeutung wie in Beispiel 7. Bei jedem Versuch werden 5 Ratten verwendet. Aus F 1 g. 2 geht klar und deutlich hervor, daß durch l:x-Hydroxy-24-oxovitamin Di eine raschere Calciummobilisation aus Knochengeweben erfolgt als mit Vitamin D3.

Die Ergebnisse der Beispiele 7 und 8 zeigen, daß das neue la-Hydroxy-24 oxovitamin Di die Intestinal-Calciumabsorption und die Calciummobilisierung aus Knochen bei Ratten fördert und daß diese Wirkungen rascher eintreten als bei Vitamin D₁. Dies stellt in Verbindung mit der Annahme, daß das K-Hydroxy-24-oxovitamin D_f als Vorläufer von la,24-Dihydroxyvitamin D angesehen werden kann, eine sehr wesentliche Information dar. Vermutlich wandelt sich die 24-Oxogruppe in vivo in eine 24-Hydroxylgruppe um.

Beispiel 9

1 'x,3^Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dJen aus
la,3j3-Diacetoxy-24-oxocholesta-5,7-dien

40

20 mg la,3^-Diacetoxy-24-oxocholesta-5.7-dien, das gemäß der US-Patentanmeldung mit der Serial No. 906 785 hergestellt worden war, werden in 10 ml einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung gelöst und über Nacht bei einer Temperatur von 40⁰C gerührt Nach dem Abdampfen des Methanols unter vermindertem Druck wird der Verdampiungsrückstand dreimal mit 30 ml Äthylacetat extrahiert. Die abgetrennten Äthylacetatschichten werden miteinander vereinigt und nach und nach mit 30 ml lnHCl-Lösung, 30 ml gesättigter wäßriger NaHCO₃-Lösung und JO ml gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Nach dem Trocknen über NüjSOa wird das Lösungsmittel ϊϊ abgedampft wobei 16 mg Verdampfungsrückstand erhalten werden. Der Verdampfungsrückstand wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel 60 F254 (0,25 mm χ 20 cm χ 20 cm) (Entwickler: Benzol/Aceton 5/1) gereinigt, wobei 14 mg bo einer Verbindung der folgenden physikalischen Eigenschaften erhalten werden:

3,7 (IH, m, 3α-Η),

4,1 (IH, m, 3λ-Η),

5,38, 5,72 (IH, dd J = 2Hz, 6Hz; IH, d,

J = 6Hz: 6,7-Hz)
Massen-Spektrum (m/e):

414(M+),396(M-18),378(M-18x2)

Hochauflösendes Massen-Spektrum:
Gefunden: 414.3136;
erforderlich: M⁺ (C₂₇H₄₂O₃)414.3134

Auf Grund der angegebenen Eigenschaften läßt sich das Reaktionsprodukt als la,3j?-Dihydroxy-24-cholesta-5,7-dien identifizieren.

Beispiel 10

lix,3iS-Dibenzoy!oxy-24,oxochQ!esta-5,7-dienaus
la,3j3-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dicn

20 mg la,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 2 ml trockenem Pyridin gelöst und 30 min in einem Kühlschrank ( — 20° C) stehengelassen. Dann werden dazu 20 μΐ Benzoylchlorid hinzugegeben und über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Darauf werden 30 ml kaltes Wasser hinzugegeben und dreimal mit 30 ml Äthylacetat extrahiert. Die abgetrennte Äthylacetatschicht wird mit 30 ml In HCl, 30 ml einer an NaHCC>3 gesättigten wäßrigen Lösung und mit 18 ml Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedamp.t und 18 mg Rückstand erhalten. Dieser wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel 60 F 254 (0.025 mm χ 20 cm χ 20 cm) mit Benzol als Entwickler gereinigt, um eine Verbindung der folgenden Eigenschaften zu erhalten:

'UV-Spektrum: λ*" (nm); 231,261,271,282,293.

Kernresonanz-Spektrum (CDCU), ό (ppm):
0,62 (3H, s, 18-CH,),

1,08 (6H, d, ] = 7H„26-,27-,

4,95 (IH. m, 3<x-H),

5,32 (2H. m, Ip-H und 6- oder 7-H),

5,72 (IH. d, J = 6H„6-oder7-H),

7,49 8,02 (10H.m.aromatisch-2(H₅)).

Massen-Spektrum (m/e):

622 (M⁺), 500 (M * -Benzoesäure),
378 (M ⁺-2 χ Benzoesäure),

Hochauflösendes Massen-Spektrum:
Gefunden: 6223651;
erforderlich: M +(C₄₁HwO,) 622.3658.

An Hand der vorstehenden Eigenschaften wird die Verbindung als 1 *,3jS-Dibenzoyloxy-24-oxocholesta-5,7-dien identifiziert.

UV-Spektrum:

,(nm);261,271,282,293.

Kernresonanz-Spuktrum (CDCl3), δ (ppm)
0,63 (3H, s, I8-CH3),

0,95 (3H, s, 19-CH3),

1,08 (6H, d, J = 7Hz, 26,27 (CH₃J₂),

65 Beispiel 11

l«,j9-Bis(trimethylsilyloxy)-24-oxocholesta-

5,7-dien aus
lix3j5-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien

2OG mg eines loc,3/?-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 1 ml N-Trirnethylsilylimidazol gelöst und über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Nach Zugabe von 50 ml η-Hexan wird das Ganze dreimal mit 20 ml Wasser gewaschen, worauf die n-Hexanschicht abgetrennt und über Na₂SCU getrocknet wird. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem

Druck erhält man 15 mg Verdampfungsrückstand. Dieser wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel 60 F 254 (0,25 mm χ 20 cm χ 20 cm) (Entwickl.-r: Benzol) gereinigt, wobei 5 mg einer Verbindung der folgenden Eigenschaften erhalten werden:

UV-Spektrum; λ ^f³¹"" (nm): 261,271,282,293.

Kernresonanz-Spektrum (CDCI3: <5 (ppm),

0,13 (18H, s, Trimethylsilyl-2(CH₃)₃),

0,62 (3H, s, 18-CH₃),

0,90 (3H, s, 19-CH₃),

1,08 (6H, d, J = 7Hz, 36,27-(CH₃J₂),

3,74 (IH, m, IjS-H),

4,02 (IH, 3«-H),

5,34 5,65 (2H, ein Paar m, 6-,7-Hz)

Massen-Spektrum (m/e):

558 (M ⁺) 468 (m-Trimethylsilyl)
378 (m-2 χ Trimethylsilanol)

Hochauflösendes Massen-Spektrum:
gefunden: 558.3923;
erforderlich: M+ (C₃₃H₅₈O₃Si₂)558.3925.

Auf Grund der erhaltenen Ergebnisse läßt sich die Verbindung als la,3/?-Bis(trimethylsilyloxy)-24-oxocholesta-5,7-dien identifizieren.

Referenzbeispiel 1

Beispiel 12

la,3^-Bis(tetrahydropyranyloxy)-24-oxocholesta-

5,7-dien aus
la,3^-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien

20 mg la,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 10 ml trocknenen Methylenchlorid gelöst, worauf die Lösung unter Kühlen mit Eiswasser mit 15 μΐ destilliertem 2,3-Dihydropyran versetzt wird. Danach wird noch eine katalytisch^ Menge p-Toluolsulfonsäure zugegeben, worauf 30 min lang gerührt wird. Nach Zugabe von 30 ml Methylenchlorid wird das erhaltene Gemisch mit 20 ml gesättigter wäßriger NaHCO₃-Losung und 20 ml Wasser gewaschen und danach über Na₂SO₄ getrocknet. Hierauf wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel 60 F 254 (0,25 mm χ 20 cm χ 20 cm) (Entwickler: Benzol/Aceton 40/1) gereinigt. Hierbei erhält man 1,2 mg einer Verbindung der folgenden Eigenschaften:

UV-Spektrum;λ*'?™' ,(nm):261,271,282,293

Kernresonanz-Spektrum ((CDCl₃; <5 (ppm)):
0,62 (3H, s, 18-CH 3),

0,94 (3H, s, 19-CH₃),

1,08 (6H, d, J = 7Hz,26,27-(CH₃)₂),

3,2 ~ 4,1 (6H, m, l]5-,3a-Hzund2Hzan

der 6-Stellung des Tetrahydrepyranylre-

sies),
4,73 (2H, m, 2(H) an der 2-Stellung des

Tetrahydropyranylrestes),
5,35, 5,63 (2H,m2 x,6-,7-Hz)

Hochauflösendes Massen-Spektrum:
Gefunden: 582.4299;
erforderlich: M+ (C₃₇H₅₈O₅)582.4284.

Auf Grund der ermittelten Eigenschaften läßt sich diese Verbindung als 1a,3/?-Bis(tetrahydropyranyloxy)-24-oxocholesta-5,7-dien identifizieren.

Herstellung von la,24-Dihydroxyvitamin D₃
aus la-Hydroxy-24-oxovitamin D₃

a) Nach dem Auflösen von 20 mg loc-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ in 20 ml Tetrahydrofuran wird die Lösung bei Raumtemperatur (15° C) mit 15 mg Lithiumaluminiumhydrid versetzt und 3 h lang unter Argonatmosphäre gerührt. Nach der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch zur Zersetzung überschüssigen Lithiumaluminiumhydrids mit einer geringen Menge an mit Wasser gesättigtem Diäthyläther versetzt. Danach wird das Gemisch über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, worauf das Tetrahydrofuran sorgfältig unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler: 6% Methanol in Chloroform) gereinigt, wobei 18 mg la,24-Dihydroxyvitamin'D₃ der folgenden Eigenschaften erhalten werden:

UV-Spektrum: λ™;"°' ;(nm), 265 (ε = 18.000)

λ™°""' ;(nm),228
Kernresonanz-Spektrum (C₃DeO); <5 (ppm):

0,57 (6H, 1, 18-CH₃),

0,87 (6H, d, ] = 7Hz, 26-,27-CH₃),

0,96 (3H, d, ]=5Hz,21-CH₃),

3,19 (IH, m, 24-H)

4,15 (IH, m, 16-H)

4,36 (IH, m, 3«-H),

4,85 (IH, bs, 19-H),

5,30 (IH, bs, 19-H)

6,05 (IH, d, Kb= 11 Hz,6oder7-H),

6,25 (IH, d, Ub = 11 Hz, 6 oder 7-H)

Massen-Spektrum (m/e):

416 (M + ), 398,380,269,251,134.

Hochauflösendes Massen-Spektrum:

M⁺(C₂₇H₄₄O₃) = 416.32927;
gefunden: 416.32768.

Fp: 84 bis 85° C

b) 18 mg l<x,3|?-Diacetoxy-24-oxovitamin D₃ (Ia-Acetoxy-24-oxocholecalciferol 3jS-Acetat) werden in 20 ml Methanol gelöst, worauf die Lösung bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre mit 15 mg Natriumborhydrid versetzt wird. Nun wird 10 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wird eine geringe Menge 10' iger Essigsäurelösung zugesetzt, um das überschüssige Nalriumborhydrid zu zersetzen. Danach wird das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt, wobei 14 mg la-Acetoxy-24-hydroxyvitamin D₃ 3jS-Acetat erhalten werden. Die Eigenschaften des Reaktionsprodukts sind folgende:

UV-Spektrum; A^T⁰' (nm), 264 (ε = 18.600);
λ™'""' (nm),228.

12 mg des in der geschilderten Weise hergestellten la-Acetoxy-24-hydroxyvitamin D₃ 3j3-Acetat werden in 2 ml Benzol gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung versetzt und dann bei Raumtemperatur 20 h lang stehengelassen wird. Nach der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und mit Ä'thylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mehrmals mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat

getrocknet und durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird mittels Dünnschichtchromatographie getrennt und gereinigt, wobei S mg la,24-Dihydroxyvita-nin D3, das dieselben physikalischen Eigenschaften aufweist wie das in Stufe a) erhaltene Produkt erhalten werden.

c) 20 mg la,3jS-Dibenzoyloxy-24-oxovitamin D₃ werden in 25 ml Methanol gelöst, worauf die Lösung bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre mit 18 mg Natriumborhydrid versetzt wird. Dann wird 10 h lang gerührt Nach beendeter Umsetzung wird zur Zersetzung des überschüssigen Natriumborhydrids eine geringe Menge 10%iger Essigsäure zugesetzt, worauf das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt, wobei 15 mg lot,3/?-Dibenzoyloxy-24-hydroxyvitamin D3 erhalten werden.

Das erhaltene Produkt wird in 5 ml einer 7°/oigen methanolischen Kaliumhydroxidlösung gelöst und dann 18 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Gemisch mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mehrmals mit 5%iger wäßriger Natriumhydroxidlösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird durch Dünnschichtchromatographie getrennt und gereinigt, wobei 9,8 mg 1«,24-Dihydroxyvitamin D3 derselben physikalischen Eigenschaften, wie sie das Produkt der Stufe a) aufweist, erhalten werden.

Referenzbeispiel 2

Herstellung von j
dien bzw. von dessen Derivaten mit geschützten Hydroxylgruppen, bei denen es sich um Zwischenprodukte des loc,24-Dihydroxyvitamin D₃ (vgl. US-PS 40 22 891) handelt, aus l«,3/3-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien bzw. dessen Derivaten mit geschützten Hydroxylgruppen.

a) 15 mg l(x,3jS-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 38 ml Methanol gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre mit 15 mg Natriumborhydrid versetzt wird. Danach wird 8 h lang bei einer Temperatur von 30° C gerührt. Nach Zugabe einer geringen Menge 10%iger wäßriger Essigsäure zur Zersetzung überschüssigen Natriumborhydrids wird das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler: 6% Methanol in Chloroform) getrennt und gereinigt, wobei 11 mg Ii*,3j3,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien mit folgenden physikalischen Eigenschaften erhalten werden

UV-Spektrum: λ*¹.",""" (nm):
262,271 (ε = 11.000)
282 (ε = 12.000),
294 (ε = 7.000).

Kernresonanz-Spektrum (in CjD₆O):

0,63 (3H, s, I8-CH3),

3,30 (IH, m, 24-H),

3,70 (IH, m, IjJ-H),

4,08 (IH, m, 3«-H),
■' 5,30 (IH, d, J = 6Hz, 6oder7-H),

5,60 (IH, d, J = 6Hz, 6oder7-H)

Massen-Spektrum (m/e):
416 (M + ), 398,380,357,
251,227,197,157

. Fp: 102° C bis 103° C.

b) 25 mg la,3j3-Diacetoxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 25 ml Tetrahydrofuran gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur unter Rühren mit 15 mg Lithiumaluminiumhydrid versetzt wird.

ίο Danach wird noch 2,5 h lang unter Argonatmosphäre weitergerührt. Nach der Umsetzung wird eine geringe Menge mit Wasser gesättigten Diäthyiäthers zur Zersetzung des überschüssigen Lithiumaluminiumhydrids zugesetzt Nun wird das Gemisch über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch sorgfältiges Eindampfen unter vermindertem Druck vom Tetrahydrofuran befreit

Der Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler: 6% Methanol in Chloroform) gereinigt, wobei 18 mg 1 ct,3(9,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien derselben physikalischen Eigenschaften, wie sie das Produkt der Stufe a) aufweist, erhalten werden.

c) 20 mg la,3j3-Diacetoxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 25 ml Methanol gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre mit 20 mg Natriumborhydrid versetzt wird. Danach wird 8 h lang bei einer Temperatur von 35° C gerührt. Nach Zugabe einer geringen Menge lO°/oiger wäßriger Essigsäure zur Zersetzung überschüssigen Natriumborhydrids wird das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler: 3% Methanol in Chloroform) getrennt, wobei 15 mg la,3^-Diacetoxy-24-hydroxycho-Iesta-5,7-dien der folgenden physikalischen Eigenschaften erhallen werden:

UV-Spektrum, λ™™""' (nm):
261,271 (f = 11.200),

282(ε = 12.000),
293.

Kernresonanz-Spektrum (in C₃D₆O):
0,63 (3H. s, 18-CH₃),
2,03 (6H, s, CH₃COO-),
3,30 (IH, m, C-24-H),
4,75 (IH. b, C-3-H)
5,01 (IH, b, C-I-H),
5,35 (IH, d, J=6Hz,C-6oderC-7-H),
5,69 (IH, d, J=6Hz,C-6oderC-7-H).

10 mg des Diacetatderivats werden in 10 ml 10%iger methanolischer Kaliumhydroxidlösung gelöst und 18 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach beendeter Umsetzung wird das Gemisch mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschichl wird wiederholt mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und durch Eindampfen unter

vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit.

Der Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie getrennt und gereinigt, wobei 6 mg lct,3ji,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien derselben physikalischen Eigenschaften, wie sie das Produkt der Stufe a) aufweist, erhalten werden.

d) 18 mg l«,3jS-Dibenzoy!oxy-24'-oxocholesta-5,7-dien werden in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur mit 18 mg

130 218/306

Lithiumaluminiumhydrid versetzt wird. Danach wird 5 h lang unter Argonatmosphäre gerührt

Nach beendeter Umsetzung wird das Gemisch mit einer geringen Menge von mit Wasser gesättigtem Diäthyläther versetzt, um überschüssiges Lithiumaluminiumhydrid zu zersetzen. Nach dem Trocknen des Gemischs über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird das Tetrahydrofuran sorgfältig unter vermindertem Druck abgedampft Der erhaltene Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler: 6% Methanol in Chloroform) gereinigt, wobei 10 mg la,3J3,24-Trihydroxycholesta-5_s7-dien derselben physikalischen Eigenschaften, wie es das Produkt der Stufe aj aufweist, erhalten werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. lcc-Hydroxy-24-oxovitamin D₃.

2. Verfahren zur Herstellung von la-Hydroxy-24-oxovhamin D₃, dadurch gekennzeichnet, daß man l«,3j3-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder ein Derivat hiervon der allgemeinen Formel (1)