DE2012167C2

DE2012167C2 - 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat und Verfahren sowie Zwischenprodukte zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2012167C2
Application number: DE2012167A
Authority: DE
Inventors: John Claude Babcock; J. Allan Kalamazoo Mich. Campbell
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1969-03-17
Filing date: 1970-03-14
Publication date: 1982-09-23
Also published as: FR2035000B1; NL7003686A; GB1286761A; CA968789A; CH528500A; IL33860A; DE2012167A1; JPS4934980B1; FR2035000A1; US3833622A; IL33860A0; BE747492A

Description

H₂O

HO

Verfahren zu seiner Herstellung sowie neue Zwischenprodukte für seine Herstellung, entsprechend den vorstehenden Patentansprüchen.

Das Hydrat sowie andere strukturelle Derivate besitzen die nachstehend beschriebenen Wirksamkeiten und Verwendungszwecke sowie die aus der nachfolgenden Beschreibung hervorgehenden, ihnen eigentümlichen Vorteile gegenüber 25-Hydroxycjlciferol.

Das erfindungsgemäße Endprodukt stellt ein physiologisch aktives Steroid mit Vitamin-D-a tiger Wirksam-

(CH₂)J-CO₂R₄ /

keit dar, d. h, es fördert die intestinale Wiederaufnahme von Calcium sowie die Freigabe von Calcium aus den Knochen. Bei der Behandlung von Krankheiten, wie chronisches Versagen der Nieren, Hypoparathyreose, sekundäre Hyperparathyreose, Knochenerweichung, Flachitis, durch Corticoid herbeigeführte Osteoporose, Osteoporose nach der Menopause od. dgl, kann das erfindungsgemäße Endprodukt an die Stelle von Vitamin-D-Substanzen treten und diese ersetzen. Des

ίο weiteren werden erfindungsgemäß Zusammensetzungen zur Verhütung von Osteoporose wähernd der Behandlung mit Corticosteroiden unter Verwendung des erfindungsgemäßen Endproduktes bereitgestellt Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ent sprechend den nachstehenden Gleichungen, ausgehend voa einer S-Hydroxychola-SJ-diensäure (I) und ihren funktioneilen Derivaten hergestellt werden. Die Choladiensäuren (I) können gegebenenfalls aus den entsprechenden Chol-5-en-säuren (VII) durch Bromierung und Bromwasserstoffabspaltung gemäß Fieser und Fieser, »Steroids«, Reinhold Publishing Corporation, New York (1959), Seiten 157-161, hergestellt werden. Die Bromierung erfolgt gewöhnlich in einem inerten Lösungsmittel (z. B. Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Methylenchlorid, Benzol, Petroläther) mittels eines Allyl-Bromierungsmittels wie N-Bromsuccinimid, N-Bromacetamid, l^-Dibrom-53-dimethylhydantoin usw. Die Bromwassereioffabspaltung kann mit Hilfe einer organischen Base wie Collidin oder mit einem

w Trialkylphosphit wie Trimethylphosphit in einem inerten hochsiedenden Lösungsmittel wie Xylol vollzogen werden. Vorzugsweise erfolgen Bromierung und Bromwasserstoffabspaltung nach dem in HeIv. Chim. Acta, Bd. 41, S. 70 (1958), beschriebenen Verfahren.

Die erfindungsgemäßen Verfahren können durch folgende Gleichungen dargestellt werden:

CH₃

(CH₂)J-C-OR₅ CH₃

R₃O

(CHj)₃-CO₂R₄

R,0

CH₃

(CH₂)J-C-ORs CH₃

R₃O

(CHj)₃-CO₂R₄

CH₂

ΠΙ

In den Verbindungen gemäß hormeln i—V bedeutet R4 ein Wasserstoffatom oder eine Alkyigruppe mit weniger als 9 Kohlenstoffatomen, ζ. B. niedere Alkylgruppen wie Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl- oder Octylgruppen und niedere Cycloalkylgruppen wie Cyclopropyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexylgruppen und R₃ und R5 bedeuten in den obigen Formeln ein Wasserstoffatom oder eine niedere Acylgruppe. Als Acylgruppen werden solche von Kohlenwasserstoffcarbor.säuren mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen, z.B. von niederen Alkancarbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure und tert-Pentancarbonsäure, der monocyclischcn Arylcarbonsäuren, wie z. B. Benzoesäure und Toluylsäure, der monocydischen Aryl-niedrig-alkancarbonsäuren, wie z. B. Phenylessigsäure und /3-Phenylpropionsäure, der Cycloalkan- und der Cycloalkencarbonsäuren bevorzugt.

In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine funktionell substituierte 3-Hydroxychola-5,7-diensäure (I) vorzugsweise in Form ihres Methylesteracetats oder Methylester-3-tetrahydropyranyI-äthers mit Methylmagnesium-halogenid (RiMgX), wobei X Chlorid, Bromid oder jodid (z. B. Methylmagnesiumbromid) bedeutet, oder mit Methyllithium zu einer Verbindung der Struktur IV umgesetzt. Eine Verbindung der Struktur IV wird nach bekannten Verfahren zur Umwandlung von 7-Dehydrocholesterin in Vitamin Dj und von Ergosterin in Vitamin D₂ unter Anwendung aktinischer Strahlung einschl. Wellenlängen von nahezu 280 ηιμ unter Bildung von 9,10-Seco-steroid-trien der Struktur (V) bestrahlt Vorzugsweise, und dann, wenn Verbindung V in relativ reiner Form anfallen soll, wird die Temperatur der Bestrahlungsumsetzung unter 50° gehalten. Anschließend erwärmt man das 9,10-Seco-steroid-trien der Struktur V auf über 5O⁰C, vorzugsweise auf 60-90⁰C, wodurch die Doppelbindung in V isomeriert wird und ein Gleichgewichtsgemisch aus V und VI entsteht Das Gleichgewichtsgemisch V und VI besteht zu mindestens 50%, günstigenfalls zu 75% oder mehr aus Verbindung VI.

Die Verbindung d«:r Struktur VI wird gereinigt und von der Verbindung V sowie von anderen Doppelbindungsisonieren durch Kristallisation ihres Hydrates und durch Chromatographie abgetrennt. Als Adsorbtionsmittel für die Chromatographie können u. a. Magnesiumsilikat, Tonerde, Kieselsäure oder Silicagel verwen-

CH₃

(CH₂)J-C-OH
CH₃

H₂O

CH₂

det werden. Diejenigen chromaiogfarrhischen Fraktionen, die die Verbindung der Struktur VI in von Verunreinigungen relativ freier Form enthalten, werden vereinigt und aus einem wasserhaltigen Lösungsmittel umkrätallisiert

Erfindungsgemäß wurde überraschend gefunden, daß sich 25-Hydroxycholecalciferol in Form seines Hydrates kristallisieren und durch Kristallisation reinigen läßt, wohingegen das wasserfreie, duuh Blunt et al. (Biochem, 7,3317,1968) isolierte 25-Hydroxycholecalciferol eine Reinigung mit Hilfe einer komplizierten Kieselsäure-Adsorptionschromatographie (vgl. J. Lipid Res, Bd. 7, S. 739,1966) erforderlich machte und in Form eines Öles anfiel.

Es wurde gefunden, daß die Verbindung der Struktur VI als wasserfreier Stoff sehr schwer kristallisiert, in Form seines Hydrates aber rasch kristallisiert und gereinigt werden kann. Das 25-Hydroxychole calciferol (VI) kann also nicht in kristalliner Form aus wasserfreien Lösungsmitteln, wie wasserfreiem Methanol, wasserf.eiern Äthanol, Äther, Methylenchlorid, wasserfreiem Aceton, Petroläther, Äthylacetat u.dgl. gewonnen werden. Doch ist das 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat nach Zusatz von Wasser zu mit Wasser mischbaren wie auch nichtmischbaren Lösungsmitteln leicht erhältlich. Kristallines 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat läßt sich — bei gleichen biologischen Eigenschaften wie die

so wasserfreie Verbindung — rascher reinigen und ist beständiger und weniger empfindlich gegen Autoxydation.

Wasserfreies 25-Hydroxycholecalciferol (VI) läßt sich aus seinen Hydraten gewinnen. Eine Lösung von 25'Hydroxycholecalciferol-pydrat in einem organischen Lösungsmittel (wie z. B. Iviethylenchlorid, Äther, Äthylacetat Benzol u dgl.) wird mit Hilfe eints Trockenmittels (z. B. Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Molekularsieben) getrocknet, filtriert und bei Temperaturer, unter 80⁰C zu einem nichtkristallinen Rückstand de. wasserfreien Verbindungen eingedampft Man kann aber auch das Hydrat dadurch trocknen, daß man es längere Zeit un'.er einem Hochvakuum auf Temperaturen ukter 85° C hält,

(,-, wonach nichtkristalline Rückstände der wasserfreien Verbindung der Struktur V! anfallen. Das Hydrat kann auch durch längerts Trocknen in einem Exsikkator, der ein Trockenmittel, vorzugsweise ein nichtsaures Trok-

kenmittel (ζ. B. Kaliumhydroxyd) enthält, unter Erhalt der nichtkristallinen, wasserfreien Verbindung getrocknet werden.

In Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens muß die Seitenkette der Verbindung VI entwickelt und das 5,7-Dien-System der Verbindung I in das umgelagerte 9,10-Secotrien-System der Struktur Vl übergeführt werden. Zweckmäßigerweise und in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung geht man wie folgt vor: I -»IV — V — VI. Doch ist die Reihenfolge nicht kritisch, sie kann durchaus verändert werden. Dementsprechend können 3-Hydroxychola-5,7-diensäure (I) wie auch ihre funktionellen Derivate (I) als erstes bei Temperaturen von nicht mehr als 50⁰C in beschriebener Weise unter Bildung von 9,10-Secotrien der Struktur II bestrahlt werden. Durch Erwärmung auf über 50°C entstehen die umgelagerten 9,10-Secotriene der Struktur III. Die Umsetzung von Verbindungen der Struktur III mit Methylmagnesiumhalogenid oder Methyllithium — wie vorstehend im ! !inblick Aiii die Umwandlung ί —» IV" beschrieben — führt zur Verbindung Vl, die sich durch

(CH₂)J-CO₂H

HO

Chromatographie und durch Überführung in ihr Hydrat reinigen läßt. Man kann aber auch die 9.10-Secotriene der Struktur Il mit Methylmagnesiumhalogenid oder Methyllithium, wie beschrieben, bei Temperaturen von nicht mehr als 50⁰C unter Bildung von 9,10-Secotrien der Struktur V behandeln, das sich in beschriebener Weise in die Verbindung der Struktur Vl und deren entsprechendes Hydrat überführen läßt. Die Verbindung der Struktur IV wird aus der Verbindung der Struktur VIIb durch Bromierung und Bromwasserstoffabspaltung, wie hinsichtlich I beschrieben, hergestellt.

In vorstehend beschriebenen Verfahren führt die Entwicklung der Seitenkette in Verbindung der Strukturen IV-VI (z. B. I - IV, Il - V, III - Vl) zu den entsprechenden vorstehend angegebenen Verbindungen.

Die Herstellung der als Ausgangsverbindungen eingesetzten Choladinsäuren (I) aus den entsprechenden Chol-5-ensäuren (VII) kann vorzugsweise in folgender Siufeiifüige durchgeführt werden:

(CHi)₁-CO₂I

VII

VIII

(CH₂),

R₃O

VD"

(CH₂)J-CO₂R₄

R₃O

(CH₂)J-CO₂R₄

VHa

Ia

CM-.

CM,

R, O

(CIl,)-,- -C- Oil

CII, (C 11,).,--C ----OM

CM,

R,O

VlIb

IV

Dabei wird die 3/?-Hydroxychol-5-en-säure (VII) zunächst in 3-Stellung durch eine niedere Alkyl- oder Arylcarbonsäure verestert (oder gegebenenfalls durch

flinlr-

tionell substituiert), sodann wird der 3-Ester (oder 3-Äther) VIII mit Thionylchlorid, Thionylbromid, Phosphortrichlorid, Phosphortribromid, Phosphoroxychlorid oder Oxalylchlorid (vgl. Wagner und Zook, »Synthetic Organic Chemistry«, Hohn Wiley and Sons, New York, 1953, Seiten 546-557) unter Bildung des Säurechlorids oder Säurebromids (VII') von VII umgesetzt. Anschließend wird das Säurechlorid oder Säurcbromid (VIl') in den Ester Vila umgewandelt, der wie beschrieben durch Bromierung und Bromwasser- jo Stoffabspaltung in den Dienester Ia umgewandelt '.erden kann.

Liegt bei der Umesterung der Verbindung I zu IV R₃ als niederes Acylat (z. B. Acetat) vor, so setzt sich bei diesen Umwandlungen die Acylatgruppe mit dem Methylmagnesiumhalogenid oder Methyllithium um, so daß nach ihrer Entfernung Verbindungen der Strukturen IV, V bzw. VI entstehen, in denen R₃ ein Wasserstoffatom darstellt. Liegt hingegen bei dieser Umwandlung R₃ als H oder als eine Ätherfunktion, z. B. als Tetrahydropyranyl- oder Trimethylsilylrest vor, dann bleibt R₃ unverändert.

Liegt R₃ als Tetrahydropyranyl- oder Trimethylsilylrest vor, so verringert sich die Menge Methylmagnesiumhalogenid oder Methyllithium, die zur Erzielung brauchbarer Überführungen von I-»IV, II —► V und III -► VI erforderlich ist, um 50% gegenüber derjenigen Menge, die notwendig ist, wenn R₃ eine niedere Acylgruppe ist, und um 333% gegenüber derjenigen Menge, die bei R₃ = H nötig ist Diese funktionell Variante von R₃ eignet sich insbesondere für die Herstellung von Verbindungen der Struktur VI, in der die Gruppe Ri, R2 oder beide mit ¹⁴C oder mit ³H markiert sind, wie z. B. dann, wenn Ri und R2 die Bedeutung ¹⁴CH₃ haben, was z. B. bei 25,26 - ^l4C-25-Hydroxycholecalciferol (VI) der Fall ist Die derart hergestellten Äther der Verbindungen mit den Strukturen IV, V und VI werden zu den entsprechenden Verbindungen IV, V und VI, in denen R₃=H ist, solvolysiert, indem man sie in Lösung in einem organischen Hydroxyl-Lösungsmittel (z. B. Methanol) mit einer schwachen Säure wie Essigsäure, Ameisensäure, p-Toluolsulfonsäure behandelt, bis die Äthergruppe entfernt ist Eventuell kann auch Wasser oder eine Lewis-Base (z. B. Dimethylformamid) zugegen sein. Obgleich obige Äther unter Verwendung einer starken Säure auch in Alkohole (IV, V und VI), in denen R₃=H ist, überführbar sind, so muß doch dafür Sorge getragen werden, daß die tertiäre Hydroxylgruppe in der Seitenkette nicht dehydratisiert und die Kerndoppelbindungen nicht umgelagert werden. Die Solvolyse wird daher vorzugsweise hei niedrigeren Temperaturen Iz. B. nicht über 40⁰C) vollzogen, und sie soll beendet werden, sobald die Analyse (z. B. Dünnschicht-Chromatographie) ergibt, daß die Solvolyse im wesentlichen vollständig ist.

Verbindungen I —Vl, in denen R₃ ein Wasserstoffatom darstellt, können durch Umsetzung mit überschüssigem niedrig-Acylanhydrid oder niedrig-Acylhalogenid (z. B. Acetylanhydrid, Acetylchlorid, Propionsäureanhydrid, Octansäureanhydrid, Cyclopentyl-propionylchlorid u. dgl.) vorzugsweise in Gegenwart einer tertiären organischen Base (z. B. Pyridin, Triäthylamin) und bei einer Temperatur von 0 bis 6O⁰C zu Verbindungen der Strukturen I bis VI, in denen R₃ eine niedere Acylgruppe ist, verestert werden. Gewünschtenfalls kann die nach bekannten Verfahrn erfolgende Veresterung in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt werden. Verbindungen der Struktur IV—VI, in denen R₃ und R5 Wasserstoffatome sind, enthalten zwei Hydroxylgruppen, und durch obige Veresterung wird lediglich R₃ in die Estergruppe übergeführt. Wird jedoch hierbei die Veresterungstemperatur auf 65 bis 100⁰C erhöht, dann werden sowohl R₃ als auch R5 in die Estergruppe übergeführt.

Verbindungen der Strukturen I—VI, in denen R₃ eine niedere Acylgruppe bedeutet, werden nach bekannten Verfahren zu Verbindungen der Struktur I—VI, wobei R₃ ein Wasserstoffatom bedeutet, hydrolysiert. Verbindungen der Strukturen I —VI sind etwas säureempfindlich und können sich zersetzen, wenn übermäßig Säure verwendet oder bei zu hohen Temperaturen gearbeitet wird. Daher verfährt man vorzugsweise unter Anwendung der bekannten Bedingungen für basische Hydrolyse. Demgemäß werden Verbindungen der Strukturen I—VI, in denen R₃ eine niedere Acylgruppe bedeutet, durch Behandlung mit einer starken Base in einem organischen Hydroxyllösungsmittel in Verbindungen der Struktur I—VI übergeführt, in denen R₃ ein Wasserstoffatom bedeutet Geeignete Basen sind z. B. Natriummethoxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Bariumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumbicarbonat u.dgl.

Beispiele geeigneter Lösungsmittel sind Methanol, Äthanol, Isopropanol, wäßriges Tetrahydrofuran, wäßriger tert-Butylalkohol oddgL Für die Umwandlung von Verbindungen der Strukturen I—III, in denen R₃ eine niedere Acyl- und R4 eine niedere Alkylgruppe bedeuten, in Verbindungen der Struktur I—III, wobei R₃=H ist, verwendet man als Base vorzugsweise das

Natriumsalz des Alkohols R₄OH und als Lösungsmittel den Alkohol R4OH, um eine Modifizierung der Seitenkette zu verhindern. Sind in den Verbindungen der Strukturen IV-VI sowohl R₃ als auch R-, niedere Acylgruppen und Ri sowie R2 Methylreste, dann kann das Ausmaß der Hydrolyse dnrrh Diinnschicht-Chromatographie verfolgt und jene unterbrochen werden, sobald Rj in H übergeführt ist, wobei R5 als niedere Acylgruppe verbleibt. Zu diesem Zweck werden als Basen Natrium- oder Kaliumbicarbonat und Natriumoder Kaliumcarbonat bevorzugt.

Die Tetrahydropyranyläther und Trimethylsilyläther der Verbindungen I —III werden aus den entsprechenden Verbindungen I —III, in denen R3 Wasserstoff darstellt, so hergestellt, daß man bekannte Verätherungsreaktionen unter Verwendung von Dihydropyran und eines sauren Katalysators bei milden Bedingungen durchführt und diese abbricht, sobald die Verätherung vollständig ist. Unter Verwendung obiger Stoffe entstehen dabei die Tetrahydropyranyläther, während bei Einsatz von Trimethylsilylchlorid und einem Amin oder Hexamethyldisilazan die Trimethylsilyläther anfallen.

Die Überführung von Säuren der Struktur I —III (R₁ = H) in Ester der Struktur I — III (R* = niedere Alkylgruppe) erfolgt nach bekannten Verfahren, insbesondere durch Umsetzung der Säure mit einem Diazoalkan oder mit einem Alkohol in Gegenwart eines Veresterungsmittels, wobei die Ester in vorstehend beschriebener Weise aus dem Reaktionsgemisch gewonnen und durch chromatographische Verfahren abgetrennt werden können.

Das erfindungsgemäße 25-Hydroxycholecalciferolhydrat stellt ebenso wie die wasserfreie Verbindung einen nützlichen Vitamin- und Ernährungsfaktor für den Menschen und für alle Spezies auf dem Veterinärgebiet dar und kann bei Vitamin- und Ernährungsbehandlungen von Vögeln, Säugetieren und des Menschen anstelle von und in Verbindung mit Vitamin D₂, D₃ und D₄ verwendet werden. Vögel können mit Vitamin D₂ und D4 nicht wirksam behandelt werden. Das 25-Hydroxycholecalciferol und sein Hydrat zeichnen sich daher bei Vögeln durch eine viel größere Wirksamkeit als die Vitamine D₂ und D₄ aus. Die Wirksamkeit des 25-Hydroxycholecalciferols und seines kristallinen Hydrates wird nach dem Linientest-Verfahren (U.S. Pharmacopeia, 1955, XV₁14. revidierte Ausgabe, Eaton, Pa^ Mack, Seite 889) ermittelt und in Internationalen Einheiten (LU.) ausgedrückt. 25-HydroxycholecalciferoI und sein Hydrat ersetzen Vitamine D₂, D₃ und D₄ bei Vögeln, Säugetieren und beim Menschen auf der Basis vergleichbarer internationaler Einheiten in den Formen üblicher Einheitsdosierung, wie Kompretten, dragierte Tabletten, harte oder weiche elastische Gelatinekapseln, in Propylenglycollösung, ÖHösung, wäßriger Suspension, in mit Stärkemitteln versehenen Nahrungsmitteln u. dgL Des weiteren können unter Verwendung von 25-HydroxycholecaIciferol und seines Hydrates Vormischungen für stärkende Nahrungsmittel für VögeL Säugetiere und für den Menschen hergestellt werden. Eine zweckmäßige Verabreichung ist z. B. der orale, bukkale und parenterale Weg (intramuskulär, subkutan und intravenös). -

Die Entdeckung der Hydratform des 25-Hydroxycholecalciferols sowie das Auffinden von Verfahren zu seiner Herstellung stellen einen nützlichen Erfindunjsaspekt__dar. Wie in den nachstehenden Beispielen dargetan wird, sondert sich diese kristalline Form rasch

aus Reaktionsgemische und aus Lösungen ab. Man hai somit die Möglichkeit, das 25-Hydroxycholecalciferol zu reinigen und saube." aus Gemischen, die sehr verschiedene organische oder anorganische Verunreinigungen enthalten, abzutrennen. Das Hydrat ist in allen wesentlichen Hauplzügen in gleicher Weise wirksam wie das wasserfreie 25-Hydroxycholecalciferol, und kann als vollständiger Ersatz dafür verwendet werden.

Als weiteren Vorteil wird durch das Hydrat eine Umgehung langwieriger, kostspieliger und auch sonst nachteiliger Verfahren zur Abtrennung und Reinigung des 25-Hydroxycholecalciferols in wasserfreier Form ermöglicht. Ferner bildet es eine Zwichenproduktion des 25-Hydroxycholecalciferols, aus dem die wasserfreie Verbindung VI, wie beschrieben, gewonnen werden kann.

Das 25-Hydroxycholecalciferol sowie sein Hydrat eignen sich insbesondere für die Behandlung von Krankheiten, die sich durch niedrige 25-Hydroxycholecalciferolspiegel im Serum auszeichnen, und zwar insbesondere in den Fällen, in denen diese niedrigen Spiegel durch Unfähigkeit oder gestörte Fähigkeit, das Vitamin Dj in seinen biologisch wirksamen Metabolit. nämlich 25-Hydroxycholecalciferol (VI) zu überfuhren, bedingt sind. Krankheiten dieser Art sind u. a. Vitamin-D-resistente Rachitis mit Phosphatarmut des Bluts, chronische Nierenerkrankung, durch Corticoid ausgelöste Verminderung der Calciumabsorption, durch Corticoid ausgelöste Osteoporose, altersbedingte Verringerung der Calciumabsorption, Hyperparathyreose, Alkoholismus u. dgl.

Das 25-Hydroxycholecalciferol und sein Hydrat eignet sich auch für Patienten, die unterschiedlich und oft übermäßig auf Vitamin D₃ ansprechen und manchmal sogar eine Kaikspiegelerhöhung im Blut aufweisen, dort wo die endogene Produktion an 25-Hydroxycholecalciferol unterschiedlich oder übermäßig verläuft. Bei solchen Patienten gewährt das 25-Hydroxycholecalciferol und sein Hydrat wiederholbares und vorhersagbares Ansprechen.

25-Hydroxycholecalciferol und sein H>drat eignen sich insbesondere zur Verhütung und Umkehrung einer durch Cortisonsteroid ausgelösten Herabsetzung der Calciumabsorption im Darm. Tiere wie auch Menschen, die längere Zeit mit Corticosteroiden in pharmakologischen Dosen behandelt wurden, zeigen gewöhnlich ein negatives Kalkgleichgewicht und bekommen Osteoporose. Werden gleichzeitig mit den Corticosteroiden 25-Hydroxycholecalciferol und dessen Hydrat verordnet, und zwar entweder durch getrennte Verabreichung jedes Mittels in einheitsdosierter Form oder durch Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit beiden Mitteln in einer einzigen Einheitendosierungsform, dann werden die unerwünschte Schwächung der Calciumabsorption und die nachteiligen Folgeerscheinungen einer übermäßigen Nebenschilddrüsen-Hormonproduktion herabgesetzt oder verhütet. Eine lang andauernde Verabreichung von Corticosleroiden ist von besonderem Wert für Patienten, die an Arthritis und anderen Entzündungskrankheiten leiden, und diese Erkrankungen werden gewöhnlich bei Alterspatienten angetroffen, die einem weiteren Verlust an bereits gefährdeter Calciumabsorption am wenigsten zu widerstehen vermögen. In diesem Zustand können der durch Corticoid gestörte Kalkhaushalt und die durch Corticoid ausgelöste Osteoporose durch 25-Hydroxychoiecalciferoi oder sein Hydrat spezifisch gemildert werden.

Bei einem ^verfahren zur Verhütung von corticosteroidbedingten Änderungen der Calciumabsorption können folgende Dosierungen aufgestellt werden: Eil· Patient wird mit Vitamin D unter Anwendung einer Dosierung behandelt, die einem normalen Calciumtransport im Darm entspricht. Zu vorgeschriebener Zeit werden 25-Hydroxychoiecalciferoispiegei im Blutserum ermittelt (z. B. nach den Verfahren gemäß Avioli, »J. Clin. Inv.«, Bd. 46, S. 983 [1968], und J. Clin. Endocrinol. Bd. 28. S. 1341 [1968]). Anschließend wird ein Corticosteroid in einer Dosierung gegeben, die zur Bewirkung des angestrebten Corticosteroideffekte«; erforderlich ist. Man verabreicht dann 25-Hydroxycholecalciferol oder sein Hydrat und ermittelt gleichzeitig erneut deren Serumspiegel. Die Dosis an 25-Hydroxycholecalciferol oder dessen Hydrat, die wirksame Serumspiegel, die den vor der Corticosteroidtherapie aufgestellten Spiegeln vergleichbar sind, ergeben würde, läßt sich dann errechnen. Corticosteroid und 25 Hydroxycholecalciferol oder dessen Hydrat werden Wirksamkeit.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Hierbei sind Temperaturen durchweg in Grad Celsius und die durch magnetische Kernresonanz ermittelten Daten, zu deren Bestimmung ein 60-Megahertz-Gerät und Tetramethylsilan als innerer Standard verwendet wurde, in ό-Einheiten angegeben. Die in Klammern gesetzten Zahlen verwehen auf beispielhafte Arten, die von den allgemeinen Formeln I bis VII erfaßt werden.

Beispiel 1 LfUSlLl UfI"

gen entweder als getrennte Größen oder als geeignetes, vergleichbares, festdosiertes Stoffgemisch derselben verabreicht. Anstatt die geeignete Dosis für 25-Hydroxycholecalciferol oder dessen Hydrat durch Messung der Konzentrationen an 25-Hydroxycholecalciferol (Vl) im Blutserum auf die oben beschriebene Weise festzustellen, kann man die Dosierung auch durch bekannte Calciutngleichgewichts- oder Strontiumuntersuchungen oder durch Messung der Serumkonzentrationen an Nebenschilddrüsrnhormon nach derzeit bekannten immunologischen Methoden ermitteln.

Auch Zusammensetzungen aus Corticosteroiden und 25-Hydroxycholecalciferol oder dessen Hydrat können angewandt werden. Geeignete Corticosteroide sind u. a.: Hydrocortison, Cortison, Prednisolon, Prednison, Methylprednisolon, Fluorprednisolon und deren 9λ-Fluor-Derivate, 9«-Fluor-16«-methylprednisolon, 9λ-Fluor-16/?-methylprednisolon, 9a-Fluor-16ac-hydroxyprednisolon, 6«-Methyl-9«-fIuor-16a-hydroxyprednisolon, 6«,9«-Difluor-16«-hydroxyprednisolon sowie deren entsprechende Acetonide, bekannte 2'-Acetate und 21-AcyIate obiger Corticosteroide, 9a-Fluor-16j3-methylprednisolon-17-valerat u.dgl. Geeignete Arzneimengen umfassen das '/2 — 2fache derjenigen Dosen, die normalerweise systemisch bei Mensch und Tier angewendet werden und die einer Prednisolon-Dosierung von 2,5 — 100 mg/Tag oral beim Menschen im allgemeinen als gleichwertig erachtet werden. 25-Hydroxycholecalciferol oder sein Hydrat kann zwischen 200 und 20 000 LU. dosiert werden, wobei die höheren Dosen gewöhnlich für die Korrektur eines festgestellten gestörten Calciumhaushaltes und die niedrigeren Dosen zur Verhütung eines solchen angewendet werden.

25-Hydroxycholecalciferol oder dessen Hydrat lösen bei einer Molkonzentration von 10~⁶ bis 10-^l0 die Freigabe von Calcium aus Knochen aus, die nach bekannten Verfahrer, in Organkultur (in vitro) gehalten werden. Die auf diese Weise bewirkte Freisetzung von Knochenkalk in das Medium der Organkultur kann durch Messung der Konzentrationszunahme an löslichem Calcium quantitativ bestimmt werden. Potentielle Verbindungen, die eine derart herbeigeführte Calciumfreisetzung verhindern, sind für Forschung und klinische Zwecke von Interesse, da sie die Möglichkeit einer Osteolyse-Verhütung böten. Somit eignen sich 25-Hydroxycholecalciferol oder dessen Hydrat für die Untersuchung von Verbindungen auf anti-osteolytische 3/3,25-diol (V)

(25-Hydroxyprecholecalcifero!)und 25-Hydroxycholecalciferol (Vl)

Eine Lösung von 125 mg Cholesta-5.7-dien-3j3,25-diol (IV) in 125 ecm Benzol und 10 ecm absolutem Äthanol JIi wird in einen mit einer wassergekühlten Quarztausch- !ärnpe und einer Siiuksiuifzuiüiiruiig versehenen P'notoreaktor gebracht. Durch das auf etwa 16⁰C gekühlte Reaktionsgemisch wird N2 geblasen. Eine im Zentrum der Tauchlampe und in einem Abstand von 2,5 cm von ji der innenfläche des Reaktionsgemisches angeordnete Lichtquelle Hanovia 8A36,100 W, wird 15 Minuten lang eingeschaltet (diese Dauer gilt einschließlich der 5 — 6 Minuten, die verstreichen, ehe die Lampe ihre volle Helligkeit erreicht). Diese Lampe ist eine charakteristi-

JIi sehe, für die Bestrahlungsphase bei der bekannten Vitamin-D-Synthese geeignete Quelle für aktinische Energie und ist durch jede andere verfügbare Lampe dieser Art ersetzbar. Die hier verwendete Lampe ist eine Quecksilberdampf-Hochdruckquarzlampe 100W,

r> die insgesamt annähernd 11,5 W abgestrahlte, über einen Bereich von 220—1400 m gestreute Energie erzeugt. Ein rascher Wasserstrom ist erforderlich, um die Wasseraustrittstemperatur unter 20⁰C zu halten. Man engt das Reaktionsgemisch in einem Rotationsverdämpfer unterhalb Raumtemperatur zur Trockne ein. Der Rückstand in halbfe^er Form wird mit 5 ecm eines zu 35% aus Äthylacetat und zu 65% aus Hexankohlenwasserstoffen (Skellysolve B) bestehenden Gemisches verrieben und filtriert Nochmals 5 ecm des gleichen > Lösungsmittels werden zum Waschen verwen.' M.

Der Feststoff enthält nicht umgesetztes Ausgangsmaterial, die Flüssigkeit das Produkt. Man gießt letztere auf eine 40 g schwere, mit einem Gemisch aus 35% Äthylacetat und Hexankohlenwasserstoffen (Skeilysolve B) naß gepackte Säule aus für die Dünnschichtcbromatographie geeignetem Florisil einer lichten Maschenweite von 0,074 — 0,1.04 mm. Die Produkte werden mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert und in Fraktionen von 10 ecm aufgefangen. Die gemäß Prüfung auf einer Dtinnschichtchromatographie-Platte produkthaltigen Fraktionen werden vereinigt und unterhalb Raumtemperatur zur Trockne eingedampft Es fällt ein öliger Rückstand an, dem einige Tropfen absoluter Äther zugesetzt werden, die man unter Vakuum wieder entfernt Es entsteht 25-Hydroxyprecholecalciferol (V) als flockiger Schaum in einer Ausbeute von 60 mg. λ ™,. 256 πιμ (ε = 83C0), m.s. m/e 400 (M⁺), 385,382,380,376,154,136,118; NMR (CDCl₃), δ 0,71 (C-18-CH₃), 037 (d, C-21-H₃), UO (C-25 und C-26-H₆), 1,63 (C-I9H3), 330 (m, C-3-H), 5,54 (C-9-H), 534, 5,78, 5,89 und 6,10 (q, C-6 und C-7-H₂); bei der Gaschromatographie (OV-17-Säule, 1,83 m (6 ft). Temp. 230° C, Einspritzöffnung: 240⁰C erhält man 2 Peaks mit

für die »Pyro«- und »Isopyrow-Umbildungsprodukte charakteristischen Retentionszeiten von 49 und 58 Minuten.

Anstatt die Temperatur auf unter 20° C zu halten, läßt man diese in dem Verfahren des Beispiels 1 während der Bestrahlung auf nahezu Rückflußtemperatur des Lösungsmittels ansteigen. Das daraus hervorgehende Bestrahlungsprodukt wird durch Chromatographie gemäß Beispiel 1 gereinigt und man erhält direkt 25-HydroxychoIecaIciferol (VI).

Das als Ausgangsmaterial verwendete Cholesta-5,7-dien-3j3,25-diol (IV) wurde folgendermaßen hergestellt:

A) Herstellung von 3/»-Hydroxychol-5-en-säure-3-acetat(VIII)

Eine Lösung von 95,8 g 3/?-HydroxychoI-5-en-säure (VII) in 600 ecm Pyridin wird im Eisbad gekühlt Unter Rühren werden langsam 100 ecm Essigsäureanhydrid zugesetzt, wobei man die Temperatur auf 10" C oder darunter hält Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und mit 25 ecm Wasser verdünnt Nach etwa 1 Stunde gießt man das Gemisch in 750 ecm konzentrierte, mit gestoßenem Eis aui" 2500 ecm verdünnte Salzsäure. Das Rohprodukt wird filtriert gut gewaschen und getrocknet Man erhält 1043 g Rohacetat wovon man 90 g in 450 ecm warmer Essigsäure plus 100 ecm Methylenchlorid löst und nitriert Man läßt die Lösung langsam auf Raumtemperatur abkühlen, so daß große Kristalle entstehen. Das Produkt wird filtriert, auf dem Saugfilter getrocknet und mit Wasser gewaschen; man erhält 49 g 3jJ-Hydroxychol-5-en-säure-3-acetat (VIII) als kristallinen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 178- 186°C.

B) Herstellung von Sß-Hydroxychol-S-en-säurechlorid-S-acetatiVH')

60 g in 1,131 Benzol und 23 ecm Pyridin aufgeschlemmtes Sß-Hydroxychol-S-en-säure-S-acetat (VIII) werden '/2 Stunde lang im Eisbad gekühlt. Wähernd dieser Zeit werden 60 ecm Thionylchlorid tropfenweise zugegeben. Nach 2'/2 Stunden wird die Lösung nahezu zur Trockne eingeengt und nach der Zugabe von Benzol wiederum konzentriert. Zur vollständigen Entfernung von Thionylchlorid und Salzsäure wird diese Behandlung mehrmals wiederholt, wobei man als Rückstand S/J-Hydroxychol-S-en-säurechlorid-S-acetat (VII') erhält

C) Herstellung von Methyl-3/Miydroxy-25-homochol-5-enat-3-acetat (VIIa)

400 ecm einer 22,5%igen wäßrigen Kaliumhydroxid· lösung werden nach Kühlung im Eisbad 600 ecm Äther und anschließend in kleinen Portionen unter Aufwirbelung 50 g N-Nitro-N-nijroso-N'-methylguanidin zugesetzt Man trennt die Ätherphase ab und wäscht die alkalische Phase mit 300 ecm Äther. Die kombinierten Ätherschichten, die Diazomethan enthalten, werden über Kaliumhydroxid getrocknet. Man führt das Verfahren dreimal durch und vereinigt die Diazomethanlösungen.

Das als Rückstand gemäß dem unter B beschriebenen Verfahren gewonnene Sß-Hydroxychol-S-en-säurechlorid-3-acetat (VlI') wird in 600 ecm Benzol gelöst, durch Glaswolle filtriert und tropfenweise unter Rühren der eiskalten Lösung aus Diazomethan und Äther zugesetzt. Nach beendeter Zugabe läßt man die Lösung 30 Minuten stehen, dann engt man sie mit einem Rotationsverdampfer zu einem Rückstand ein. Disser Rückstand (78 g), der das erwartete Diazoketon (v 2100 cm-') enthält, wird in 700 ecm Methylenchlorid und 935 ecm Methanol gelöst und bei Raumtemperatur gerührt Nach dem Verfahren von Newman und Beal, J.

Am. Chem. Soex, 72, 5163 (1950), wird eine Lösung von 5 g Silberbenzoat in 50 ecm Triethylamin in Teilmengen von etwa 0,5 ecm so oft zugegeben, daß die Entwicklung von Gas aufrechterhalten wird. Wenn gemäß der Dünnschichtanalyse die Umsetzung vollzogen ist (nach Zugabe etwa der Hälfte der Silberbenzoatlösung), setzt man Wasser zu und extrahiert das Produkt mit Methylenchlorid Man wäscht den Extrakt mit verdünnter Salzsäure, Waser, Natriumbicarbonatlösung und wiederum mit Wasser, trocknet ihn über Natriumsulfat, filtriert ihn und engt ihn zu einem Feststoff ein, der den Rohester VIIa enthält Der Rohester wird an einer Säule mit 3 kg Florisil chromatographisch getrennt Die Säule wurde mit Hexankohlenwasserstoffen (Skellysolve B) und mit 10% Äthylacetat/Hexankohlenwasserstoffen

20' stufenweise eluiert wozu etwa 651 Lösungsmittel gebraucht werden. Fraktionen, die reines Methy!-3p-hydroxy-25-homochol-5-enat-3-acetat (Vila) [=3/J-Hy-

droxy-25-homochol-5-ensäure-methylester-3-acetat] enthalten, werden vereinigt und aus Methylenchlorid/ Methanol umkristallisiert Die Ausbeute beträgt 44 g, der Schmelzpunkt liegt bei 110-112,5⁰C; [<x]_o-45° (CHCl₃).

Analyse für C₂₈H₄₄C₄: berechnet: C 75,63 H 9,97%, gefunden: C 75,45 H 9,83%.

D) Herstellung von Methyl-3/J-hydroxy-25-homochola-5,7-dienat-3-acetat(I)

j5 a) Eine Lösung von 2,22 g Methyl-30-Hydroxy-25-homochol-5-enat-3-acetat (VIIa) in 20 ecm Petroläther und 15 ecm Benzol wird unter Rückfluß erhitzt und mit O32 g U-Dibrom-53-dimethylhydantoin vereinigt Man hält die Lösung Ui Stunde unter Rückfluß, kühlt sie und filtriert den Niederschlag aus 5,5-DimethyIhydantoin. Durch Konzentrieren des Filtrats unter vermindertem Druck erhält man eine 7-Brom-Verbindung in Rohform als schweres ÖL Das öl wird in 8 ecm Xylol (über Molekularsieb getrocknet) gelöst und tropfenweise

4-, einer unter Rückfluß gehaltenen Lösung von 2ecm Trimethylphosphit in 10 ecm Xylol zugesetzt. Man erhitzt die Lösung 1 Stunde lang unter Stickstoff und erhält durch Entfernen des Lösungsmittels einen Rückstand, den man über 200 g Florisil chromatogra-

M) phisch trennt und mit 51 Hexankohlenwasserstoffen (Skellysolve B) und mit 5 1 eines Gemisches aus 10% Äthylacetat und Hexankohlenwasserstoffen (Skellysolve B) stufenweise eluiert. Man erhält Fraktionen von 400 ecm, die durch Dünnschichtchromatographie auf mit Silbernitrat getränkten Kieselgelplatten untersucht werden. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und aus Methylenchlorid/Methanol umkristallisiert Die Ausbeute beträgt 260 mg Methyl-3^-hydroxy-25-homochola-5,7-dienat-3-acetat (I),

μ Schmelzpunkt: 130-134⁰CAAIiV 271 (e-10,450), 282 (e-11,000), 293 πιμ (ε -6,250); LR. 1735 (C-O), 1650. 1600 cm¹ (C = O), NMR (CDCIj), d 0,62 (C-I8-H1), 0.96 (C-I9-H3), 0,98 (d, C-2I-H3), 2,08 (COCHj), 3.67 (OCH,). 5,52(q,J = 6Hz,C-6undC-7-Hj).

Analyse für C₂₈H₄₂O* (432,54): berechnet: C 75,97, H 9,56%, gefunden: C 75,73, 119,47%.

230 238/19

b) In einem mit Rührwerk, Stickstoffzuleitung und Rückflußkondensator versehenen Rundkolben mit einem Volumen von 500 ecm werden 75 ecm Benzol zur Trocknung des Systems unter Rückfluß auf ein Volumen von 67 ecm eingeengt Man kühlt das Benzol "> gerade nur unter Rückflußtemperatur ab und gibt nacheinander 10 g Metfryl-S/Miydroxy^-homochol-S-enat-3-acetat (VIIa), 67,5 ecm Petroläther (über Molekularsieb getrocknet), 50 mg Benzoyloeroxid und 3,59 g 13-Dibrom-5^-dimethylhydantoin zu. Die Lösung wird ι ο etwa 12 Minuten gerührt und unter Rückfluß gehalten, bis der Stärkejodid-Test negativ ausfällt Dann setzt man nochmals 036 g Dibromhydantoin zu, hält die Lösung 5 Minuten unter Rückfluß und kühlt sie bis unter Raumtemperatur ab. Ein Niederschlag von Dimethylhydantoin wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt und zu einem teilweise kristallinen Rückstand getrocknet, der in 36 ecm Xylol (über Molekularsieb getrocknet) aufgenommen und im Laufe von 10 Minuten tropfenweise einer unter Rückfluß gehaltenen Lösung aus 45 ecm Xylol und 9 ecm Trimethylphosphit zugegeben wird. Man hält die Lösung l>/2 Stunden unter Rückfluß und engt sie in einem Rotationsverdampfer zu einem Rückstand ein, den man etwa 2 Stunden lang unter Hochvakuum trocknet Durch Zerreiben mit 50 ecm kaltem Methanol werden aus dem Rückstand Kristalle gebildet, die nach dem Filtrieren und Waschen mit Methanol 4,0 g Rohprodukt I mit einer Reinheit von etwa 90% ergeben.

Eine durch mehrmalige Wiederholung des oben beschriebenen Verfahrens hergestellte Menge von 15 g des Rohprodukts I wird zur Chromatographie über eine Säule aus 750 g mit Silbernitrat getränktem Kieselsäuregel geführt das aus 1 kg Kieselsäuregel und 1 kg Silbernitrat in 21 Wasser mit einer Temperatur von is 90⁰C hergestellt und 24 Stunden bei einer Temperatur von 100° C getrocknet wurde. Die Säule wird mit Hexankohlenwasserstoffen (Skellysolve B) und mit 30% Äthylacetat in Hexankohlenwasserstoffen unter Auffangen von 400 ecm Fraktionen stufenweise eluiert Produkthaltige Fraktionen werden vereinigt und aus Methylenchlorid/Methanol umkristallisiert Man erhält 6,1 g Methyl-3/J-hydroxy-25-homochola-5,7-dienat-3-acetat(I) vom Schmelzpunkt 133-137°C;AmA 282 πιμ (6=12,000). 4-,

Gegebenenfalls wird aus dem Hydrat durch Trocknung die wasserfreie Verbindung IV hergestellt, indem es entweder unter Hochvakuum auf 60-80" C erwärmt oder in einem Lösungsmittel wie Methylenchlorid gelöst mit Natriumsulfat getrocknet und durch Verdampfen unter wasserfreien Bedingungen vom Lösungsmittel befreit wird.

Beispiel 2 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat (VI-Hydrat)

Eine Lösung von etwa 300 mg des nach Beispiel 1 hergestellten 25-Hydroxyprecholecalciferols (V) in 5 ecm Chloroform wird 3'/j Stunden in einem verschlossenen Kolben unter N2 auf einer Temperatur von 70—75°C gehalten. Man verdampft das Lösungsmittel und führt den Rückstand zwecks Chromatographie über eine 60 g wiegende Säule ab" für Dünnschichtchromatographie geeignetem, mit einem Gemisch aus 35% Allylacetat und Hexankohlenwasserstoffen (Skellysolve B) naß gepacktem Florisil von 0,074 — 0,104 mm lichter Maschenweite. Man eluiert die Säule mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch und fängt Fraktionen von 10 ecm auf. Die beim Zerreiben mit wäßrigem Methanol kristallisierenden Fraktionen werden vereinigt und zweimal aus wäßrigem Methanol umkristallisiert Die Ausbeute beträgt 120 mg 25-Hydroxycholecalciferolhydrat (VI-Hydrat) mit einem Schmelzpunkt von 81-83°C (Sinterung: 75°C), UV-Maximum 264 τημ (a, 41,59). Massenspektrum: in Übereinstimmung mit den von Blunt und Mitarbeitern (Biochem, Bd. 7, S. 3317,1968) berichteten Ergebnissen. NMR (CDCb), d 0,55 (C-I8-H3), 036 (d, C-21-H₃), 1,0 (C-25 und C-26. H₆), 333 (m, C-3-H), 4,83 und 5,07 (C-I9-H2), 6,09 (d, J-Il, C-6 oder 7-H), 6,23 (d, J = U, C-6 oder 7-H); bei der Gaschromatographie (CV-17-Säule, 1,83 m, Temp. 230° C, Einspritzöffnung: 240° C) erhält man 2 Peaks mit für die »Pyro«- und »Isopyro«-Umbildung charakteristischen Retentionszeiten von 49 und 58 Minuten.

Analyse für C₂₇H₄₄O₂ · H₂O: berechnet: C 77,46, H 11,08, H₂O 432%, gefunden: C 76,73, H 11,13, H₂O 4,95%.

E) Herstellung von Cholesta-5,7-dien-30,25-diol (IV)

Eine Lösung von 2,0 g Methyl-3/?-hydroxy-25-homochola-5,7-dienat-3-acetat (I) und 100 ecm trockenem Äther wird mit einer Suspension von 20 ecm 3m ätherischem Methylmagnesiumbromid versetzt und über Nacht gerührt Man gibt Ammoniumchloridlösung zu, trennt den Äther ab und verdampft ihn unter einem NrStrom und erhält einen kristallinen Rückstand. Der Rückstand wird in einem Filter aufgefangen, gut mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus Methylenchlorid/Methanol umkristallisiert Man erhält Cholesta-5,7-dien-3/?,25-diol (IV) als Hydrat in einer Ausbeute von 1.15 g. Schmelzpunkt 185-187°, λ Hh. 271 («-9,850), 281 (e-10,450), 293 ηιμ (ε-6,100), I.R. 3310, 3360 (OH), 1600,1650cm-'(C-O); NMR(CDCl₃)JiJO₁Oe(C-Ie,H₃), 0.98(C-19, H₃), l,0(d,C-21, H₃), Ul (C-25,C-26, H₆),5,50 (q,j-6Hz,C-6undC-7-H₂).

Analyse für C₂₇H₄₄O₂ · V₂H₂O berechnet: C 79,16, H 11,07%, gefunden: C 79.08, H 11,09%.

Beispiel 3 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat (VI-Hydrat)

Etwa 20 mg in 2 ecm 3m ätherischem Methylmagnesiumbromid gelösets Methyl-30-hydroxy-9(lO)-seco-25-hümochola-5-cis-7,10(19)-trienat-3-acetat werden über Nacht auf Raumtemperatur gehalten. Ammoniumchloridlösung wird zugegeben und die Ätherschicht wird

abgetrennt und mit einem Ätherextrakt der wäßrigen Schicht vereinigt Man trocknet die vereinigte Ätherlösung und dampft sie zu einem öl ein, das man in mit 35% Äthylacetat gemischten Hexankohlenwasserstoffen löst und gemäß Beispiel 2 durch für Dünnschichtchromato graphie geeignetes Florisil leitet Die beim Verreiben mit wäßrigem Methanol kristallisierenden Fraktionen werden vereinigt und aus wäßrigem Methanol umkristallisiert. Man erhält 4 mg 25-Hydroxycholecalciferolhydrat (VI-Hydrat), das mit dem Produkt aus Beispiel 2 identisch ist.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Methyl-3/7-hydroxy-9,10-seco-25-homochola-5-cis,7,10(19)-trienat-3-acetat wurde folgendermaßen hergestellt:

A) Herstellung von Methyl-3/Miydroxy-9,10-seco-25-homochola-5(l 0),6-cis,8-trienat-3-acetat (II)

0,25 g in 125 ecm Benzol gelöstes Methyl-3/?-hydroxy-25-homochola-5,7-dienat-3-acetat (I) werden gemäß Beispiel 1 bestrahlt Der nach Verdampfen des Lösungsmittels verbleibende Rückstand aus zwei solchen Bestrahlungen wird vereinigt, in mit 8% Äthylacetat gemischten Hexankohlenwasserstoffen (Skellysolve B) gelöst und zur Chromatographie Ober eine 60 g schwere Säule aus Dünnschichtchromatographie-Florisil einer Teilchengröße von 0,074-0,104 mm lichte Maschenweite unter Verwendung von mit 8% Äthylacetat gemischten Hexankohlenwasserstoffen geführt Man vereinigt die laut Dünnschichtchromatographie produkthaitigen Fraktionen und erhält nach dem Verdampfen Methyl-3/?-hydroxy-9,10-seco-25-homochola-5(10),6-cis,8-trienat-3-acetat (II) in Form eines Öles, a max. 258 πιμ (ε= 1 IiOO); IR 1740 (C = O), 1435, 1375, 1360 (C-H), 1245, 1165, 1030cm-' (C-O); NMR (CDCl₃), «5 0,66 (s. C-I8-H3), 035 (d, C-2I-H3), 1,61 (s, C-I9-H3), 138 (s, COCH3), 3,62 (s, OCH₃), 4,93 (m, C-3-H), 5,50 (S.C-9-H), 5,7 (d = etwa 11), 53 (d, J = etwa U).

Beispiel 5 25-HydroxychoIecaIciferol (VI)

Eine Lösung von 116 mg des in Beispiel 2 hergestellten 25-HydroxycholecalciferoI-hydrats (VI-Hydrats) in 15 ecm Benzol wird 3 Minuten lang bei Atmosphärendruck unter Rückfluß gehalten und dann unter vermindertem Druck zu im wesentlichen wasserfreiem 25-Hydroxycholecalciferol (VI) in der Form amorphen Öles eingeengt

Beispiel 6 25-HydroxychoJecalciferol (VI)

Man erhitzt einen Rundkolben mit 80 mg kristallinem 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat (VI-Hydrat) unter Hochvakuum (0,1 -2 mm Hg) 3 Stunden lang auf 8O⁰C und erhält im wesentlichen wasserfreies 25-Hydroxycholecalciferol (VI) als amorphes Öl. Der Gewichtsver lust beträgt 4,02% (berechnet 4,31 %).

Analyse KrC₂₇H₄^O₂:

berechnet: C 80,94, H 11,07%, gefunden: C 80,15, H 10,92%.

B) Herstellung von

Methyl-3jS-hydroxy-9,10-seco-25-homochola-5-cis, 7,10(19)-trienat-3-acetat(III)

Eine Lösung von C.22 g Methyl-S/Miydroxy-^lO-seco-25-homochola-5(20),6-cis3-trhnat-3-;:?etat (II) in 5 ecm Chloroform wird im verschlossenen Rohr 3'/2 Stunden auf 70-75⁰C gehalten. Der nach ώ m Verdampfen verbleibende Rückstand wird in mit 8% Äthylacetat gemischten Hexankohlenwasserstoffen gemischt und zur Chromatographie durch eine 60 g schwere Säule aus Dünnschichtchromatographie-Florisil von 0,074-0,104 mm lichter Maschenweite unter Verwendung von mit 8% Äthylacetat gemischten Hexankohlenwasserstoffen geführt Von den aufgefangenen Fraktionen mit einem Volumen von 25 ecm werden diejenigen, die laut Ergebnis der Dünnschichtchromatographie auf mit Silbernitrat getränkten und mit einem zu 15% aus Äthylacetat und zu 85% aus Hexankohlenwasserstoffen bestehenden Gemisch entwickelten Kieselsäuregel-Platten das Produkt enthalten, vereinigt. Nach dem Verdampfen erhält man 90 mg Methyl-3/?-hydroxy-9,10-seco-25-homochola-5-cis-7,10il9)-trienat-3-acetat (III) in Form eines Öles. Daten:λ Jia, 264 πιμ(ε = 14,450), IR 1740 (C=O), 1645, 1630 (C = O), 910, 890 cm-' ( = CH₂); NMR (CHCl₃), δ 0^2 (s, C-I8-H3), 0,93 (d, C-21 -H₃), 2,00 (s, CH3CO), 3,58 (s, OCH3), 4,71 und 4,96 (d, =CH₂), 4,85 (m, C-3-HX 6,0 (d, J = 11, C-6 oder C-7, H), 6,2 (d, J = 11, C-6oderC-6,H).

Beispiel 4 25-Hydroxycholecalciferol (VI)

Eine Lösung von 20 mg des nach Beispiel 2 hergestellten 25-Hydroxy-cholecalciferol-hydrats (VI-Hydrats) in 20 ecm Methylenchlorid wird mit 200 mg wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat dampft man zu im wesentlichen wasserfreiem 25-Hydroxycholecalciferol (VI) in Form eines amorphen Öles ein.

Beispiel 7 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat (VI-Hydrat)

Man löst 25-HydrcEycholecalciferol (VI), hergestellt nach Beispiel 4 —6, in warmem Methylenchlorid, so daß sich eine Konzentration von 10 mg/ccm ergibt Man läßt das Lösungsmittel langsam verdampfen und versucht, durch Kratzen aus der konzentrierten Lösung Kristalle herzustellen. Bei allen Konzentrationen jedoch ist eine Kristallbildung nicht zu erreichen, und man gewinnt Produkt Vl nur in öliger Form. Nach Zugabe eines Tropfen Wassers zu einer Lösung des Produktes VI in Methylenchlorid erhält man Kristalle von 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat (VI-Hydrat) mit einem Schmelzpunkt von 81 -83° C.

Ebenso sind auch aus einer Lösung von 25-Hydroxycholecalciferol (Vl) in Benzol keine Kristalle zu gewinnen, schöne Kristalle von 25-Hydroxycholecalciferol-hydrat (VI-Hydrat) jedoch entstehen durch Zugabe eines Tropfen Wassers zu einer konzentrierten Lösung von 25-Hydroxycholecalciferol (VI) in Benzol. Auch bei Verwendung von Äther anstelle von Benzol erhält man kristallines 25-Hydroxycholecalciferolhydrat (VI-Hydrat).

Ebenso kristallisiert 25-Hydroxycholecalciferol (Vl) nichi aus wasserfreiem Methanol, wasserfreiem Äthanol oder wasserfreiem Aceton aus. Versetzt man diese konzentrierten Lösungen mit einem Tropfen Wasser, so bilden sich Kristalle aus 25-HydroxychoIecalciferol-hydrat (VI-Hydrat).

Beispiele

25-Hydroxycholecalciferoi-hydrat (VI-Hydrat)

Eine Lösung von 200 mg 9,10-SeCOChOIeSIa-S(IO)₁O-cis,8-trien-3/?,25-diol (V) in 5 ecm Äthanol und 0,5 ecm Wasser wird mehrere Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre unter mildem Rückfluß gehalten und eingeengt, bis die Lösung nach Abkühlung auf Raumtemperatur gerade trüb ist. Man fügt Impfkristalle

an 25-Hydroxycholeca!cifero|-hydrat (VI-Hydrat) hini und läßt die geimpfte Lösung mehrere Stunden unter ristallabscheidung stehen. Die Kristalle werden jfütriert und mit wäßrigem Äthanol unter Gewinnung Dn M-Hydroxycholecalciferol-hydrat (VI-Hydrat) geaschen.

Claims

eine Alkylgruppe mit weniger als 9 Kohlenstoffatomen bedeuten.

Die vorliegende Erfindung betrifft 25-Hydroxycholecalciferolhydrat der Formel

CH₃

(CHz)₃-C-OH CH₃