DE2838092A1

DE2838092A1 - 1 alpha -hydroxy-24-oxovitamin d tief 3 , verfahren zu seiner herstellung, dabei verwendete vorlaeufer und verwendung von 1 alpha -hydroxy-24-oxovitamin d tief 3

Info

Publication number: DE2838092A1
Application number: DE19782838092
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Bannai; Hiroyuki Kawashima; Takao Niki; Toru Takeshita
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1977-09-07
Filing date: 1978-08-31
Publication date: 1979-03-08
Also published as: FR2421882A1; GB2006216B; GB2006216A; FR2412568B1; JPS5441856A; DE2838092C3; JPS5822479B2; US4199577A; DE2838092B2; CH643827A5; FR2421882B1; FR2412568A1

Description

31. AUG. 1978

1pC/-Hydroxy-24-oxovitamin D₃, Verfahren zu seiner Herstellung, dabei verwendete Vorläufer und Verwendung von i0t-Hydroxy-24-oxovitamin D₃

Die Erfindung betrifft ein neues io.-Hydroxy-24-oxovitamin D₃, neue Vorläufer desselben, 1<X,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder dessen Derivate mit geschützter Hydroxylgruppe sowie ein Verfahren zur Herstellung des neuen 1oc.-Hydroxy-24-oxovitamin D₃. Ferner betrifft die Erfindung Arzneimittel für Warmblüter mit wirksamen Mengen an dem neuen 10c-Hydroxy-24-oxovitamin D₃, sowie dessen Verwendung zur Steuerung des Calciumstoffwechsels bei Warmblütern.

Das neue 1<x>-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ läßt sich durch folgende Strukturformel

(2)

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wiedergeben.

Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß das neue 1a.-Hydroxy-24-oxovitamin D, in höchstwirksamer Weise den Calciumstoffwechsel von Warmblütern zu steuern vermag. In der diesbezüglichen Wirkung ist das neue 1iX-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ dem bekannten Vitamin D₃ weit überlegen (vgl. die später folgenden Tierversuche).

Das iix-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ g ämäß der Erfindung stellt eine neue/ bislang in der Literatur noch nicht beschriebene Verbindung dar. Ebenso wenig sind bisher ein Verfahren zu dessen Herstellung bzw. dessen biologische Aktivitäten bekannt geworden.

Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß das neue 1ix-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ infolge seiner Struktureigenschaften, nämlich Anwesenheit einer Hydroxylgruppe in 1<x-Stellung und einer Oxogruppe in 24-Stellung_f zu einer rascheren Intestinal-Calciumabsorption und einer erhöhten Calciumkonzentration im Blut führt und darüber hinaus stärkere Wirkungen bei der Knochenresorption und Heilung von Rachitis zeigt als 1«x,25-Dihydroxy- oder ICt-Hydroxy-vitamin D-.

Das neue 'bt-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ und dessen neue Vorläufer, nämlich 1iX,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder dessen Derivate mit geschützter Hydroxylgruppe eignen sich ferner als Zwischenprodukte bei der Herstellung von ■U,24-Dihydroxy-vitamin D₃ (vgl. US-PS 4 022 891).

Erfindungsgemäß ist es nun gelungen, 1ix-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ und dessen Vorläufer herzustellen.

Das 1a-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ erhält man durch Bestrahlen von 1».,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder dessen Derivaten mit geschützter Hydroxylgruppe der Formel:

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(1)

worin R- und R₂, die gleich oder verschieden sein können und für ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylschutzgruppe stehen, mit UV-Strahlen in einem inerten organischen Lösungsmittel, anschließende Isomerisierung und gegebenenfalls Eliminierung der Hydroxylschutzgruppe(n).

Die erfindungsgemäß verwendete Ausgangsverbindung(en) 1ou-3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder dessen Derivate läßt (lassen) sich ohne Schwierigkeiten aus Fucosterin über 24-Oxocholesterin und 1a, 2«<-Epoxycholesta-4,6-dien-3,24-dion-?4-ketal in hoher Ausbeute herstellen.

einem
Dieses Verfahren ist Verfahren zur Herstellung von andere Zwischenprodukte bei der Herstellung von 1<X ,25-Dihydroxyvitamin D₃ bildenden ioc,25-Dihydroxycholesterin oder 1a,3ß,25-Trihydroxycholesta-5,7-dien weit überlegen.

Von 1-Λ ,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5 ,7-dien oder dessen Derivaten mit geschützter Hydroxylgruppe der Formel (1) läßt sich das 24-Oxocholesta-5,7-dien mit geschützten Hydroxylgruppen in X)C- und 3ß-Stellung (R¹ und R² stellen in der Formel (1) Hydroxylschutzgruppen dar) ohne weiteres durch Bromieren von 24-Oxocholesta-5-en-24-ketal mit geschützten Hydroxylgruppen in 1Ä- und SB-Stellung zu dem allylbromierten Derivat, anschließende

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Entbromierung (dehydrobromination) und abschließende EIiminierung der Schutzgruppen herstellen. Auch die Ver-

1 2 bindung der Formel (1), in der beide Reste R und R für Wasserstoffatome stehen, kann ohne Schwierigkeiten durch Eliminieren der Schutzgruppen aus dem genannten doppeltgeschützten Hydroxy-5,7-dien-Derivat hergestellt werden. In der Formel (1) können, wie bereits erwähnt,

1 2
die Reste R und R gleich oder verschieden sein und für Wasserstoffatome oder zum Schutz der Hydroxylgruppen geeignete Gruppen stehen. Als Hydroxylschutzgruppen kann man sich-üblicher Hydroxylschutzgruppen für Cholesterine bedienen. Im folgenden werden einige Beispiele hierfür angegeben: _:

a) Acy!gruppen

Vorzugsweise handelt es sich hierbei um die Reste gegebenenfalls nitro-, halogen- oder alkoxysubstituierter aliphatischer Carbonsäuren mit 1 bis 12 Kohlenstoffatom(en) oder gegebenenfalls nitro-, halogen- oder alkoxysubstituierter aromatischer Carbonsäuren, ζ-B. um Acetyl-, Propanoyl—, Butanoyl-, Pivaloyl-, Pentanoyl-, Chloracetyl-, Brom- acetyl-, Benzoyl-, p-Brombenzoyl-, p-Nitrobenzoyl-, Äthylbenzoyl- oder Toluoylgruppen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Acetyl-, Benzoyl-, Propanoyl- oder Pivaloylgruppen.

b) Mit Hydroxylgruppen Ätherbindungen bildende Gruppen

Hierbei handelt es sich um Trialkylsilylgruppen, z.B. Trimethylsilyl- oder Dimethyl-tert.-butylsilylgruppen oder cyclische Äthergruppen, wie 2-Tetrahydropyranyl- oder 2-Tetrahydrofuranylgruppen. .

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Von den genannten Schutzgruppen werden Acylgruppen am meisten bevorzugt.

Von den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen 1ct,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder dessen Derivaten mit geschlitzter Hydroxylgruppe (Formel 1) stellen die in k- und 3ß-Stellung geschützte Hydroxylgruppe! aufweisenden 24-Oxocholesta-5 ,7-d.Lene der Formel

(1-a)

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worin R und R , die gleich oder verschieden sein können und jeweils für ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe mit mindestens 3 Kohlenstoffatomen, eine Trialkylsilylgruppe oder eine 2-cyclische Äthergruppe stehen, neue Verbindungen dar. Diese neuen Verbindungen bzw. Vorläufer des 1<*,-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ können nicht nur erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial sondern auch als wertvolles Zwischenprodukt bei der Herstellung von 1CC?24-Dihydroxy-vitamin D^ verwendet werden»

Erfindungsgemäß wird 1a ,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder ein geschützte Hydroxylgruppen aufweisendes Derivat hiervon (Formel 1) zunächst in einem inerten organischen Lösungsmittel mit UV-Licht bestrahlt.

Zu diesem Zweck bedient man sich einer UV-Strahlung einer Wellenlänge im Bereich von etwa 200 - 360, vorzugswei-

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se von 260 - 310 nm. Als Lösungsmittel eignen sich Kohlenwasserstoffe oder halogenierte Kohlenwasserstoffe, z.B. Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol, Brombenzol. Chlorbenzol, Nitrobenzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder 1,2-Dibromäthan, Äther, wie Diäthylather, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylcellosolve oder Phenylcellosolve oder Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Hexanol oder Cyclohexanol.

Die Bestrahlung mit UV-Strahlen erfolgt bei einer Temperatur von -20 bis +80°, vorzugsweise von -10 bis +20⁰C in sauerstoffreier Atmosphäre, z.B. in Argon- oder Stickstof fatmosphäre.

Durch die Bestrahlung mit UV-Strahlen kommt es zu einer Spaltung zwischen der 9- und 10-Stellung der als Ausgangsmaterial verwendeten 5,7-Dien-Verbindung, wobei man tji.-Hydroxy-24-oxoprovitamin D₃ bzw. ein geschützte Hydroxylgruppen aufweisendes Derivat hiervon erhält.

Das gebildete Provitamin D₃ wird erfindungsgemäß zu iot-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ oder einem geschützte Hydroxylgruppen aufweisenden Vitamin D₃ der Formel (2) isomerisiert. ,

Die Temperatur während der Isomerisierung für das Fortschreiten der Umsetzung ist nicht von wesentlicher Bedeutung. Das Gleichgewicht zwischen Provitamin D₃ oder dem geschützte Hydroxylgruppen aufweisenden Derivat desselben und dem Vitamin D₃ oder dessen Derivat mit geschützten Hydroxylgruppen hängt von der Temperatur ab. Hierbei ist eine Tendenz festzustellen, daß letztere mengenmäßig steigen und gleichzeitig die Geschwindigkeit der Umwandlung ersterer in letzterer mit fallender Temperatur langsamer wird. Folglich kann die Temperatur unter Beachtung des Gleichgewichtswerts und des Umwandlungsgrades in

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geeigneter Weise gewählt werden. Somit ist also die Temperatur als solche für das Fortschreiten der Umsetzung nicht notwendigerweise von Bedeutung.

Im Hinblick auf den Gleichgewichtswert und den Umwandlungsgrad bedient man sich bei der Isomerisierung in der Praxis einer Temperatur von 10° bis 120⁰C. In der Regel wird die Isomerisierung vorzugsweise in einem inerten organischen Lösungsmittel, bei dem es sich um dasselbe Lösungsmittel handeln kann, wie es auch bei der Bestrahlung mit UV-Strahlung verwendet wird, durchgeführt. Die Isomerisierungsreaktion braucht nicht zwangsläufig nach Beendigung der bei der Bestrahlung mit UV-Strahlen ablaufenden Umsetzung, d.h. nach Beendigung der Strahleneinwirkung, begonnen zu werden, sie kann vielmehr parallel mit der Bestrahlung zur Umwandlung des während der Bestrahlung gebildeten Provitamins D₃ zu dem Vitamin D₃ ablaufen gelassen werden. Wenn als Ausgangsverbindung 1ix ,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-

1 2 5,7-dien (Verbindung der Formel (1), worin R und R beide Wasserstoffatome darstellen) verwendet wird, erhält man 1a-Hydroxy~24-oxovitamin D₃ der Formel (2). Wenn ein Derivat mit geschützter (geschützten) Hydroxylgruppe(n) der

1 2 Formel (1), worin mindestens einer der Reste R und R für eine Hydroxylschutzgruppe steht, verwendet wird, erhält man durch sukzessive Eliminierung der Hydroxylschutzgruppe(n) 1«-Hydroxy-24-oxovitamin D₃.

Wenn als Schutzgruppe eine Acylgruppe vorgesehen ist, besteht die Eliminierung der Schutzgruppe(n) vorzugsweise in einer Spaltung in einem alkalischen Alkohol, z.B. NaOH/Methanol oder NaOH/Äthanol. Die Entacylierung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von -10° bis +5O⁰C während 30 min bis 40 h.

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Die mit den Hydroxylgruppen über Ätherbindungen verbundenen Schutzgruppen können ohne weiteres durch Inberührungbringen mit einer Säure, z.B. verdünnter Salzsäure, eliminiert werden.

Das in der geschilderten Weise erhaltene "K*-Hydroxy-24-· oxovitamin D₃ der Formel (2) läßt sich durch Säulenchromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie, Hochdruck/ Flüssigchromatographie oder Umkristallisieren isolieren und reinigen.

Das erhaltene ia.-Hydroxy-24-oxovitamin D, besitzt, wie die später beschriebenen Tierversuche zeigen, eine hohe pharmazeutische Wirksamkeit hinsichtlich der Förderung der Intestinal-Calciumabsorption und einer Erhöhung der CaIciumkonzentration im Blut.

Folglich eignet sich also das erfindungsgemäß hergestellte lot-Hydroxy-24-oxovi tamin D₃ als bei durch einen anomial&n Calciumstoffwechsel hervorgerufenen Erkrankungen verwende bares Arzneimittel.

Eine geeignete Dosierung des neuen 1<a,-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ bei klinischer Applikation beträgt aufgrund·, durchgeführter pharmakologischer Tests etwa 0,04 bis 0,4 ng (etwa 96 bis 960 pMol pro kg Körpergewicht des Warmblüters).

Das erfindungsgemäße 1⁽X-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ läßt sich bei folgenden Erkrankungen in der Human- oder Tiermedizin zum Einsatz bringen:

Vitamin D abhängige Rachitis, renale Osteodystrophie, Hypoparathyroidismus, Osteoporose, Osteomalazie, Behcet'sche

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* 'ψ

Krankheit, auf schlechter Absorption beruhende Syndrome, durch Leberzirrhose induzierte Hypocalcämie, durch Steatorrhoe induzierte Hypocalcämie, durch Vitamin D resistente Rachitis induzierte Hypocalcämie und anormalen Calcium- und Phosphorstoffwechsel, bedingt durch Erkrankungen oder Fehlleistungen der Leber, der Niere, des Gastrointestinaltrakts oder der Epithelkörperchen (Parathyreoide) sowie verwandte Knochenerkrankungen.

Das i£*.-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ kann in Arzneimitteln in Kombination mit anderen den Calciumstoffwechsel regulierenden Mitteln verwendet werden. So kann es beispielsweise zur Behandlung von Behcet¹scher Krankheit in Kombination mit Calcitonin zum Einsatz gelangen.

Geeignete Verabreichungswege sind der orale, bukkale und parenterale, nämlich intramuskuläre, subkutane, intravenöse und intrarektale Verabreichungsweg. Geeignete Dosierformen sind beispielsweise gepreßte Tabletten, beschichtete Tabletten, Hartgelatinekapseln oder weiche elastische Gelatinekapseln, äthanolische Lösungen, ölige Lösungen und wäßrige Suspensionen.

Das Lösungsmittel für ölige Lösungen kann aus einem Pflanzenöl, z.B. Mais-, Baumwollsaat-, Kokosnuß-, Mandel- oder Erdnußöl, einem Fischleberöl oder einem öligen Ester, z.B. Polysorbat 80, bestehen.

Zur intrarektalen Verabreichung kann das 1cx-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ zu einem Arzneimittel mit einer Supositoriengrundlage, wie Kakaobutter oder einem sonstigen Triglyzerid, formuliert werden. Zur Verlängerung der Haltbarkeit des Arzneimittels kann ein Antioxidationsmittel, z.B. Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hydrochinon, mitverwendet werden.

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Das 1(X-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ gemäß der Erfindung kann im Futter für Haustiere zugemischt werden. Das die be-, treffende Verbindung enthaltende Futter für Haustiere kann in einer solchen Menge verabreicht werden, daß es bei der Verhinderung einer Hypocalcemie bei Kühen bei oder nahe dem Zeitpunkt der Verfütterung oder bei der Verhinderung einer Hypocalcemie von Haustieren ohne Anzeichen einer Hypocalcemie nicht-toxisch ist. Wenn ein solches Futter an Geflügel während des Eierlegens verfüttert wird, ist es möglich, die Ablage vo.i weichschaligen Eiern zu verhindern. Dies stellt ein weiteres charakteristisches Merkmal des erfindungsgemäßen ict-lIydroxy-24-oxovitamin D₃ dar.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Die Kernresonanzspektren werden mit Hilfe handelsüblicher Kernresonanzspektrometer in Deuterochloroform (CDCl₃) unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard ermittelt. Auch die Massenspektren und hochauflösenden Massenspektren werden mit Hilfe eines handelsüblichen Geräts bestimmt. Die UV-Spektren werden mit Hilfe eines handelsüblichen Spektralfotometers unter Verwendung äthanolischer Lösungen aufgenommen. Die Fließpunkte (Fp) werden mittels eines Mikroskops mit beheizbarem Block bestimmt. Die hierbei ermittelten Werte werden nicht korrigiert.

Beispiel 1

10 mg eines 1ct,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-diens werden in so viel Diäthylather, der nach einer Behandlung zur Entfernung jeglichen Sauerstoffs zur Reinigung destilliert wor-

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den war, gelöst, daß 500 ml Lösung erhalten werden. Danach wird die Lösung 2 min lang bei einer Temperatur von 5⁰C in einer Argonatmosphäre mittels einer 200 W Hochdruckquecksilberlampe mit UV-Licht bestrahlt. Danach wird ein Teil der Lösung abgezweigt und auf sein UV-Spektrum hin untersucht. Hierbei ist eine Absorption bei 262 - 263 nm feststellbar. Diese kann auf ein Provitamin D^ zurückzuführen sein. Nach beendeter Umsetzung wird der Äther bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck abgeraucht. Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird mit 100 ml Benzol versetzt, worauf durch zweistündiges Erhitzen des Gemisches unter Argonatmosphäre auf Rückflußtemperatur eine Isomerisierungsreaktion ablaufen gelassen wird. Nach beendeter Isomerisierung wird das Benzol unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 10 mg eines fahlgelben Feststoffs erhalten werden. Das erhaltene Reaktionsprodukt wird mittels präparativer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Silikagelträgers mit Silbernitrat (und dreimaliger Entwicklung mit Methanol/Chloroform) getrennt. Hierbei erhält man Bänder, die durch Bestrahlen mit UV-Strahlung nachgewiesen werden. Aus dem letzten polaren Band erhält man 2,1 mg eines Feststoffs. Dieses als 1«.-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ identifizierte Produkt besitzt folgende Eigenschaften:

UV-Spektrum; λ ^Xthano1 (_nm) 264 (E = 18300)

λ ^Ätha*ol _(nm) 228
mm

Massen-Spektrum (m/e); 414 (M⁺), 396 (M-18)

378 (M-18x2)

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Kernresonanz-Spektrum (CDCl- + Aceton dg),« (ppm);

0,54 (3H, s, C-18, CH₃)

1.1 (6H, d, J=7 Hz, 26, 27-CH₃),

4.2 (1H, b, C-1-H oder C-3-H), 4,4 (1H, b, C-3-H oder C-1-H),

5.0 (TH, m, C-19-H),

5.3 (1H, m, C-19-H),

6.1 (1H, d, J=I1 Hz, C-6 oder

C-7-H),

6.4 (1H, d, J-11 Hz, C-6 oder C-7-II) , Die Symbole s, d, b und m bedeuten Singlett, Doublett, breites und Multiplett.

• hochauflösendes Massen-Spektrum;
gefunden: 414.3132 (M⁺)
erforderlich: 414.31338 (C₃₇ H₄₃O₃)

Aus dem am stärksten polaren Band werden 3 mg Ift^ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7~dien gewonnen.

Beispiel 2

500 ml einer benzolischen Lösung mit 13 mg ta,3ß-Diacetoxy~ 24-oxocholesta-5,7-dien, dessen Benzolanteil nach einer Behandlung zur Befreiung von Sauerstoff durch Destillation gereinigt worden war, werden 2 min lang bei einer Temperatur von 10⁰C unter Argonatmosphäre mit der in Beispiel 1 verwendeten Hochdruckquecksilberlampe mit UV-Strahlen bestrahlt. Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktionsprodukt durch 2,5-stündiges Erhitzen unter Argonatmosphäre auf Rückflußtemperatur isomerisiert. Danach wird das Benzol größtenteils abgedampft. Nach Zusatz von 3 ml einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung und 3 ml Benzol wird das Gemisch 24 h lang bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre stehengelassen.

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Danach wird das Reaktionsprodukt mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen, getrocknet und durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. Der.hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird entsprechend Beispiel 1 getrennt und gereinigt, wobei 2,2 mg 1Λ-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ derselben Eigenschaften, wie sie das Reaktionsprodukt des Beispiels 1 aufweist (mit Ausnahme des hochauflösenden Massen-Spektrums, das etwas anders ist) erhalten werden. Das hochauflösende Massen-Spektrum des Reaktionsprodukts des vorliegenden Beispiels beträgt 414.3140 (M⁺).

Beispiel 3

500 ml einer Lösung von 15 mg 1ct ,3ß-Dibenzoyloxy-24-oxocholesta-5,7-dien in Diäthyläther werden unter Argonatmosphäre 1,5 min lang mit UV-Strahlen bestrahlt. Nach beendeter Umsetzung wird der Äther bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck abgedampft. Der hierbei erhaltene Verdampfung srückstand wird mit 100 ml Benzol versetzt, worauf das Gemisch zur Durchführung der Isomerisierungsreaktion 2 h lang unter Argonatmosphäre auf Rückflußtemperatur erhitzt wird. Nach beendeter Umsetzung wird der Großteil des Benzols unter vermindertem Druck abgedampft, worauf der Verdampfungsrückstand mit 20 ml einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung, 1 ml Methanol und 1 ml Benzol versetzt wird. Nun wird das Gemisch 4 h lang bei einer Temperatur von 4 0⁰C einer Alkoholyse unterworfen, danach mit Wasser verdünnt und schließlich mit Äthylacetat extrahiert.

Die Äthylacetatschicht wird mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und durch Verdampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. Hierbei erhält man einen hellgelben öligen Rückstand.

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Der ölige Rückstand wird mit Hilfe der präparativen Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines silbernitrathaltigen Silikagelträgers entsprechend Beispiel 1 getrennt und gereinigt, wobei 1,8 mg 1<x-Hydroxy-24-oxovitamin D^ der folgenden Eigenschaften erhalten werden:

UV-Spektrum;λ ^Äthano1 (nm), 264 (g = 18.500) max

X ^Äthano1 (nm), 228
mm

Hochauflösendes Massen-Spektrum:

414.3129 (M⁺)

Die sonstigen Eigenschaften entsprechen den Produkteigenschaften des Beispiels 1.

Beispiel 4

20 mg 1ct,3ß-Dipivaloyl-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 500 ml Diäthyläther/Äthanol-Gemisch (Volumenverhältnis: 450 : 50) , das nach einer Behandlung zur Befreiung von Sauerstoff durch Destillation gereinigt worden war, gelöst. Danach wird die Lösung 2 min lang bei einer Temperatur von 12°C unter einer Argonatmosphäre mit UV-Strahlen bestrahlt. Nach der Umsetzung wird der Diäthyläther unter vermindertem Druck abgedampft. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird mit 200 ml Benzol versetzt und während 2,5 h bei Rückflußtemperatur einer Isomerisierung unterworfen. Schließlich werden große Teile des Benzols und Äthanols sorgfältig unter vermindertem Druck abgedampft, wobei 20 mg eines öligen Rückstands erhalten werden. Dieser ölige Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatogräphie unter Verwendung eines Silbernitrat enthaltenden Silikagelträgers (der viermal mit Methanol/Chloroform entwickelt wird) getrennt, wobei letztlich 3,8 mg einer Verbindung mit einem Absorptionspeak

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im UV-Spektrum, \ ^Äthano1 (_nra) 264 (S = 17.000) isoliert

max

werden. Das isolierte Produkt wird mit 3 ml einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung und 3 ml Benzol gemischt, und 24 h lang bei einer Temperatur von 35⁰C unter einer Argonatmosphäre stehengelassen.

Danach wird das Reaktionsprodukt mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird entsprechend Beispiel 1 gereinigt und getrennt, wobei 2,1 mg 10t-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ derselben physikalischen Eigenschaften, wie sie das Reaktionsprodukt des Beispiels 1 aufweist, erhalten werden.

Beispiel 5

500 mg Diäthylätherlösung mit 10 mg 10t ,3ß-Ditoluoyl-24-oxocholesta-5,7-dien wird unter einer Argonatmosphäre bei einer Temperatur von 10⁰C 50 see lang mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt. Nach der Umsetzung wird der Diäthyläther größtenteils unter vermindertem Druck abgedampft, worauf der Verdampfungsrückstand mit 200 ml Benzol versetzt und durch 2,5-stündiges Erhitzen auf Rückflußtemperatür unter einer Argonatmosphäre einer Isomerisierungsreaktion unterworfen wird. Schließlich wird ein Großteil des Benzols sorgfältig unter vermindertem Druck abgedampft, worauf der erhaltene Verdampfungsrückstand mit 1,5 ml einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung und 1,5 ml Benzol gemischt wird. Danach wird die Mischung 19h lang bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre stehengelassen. Nach der Extraktion wird das Reaktionsprodukt in der in Beispiel 1 geschilderten Weise getrennt und gereinigt, wobei 1,1 mg ict-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ derselben Eigenschaften, wie

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sie das Reaktionsprodukt des Beispiels 1 aufweist, erhalten werden.

Beispiel 6

20 mg 1,x,3ß-Di(trimethylsilyloxyl)-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 500 ml Benzol gelöst, worauf die Lösung unter einer Argonatmosphäre 2 min lang bei einer Temperatur von 13⁰C mit Ultraviolettstrahlen bestrahlt wird. Nach der Umsetzung wird sukzessive durch 2-stündiges Erhitzen auf Rückflußtemperatur unter einer Ärgonatmosphäre eine Isomerisierung durchgeführt. Hierauf wird ein großer Teil des Benzols unter vermindertem Druck abgedampft, worauf 4 0 ml Äthylacetat und 20 ml Eiswasser mit einigen Tropfen verdünnter Salzsäure zugegeben werden. Darauf wird das Reaktionsgemisch kräftig gerührt.

Die Äthylacetatschicht wird nun abgetrennt, wiederholt mit Wasser gewaschen und getrocknet, worauf das Äthylacetat unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der hierbei erhaltene Rückstand wird entsprechend Beispiel 1 behandelt, wobei 0,9 mg 1(X-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ derselben Eigenschaften, wie sie das Reaktionsprodukt des Beispiels 1 aufweist:j erhalten wird.

Beispiel 7

Einfluß von lA-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ auf die Förderung der Intestinal-Calciumabsorption:

Entwöhnte männliche Wistar-Ratten werden 4 Wochen lang lediglich mit einer einen niedrigen Calciumgehalt aufweisenden Vitamin D-Mangeldiät gefüttert. Nach Feststellung einer D-Avitaminose erhalten die Ratten eine intraperitpneale Gabe von 0,25 ug/kg 1fX-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ in 95%igem Äthanol. Nach einer bestimmten Anzahl von Stunden werden

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die Ratten getötet, worauf das Duodenum entnommen und die Calciumabsorption nach der Methode des umgestülpten Gedärmsacks ermittelt wird. Die Inkubation erfolgt mit einem Intestinaltrakt einer Länge von etwa 5 cm bei einer Temperatur von 37°C während 90 min unter 120-maligem Schütteln pro min in Gegenwart von Sauerstoff. Nach der Reakbion werden die Radioaktivitätsgrade der Inkubationsmedien außerhalb und innerhalb des umgestülpten Gedärmsacks bestimmt, indem 0,2 ml jeden Inkubationsmediums in eine Phiole gefüllt, 12 ml des einen Szintillator enthaltenden Cocktails zugegeben und dann die Radioaktivität mit Hilfe eines Flüssigszintillationszählers ermittelt wird. Das Verhältnis der Radioaktivität der serösen Membranseite, d.h. des Inneren des umgestülpten Gedärmsacks, zu der der mukösen Membranseite, d.h. des äußeren Inkubationsmediums, dient als Index für die Calciumabsorption.

Die Zusammensetzung des Inkubationsmediums und des Cocktails sind folgende:

Inkubationsmedium

NaCl 125 mM,

Fruktose 10 mM,

Tris(hydroxymethyl)aminomethan 30 mM,

CaCl₂	0,25	mM
⁴⁵CaCl₂	10	\iC
Cocktail
Toluol	1200	ml
Äthylcellosolve	800	ml
2,5-Diphenyloxazol	8	g

2,2-p-Phenylenbis(5-phenyloxazol) 300 mg

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Die Ergebnisse sind in Figur 1 dargestellt. Neben den erfindungsgemäß erzielten Ergebnissen sind auch noch die Ergebnisse eines Blindversuchs und eines Beispiels, bei dem anstelle des 1(x-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ eine äquivalente Menge Vitamin D, verabreicht wird, angegeben. Bei jedem Versuch werden 5 Ratten verwendet.

In Figur 1 entsprechen die schwarzen Punkte · den Ergebnissen des Blindversuchs, die weißen Punkte ° dem Versuch, bei dem Vitamin D₃ in einer Menge von 2,5 μg/ kg intraperitoneal verabreicht werden und die weißen Dreiecke Δ, dem Versuch bei dem 1c*-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ in einer Menge von 2,5 ug/kg intraperi toneal verabreicht wird. Ferner unterscheiden sich die in Figur 1 mit ** bezeichneten Beispiele signifikant vom Blindversuch um τρζ 0,01. Die mit *** bezeichneten Beispiele unterscheiden sich ump^0,001.

Den Ergebnissen der Figur 1 ist klar und deutlich zu entnehmen, daß die Intestinal-Calciumabsorption durch 1<x-Hydroxy-24-oxovitamin D₃~Gabe weit rascher erfolgt als bei Vitamin D₃~Gabe.

Beispiel 8

Knochencalcium mobilisierende Aktivität von Vx-Hydroxy-24-oxovitamin D₃.

ict-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ wird an in entsprechender Weise wie in Beispiel 7 gefütterte Ratten intraperitoneal in einer Menge von 2,5 ug/kg verabreicht. Vorgegebene Stunden später wird den Rat^l.en Blut entnommen, worauf der Calciumgehalt im Plasma bestimmt wird. Da die Menge

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an aus den Gedärmen absorbiertem Calcium vernachläßigbar ist (der Calciumgehalt der Diät beträgt 0,003 %) , läßt sich die Zunahme des Calciumgehalts im Plasma als die aus dem Knochengewebe mobilisierte Calciummenge betrachten.

Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt. Die verschiedenen Zeichen besitzen dieselbe Bedeutung wie in Beispiel 7. Bei jedem Versuch werden 5 Ratten verwendet. Aus Figur 2 geht klar und deutlich hervor, daß durch 1a-Hydroxy-24-oxovitainin D₃ eine raschere Calciummobilisation aus Knochengeweben erfolgt als mit Vitamin D₃.

Die Ergebnisse der Beispiele 7 und 8 zeigen, daß das neue V.X-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ die Intestinal-Calciumabsorption und die Calciummobilisierung aus Knochen b^i Ratten fördert und daß diese Wirkungen rascher eintreten als bei Vitamin D-.. Dies stellt in Verbindung mit der Annahme, daß das ic*-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ als Vorläufer von Ux. ,24-Dihydroxyvitamin D angesehen werden kann, eine sehr wesentliche Information dar. Vermutlich wandelt sich die 24-Oxogruppe in vivo in eine 24-Hydroxylgruppe um.

Beispiel 9

1'X,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien aus 1(X,3ß-Diacetoxy-24-oxocholesta-5 ,7-dien

20 mg 1<\ ,3ß-Diacetoxy-24-oxocholesta-5,7-dien, das gemäß der US-Patentanmeldung mit der Serial No. 906 785 hergestellt worden war, werden in 10 ml einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung gelöst und über Nacht bei einer Tempe-

9098 1 0/0962

ratur von 40⁰C gerührt. Nach dem Abdampfen des Methanols unter vermindertem Druck wird der Verdampfungsrückstand dreimal mit 30 ml Äthylacetat extrahiert. Die abgetrennten Äthylacetatschichten werden miteinander vereinigt und nach und nach mit 30 ml 1nHCl-Lösung, 30 ml gesättigter wäßriger NaHCOn-Lösung und 30 ml gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Na₃SO₄ wird das Lösungsmittel abgedampft, wobei 16 mg Verdampfungsrückstand erhalten werden. Der Verdampfungsrückstnnd wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel 60 F254 (0,25 mm χ 20 cm χ 20 cm) (Entwickler: Benzol/Aceton 5/1) gereinigt, wobei 14 mg einer Verbindung der folgenden physikalischen Eigenschaften erhalten werden:

UV-Spektrum λ f!j^ano1 , (nm);261, 271, 282, 293.

Iu ei X

Kernresönanz-Spektrum (CDCln); S (ppm),

0,63 (3H, S, 18-CH₃), 0,95 (3H, S, 19-CH₃), 1,08 (6H, d, J=7Hz, 26, 27(CH₃V₂), 3,7 (IH, m, 3'/-H) , 4,1 (1H, m, 3*.-H) , . - -

5,38, 5,72 (1H, dd J=2Hz, 6Hz; 1H, d,

J=6Hz: 6,7-Hz)

Massen-Spektrum (m/e):

414 (M⁺), 396 (M-18),378 (M-18x2)

Hochauflösendes Massen-Spektrum:

gefunden: 414.3136 erforderlich: M⁺ (^C27^H42^O3) ⁴¹⁴·³¹³⁴

Aufgrund der angegebenen Eigenschaften läßt sich das Reak tionsprodukt als tx,3ß-Dihydroxy-24-cholesta-5,7-dien identifizieren.

909S10/0982

Beispiel 10

1v^, 3ß-Dibenzoyloxy-24-oxocholesta-5 ,7-dien aus 1-jc, 3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien 20 mg 1>Ä,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 2 ml trockenem Pyridin gelöst und 30 min in einem Kühlschrank (-20⁰C) stehengelassen. Dann werden dazu 20μ1 Benzoylchlorid hinzugegeben und über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Darauf werden 30 ml kaltes Wasser hinzugegeben und dreimal mit 30 ml Äthylacetat extrahiert. Die abgetrennte Äthylacetatschicht wird mit 30 ml 1_n HCl, 30 ml einer an NaHCO₃ gesättigten wäßrigen Lösung und mit 18 ml Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und über Na₃SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft und 18 mg Rückstand erhalten. Dieser wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel 60 F254 (0.025 mm χ 20 om χ 20 cm) mit Benzol als Entwickler gereinigt, um eine Verbindung der folgenden Eigenschaften zu erhalten:

UV-Spektrum; ^^^ano1 (nm) ; 231, 261, 271, 282, 293.

Kernresonanz-Spektrum (CDCl₃) , (/"(ppm) ;

0,62 (3H, s, 18-CH₃),

1,08 (6H, d, J=7H_z, 26-, 27-,₃₂ 4,95 (1H, m, 3^-H) ,

5,32 (2H, m, 1ß-H und 6- oder 7-H), 5,72 (1H, d, J=6H_, 6- oder 7-H),

7,49 8.02 (10H, m, aromatisch-2(H₅)),

Massen-Spektrum (m/e);

622 (M⁺), 500 (M⁺-Benzoesäure), 378 (M⁺-2x Benzoesäure),

909810/0963

Hochauflösendes Massen-Spektrum: gefunden: 622.3651, erforderlich: M⁺(C₄₁H₅₀O₅) 622.3658.

Anhand der vorstehenden Eigenschafben wird die Verbindung als Lc,3ß-Dibenzoyloxy-24-oxocho]esta-5,7-dien identifiziert.

909810/0962

Beispiel 11

1«,3ß-Bis(trimethylsilyloxy)-24-oxocholesta-5,7-dien aus 1¹Jt ,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5 ,7-dien.

200 mg eines 1·λ ,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5 ,7-dien werden in 1 ml N-Trimethylsilylimidazol gelöst und über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Nach Zugabe von 50 ml η-Hexan wird das Ganze dreimal mit 20 ml Wasser gewaschen, worauf die n-Hexanschicht abgetrennt und über Na^SO^ getrocknet wird. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man 15 mg Verdampf ungs rück stand. Dieser wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel 60 F254 (0,25 mm χ 20 cm χ 20 cm) (Entwickler; Benzol) gereinigt, wobei 5 mg einer Verbindung der folgenden Eigenschaften erhalten werden:

UV-Spektrum;λ ^Methano1 (nm); 261, 271, 282, 293. max

Kernresonanz-Spektrum (CDCl₃); ί (ppm),

0,13 (18H, s, Trimethylsilyl -2(CH₃J₃),

0,62 (3H, s, 18-CH₃),

0,90 (3H, s, 19-CH₃),

1,08 (6Η, d, J=7Hz, 36, 27-(CII₃J₂),

3,74 (1H, m, 1ß-H),

4,02 (UI, m, 3-x-H) ,

5,34 5,65 (2H, ein Paar m, 6-,7-Hz)

Massen-Spektrum (m/e); 558 (M⁺) 468 (m-Trimethylsilyl)

378 (m-2 χ Trimethylsilanol)

Hochauflösendes Massen-Spektrum:

gefunden: 558.3923

erforderlich: M⁺ (C₃₃H₅₈O₃Si₃) 558.3925

90 9810/0962

2838032

Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse läßt sich die Verbindung als ioc,3ß-B-is (trimethylsilyloxy) -24-oxocholesta-5,7-dien identifizieren.

Beispiel 12

1cx, 3ß-Bis(tetrahydropyranyloxy)-24-oxocholesta-5,7-dien aus 1⁽X,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien»

20 mg 1oi,3ß-Dihydroxy~24-oxocholesta-5,7-dien werden in 10 ml trockenen Methylenchlorid gelöst, worauf die Lösung unter Kühlen mit Eiswasser mit 15 μΐ destilliertem 2,3-Dihydropyran versetzt wird. Danach wird noch eine katalytische Menge p-Toluolsulfonsäure zugegeben, worauf 30 min lang gerührt wird. Nach Zugabe von 30 ml Methylenchlorid wird das erhaltene Gemisch mit 20 ml gesättigter wäßriger NaHCG₃-Lösung und 20 ml Wasser gewaschen und danach über Na₃SO. getrocknet. Hierauf wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel 60 F254 (0,25 mm χ 20 cm χ 20 cm) (Entwickler: Benzol/Äceton 40/1) gereinigt. Hierbei erhält man 1,2 mg einer Verbindung der folgenden Eigenschaften:

UV-Spektrum; λ Äthanol^ _inm). ₂61, 271, 282, 293 max

Kernresonanz-Spektrum C(CDCl₃) , « (ppm)}:

0,62 (3H, s, 18-CH₃), 0,94 (3H, s, 19-CH₃), 1,08 (6H, d, J=7Hz, 26, 27-(CH₃)₂), 3,2 ** 4,1 (6H, m, 1ß-> 3Ci-Hz und 2Hz an der 6-Stellung des Tetrahydropyranyirestes) , 4,73 (2H, m, 2(H) an der 2-Stellung

des Tetrahydropyranyirestes), 5,35, 5,63 (2H, m 2 χ ,S-, 7-Hz)

909810/098 2

Hochauflösendes Massen-Spektrum:
gefunden: 582.4299
erforderlich: M⁺ (C₃₇H₅₈O₅) 582.4284

Aufgrund der ermittelten Eigenschaften läßt sich diese Verbindung als 10c ,3ß-Bis (tetrahydropyranyloxy) -24-oxocholesta-5,7-dien identifizieren.

Referenzbeispiel 1

Herstellung von 1o(, 24-Dihydroxyvitamin D₃ aus 1d.-Hydroxy-24-oxovitamin D₃

a) Nach dem Auflösen von 20 mg 1(x-Hydroxy-24-oxovitamin D₃ in 20 ml Tetrahydrofuran wird die Lösung bei Raumtemperatur (15°C) mit 15 mg Lithiumaluminiumhydrid versetzt und 3 h lang unter Argonatmosphäre gerührt. Nach der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch zur Zersetzung überschüssigen Lithiumaluminiumhydrids mit einer geringen Menge an mit Wasser gesättigtem Diäthyläther versetzt. Danach wird das Gemisch über wasserfreien Magnesiumsulfat getrocknet, worauf das Tetrahydrofuran sorgfältig unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler; 6 % Methanol in Chloroform) gereinigt, wobei 18 mg 1Ct ,24-Dihydroxyvitamin D₃ der folgenden Eigenschaften erhalten werden:

UV-Spektrum: I ^Äthano1 _? (_nm), 265 (£ = 18.000)

IHcIX

^Äthano1

IHcIX

Äthanol , * «_no _min i (nm), 228

Kernresonanz-Spektrum (C₃DgO) ; «Γ (ppm) ,

0,57 (6H, d, 18-CH₃),

0,87 (611, d, J=7Hz, 26-,27-CH₃),

0,96 (3H, d, J=5Hz, 21-CH₃),

0 9 8 10/0962

■^J26 —

3,19	(1H,	m,	24-H)
4,15	(1H,	m,	16-H)
4,36	(1H,	m,	3.X-H) ,
4,85	(1H,	bs,	19-H),
5,30	(1H,	bs,	19-H)
6,05	(1H,	d,	J„„=11E

6,25 (1H, d, J_AB=11Hz, 6 oder -7-H).

Massen-Spektrum (m/e):

416 (M⁺), 398, 380, 269, 251, 134.

Hochauflösendes Massen-Spektrum:
M⁺ (C₂₇H₄₄O₃) = 416,32927
ge funden: 416.32768

Fp: 84 bis 85⁰C

b) 18 mg iÄ,3ß-Diacetoxy-24-oxovitamin D₃ (1ft.-Acetoxy-24-oxocholecalciferol 3ß-Acetat) werden in 20 ml Methanol gelöst, worauf die Lösung bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre mit 15 mg Natriumborhydrid versetzt wird. Nun wird 10 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wird eine geringe Menge 10%iger Essigsäurelösung zugesetzt, um das überschüssige Natriumborhydrid zu zersetzen. Danach wird das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt, wobei 14 mg 1c\-Acetoxy-24-hydroxyvitamin D₃ 3ß-Acetat erhalten werden. Die Eigenschaften des Reaktionsprodukts sind folgende:

UV-Spektrum; Λ. ii5^anO1 (nm), 264 (£ = 18.600);

-\ Äthanol . .
^λ min ^(nm)'

8Ί0/-0 9

-βτΡ-

12 mg des in der geschilderten Weise hergestellten 1·Λ-Acetoxy-24-hydroxyvitamin D₃ 3ß-Acetat werden in 2 ml Benzol gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit einer 5%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung versetzt und dann bei Raumtemperatur 20 h lang stehengelassen wird. Nach der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mehrmals mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird mittels Dünnschichtchromatographie getrennt und gereinigt, wobei 8 mg 1c* ,24-Dihydroxyvitamin D₃, das dieselben physikalischen Eigenschaften aufweist wie das in Stufe a) erhaltene Produkt, erhalten werden.

c) 20 mg Vi ,3ß-Dibenzoyloxy-24-oxovitamin D_ werden in 25 ml Methanol gelöst, worauf die Lösung bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre mit 18 mg Natriumborhydrid versetzt wird. Dann wird 10h lang gerührt. Nach beendeter Umsetzung wird zur Zersetzung des überschüssigen Natriumborhydrids eine geringe Menge 10%iger Essigsäure zugesetzt, worauf das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt, wobei 15 mg lot, 3ß-Dibenzoyloxy-24-hydroxyvitamin D₃ erhalten werden.

Das erhaltene Produkt wird in 5 ml einer 7%igen methanolischen Kaliumhydroxidlösung gelöst und dann 18 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Gemisch mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die ÄthylacetatP'-!licht wird mehrmals mit 5%iger wäßriger Natriumhydroxidlösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. Der hierbei angefallene

9 0 9 8 10/0962

Verdampfungsrückstand wird durch Dünnschichtchromatographie getrennt und gereinigt, wobei 9,8 mg 1^,24-Dihydroxyvitamin D, derselben physikalischen Eigenschaften, wie sie das Produkt der Stufe a) aufweist, erhalten werden.

Referenzbeispiel 2

Herstellung von 1tX,3ß,24-Trihydroxy-cholesta-5,7-dien bzw. von dessen Derivaten mit geschützten Hydroxylgruppen, bei denen es sich um Zwischenprodukte des 1^,24-Dihydroxyvitamin D₃ (vgl. US-PS 4 022 891) handelt, aus 1oi,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien bzw. dessen Derivaten mit geschützten Hydroxylgruppen

a) 15 mg 10c, 3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 38 ml Methanol gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur unter Ärgonatmosphäre mit 15 mg Natriumborhydrid versetzt wird. Danach wird 8 h lang bei einer Temperatur von 30⁰C gerührt. Nach Zugabe einer geringen Menge 10%iger wäßriger Essigsäure zur Zersetzung überschüssigen Natriumborhydrids wird das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft. Der hierbei angefallene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler! 6 % Methanol in Chloroform) getrennt und gereinigt, wobei 11 mg 10C,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien mit folgenden physikalischen Eigenschaften erhalten werden:

UV-Spektrum: X ^Äthano1 (_nm) _: 262, 271 (<? = 11.000)

Iu ei X

282 (£ = 12.000),

294 (£ = 7.000),

Kernresonanz-Spektrum (in

0,63 (3H, s, 18-CH₃),

3,30 (1H, m, 24-H),

3,70 (1H, m, 1ß-H),

4,08 (1H, m, 3x-H),

9 0 9 8 10/0962

5,30 (1H, d, J=6Hz, 6 oder 7-H), 5,60 (111, d, j=6Hz, 6 oder 7-H)

Massen-Spektrum (m/e): 416 (M⁺), 398, 380, 357,

251, 227, 197, 157

Fp: 102⁰C bis 103⁰C.

b) 25 mg 10c,3ß-Diacetoxy-24-oxocholesta-5 ,7-dien werden in 25 ml Tetrahydrofuran gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur unter Rühren mit 15 mg Lithiumaluminiumhydrid versetzt wird. Danach wird noch 2,5 h lang unter Argonatmosphäre weitergerührt. Nach der Umsetzung wird eine geringe Menge mit Wasser gesättigten Diäthyläthers zur Zersetzung des überschüssigen Lithiumaluminiumhydrids zugesetzt. Nun wird das Gemisch über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch sorgfältiges Eindampfen unter vermindertem Druck vom Tetrahydrofuran befreit.

Der Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler: 6 % Methanol in Chloroform) gereinigt, wobei 18 mg 1«._f,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien derselben physikalischen Eigenschaften, wie sie das Produkt der Stufe a) aufweist, erhalten werden.

c) 20 mg 1eo,3ß-Diacetoxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 25 ml Methanol gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur unter Ärgonatmosphäre mit 20 mg Natriumborhydrid versetzt wird. Danach wird 8 h lang bei einer Temperatur von 35⁰C gerührt. Nach Zugabe einer geringen Menge 10%iger wäßriger Essigsäure zur Zersetzung überschüssigen Natriumborhydrids wird das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft. Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler: 3 % Methanol in Chloroform) getrennt, wobei

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15 mg 1tX,3ß-Diacetoxy-24-hydroxycholesta-5,7-dien der folgenden physikalischen Eigenschaften erhalten werden

UV-Spektrum,/l*??^ano1 (nm) : 261, 271 (£ = 11.200),

III 3. X

282 (£ = 12.000), 293.

Kernresonanz-Spektrum (in C₃DgO):

0,63 (3H, s, 18-CH₃),

2,03 (6H, s, CII₃COO-) ,

3,30 (1H, m, C-24-H),

4,75 (1H, b, C-3-H),

5,01 (1H, b, C-1-H),

5,35 (1H, d, J=6Hz, C-6 oder C-7-H),

5,69 (1H, d, J=6Hz, C-6 oder C-7-H).

10 mg des Diacetatderivats werden in 10 ml 10%iger methanolischer Kaliumhydroxidlösung gelöst und 18 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach beendeter Umsetzung wird das Gemisch mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Äthylacetat befreit. ■

Der Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie getrennt und gereinigt, wobei 6 mg 1'λ,3β,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien derselben physikalischen Eigenschaften, wie sie das Produkt, der Stufe a) aufweist, erhalten werden.

d) 18 mg 1ot,3ß-Dibenzoyloxy-24-oxocholesta-5,7-dien werden in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur mit 18 mg Lithiumaluminiumhydrid versetzt wird. Danach wird 5 h lang unter Argonatmosphäre gerührt.

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-ST-

Nach beendeter Umsetzung wird das Gemisch mit einer geringen Menge von mit Wasser gesättigtem Diäthyläther versetzt, um überschüssiges Lithiumaluminiumhydrid zu zersetzen. Nach dem Trocknen des Gemischs über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird das Tetrahydrofuran sorgfältig unter vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird durch präparative Dünnschichtchromatographie (Entwickler: 6 % Methanol in Chloroform) gereinigt, wobei 10 mg 1λ , 3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien derselben physikalischen Eigenschaften, wie es das Produkt der Stufe a) aufweist, erhalten werden.

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Claims

Henkel, Kern, Feiler & Hänzel

Patentanwälte

Teijin Limited Osaka, Japan

Möhlstraße 37 D-8000 München 80

Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkld Telegramme: ellipsoid

31. AUG. 1978

Dr.F/H
T-124

Patentansprüche

f 1 J 1cx-Hydroxy-24-oxovitamin D~

2. Verfahren zur Herstellung von 1ot-Hydroxy-24-oxovitamin D^/ dadurch gekennzeichnet, daß man 1<x,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien oder ein Derivat hiervon der allgemeinen Formel (1)

RO

(1)

worin R.. und R~, die gleich oder verschieden sein können, für Wasserstoffatome oder die Hydroxylgruppe schützende Gruppen stehen können, in einem inerten organischen Lösungsmittel mit UV-Strahlen bestrahlt,

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das jeweils erhaltene Reaktionsprodukt isomerisiert und gegebenenfalls die die Hydroxylgruppe schützenden Gruppen eliminiert.

3. 1i\,,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien und dessen Derivate der Formel:

Jl

22

ir o

worin R₁₁ und R₂2^f ^^ie 9l^e^-^cn °der verschieden sein können, Wasserstoffatome, Acylgruppen mit mindestens drei Kohlenstoffatomen, Trialkylsilylgruppen oder 2-cyclische Rthergruppen darstellen.

. 1.x-,3ß-Dihydroxy-24-oxocholesta-5,7-dien.

5. Arzneimittel (für Warmblüter) mit einer wirksamen Menge 1 i-Hydroxy-24-oxovitamin D₃.

6. Arzneimittel nach Anspruch 5 zur oralen, intramuskulären oder intravenösen Verabreichung mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge 1cx-Hydroxy-24-oxovitamin D-. und einem für Warmblüter nicht-toxischen Träger.

7. Arzneimittel nach Ansprüchen 5 oder 6 zur Steuerung des Calciumstoffwechseis von Warmblütern.

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8. Verwendung von ioc-Hydroxy-24-oxovitamin D, durch orale, subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung an Warmblüter zur Steuerung von deren Calciumstoffwechsel.

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