DE2407025C3 - 22-Dehydro-25-Hydroxycholecalciferol, Verfahren zu seiner Herstellung sowie dessen Verwendung zur Herstellung antirachitischer Mittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft 22-Dehydro-25-hydroxycholecalciferol und ein Verfahren zu dessen Herstellung aus 3/i-Acetoxy-22,23-bisnorcholenaldehyd. 22-Dehydro-25-hydroxycholecalciferol ist gekennzeichnet durch eins antirachitische Wirksamkeit, die wesent- »s Hch größer ist als diejenige von Vitamin D₃.

Die Art und die Wirksamkeit der D-Vitamine (Vitamin D₂ und D₃) ist bekannt. In letzter Zeit wurden verschiedene Derivate von D-Vitaminen gefunden, die eine größere antirachitische Wirksamkeit besitzen aus die D-Vitamine selbst oder die speziell an bestimmten Stellen innerhalb des Körpers wirksam sind, um bestimmte spezielle Funktionen einzuleiten oder zu fördern. Zum Beispiel wurden 25-Hydroxycholecalciferol (25-HCC) und 25-Hydroxyergocalciferol (25-HEC) als wesentliche im Körper kreisende Derivate der Vitamine D₃ bzw. D₂ angenommen. Andere Derivate wie 1,25-Dihydroxycholecalciferol (US-PS 3697 559) und 25,26-Dihydroxychole-

CHO

calciferol (»25,26-Dihydroxycholecalciferol, A Metabolite of Vitamin D₃ with Intestinal Transport Activity«, T. S u d a, H. F. D e L u c a et al, Biochemistry, 9, 4776 [1970]) führen zu einer Calciumabsorption oder einem Calciumtransport in den Därmen.

Es wurde eine neue Verbindung synthetisiert, die eine wesentlich größere antirachitische Wirksamkeit besitzt als Vitamin D₃. Diese Verbindung wurde identifiziert als 22-Dehydro-25-hydroxycholecalciferol (^-25-HCC).

Herstellung von .1"-25-HCC

Das, folgende Schema zeigt das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 22-Dehydro-25-hydroxycholecalciferol aus leicht zugänglichen Ausgangssubstanzen. Das Schema gibt nur den synthetischen Weg des Verfahrens an, der im folgenden unter Rückbeziehung auf das Schema näher erläutert wird.

COOCH₃

HO

(D

HO

(Π)

(III)

COOCH,

(VI)

AcO

(V)

(IV)

Fortsetzung

(VIII) ( 1²²-25-HCC)

Der leicht zugängliche S/y^
cholenaldehyd(I) (s. T. C. McMorris, J. Org. Chem., 35, 458. [1970]) wurde umgesetzt mit dem Phosphonium-ylid, das hergestellt worden war aus 2 - Carboxyäthyltriphenyl-phosphoniumbromid (s. D. B. Denney & L. C. Smith, J. Org. Chem., 27, 3404 [1962]) unter Bildung von cis-trans-. I^-Homocholensäure(II).

Der 3/J - Acetoxy - I²² - homocholen - säure - methyl ester (IV) wurde aus II hergestellt durch Methylierung der Carbonsäuregruppe nach dem Verfahren von Alvarez (F. S. Alvarez und A. N. W a 11, J. Org. Chem., 33, 2143 [1968]) für Bisnorcholensäure und anschließende Acylierung von III mit Essigsäureanhydrid in Pyridin. Es erwies sich als vorteilhaft, die 3-Hydroxygruppe vor der Bromierung durch Bildung des Acetats zu schützen.

Die Bromierung von IV mit l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin und anschließende Dehydrohalogenierung mit Trimethylphosphit nach dem Verfahren von H u η ζ i k e r und M u 1Il η e r (HeIv. Chim. Acta, 41, 70 [1958]) ergab ein Gemisch der f*¹²²- und /^•^-Isomeren. Das l⁵-^7-22-Ispmere(V) wurde von dem /!^"Msomeren durch fraktionierte Kristallisation abgetrennt.

Behandlung des l^5-7-22-Homoesters (V) mit Methylmagnesiumbromid ergab das erwartete 7-Dehydro-/P^S-HydroxycholesteroHVI). Bei UV-Bestrahlung von VI bei 300 nm in Äthanol-Äther-Lösung erhielt man die provitamin-D-artige Verbindung Pro- I²²-25-hydroxycholecalciferol(VII), die nach der Isomerisierung /1'ⁱ'^!-25-hydroxycholecalciferol (VIII) ergab.

Es folgt eine Beschreibung des oben angegebenen Verfahrens im einzelnen.

1²²-Homocholensäure (II)

Eine Lösung aus 5,2 g (14mMol) 3/i-Acetoxy-22, 23-bisnorcholenaldehyd(I) und 7,5 g (18mMol) 2 - Carboxyäthyltriphenylphosphonium - bromid in 80 cm³ eines trockenen Dimethylsulfoxid-Toluol-Gemisches (1 :1) wurde auf ungefähr 5"C abgekühlt und schnell unter gutem Rühren zu einer gekühlten Suspension (Eisbad) von 1,04 g (43,3 mMol) Natriumhydrid in 10 cm³ trockenem Toluol gegeben. Die Zugabe und anschließende Umsetzung wurde unter trockenem Stickstoff durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zersetzung des überschüssigen Natriumhydrids mit einer kleinen Menge Methanol wurde das Reaktionsgemisch in Wasser gegossen. Das rohe Produkt wurde durch Extraktion mit Benzol entfernt, das nacheinander mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet wurde.

Der Hauptanteil des Triphenylphosphidoxids wurde durch Lösungsmittelverteilung entfernt. Das rohe Produkt wurde in 140 cm³ Methanol, enthaltend 20 cm³ 5%ige Natriumhydroxidlösung, gelöst. Die

Lösung wurde zunächst mit 200 cm³ Diäthyl-äther und dann mit 200 cm³ Wasser vermischt. Die Ätherschicht wurde verworfen und die wäßrige Methanollösung weiter mit 2mal je 200 cm³ Äther gewaschen. Die alkalische Lösung wurde mit 300 cm³ Wasser verdünnt und mit 25 cm³ 20%iger Schwefelsäure angesäuert. Das rohe Produkt wurde mit Äther extrahiert. Das Produkt wurde durch Umkristallisieren aus Methanol gereinigt. Die Ausbeute betrug ungefähr 80%, bezogen auf das Aldehyd. Das Infrarotspektrum (KBr) der Substanz besaß eine Carbonylabsorption bei 5,88 μηι und stimmte sonst mit der angegebenen Struktur überein. Es war keine Acetoxyabsorption vorhanden.

Analyse für C₂₅H₃₈O₃:

Berechnet ... C77,67, H 9,91;
gefunden .... C78,08, H 10,14.

Das Molekulargewicht von 386 wurde durch Massenspektroskopie bestimmt. Die Gasflüssigkeitschromatografie (GLC-Analyse) zeigt das Vorhandensein der beiden l²²cis- und trans-Isomere in einem Verhältnis von ungefähr 1 :4 an.

F-Homocholensäuremethylester (III)

Der Methylester von II wurde nach dem von Alvarez (s. o.) angegebenen Verfahren zur Herstellung von 22,23-Bisnorcholensäuremethylester hergestellt.

Eine Lösung von 2,8 g (7,25 mMol) II, 1,5 g Natriumbicarbonat und 2,0 g Methyljodid in 15 cm³ trockenem Ν,Ν-Dimethylacetamid wurde in der Dunkelheit mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam zu 300 cm³ 10%iger Natriumchloridlösung gegeben. Das rohe Produkt wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das rohe Produkt wurde mit Hilfe einer Silicagel-Säule mit Benzol-Chloroform als EIuiermittel chromatografisch gereinigt. Die Ausbeute betrug über 90%. Das Molekulargewicht von 400 wurde durch das Massenspektrum bestimmt.

..... vioiett!,pektrum

S^-Acetoxy-.P-homochoIensäuremethylester (l ν) handensein des

λ™,272, 282, 294 bestätigte das Vor- |5-⁷-Stei oiddiensystems.

Zu 10 cm³ trockenem Pyridin wurden 2,26 g (5,65 mMol) III und 10 cm³ Essigsäureanhydrid gegeben. Die Lösung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wurde in 200 cm³ Wasser gegossen und das Produkt durch Ätherextraktion entfernt. Die Äth^rlösung wurde mit einigen Anteilen Wasser und schließlich mi: gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatografie über Silicagel mit Benzol als Eluiermittel gereinigt. Die Ausbeute war nahezu quantitativ. Das Infrarot-Spektrum stimmte mit der angegebenen Struktur überein.

3/i-Acetoxy-7-dehydro-,1²²-homocholensäuremethylestcr (V).

Zu 25 cm³ trockenem Benzol wurden 1,75 g (3,96 mMol) IV, 0,63 g (2,2 mMol) l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin und 25 cm³ trockenes η-Hexan gegeben. Das Gemisch wurde 4 Minuten unter Stickstoffatmosphäre unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und das 5,5-Dimethylhydantoin abfiltriert. Die entstehende Lösung wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Eine Lösung des Rückstandes in 10 cm³ trockenem Xylol wurde zu einer erhitzten Lösung (130⁰C) von 10 cm³ trockenem Xylol und 1,8 cm³ Trimethylphosphit unter Stickstoff zugetropft. Die Lösung wurde 90 Minuten auf 130⁰C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Benzol gelöst und wieder unter Vakuum eingeengt, um die Entfernung des Trimethylphosphits zu erleichtern. Das Produkt wurde teilweise durch Säulenchromatografie über Silicagel mit Benzol als Eluiermittel ge- · reinigt. Die reinen Anteile (bezogen auf die Dünnschichtchromatografie-Bewertung) wurden zusammengegeben und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand war im wesentlichen ein Gemisch der 1⁴·⁶·²²- und . !"-^-Isomere. Die Abtrennung des 1⁵-⁷²²-Isomers (V) wurde erreicht durch fraktionierte Kristallisation aus einem l:l-Gemisch aus Äther und η-Hexan. Dar Infrarot-Spektrum (KBr) stimmte mit der angegebenen Struktur überein. Das Ultraviolett-Spektrum besaß das charakteristische Absorptionsmaximum für das konjugierte /1⁵⁷-Steroidsystem /. £* 272, 282, 294.

50 7-Dehydro- 1²²-25-hydroxycholesterol (VI)

Zu einer Lösung von 20 mMol Methylmagnesiumjodid in 50 cm³ trockenem Äther wurden unter Rühren langsam 0,45 g (1,02 mMol) V in 20 cm³ trockenem Äther gegeben. Ein weißer Feststoff fiel bei der Zugabe von VI aus. Nach 30 Minuten wurden weitere 10 mMol Methylmagnesiumjodid zugegeben und das Reaktionsgemisch weitere 60 Minuten gerührt.

Das Reaktionsgemisch wurde in 10 cm³ gesättigte Ammoniumchloridlösung gegossen, mit Eiswasser verdünnt und mit Äther extrahiert. Die Ätherauszüge wurden mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt wurde durch Säulenchromatografie über Silicagel mit Chloroform als Eluiermiltel gereinigt. Das Infrarotspektrum stimmte mit der angegebenen Struktur überein. Das Ultra-1²²-25-Hydroxycholecalciferol (VIII)

Eine Lösung von 0,07 g VI in 200 cm³ Methanol-Äther (Γ 5) wurde 10 Minuten bei ungefähr 15 C mit UV-Licht von 300 nm bestrahlt. Die Bestrahlung wu-de in »inem phoxoehemischen Reaktor (Rayone! der The Southern New England Ultraviolet Co., Meddletown, Conn.) mit einem Quarzreaktionsgefäß, das mit einem StickstofTebulator und einer Wasserkühlschlange versehen war, durchgerührt.

D^;e bestrahlte Lösung wurde im Vakuum auf ungefähr 2 cm³ und dann unter einem StickstofTstrom zur Trockne eingedampft. Es wurde festgestellt, daß eine ungefähr 30%ige Umwandlung eingetreten ivar ihezoeen auf die Antimontrichloridfarbreaktion von Niel d et al, J. Biol. Chem., 136, 73 [1940]). Pre- F-25-hydroxychoiecalciferol (VlI) wurde durch Säulenchromatografie über eine viellöchrige Kieselsäuresäule isoliert (Fisher et al in Anal. Biochem, 9, 303

[1966]). . Kuu

Die Säule wurde mit einem Äther-n-Hexan Gradientensystem eluiert (Neville&DeLuca, Boichemistry, 5,2201 [1966]). Aufeinanderfolgende Fraktionen von 5 cm³ wurden gesammelt. Die Fraktionen, enthaltend VII, die durch ihre UV-Absorption bei 260 nm identifiziert wurden, wurden zur weiteren Reinigung zusammengegeben.

Ungefähr 3 mg VII, das bei der Säulenchromatografie isoliert worden war, wurde durch 12stündiges Erhitzen in Benzol auf 6O⁰C zu ,I^S-Hydroxycholecalciferol (VIII) isomerisiert. Das Benzol wurde entfernt und das Produkt in Pyridinlösung mit Essigsäureanhydrid acetyliert. Das isolierte Diacelat wurde durch Säulenchromatografie unter Anwendung von mit Silbernitrat imprägnierter Kieselsäure und Äther-n-Hexan als Lösungsmittel gereinigt. Das cis-/F^S-HCC-Diacetat und das trans- 1^-25-HCC-Diacetat wurden getrennt und erwiesen sich als mehr als 90% rein. Die eis- und trans-Diacetats von VIII wurden mit Aluminiumhydrid in Äther hydrolisiert, um die Acetylgruppe abzuspalten (Blunt and D e L u c a in Biochemistry, 8,671 [1969]).

Das Ultraviolett-Spektrum dieser Isomeren von VIII stimmte mit der angenommenen Struktur überein, /™\265. Das Molekulargewicht von 398 wurde durch das Massenspektrum bestätigt. Die Gas-Flüssigkeits-Chromatografie von jedem Isomeren zeigte zwei Peaks (Pyro und Isopyro), die durch die thermische Umlagerung entstanden, wie sie von Blunt et al, Biochemistry, 7, 3317 (1968) für Cholecalciferol und seine Metaboliten beschrieben ist.

Bei der obigen Beschreibung ist Kieselsäure Bio-Rad-Kieselsävire, HA, -325 mesh (0,044 mm) der Calif. Corp. for Biochemical Research, Los Angeles, Kalifornien und Silicagel Silica Gel 60 [70 bis 230 mesh (0,062 bis 0,21 mm) ASTM] E. Merck & Co., Darmstadt.

Biologische Aktivität von
eis- l²²-25-HCC und trans-, 1^-25-HCC

Die eis- und trans-Isomeren von ,1"-25-HCC wurden auf ihre antirachitische Wirkung mit Hilfe des Ratten-»line«-Tesls untersucht (US. Pharmacopeia XV, 889, Mack Publishing Co., 1955) mit der Ausnahme, daß das Versuchsmaterial (die Isomeren)

in vier gleiche Anteile aufgeteilt und an den ersten vier aufeinanderfolgenden Tagen während der Versuchszeit verabreicht wurde.

Bezogen auf die in dem »line« Versuch erhaltenen Ergebnisse zeigte es sich, daß die eis- und trans-

l²²-25-HCC-lsomeren jeweils eine antirachitische Aktivität von ungefähr 160IU pro Mikrogramm besaßen. Diese Aktivität ist wesentlich größer als diejenige von Vitamin D₃, dessen Aktivität zu ungefähr 40 IU pro Mikrogramm berechnet wurde.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. 22-Dehydro-'?5-hydroxycholecalciferol.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 3/?-Acetoxy-22,23-norcholenaldehyd umsetzt mit Phosphonium-ylid, die entstehende /l^-Homocholensäure methyliert, den erhaltenen /l^-Homocholensäuremethylester mit Essigsäureanhydrid in Pyridinlösung acetyliert, den dabei erhaltenen 3β - Acetoxy - J - homocholensäuremethylester mit l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin bromiert und anschließend mit Trimethylphosphit dehydrohalogeniert, aus dem Gemisch der I⁴-⁶-²²- und ,1^s>7J2-Isomere den .1⁵·⁷—-Homoester durch fraktionierte Kristallisation abtrennt und mit Magnesiumbromid behandelt, das entstehende 7-Dehydro-zP^S-hydroxycholesterol einer UV-Bestrahlung bei 300 nm in einem Äthanol-Äther-Gemisch unterwirft und das Pro--r^S-hydroxycholecalciferol zu dem gewünschten 22-Dehydrc-25-hydroxycholecalciferol isomerisicrt.

3. Verwendung der Verbindung nach Anspruch I zur Herstellung antirachitischer Mittel.