DE2526981C3

DE2526981C3 - lalpha^4-Dihyaroxycholecalciferol-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Mittel

Info

Publication number: DE2526981C3
Application number: DE752526981A
Authority: DE
Inventors: Yoshinobu Fujisawa Kanagawa Hashimoto; Nobuo Ikekawa; Sachio Ishimoto; Hiroyuki Hino Tokio Kawashima; Masuo Morisaki; Toru Hino Tokio Takeshita
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1974-06-18
Filing date: 1975-06-18
Publication date: 1979-03-01
Also published as: DK142410C; GB1508042A; NL7507268A; NO145162C; DE2526981B2; DK142410B; DE2526981A1; DK273375A; NO145162B; FR2275196A1; FR2275196B1; US4022891A; GB1508043A; CH618669A5; SE413096B; SE7506560L; NO752150L; CA1051442A

Description

'N/V

( Y

H O

OH

enthält.

14. Pharmazeutisches Mittel für Warmblüter gemäß Anspruch 13, das oral oder durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion verabreichbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1rt-24(S)-und 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel (5-a) und ein Trägermaterial enthält, das gegenüber Warmblütern nicht toxisch ist.

15. Pharmazeutisches Mittel, um den Calciummetabolismus von Warmblütern zu regulieren, nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1a-24(S)- und 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel (5-a) und ein für Warmblüter nichttoxisches Trägermaterial enthält.

16. Prophylaktisches oder therapeutisches pharmazeutisches Mittel für Vitamin-D-Mangelkrankheiten und verwandte Krankheiten nach einem der Ansprüche 13, 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem 1ä-24(S)- und l<x-24(R)-Dihyd oxycholecalciferol der Formel (5-a) enthält.

17. Futtermittel für Haustiere und Geflügel, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,2 bis 20 μg/kg Futtermittel von mindestens einer der folgenden Verbindungen, nämlich 1ä-24(S)- und/oder 1 «-24(R)-Dihydroxycho!ecalciferol, enthält.

18. Angereicherte Milch, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis l,0μg/l von mindestens einer der folgenden Verbindungen, nämlich 1«-24(S)- und/ oder 1 «-24{R)-Dihydroxycholecalciferol, enthä It.

R₁O OR₂

dargestellt, worin

R'. R; und Kj gleich oder unterschiedlich sein können und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, bedeuten.

Die allgemeine Formel (5) stellt allgemein 1*,24-(S)-Dihydroxycholecalciferol und seine Derivate (das als 1r*,24(S)-DHCC und seine Derivate bezeichnet werden) der folgenden Formel

OR.,

15-1)

R₁0

OR-

dar, worin

Ri, R2 und R 3 die gleiche Bedeutung wie oben gegeben besitzen, la^RJ-Dihydroxycholecalciferol und seine Derivate (das als la,24(R)-DHCC und seine Derivate bezeichnet werden) der folgenden Formel

OR.,

,■ν A

(5-2)

Gegenstand der Erfindung sind neue la,24-Dihydroxycholecalciferole und ihre Derivate, Verfahren zu ihrer hi worin Herstellung sowie pharmazeutische Mittel gemäß den Patentansprüchen.

Die neuen la^-Dihydroxycholecalciferoleund Deri-R₁O

Ri, R2 und R3 die gleiche Bedeutung wie oben gegeben besitzen, und eine Mischung aus la,24(S)-Epimer der Formel (5-1) und la,24(R)-Epimer der Formel (5-2).

In der vorliegenden Anmeldung wir wird die obige Mischung aus dem 1 v?^d(S)-lipimer der Formel (5-1) und dem 1 x,24(R)-Epimer der formel (5-2) in beliebigem Verhältnis durch die folgende Formel

OR,

IO

besitzen eine wesentlich niedrigere Toxizität (LD·-«) a!s lA-Hydroxycholccalciferol (Ia-HCC), welches ein zu aktiven Formen des Vitamins Di bekanntes Analoges ist.

Das !«-Hydroxycholecalciferol (Ia-HCC) wird durch die folgende Formel

(5-3)

(B-Il

R,O

OR,

ausgedrückt In anderen Worten wird —ORj in der 24-Stellung durch

dargestellt.

Die gleiche Darstellung wie in den obigen Formeln (5), (5-1) und (5-2) wird verwendet, um die Vorstufen für diese Verbindungen darzustellen.

Von den lm^-Dihydrowcholecalciferolen und seinen Derivaten der Formel (5) besitzen 1«,24-Dihydroxycholecalciferole der Formel

(5-a)

HO

OH

die nützlichsten pharmakologischen Wirkungen, wie die Anmelderin festgestellt hat.

Die Ift^-Dihydroxycholecalciferole der Formel (5-a) bedeuten ebenfalls (i) la^SJ-Dihydroxycholecalciferol [la,24(S)-DHCC],(ii)la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol [1*,24(R)-DHCC] und (iii) eine Mischung aus 1«,24(S)-DHCC und la,24(R)-DHCC (l<x,24-DHCC epimere Mischung).

Wie im folgenden in ausführlichen Tierversuchen erläutert wird, zeigen das la,24(S)-DHCC allein, das 1«,24(R)-DHCC allein und Mischung davon eine sehr wertvolle pharmakologische Aktivität, um den Calcium-Metabolismus von Warmblütern zu regulieren, und sie

IiO

X)

dargestellt.

Soweit der Anmelderin bekannt ist, wurde über die !«^-Dihydroxycholecalciferole noch nicht berichtet, die einzige Ausnahme ist eine Arbeit der Erfinder der vorliegenden Anmeldung in The Journal of Steroid Biochemisty, Band 5, Nr. 4, Juni 1974, Fourth International Congress on Hormonal Steroids, Mexico-City, 2. bis 7. Septemper 1974, Abstracts of Papers Presented (tatsächlich publiziert am 16. August 1974). In dieser Arbeit wird angegeben, daß 24-Hydroxycholesterin (24-HC) der folgenden Formel

OH

., X

HO-

IB-2I

24.25-Dihydro\yeholcslcrin (24,25-I)HC) der folgenden Formel

OH

HO

OH

(B-31

und deren lrc-Hydroxyderivate in Vitamin-D-Derivate nach bekannten, üblichen Verfahren überführt werden können. Es sind jedoch nur die Verbindungen der Formeln (B-2) und (B-3), die damals in Vitamin-D-Derivate überführt werden konnten. Dementsprechend ist es seit dem obenerwähnten Kongreß in Mexico-City nur bekannt, daß die Umwandlung von ΐΛ-Hydroxyderivaten der Formel (B-2) in Vitamin-D-Derivate noch untersucht wurde, und auf dem Kongreß wurde nicht über die Umwandlung der lot-Hydroxyderivate der

Formel (B-3) in Viiamin-Ü-Üerivate berichtet. Nach den damaligen Arbeiten der Anmelderin und ihren folgenden Untersuchungen war es nicht möglich, mit den Verfahren, die vor der Einreichung der vorliegenden Anmeldung bzw. vor dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung bekannt waren, Vitamin-D-Derivate des Cholecalciferol-Typs aus diesen Derivaten herzustellen, wie im folgenden näher erläutert wird. Der Anmelderin gelang es jetzt jedoch, eine Gruppe von neuen l«-24-Dihydro\ycholecalciferolen und deren Derivaten der Formel (5) und bevorzugt der Formel (5-a) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das im folgenden näher erläutert wird, zu synthetisieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden in Einzelheiten beschrieben.

(1) Erste Reaktionssiufe

Erfindungsgemäß wird ΐΛ-24-Dihydroxycholesterin (das als Ιλ-24-DHC bezeichnet wird) der folgenden Formel (2-a)

Oil

(Ml

(2-a)

HO

durch Umsetzung von l(\,2i\-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on (das als 1«,2«-Epoxy bezeichnet wird) der folgenden Formel

(H

mit einem Alkalimetall und einem Protondonor in Anwesenheit von flüssigem Ammoniak oder einem flüssigen Amin hergestellt.

li\-24-DHC, das durch die Formel (2-a) dargestellt wird, bedeutet eine Mischung aus 1«-24{S)-Dihydroxycholesterin [1a-24(S)-DHC] und la-24(R)-Dihydroxycholesterin [I a-24(R)-DHC] in beliebigen Verhältnissen, und gemäß dem Verfahren der ersten Stufe oben wird Ιλ-24-DHC als Mischung aus (S)-Epimer und (R)-Epimer erhalten.

Soweit der Anmelderin bekannt ist, sind Ια-24-Epoxy der Formel (1) und Ια-24-DHC der Formel (2-a) beides neue Verbindungen, die in der Literatur nicht beschrieben werden, sondern die erstmals von der Anmelderin synthetisiert wurden.

Das obige Ια-24-DHC kann in eine Gruppe von Ιλ-24-DHCC und seinen Derivaten der Formel (5), insbesondere der Formel (5-a), nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das näher erläutert wird, überführt werden. Zusätzlich sind diese Verbindungen wertvolle Zwischenprodukte für andere Steriode. die physiologische Aktivitäten besitzen, beispielsweise Zwischenprodukte für die Synthese von l<x-24,25-Trihydroxycholecalcifcml, welches eine aktive Form von Vitamin Di ist.

Beispiele von flüssigen Aminen, die bei der ersten Stufe verwendet werden können, sind primäre, sekundäre oder tertiäre Alkylamme wie Methylamin, Athylamin. Diäthy'amin oder Triathylamin. Die Verwendung von flüssigem Ammoniak ist jedoch bevorzugt. Obgleich im Hinblick auf den flüssigen Ammoniak keine besondere Beschränkung besteht, ist es bevorzugt, ihn beispielsweise durch Destillation zu behandeln, um das Wasser daraus so weit wie möglich zu entfernen. Die geeignete Menge an flüssigen! Ammoniak oder flüssigem Amin beträgt das 5- bis 500fache, insbesondere das 10- bis 200fache, bezogen auf diis Gewicht des li\.2rv-Epoxy-24-ketoch lcsta-4,6-dien-3-ons.

Beispr.-ie von bevorzugten Alkalimetallen sind Lithium, M't:ium und kalium. Lithium ist besonders gin geeignet. Es wird eine überschüssige Menge an Alkalimetall, bezogen auf das h\,2(vEpoxy der Formel (1), verwendet, beispielsweise das 5- bis 250tu>;hc (ausgedrückt als Atomäquivalent), insbesondere das 10-bis 200fache, bezogen auf die Menge an 1λ,2λ-Epoxy der Formel (1).

Bevorzugt wird ein inertes organisches Lösungsmittel für das 1λ,2λ-Epoxy der Formel (1) verwendet, damit die Umsetzung glatt verlänti. Beispiele bevorzugter Lösungsmittel sind die Ä'Hcr wie Äthyläther. Tetrahydrofuran, Dioxan odei l,2-Dimetho\yäihan, aliphatisch^ Kohlenwasserstoffe wie Ligroin, Pentax Hexan. Cyclohexan oder Methylcyclohexan und Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Verbindungen.

Die Menge an organischem Lösungsmittel ist mindestens gleich, bezogen auf das Volumen des verwendeten flüssigen Ammoniaks, und beträgt bevorzugt das 1 - bis 2fache, bezogen auf das Volumen des flüssigen Ammoniaks.

Geeignete Protonendonoren sind die Ammoniumsalze wie die Ammoniumsalze organischer Säuren und die Ammoniumsalze von anorganischen Säuren. Spezifische Beispiele der Ammoniumsalze sind Ammoniumchlorid.
Ammoniumbromid,
Ammoniumcarbonat,
Ammoniumsulfat,
Ammoniumphosphat.
Ammoniumhydrogenphosphat, Ammoniumacetat,
Ammoniumformiat.
Ammoniumbenzoat,
Ammoniumbenzolsulfonat und Ammonium-p-toluensulfat.

Vondiesen sind die Ammoniumsalze der anorganischen Säuren wie Ammoniumchlorid besonders bevorzugt. Die Menge an Ammoniumsaiz ist mindestens äquimolar zu dem verwendeten Alkalimetall, bevorzugt beträgt sie das bis zu 1 Omolarfache, bezogen auf das Letztere.

Niedrigere Alkohole wie Methanol, Äthanol oder tert.-Butylalkoho! können ebenfalls als Protonendonoren verwendet werden.

Das Zugabeverfahren der Reaktionsreagentien ist bei der Durchführung der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens sehr wichtig, und vorteilhafterweise wird eines der folgenden drei Zugabeverfahren ausgewählt.

(A) Das lÄ,2a-Epoxy wird zu einer Mischung zugegeben, die flüssiges Ammoniak und Alkalimetall enthält, und dann wird das Ammoniumsalz zugefügt Zur

Zen ist es bevorzugter, 1λ$ Ammoniumsnlz nacheinander in 7wei oder mehreren kleinen Teilen zuzufügen.

(B) Ein geringer Anteil (wünschenswerterweise weniger als das 0,7molfache, bezogen auf die Menge an verwendetem Alkalimetall) des AmmoP'iimsalzes wird zuvor zii einer Mischung, die das flüssige Ammoniak und das Alkalimetall cnihä't, zugegeben. Das 1a,2<x-Epoxy wird zu diesem System zugefügt, ii"<i dann wird der Rest des Aminoniumsalzes zugegeben.

(C) Das l(\,2(Tc-Epoxy und das Ammoniumsalz werden gleichzeitig in kieip>_-n Portionen r.u e;r.ci Mischung zugegeben, die flüssiges Ammoniak und Alkalimetall enthält.

Von den ohicen Verfahren ist das Verfahren (A) besonders bevorzugt.

Oii- Reaktionsteiiipcraiur betrag! ubiii.hcrv.eise von -70^cC bis zur Rückflußtemperatür des flüssigen Ammoniaks in dc:r>. Reaktionssystem.

Es ist vorteilhaft, daß, nachdem der gesamte Pr jtc!ionoarior zugegeben wird, die Umsetzung bis zum Rückfluß des flüssigen Ammoniaks weitergeführt wird, bis das im Überschuß verwendete Alkalimetall vollständig zersetzt ist. Somit ist es mö^ch. daß man das Endprodukt Ια-24-DHC in höherer Ausbeute erhält.

hin Verfahren war früher bekannt, bei dem l(X,2*-Epoxy-cholesta-4,6-dien-3-on der Formel

lB-4)

OH /

HO

(B-5)

einer solchen Vier-Siufen-Reduklionsreaktion die Stufen (1) bis (4) glatt in einer einzigen Stufe ablaufen, wird in keiner Publikation beschrieben, und es wird angenommen, daii dies eine imue Reaktion ist, die zum ersten Mal von der Anmelderin gefunden wurde.

(2) Herstellung von 1·*,2λ-Epoxy

Das 1λ,2λ-Epoxy der Formel (1), das als Ausgangsmaterial bei dc> ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, kann leicht, beispielsweise durch das folgende Verfahien, hergestellt werden, wobei als Ausgangsmaterial Fiicciltrin der folgenden Formel

mit metallischem Lithium und Ammoniumchlorid in Anwesenheit von flüssigem Ammoniak umgesetzt wird, wobei 1«-Hydroxycholesterin(l«-HC)der Formel

gebildet wird, um la-Hydroxychoiecalciferol (B-I) herzustellen (D. H. R. Barton et al., J. Am. Chem.Soc, 95,2748,1973).

Es wurde gefunden, daß das 1«,2«-Epoxy, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch eine Oxogruppe (= 0) in der 24-Stellung substituiert ist, und erfindungsgemäß verläuft die Vier-Stufen-Reduktionsreaktion eines solchen la,2a-Epoxys,d. h.

(1) die Reduktion der Carbonylgruppe in der 24-Stellung,

(2) Die Reduktion der l«^2a-Epoxygruppe,

(3) die Reduktion des 4,6-Diens zu einem 5-En und

(4) die Reduktion der Carbonylgruppe in der 3-Stellung

glatt in einer einzigen Stufe, und wenn bevorzugte Bedingungen verwendet werden, kann das Ια-24-Dihydroxycholesterin (Ιλ-24-DHC) in hoher Ausbeute von 60 bis 75% synthetisiert werden. Die Tatsache, daß bei

Ii(T

(Λ-1)

verwendet wird, das in großen Mengen in braunen Meeresalgen vorhanden ist. Ein Beispiel dieses Verfahrens wird im folgenden näher erläutert.

Fucosterin wird mit Ozon bei niedrigen Temperaturen oxydiert, und das entstehende Ozonid wird mit einem Essigsäure/Zink-System reduziert, um 24-K.etocholesterin der folgenden Formel

HO

(A-2)

in einer Ausbeute von ungefähr 60 bis 75% zu bilden. Das entstehende 24-Ketocholesierin wird oxydiert, beispielsweise mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyanobenzochinon (DDQ) bei Rückflußbedingungen, beispielsweise unter Verwendung von Dioxan, wobei Cholesta-1,4,6-trien-3,24-dion der folgenden Formel

(A-3)

gebildet wird, und dann wird dieses Oxydationsprodukt bei Zimmertemperatur unter alkalischen Bedingungen b5 (pH-Wert ungefähr 7,5 bis 9) unter Verwendung von Wasserstoffperoxid epoxydiert.

Dieses Verfahren ermöglicht die Synthese von l«,2a-Epoxy der Formel (1) in einer Ausbeute von

ungefähr 40 bis 55% aus dem 24-Ketocholesterin der Formel (A-2).

Das Cholesta-1,4,6-trieno,24-dion der Formel (A-3) ist ebenfalls eine neue Verbindung, die zum ersten Mal von der Anmelderin synthetisiert wird.

Wenn ein niedriger Alkohol wie Methanol als Lösungsmittel für die obige Epoxydierungsreaktion verwendet wird, scheidet sich das entstehende 1λ,2λ-Epoxy aus dem niedrigen AlkohoHösungsmittel ab. Das ausgeschiedene Epoxy kann dann aus der Reaktionsmischung durch Filtration abgetrennt und direkt als Ausgangsmaterial bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.

(3) Abtrennung von (S)- und(R)-Epimeren
von Ιλ-24-DHC

Wie bereits angegeben, wird das Ιλ-24-DHC der Formel (2), das bei der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wird, als Mischung aus 1 _Ä-24(S)- DHC und 1«-24(R)- DHC erhalten.

Es wurde gefunden, daß erfindungsgemäß das (S)-Epimer und das (R)-Epimer glatt durch substituierte oder nichtsubstituierte Benzoylierung der Hydroxylgruppen in den 3- und 24-Stellungen des Ιλ-24-DHC abgetrennt werden können. Mit anderen Worten, in der 1-Stellung kann eine Hydroxylgruppe selbst vorhanden sein oder es kann eine mit einer Schutzgruppe geschützte Gruppe vorhanden sein, die in die Hydroxylgruppe überführbar ist. um die Trennung der (S)- und (R)-Epimeren zu bewirken.

Die substituierte oder nichtsubstituierte Benzoylierung der 3- und 24-Stel!ungen des Ιλ-24-DHC kann durchgeführt werden, indem man das Ιλ-24-DHC mit substituiertem oder unsubstituiertem Benzoylchlorid beispielsv/eise in einem inerten organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer organischen Base wie eines Säureakzeptors umsetzt. Diese Umsetzung ist üblicherweise als Schotten-Baumann-Reaktion bekannt. Eine organische Base wie ein Pyridin kann bei der obigen Umsetzung als inertes organisches Lösungsmittel verwendet werden, und in diesem Fall ist die Verwendung eines Säureakzeptors nicht besonders erforderlich.

Die substituierte oder unsubstituierte Benzoylierung der 3- und 24-Stellungen des 1ä-24-DHC kann selektiv erreicht werden, indem man mit substituiertem oder unsubstituiertem Benzoylchlorid beispielsweise in einer Pyridinlösung bei niedriger Temperatur (z.B. -5 bis IO°C) während einer geeigneten Zeit (z.B. 10 bis 24 Stunden) umsetzt. Die Hydroxylgruppe in der 1 -Stellung kann acyliert werden, beispielsweise indem man ein Sterin, dessen Hydroxylgruppen in den 3- und 24-Stellungen geschützt sind, mit Acylchlorid in einer Pyridinlösung bei 0 bis 50⁰C umsetzt. Die Hydroxylgruppe in der !-Stellung kann trimethylisiert werden, beispielsweise indem man ein Sterin, dessen Hydroxylgruppen in den 3- und 24-Stellungen geschützt sind, mit N-Trimethylsilyl-imidazol in einer Pyridinlösung bei hoher Temperatur (z. B. 50 bis 110⁰C) umsetzt.

Führt man die substituierte oder unsubstituierte Benzoylierung von Ιλ-24-DHC bei höheren Temperaturen, beispielsweise bei 15 bis 100⁰C, bevorzugt 3(1 bis 80⁰C, so können die I-, 3- und 24-Stellungen des Ιλ-24-DHC in einer einzigen Stufe benzoyliert werden.

Beispiele von substituierten oder unsubstituierten Benzoylgruppen sind Benzoyl-, p-Brombenzoyl-, 2,4-Dibrombenzoyl-, p-Chlorbenzoyl- und p-Nitrobcnzoylgruppen. Von diesen sind die Benzoyl- und p-Broniben-

zoylgruppen besonders bevorzugt.

In 1-Stellung von Ιλ-24-DHC kann eine Hydroxyl gruppe gebunden sein. Beispiele von Schutzgruppe! dafür sind die obenerwähnten substituierten ode unsubstituierten Benzoylgruppen, Acylgruppen (organi sehe Carbonsäurereste) oder Gruppen, die ein< Ätherbindung ergeben. Beispiele solcher Acylgruppet sind Acetyl-, Propanoyl-, öutanoyl-, Pentanoyl-, Ca proyl-, Cyclohexanoyl-, Chloracetyl- und Bromaeetyl gruppen. Beispiele von Schulzgruppen, die Ätherbin düngen mit den Hydroxylgruppen in der 1 -Stellunj ergeben können, sind eine tert.-Butylgruppe. eini Benzylgruppe. eine Triarylgruppe wie eine Triphenyl methylgruppe, eine Tetrahydropyranylgruppe, eim Methoxymethylgruppe oder eine alkylsubstituierti Silylgruppe wie eine Trimethylsilylgruppe.

Die obigen Acylgruppen einschließlich der substitu ierten oder unsubstituierten Benzoylgruppen sind al Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen in de [-Stellung bevorzugt.

Um das Ιλ-24-DHC in das (S)-Epimer und da (R)-Epimer zu trennen, wird das Ιλ-24-DHC der Forme (2-a) zuerst in ein Benzoylderivat von Ιλ-24-DHC ausgedrückt durch die folgende Formel

or;

OR,

(2-b|

überführt, worin

R4" eine substituierte oder unsubsiituierte Benzoylgrup pe und

Rs ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die ir ein Wasserstoffatom überführbar ist, bedeuten.

Dieses Benzoylderivat wird dann der Chromatographie unterworfen, wobei ein Trägermaterial verwendet wird, das wenigstens Siliciumdioxid (S1O2) enthält, um e:

4^r) in das 1 \-24(S)-Epimer und das lÄ-24(R)-Epimer zi trennen.

Diese Epimere sind ebenfalls neue Verbindungen, die von der Anmelderin zum ersten Mal synthesiert unc erfolgreich getrennt wurden.

ϊο Als Trägermaterial, das Siliciumoxid enthält, kanr man beispielsweise verwenden: Silikagel, Kieselsäure Siliciumdioxid-Aluininiumoxid-Gel, Diatomeenerdt oder Kaolin. Das Silikagel, die Kieselsäure und da; Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Gel, die hauptsächlich

v, Siliciumdioxid enthalten, sind besonders geeignet.

Die Chromatographie kann auf irgendeine geeignete Weise durchgeführt werden wie Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie. Um große Mengen zu trennen

W) ist die Säulenchromatographie bevorzugt. Die Saulenchrornatographie wird beispielsweise durchgeführt indem man Silikagel als Trägermaterial und n-Hexan Benzol Äthylacetat, Methylenchlorid oder Äther als Entwicklungslösung' mittel verwendet, um die Epimeren

πι in reiner Form zu erhalten. Unreine Fraktionen können wiederholt der Säulenchromatographie unterworfer werden oder fraktioniert kristallisiert werden, um geringe Mengen an Verunreinigungen zu entfernen.

909 609/266

Die Entwicklungsgeschwindigkeit von la-24(R)-DHC ist hoch, wohingegen die Entwicklungsgeschwindigkeit seines Benzoylderivates niedrig ist.

(4) Zweite Reaktionsstufe (Synthese des
5,7- Dien- Derivats)

Erfindungsgemäß wird das Ια-24-DHC der Formel (2-a), das bei der Umsetzung der ersten Stufe erhalten wird, in ein geschütztes Derivat des la,3/?-24-Trihydroxycholesta-5.7-diens überführt, nachdem die Wasserstoffatome der Hydroxylgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen mit einer Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, geschützt wurden oder nachdem das ΐΛ-24-DHC-benzoylderivat der Formel (2-b) in das 1«-24(S)-Epimer und das la-24(R)-Epimer getrenn! wurde oder nachdem die Benzoylschutzgruppen in den 1-, 3- und 24-Stellungen der Formel (2-a) in andere Schutzgruppen, die in Hydroxylgruppen überführbar sind, überführt wurden.

Erfindungsgemäß können mindestens ein geschütztes 1 a,3/J-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien- Deri vat und ein geschütztes lfx,3/J-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien-Derivat (diese werden im folgenden der Einfachheit halber als 5,7-Dien-Derivate bezeichnet) der Formel

OR₁,

C)R,

OR₅

. ι Λ

Cl

R₄O

hergestellt werden, indem man mindestens ein geschütztes Derivat des 1«-24(S)-Dihydroxycholcsterins und ein geschütztes Derivat des 1«-24(R)-Dihydroxycholcstcrins der folgenden Formel

OR/,

/V-V r; er

wenn

R₄'. R5' und Re' gleich oder unterschiedlich sind und je eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoff a torn überführbar ist, ohne Änderung der Struktur der folgenden Formel (3) mit einem allylischen Bromierungsmittel in einem inerten organischen Medium umsetzt und dann die Reaktionsmischung mit einem Dehydrobromierungsmittel behandelt.

Es ist wichtig, daß bei der zweiten Stufe der Herstellung der obigen 5,7-Dien-Derivate die Hydroxylgruppen in den 1-. 3- und 24-Stellungen des Ια-24-DHC und seiner Epimeren der Formel (2) geschützt sind. Wenn die Umsetzung in der zweiten Stufe durchgeführt wird, ohne daß diese drei Hydroxylgruppen des lx-24-DHC geschützt werden, können die Oxvdiition und die Zersetzung der Hydroxylgruppen nicht verhindert werden, und die Ausbeute an den gewünschten 5.7-Dien-Derivaten wird sehr niedrig.

Die Schutzgruppe kann irgendeine Schutzgruppe sein, die in eine Hydroxylgruppe in den 1-, 3- und 24-Stellungen überführt werden kann, ohne daß das CholestaöJ-dien-Skelett nach der Umwandlung in das 5,7-Dien-Derivat zerstört wird. Beispiele solcher Schutzgruppen werden im folgenden angegeben.

(1) Acy !gruppen:

Ci _ 12 aromatische oder aliphatische Caruonsäurereste oder deren nitro-, halogen- und alkoxy-substituierten Derivate, z. B. mit Acetyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Pentanoyl-, Capronyl-, Cyclohexanoyl-, Chloracetyl-, Bromacetyl-, Benzoyl-, p-Brombenzoyl-, p-Nitrobenzoyl-, Äthylbenzoyl- und Toluylgruppen. Von diesen sind die Acetyl-, Benzoyl- und Propanoylgruppen besonders bevorzugt.

(2) Gruppen, die mit Hydroxylgruppen Ätherbindungen ergeben

eine tert.-Bulylgruppe, eine Benzylgruppe, eine Triarylmethylgruppe wie eine Triphenylmethy!- gruppe, eine Tetrahydropyranylgruppe, eine Methoxymethylgruppe und eine alkylsubstituierte Silylgruppe wie eine Trimethylsilylgruppe. Von den obigen Schutzgruppen sind die Acylgruppen (I) besonders bevorzugt, aber die vorliegende Erfindung ist darauf keinesfalls beschränkt.

Das Bromierungsmittel für die Allyl-Stellung kann irgendeine Verbindung sein, die üblicherweise für die Bromierung von Allylstcllungen verwendet wird, beispielsweise kann man bevorzugt N-Bromsuccinimid, l,3-Dibrcm-5,5-dimethylhydantoin und N-Bromcaprolactam verwenden. Üblicherweise beträgt die Menge an allylischcm Bromierungsmittel das I — 2äquivalentfache, bezogen auf die Menge an 5-En der Formel (2). Bei der vorliegenden Erfindung findet zuerst eine Umsetzung zwischen dem l«-24-DHC der Formel (2), bevorzugt einem geschützten Ιλ-24-DHC oder seinem geschützten Epiiner, und dem allylischen Bromierungsmittel in einem inerten organischen Medium statt. Geeigneterweise wird diese Umsetzung bei Zimmertemperatur bis 140⁰C durchgeführt.

Das inerte organische Medium ist eines, welches mit dem Bromierungsmittel nicht reagiert. Vorteilhafterweise wird beispielsweise ein Kohlenwasserstoff oder ein halogenierter Kohlenwasserstoff wie Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol, Brombenzol, Chlorbenzol, Nitrobenzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder i,2-Dibromälhan verwendet. Man kann auch ein Ätherlösungsmittel wie Äthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylcellosolv oder Phenylcellosolv verwenden. Diese inerten organischen Lösungsmittel können entweder allein oder miteinander vermischt eingesetzt werden.

Die Umsetzung verläuft bei der obigen Temperatur. Gewünschtenfalls kann die Umsetzung unter Bestrahlung mit aktinischem Licht mit einer Wellenlänge durchgeführt werden, die den Infrarot- bis Ultraviolettstrahlen entspricht. In diesem Fall verläuft die Umsetzung bei einer Temperatur, die niedriger ist als Zimmertemperatur. Ein Radikalinitiator wie Azo-bisisobutyronitril, Benzoylperoxid oder Cyclohexyl-hydroperoxid kann ebenfalls in geringer Menge zugesetzt werden.

OH

(B-5)

/ ■;■. /

A₁X)

(B-(S)

Das Dehydrobromierungsmittel ist bevorzugt Trimethylphosphit, s-Collidin oder Diäthylanilin und diese Verbindungen können gemeinsam verwendet werden. Theoretisch verläuft die Umsetzung vollständig, wenn die Menge an Dehydrobromierungsmittel äquimolar zu dem bromierten Produkt ist, das man bei der vorhergehenden Bromierungsreaktion erhält; um geeignete Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten sicherzustellen, wird das Dehydrobromierungsmittel aber bevorzugt in einer Menge von mindestens dem ungefähr 2molfachen, bezogen auf die Menge an bromiertem Produkt, verwendet. Da das Dehydrobromierungsmittel ebenfalls als Reaktionsmedium wirkt, besteht für seine Menge keine besondere obere Grenze.

Im allgemeinen verläuft die Umsetzung sehr gut bei einer Temperatur von 80 bis 250°C, bevorzugt 120 bis 180°C. Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit von der Art des Dehydrobromierungsmittels, der Art des Reaktionslösungsmittels usw. Beispielsweise ist bei einer bevorzugten Ausführungsform, bei der die Umsetzung unter Rückfluß in einem Xylol-s-Collidin-System durchgeführt wird, die Umsetzung innerhalb einer kurzen Zeit von ungefähr 20 Minuten beendigt.

Gegen Ende derUmsetzung wird das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert, wobei man ein öliges, rohes 5,7-Dien-Derivat erhält.

(5) Dritte Reaktionsslufe (Reinigung des rohen
5,7-Dien-Derivats

Wie bereits oben angegeben, ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von la-Hydroxycholesterin (lix-HC) der Formel

durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen umgelagert werden, um es in das lot,3^-Diacetoxycholecalciferon (Vitamin-D-Derivat) der Formel

IB-I

A. O

OA,

zu überführen. Die Anmelderin rivat der Formel	hat daher	versucht	,das	5,7-Dien-De-
		\ ⁷X , Y	OR, k
	ORs /\ I
ί				(3)
" Y

bekannt (D. H. R. B a r t ο η et al., |. Am. Chem. Soc, 95, 2748,1973).

Es ist weiterhin bekannt, daß das obige la-Hydroxycholesterin (Ιλ-HC) in l«,3/?-Diacetoxycholesta-5,7-diender Formel

R₄O

das bei der /weiten Stufe erhalten wird, durch direkte Bestrahlung mit ultraviolettem Licht nach dem für die Synthese von 1«,3/?-Diacetoxycholecalciferol der Formel (B-I) bekannten Verfahren umzulagern, aber das gewünschte ΙίΧ-24-Dihydroxycholecalciferol-Derivat der Formel

OR,

R₄O

A₁- CHiCO- bedeutet, überführt werden kann, wobei die gleiche Umsetzung wie bei der zweiten Stufe der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, durchgeführt wird, und dieses Produkt kann dann thermisch worin

R.1, R-, und Ri, die gleiche Bedeutung wk¹ oben angegc >cn besii/en [Formel (2)], konnte nicht isoliert werden.

Die Anmelderin nimmt an, daß dies darauf zurückzuführen ist. daß das 5.7-Dien-Derivat der Formel (3)

unrein ist und vermutlich ein 4,6-Dien-Derivat der Formel

(6)

/x/x/

R₄O

enthält, worin R₄, Rj und R_b die gleiche Bedeutung wie oben angegeben besitzen. Aufgrund dieser Annahme hat die Anmelderin versucht, das rohe, bei der zweiten Stufe wie oben gebildete und abgetrennte 5.7-Dien-Derivat zu reinigen, wobei eine bekannte Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Silikagel als Adsorptionsmittel, d. h. eine Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie, verwendet wurde. Es gelang jedoch mit keinem dieser chromatographischen Verfahren, das 4,6-Dien-Derivat der Formel (6) aus dem rohen 2") 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) abzutrennen.

Ein Beispiel ist bekannt, bei dem die Chromatographie unter Verwendung von Silbernitrat für die Trennung und Reinigung von Acetoxycholesta-5,7 dienen (Tetrahedron Letters, Nr. 40, 4147, 1972 und jii DE-OS 24 00 931) angewendet wurde.

Die Anmelderin hat daher daran gedacht, daß es möglich sein würde, die Silbernitrat-Chromatographie mit dem obigen rohen 5,7-Dien-Derivat der Formei (3) durchzuführen, und hat versucht, das rohe 5,7-Dien-De- r, rivat durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 2%igem Silbemitrat-Silikagel zu reinigen. Dieser Versuch mißlang, und das 4,6-Dien-Derivat konnte nicht abgetrennt werden.

Verschiedene weitere Untersuchungen von Reinigungsverfahren für das rohe 5,7-Dien-Derivat haben schließlich zu dem Ergebnis geführt, daß freies 5,7-Dien gut von dem freien 4,6-Dien und anderen Verunreinigungen abgetrennt werden kann, indem man ein chromatographisches Verfahren verwendet und die 4-, Schutzgruppe von dem rohen 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) abspaltet und es in la^-Trihydroxycholesta-5,7-dien (das freie 5,7-Dien) der Formel

OH

HO

(3-a)

überführt und in Berührung mit einem Trägermaterial bringt, das Siliciumdioxid enthält und daran nichtmetallisches Silber adsorbiert enthält.

Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren kann nicht nur mit dem rohen, geschützten 5,7-Dien-Derivat, das bei der zweiten Stufe erhalten wird, sondern ebenfalls mit dem 5.7-Dien-Derivat in 24(S)-Epimer-Form oder dem 5.7-Dien-Derivat in 24(R)-Epimer-Form durchgeführt werden. Auf jeden Fall ist es wesentlich, daß eine rohe Verbindung dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren unterworfen wird, nachdem die Schutzgruppe in den 1-, 3- und 24-Stellungen abgespalten wurde, um sie in das freie 5,7-Dien der Formel (3-a) zu überführen.

Geeignete Trägermaterialien, die Siliciumdioxid enthalten und daran adsorbiert nichtmetallisches Silber enthalten, sind Silikagel und Siliciumdioxid-Aluminiumoxid-Gel, die Silbernitrai entSialten oder wobei Silbernitrat an diesen haftet. Das Silikagel ist besonders vorteilhaft.

Solches Silikagel wird beispielsweise hergestellt, indem man Silbernitrat in Wasser oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Acetonitril oder Alkoholen löst, die Lösung mit Silikagel mischt und dann das Lösungsmittel aus der Mischung abdampft. Wenn es für die Säulenchromatographie verwendet wird, wird es gewünschtenfalls aktiviert und in eine Glassäule gefüllt. Wenn es für die Dünnschichtchromatographie verwendet wird, wird ein geeignetes Fixiermittel wie Gips oder Stärke in das Silikagel eingearbeitet, das auf obige Weise hergestellt wurde, und gewünschtenfalls wird ebenfalls ein fluoreszierendes Mittel zugegeben. Die Masse wird dann auf einer geeigneten Platte (Glas oder Polyesterfilm) in einer Dicke von 0,2 bis 2 mm ausgestrichen, fixiert und aktiviert.

Um eine Dünnschichtchromatographie-Platte, die nur aus Silikagel besteht, mit Silbernitrat zu imprägnieren, wird die Platte in eine Lösung aus Silbernitrat in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Acetonitril oder ein Alkohol) in einer geeigneten Konzentration getaucht, getrocknet und dann aktiviert.

Die Menge an Silbernitrat, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, beträgt geeigneterweise 0,1 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Silikagel, insbesondere bevorzugt 0,5 bis 10 Gew.-%. Wenn die Menge an Silbernitrat unter 0,1 Gew.-% oder über 20 Gew.-% liegt, wird die Trennfähigkeii schlecht. Im letzteren Fall wird das Silbernitrat verschwenderisch verwendet.

Beispiele von Entwicklungslösungsmitteln oder Eluierungslösungsmitteln, die für die Dünnschichtchromatographie oder die Säulenchromatographie verwendet werden können, sind organische Lösungsmittel wie Cyclohexan, η-Hexan, Benzol, Toluol, Chloroform, 1,2-Dichlormethan, 1,2-Dichloräthan, Aceton, Diäthyläther. Tetrahydrofuran, Äthylacetat, Methanol, Äthanol und Propanol und Mischungen davon. Von diesen sind Mischungen aus niedrigsiedenden Lösungsmitteln wie η-Hexan, Benzol, Chloroform, Aceton, Äthylacetat oder Methanol besonders geeignet. Geeignete Mischverhähnisse können leicht experimenteil bestimmt werden.

Die Entwicklungsverfahren, die Eluierung und die Bestimmung bzw. Feststellung können auf zufriedenstellende Weise entsprechend bekannten chromatographischen Verfahren durchgeführt werden.

Die Anmelderin hat bei der Anwendung dieses Reinigungsverfahrens gefunden, daß das rohe 5,7-Dien-Derivat, das bei der zweiten Stufe erhalten wird, das 4,6-Dien in einem Gewichtsverhältnis von ungefähr '/2 bis Ua, bezogen auf das gcreinigie 5,7-Dien, enthält. Eine so große Menge an 4,6-Dien kann von dem 5,7-Dien nach dem erfindungsgemäflcii Reinigungsverfahren abgetrennt und im wesentlichen vollständig entfernt werden.

Es wurde gefunden, HaB dieses Reinigungsverfahren

es ermöglicht, das obige freie 5,7-Dien leicht in hoher Reinheil und Ausbeute herzustellen, wie im folgenden näher beschrieben wird. Dieses 5,7-Dien, entweder als solches oder nachdem mindestens eine der Hydroxylgruppen in meinen I-, 3- und 24-Stellungen mit der ^:, gleichen Schutzgruppe wie oben geschützt wurde, kann in ein I.·»· 24-r>i!iydroxyvholecalcifeiOl oder dessen jjeschuizte Derivate durch Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung: und Umlagerung (Isomerisierung) umgewandelt werden. ;;>

Es wird daher angenommen, daß das Reinigungsverfahren bei der dritten Stufe der vorliegenden Erfindung ciaen sehr hohen technischen Wert besitzt.

(6) Vierte Stufe (Synthese von ^.

!«^-Cholecalciferol oder seinen
geschützten Derivaten)

!«^-Cholecalciferol oder seine Derivate, die durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon mit einer Schutzgruppe gebildet werden, und die durch die folgende Formel

OR,

(5)

R₁O

^O

dargestellt werden, worin

Ri, Rj und Rj die gleiche Bedeutung wie bei Formel (3-b) besitzen, können erhalten werden, indem man mindestens ein freies 5.7-Dien, das bei der dritten Stufe gereinigt und abgetrennt wurde, oder die Derivate davon, die durch Schutz von mindestens einer der Hydroxylgruppen in den 1-, 3- und 24-Stcllungen des freien 5,7-Diens, -ΐΐ ausgedrückt durch die folgende Formel

OR,

Υ'^ν'Λ

OR,

i S

R₁O

(3-b)

Ri, R: und Rj gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom ohne Änderung der Struktur der Formel (5) überführbar ist. bedeuten, in einem inerten organischen Lösungsmittel mit ultravioletten Strahlen bestrahlt und dann das entstehende Produkt isomerisiert.

Das freie 5,7-Dien oder seine geschützten Derivate der Formel (3-b) kann 1a,3ß-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dicn oder die geschützten Derivate oder \.x,3ß-24(R)-Ti iliydroxycliolesta-5,7-riien oder die geschützter Deriv .c oder eine Mischung davon in beliebiger· Verhältnissen sein, >ind diese Verbindungen können in den 1ft-24(S) Typ, den I«-24(R)-Typ oder den gemischten Typ von Dihydroxycholecalciferol oder seinen geschützten Derivaten nach der vierten Stufe des erliiidungsgemäßen Verfahrens übet i'iihrt werden.

Wenn Ki, R2 und/oder Rj in den Formeln (3-b) und (5) eine Schutzgruppe bedeuten, kann dies die gleiche .SehMt/j-nipDe sein, wie sie durch R₄', R5' und und/oder Rf.' 'η Formel (2) dargestellt wird. Das gereinigte lA,J//-24-Trihydri)xycholesta-5,7-dien der Formel (3a) kann in sein geschütztes Derivat nach dem gleichen Verfahren überführt werden, wie es oben für die Trennung des Ιλ-24-LJHC in die (S)- und (K)-fcpimeren in Abschi'iiii (3) beschrieben wurde.

Bei der vierten Stufe der vorliegenden Erfindung ist jedoch die Verwendung eines gereinigten freien 5,7-Diens, in dem aile Gruppen Ki, R2 und R₃ der Formel (3-b) Wasserstoffatome bedeuten, vorteilhafter als die Verwendung der geschützten Derivate. Da Ια-24-Dihydroxycholecalcifero! der folgenden Formel

OH

HO

(5-al

OH

ein sog. Analoges der aktiven Formen von Vitamin Di ist, ermöglicht die Verwendung von gereinigtem freiem 5,7-Dien der Formel (3-b) die direkte Herstellung von Analogen von der aktiven Form des Vitamins Dj der Formel (5-a). Wenn andererseits ein geschütztes Derivat der Formel (3-b) verwendet wird, sind zwei zusätzliche Stufen erforderlich, um die Hydroxylgruppen des gereinigten freien 5,7-Diens zu schützen und die Schutzgruppen des entstehenden geschützten Ιλ-24-Dihydroxycholecalciferols abzuspalten. Insbesondere treten bei der Abspaltung der Schutzgruppen eine Teilzersetzung oder eine Degenerierung von Ια-24-Dihydroxycholecalciferol auf.

Auch aus diesem Grund ist das Reinigungsverfahren in der dritten Stufe bei der vorliegenden Erfindung ein sehr vorteilhaftes Reinigungsverfahren.

Das gereinigte 5,7-Dien oder seine geschützten Derivate der Formel (3-b), bevorzugt gereinigtes freies 5,7-Dien, wird in das l«-24-Dihydroxycholecalciferol oder seine geschützten Derivate der Formel (5) oder (5-a) überführt, indem man das freie gereinigte 5,7-Dien oder sein geschütztes Derivat in einem inerten organischen Lösungsmittel zuerst mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Die ultravioletten Strahlen sind solche, von denen bekannt ist, daß sie Wellenlängen von ungefähr 200 bis 360 nm besitzen, und bei der vorliegenden Erfindung sind solche, die Wellenlängen von 260 bis 310 nm besitzen, besonders bevorzug i.

Beispiele von inerten organischen Lösungsmitteln, die

bei dieser Stufe verwendet werckn können, sind Kohlenwasserstoffe und halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol. Broniben/oi, Chlorbenzol, Nitrobcnzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2 Cycloäthan oder 1,2-Dibrom- > äthan; Äther wie Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methyicpüosolv oder Phenylcellosolv; und Alkohole wie Methanol, Äthanol, Propanol, Hexanol oder Cyclohexanol. Eenzol, Toluol, Diäthyläther, Methanol und Äthanol, entweder allein oder als Mischungen, ;o werden bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet. Wird ein solches Lösungsmittel verwendet, so kann die nachfolgende Isomerisierungsreaktion, die noch beschrieben wird, in dem gleichen Lösungsmittel nach der ultravioletten Bestrahlung durchgeführt ι-, werden.

Die geeignete Temperatur für die ultraviolette Bestrahlung beträgt -20 bis 80° C, bevorzugt —10 bis 20⁰C. Bevorzugt wird die Bestrahlung in sauerstofffreier inerter Atmosphäre wie in Argon- oder Stickstoffatmosphäre durchgeführt.

Man nimmt an, daß als Folge der ultravioletten Bestrahlung die 9,10-Stellungen des la,3j9-24-Trihydroxycholesta-5,7-diens oder seines Derivats gespalten werden und das Ια-24-Dihydroxyprecholecalciferol- >-j Derivat als Hauptprodukt gebildet wird.

Die Isomerisierung von Precholecalciferol ergibt das Ια-24-DihydroxyeholecaIcifero! der Formel (5) oder (5-a).

Die Temperatur bei der Isomerisierungsreaktion ist so für das Fortschreiten der Reaktion nicht besonders

w'iCiliig.

Das ΐΛ-24-Dihydroxyprecholecalciferol-Derivat und das Ια-24-Dihydroxycholecalcifcrol-Derivat zeigen einen bestimmten Gleichgewichtswert, der sich entspre- r> chend der Temperatur ändert, und bei niedrigeren Temperaturen erhöhen sich die Anteile an der letzteren Verbindung. Offensichtlich werden jedoch bei niedrigeren Temperaturen die Umwandlungsgeschwindigkeiten zu der letzteren Verbindung langsamer. Die Temperatur au kann daher in Abhängigkeit vo:n Gleichgewichtswert und der Umwandlungsgeschwindigkeit ausgewählt werden. In diesem Sinn ist die Temperatur nicht besonders wichtig für den Fortlauf der Umsetzung selbst. -Ti

Bei der tatsächlichen Versuchsdurchführung werden diese Punkte in Betracht gezogen und Isomerisierungstemperaturen von 10 bis 120° C, bevorzugt von 40 bis 100°C, werden verwendet.

Wünschenswerterweise wird die Isomerisierung ,ii üblicherweise in einem inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt. Wenn das gleiche bevorzugte Lösungsmittel wie oben beschrieben verwendet wird, kann es ebenfalls als Lösungsmittel für die Isomerisierungsreaktion dienen. ',-

Das Ια-24-Dihydroxycholecalciferol oder seine geschützten Derivate der Formel (5-a) oder (5) werden so gebildet

Wenn die Schutzgruppe des geschützten Derivats von la-24-Dihydroxycholecalciferol eine Acy !gruppe e>o ist, kann sie durch Entacylierung abgespalten werden, wobei man ein Verfahren verwendet, das darin besteht, daß man in Alkalilösung eines Alkohols wie Methanol oder Äthanol zersetzt oder indem man reduktiv mit LiAlH₄, beispielsweise in einem Lösungsmittel wie _b5 Äther, zersetzt. Bevorzugt wird die Entacylierung bei einer Temperatur von -10°C bis 50° C durchgeführt

Wenn die Schutzgruppe eine Ätherbindung mit der Hydroxylgruppe bildet, kann ein Teil davon leicht durch Reduktion oder durch Behandlung mit einer Säure oder Alkali entfernt werden.

Das Abspalten der Schntzgruppen wird bevorzugt direkt mit der Reaktionsniischung, die man bei der vierten Stufe erhalt, durchgeführt.

Das so gebildete l«-24-Dihydroxycholecalciferol kann abgetrennt und durch Säulenchromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie, Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie oder Umkristallisation gereinigt werden. Man kann ebenfalls die Chromatographie verwenden, wobei man einen Träger verwendet, der Siliciumdioxid enthält, das daran adsorbiert nichtmetallisches Silber enthält, wie es oben für die Reinigung des rohen 5,7-Diens beschrieben wurde, beispielsweise kann man Silikagel, welches Silbernitrat enthält, verwenden. 1<x-24-Dihydroxycholecalciferol höherer Reinheit kann isoliert werden, indem man zwei oder mehrere dieser Reinigungsverfahren kombiniert.

(7) Pharmakologische Aktivitäten der
erfindungsgemäßen Produkte

Das ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol (la-24-DHCC) der Formel (5-a), das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wie oben beschrieben erhalten wird, insbesondere (i) la-24(S)-Dihydroxycholecalciferol. (ii) 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol oder (iii) eine Mischung der Dihydroxycholecalciferole (i) und (ii) in beliebigen Verhältnissen, ist eine neue Verbindung, die von der Anmelderin erfolgreich synthetisiert und isoliert wurde. Diese Verbindungen sind Vitamin-Di-Analoge mit überlegenen Aktivitäten, und ihre Toxizität ist niedrig.

Es ist bereits bekannt, daß ΐΛ-25-Dihydroxycholecalciferol (Ια-25-DHCC) und la-Hydroxycholecalcifcrol (Ia-HCC) überlegene Aktivitäten als Analoge der aktiven Formen von Vitamin Dj besitzen. Kürzlich wurde gefunden, daß Ia-HCC eine sehr hohe Toxizitäl besitzt und daß seine Nebenwirkungen bei der kontinuierlichen Verabreichung Schwierigkeiten mit sich bringen. Für das aus der DE-OS 22 09 352 bekannte I(X,25-DHCC stehen keine Toxizitätswerte zur Verfügung, jedoch ist aufgrund der Stoffwechselvorgänge davon auszugehen, daß seine Toxizilät analog zu derjenigen von Ia-DHCC ist. Gegenüber diesen bekannten Produkten besitzt das erfindungsgemäße 1a,24-DHCC den bedeutenden Vorteil einer wesentlich geringeren Toxizität, wodurch eine außerordentlich sichere Verabreichung möglich wird.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Toxizität des Ia-HCC zu erniedrigen. la-24,25-Trihydroxycholecalciferol (1a-24,25-THCC) scheint, wie in vivo festgestellt wurde, eine recht selektive, obgleich nicht so starke aktivierende Wirkung auf den intestinalen Calciumtransport zu besitzen. Wenn die epimere la-24-DHCC-Mischung, la-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC (diese werden allgemein als 1a-24-DHCC bezeichnet, in vivo weiter metabolisiert werden, wird das Ια-24-DHCC vermutlich in das la-24,25-THCC überführt Dies läßt den Schluß zu, daß die Wirkung der epimeren l«-24-DHCC-Mischung, 1a-24(R)-DHCC und 1a-24(S)-DHCC selektiv sein kann. Das 1a-24-DHCC ist eine neue Verbindung, die in vivo noch nicht festgestellt wurde, und man nimmt an, daß sie eine neue Aktivität aufweist

Die Anmelderin hat Vergleichsversuche der Aktivitäten der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen mit

Ιλ-HCC durchgeführt und gefunden, daß die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen, wie es aus den folgenden Beispielen hervorgeht, mindestens die gleiche Wirkung wie Ιλ-HCC beim intestinalen Calciumtransport besitzen, daß ihre Wirkung auf die Knochenresorp- ■-, tion geringer ist als ungefähr ein Drittel der Wirkung von Ιλ-HCC und daß ihre LD-,o-Werte ungefähr ein Zehntel des Werts von Ιλ-HCC betragen. Es wurde insbesondere festgestellt, daß 1ä-24(S)-DHCC eine etwas schwächere Wirkung auf die Aktivierung des m intestinalen Calciumtransports besitzt als 1a-24(R)-DHCC, daß es aber fast keine Knochenresorption zeigt.

Dementsprechend kann das erfindungsgemäße Ιλ-24-DHCC als einzigartige Medizin mit verminderten Nebenwirkungen und hoher Sicherheit verwendet werden, verglichen mit bekannten Analogen von aktiven Formen des Vitamins Di, wenn die Verbindungen beispielsweise bei Krankheiten verabreicht werden, die durch abnormale Metabolisierung von Calcium induziert werden. Pharmakologische Versuche, die von der Anmelderin durchgeführt wurden, haben eindeutig gezeigt, daß verschiedene optimale pharmazeutische Präparationen hergestellt werden können, entsprechend unterschiedlichen Krankheitszuständen.

Bei der Regulierung des Calciummetabolismus von Warmblütern kann die wirksame Verabreichungsmenge zwischen 0,01 bis 10 μg/Tag/kg Körpergewicht des Warmblüters liegen.

Pharmakologische Versuche ergaben, daß bevorzugt geeignete Dosen der obigen neuen aktivierten Vitamin- jo Dj-Derivate bei der klinischen Anwendung ungefähr 0,04 bis 0,4 μg (96,2 bis 962 ρ Mol)/kg Körpergewicht betragen.

Man nimmt an, daß die Ιλ-24-DHCC-Verbindungen der Formel (5-a) auf verschiedenen klinischen und j-, Veterinären Gebieten verwendet werden können und daß sie für die Behandlung des abnormalen Metabolismus von Calcium und Phosphor, verursacht durch Leberversagen, Nieren versagen. Versagen des gastrointestinalen Trakts und bei parathyroidem Versagen und verwandten Knochenkrankheiten verwendet werden können wie Vitamin-D-abhängige Rachitis, Nierenosteodystrophie, Hypoparathyridismus, Osteoporose, Knochenerweichung, Pagetsche Krankheit, Malabsorptionssyndrom, Hypocalcaemie, die durch Leberzirrhose 4-, induziert v.ird, Hypocalcaemie, die durch Steatorrhoe induziert wird, Hypocalcaemie, die durch Vitamin-D-resistente Rachitis erzeugt wird. Es wird angenommen, daß diese Verbindungen sicherere Arzneimittel sind als die bekannten Ιλ-HCC und Ιλ-25-DHCC. Es ist -,» ebenfalls möglich, ein Mittel zu verwenden, das mindestens eine der folgenden Verbindungen 1«-24(R)-DHCC und 1«-24(S)-DHCC zusammen mit anderen Mitteln enthält, die den Calciummetabolismus regulieren. Beispielsweise können die Verbindungen bei der r> Behandlung von Pagetscher Krankheit zusammen mit Calcitonin verwendet werden.

Geeignete Verabreichungsrouten sind orale, buccale und parenterale (intramuskuläre, subkutane, intravenöse und rektale) Verabreichung. Dosisformen sind _bn beispielsweise komprimierte Tabletten, beschichtete Tabletten, harte oder weiche, elastische Gelatinekapseln, Äthylalkohollösungen, Öllösungen und wäßrige Suspensionen.

Das Lösungsmittel für die Öllösungen kann ein _b5 pflanzliches öl wie Mais-, Baumwollsamen-, Cocosnuß-, Mandel- oder Erdnußöl sein, ein Fischleberöl oder ein öliger Ester wie Polysorbate 80.

Für die rektale Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen zu pharmazeutischen Mittein verarbeitet werden, die einen Suppositorien-Grundstoff wie Kakaoöl oder andere Triglyceride enthalten. Um die Lagerbeständigkeit zu verlängern, enthalten die Mittel vorteilhafterweise ein Antioxydans wie Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hydrochinon.

Futtermittel für Haustiere können hergestellt werden, die das erfindungsgemäße ΙίΧ-24-DHCC in einer Menge enthalten, so daß keine toxischen Wirkungen auftreten, um die Hypocalcaemie von Kühen zum Zeitpunkt des Kalbens oder nach dem Zeitpunkt des Kalbens zu verhindern oder um die Hypocalcaemie von Haustieren zu verhindern, die keine Hypocalcaemie-Vorgeschichte aufweisen. Werden diese Verbindungen Geflügel während der Legezcii verabreicht, so kann das Legen von ν tichschaligen Eiern vermieden werden. Dies ist ein weiteres Merkmal des erfindungsgemäßen h\-24-DHCC.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Die Untersuchungsverfahren, die in diesen Beispielen verwendet werden, um die Eigenschaften der Endprodukte näher zu bestimmen, sind die folgenden.

Sofern nicht anders angegeben, werden die NMR-Spektren mit einem Varian-EM 360- oder IEOL-PS/ PFT-100-(Nippon Electronics Co., I.td.JGerät in Deuterochloroform (CDCIj) Ufi;cr Verwendung von Tetramethylsilan als interner Γ ■.: ndard bestimmt.

Die Massenspektrpr md die Hochauflösungsmassenspektren werden unter Verwendung eines Shimadzu-LKB-9000-Geräts (Warenzeichen für ein Produkt von Shimazu Seisakusho Co.. Ltd.) bestimmt.

Die UV-Spektren werden mit einem Hitachi-EPS-3T-Gerät (Warenzeichen für ein Produkt der Hitachi Ltd.) unter Verwendung einer Äthanollösung gemessen.

Die Schmelzpunkte werden mit einem Mikroskop mit Heiztisch bestimmt, und die erhaltenen Werte werden nicht korrigiert.

Die absolute Konfiguration von h\-24-Dihydroxycholesterin wird folgendermaßen bestimmt:

Eine epimere Mischung aus 24,24-Epoxycholesterin-3-benzoat. d. h. eine Mischung aus

B,O

B,0

worin

B, eine Benzoylgruppe bedeutet, wird unter Verwenüung von Silikagel als Carrier bzw. Träger Chromatographien, um die beiden Epimercn /u trennen und zu gewinnen. Beide Epimere werden ni't Methanol behandelt, um ein 24-OH-Derivat und ein 25-OCHi-Derivat /u hüden. LVn <f'^ absolute Konfiguration der beiden Epimeren zu bestimmen, wi'ti das modifizierte Horean-VerfahiL-n verwendet, welches in Tetrahedron Letter 1, 15, 19/5. beschrieben wird. Durch Reduktion der beiden üpinu-ren, tieren absolute Konfiguration so bestimmt wurde mit einem AlClj-LiAlHh-lSystem, wird ein 24(R)-Hvdroxyderivat aus dem 24(R),25-Epoxyderivat und ein 2^/!(S/Hydro,xyderivat aus dem 24(S),25-Epoxiderivat erhalten. Da es bekannt ist, daß das letztere S DerKüt polarer ist ais das ersiere R-Derivat, wird ,!P.genommen, daß diese Tatsache ebenfalls für das Ια-24-DihydiOxyc'.ioluiicrin gilt. Dieses lA-24-Dihydroxycholesterin wird in das Tribenzoat- oder Dibenzoat-Derivai überiuhrt, welches dann durch eine Silikagelsäule Chromatographien wird. Sorr.ii werden ein stärker polares Epimer in ein 1ä-24(S)-Derivat und ein weniger polares Epimer :n ein 1<\-24(R)-Deriv;i überführt.

Wenn in der vorliegenden Anmeldung kein besonderer Hinweis auf ein R-Derivat oder auf ein S-Derivat erfolgt, beispielsweise wenn nur das Ια-24-DHCC erwähnt wird, so bedeutet dies eine äquimolare Mischung aus U-24(R)-DHCCund 1«-24(S)-DHCC.

Beispiel 1 (A) Synthese des Ausgangsmaterials

lÄ,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on wird nach den folgenden drei Stufen (1) bis (3) hergestellt.

(1) Synthese von 24-Ketocholesterin aus Fucosterin

Fucosterin (4,1g) wird in 100 ml Methylenchlorid gelöst und unter Kühlen der Lösung mit Trockeneis-Aceton auf ungefähr — 20⁰C wird das Fucosterin während 30 Minuten mit Ozon in einer Bildungsgeschwindigkeit von 0,86 g/h und in einer Konzentration von 17,2 g/m³ (O2) oxydiert. Nach der Umsetzung werden 8 g Zinkpulver und 200 ml Eisessig zugegeben und das entstehende Ozonid wird 24 Stunden reduktiv bei Zimmertemperatur zersetzt. Das entstehende Zinkacetat wird dann durch Filtration abgetrennt und mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumcarbonat gewaschen. Die abgetrennte Methylenchloridphase wird gut mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Methylenchlorid wird bei vermindertem Druck abdestilliert und die entstehenden, farblosen Kristalle werden unter Verwendung von Silikagel als Trägerstoff säulenchromatographiert (eluiert mit Berizol-n-Hexan-Lösungsmittelmischung), und man erhall 2,8 g 24-Ketocholesterin in einer Ausbeute von 70,3%.

(2) Synthese von 24-Ketocholesta-l,4,6-trien-3-on aus 24-Ketocholesterin

4,0 g 24-Ketocholesterin und 7,0 g ^-Dichlor-S.ö-dicyanobenzochinon werden in 140 ml Dioxan gelöst, und die Lösung wird bei Rückflußtemperatur des Dioxans 27 Stunden gerührt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung auf Zimmertemperatur abgekühlt. Das entstehende Hydrochinonderivat wird durch Filtration abgetrennt und mit 30 ml Dioxan gewaschen. Das FiUrat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und das Dioxan wird bei vermindertem Druck abdestillien wobei man eine schwarzbraune, ölige Verbindung erhält.

■> Die öiige Verbindung wird durch Säulenchromalographie übjretrcnnl und gereinigt, wozu rnun Aluinini umoxid als Trägermateria! verwendet (us wird mit einer Lösungsmiitelmischung aus Methylenchlorid und Aceton ciuiert), und man erhä't 2,76 g 24-Ketocholesta-

i" 1.4,6trien-3-on in Form von Kristallen. Bei der Analyse des Produktes erhält man die folgenden Ergebnisse:

NMR-Spektrum:

0,86(3 H,S.C-18-CH )

1,20(3 H₁S₁C-!9-CHi),
^r> 1.15(6 H, D. J = 10_Hz.C-26,27-CHi),

5,95—6,10(3 H,M,C—4,6,7 — H), 6.29(1 H.dD.J = 11.15Hz,C-2-H).

7,10(1 H, j - M HaC-I-H); ,₍₎ Molekulargewicht (durch Gasmassenspektrum):

394 (M ^).

(3) Synthese von 1a,2<x-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on aus 24-Ketocholesta-1,4.6-trien-3-on

2") 3,53 g 24-Ketocholesta-1,4,6-trien-3-on werden in einer Mischung aus 100 ml Methanol, 20 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Dioxan gelöst und 1.6 ml einer 5gew.-°/oigen Methanollösung von Natriumhydroxid und 5 ml 30%iges wäßriges Wasserstoffperoxid werden

j(i zugegeben. Die Umsetzung wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Umsetzung wird eine geringe Menge Essigsäure zugegeben, um die Lösung auf einen pH-Wert von 7 zu neutralisieren. Die Reaktionsmischung wird dann

j", extrahiert, indem man Wasser und Äther zufügt. Die Ätherphase wird gut mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wird bei vermindertem Druck abdestilliert, man erhält 4,04 g eines hellgelben Feststoffs. Das feste Produkt wird unter

4(i Verwendung von Silikagel säulenchromatographiert (man eluiert mit einer Lösungsmittelmischung aus Benzo! und Äther), und man erhält 2,52 g lA,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on, welches die folgenden Eigenschaften besitzt:

⁴' Fp.: 150bis 151.5°C
UV-Spektrum:

λί;,'Γ"'= 291 um

Hochresolutionsmassenspektrum: '"· gefunden = 410.2793

berechnet (M ⁺ ) = 410,2821 (C₂THj₈Oi)

NMR-Spektrum:

0,80(3 H.S,C-18-Hs), 1,15(3 H,S,C-19-Hs), 3,43(1 H,dD,J =4 Hz,] - 1.5 Hz.C-2-H), 3,60(1 H, D, J =4 HzX-I-H), 5,68(1 H, D,] = l,5Hz,C-4-H), 6,10(2 H,S,C-6.C-7-Hs).

(B) Synthese des erfindungsgemäßen Ια-24-Dihydroxycholesterins (erste Stufe)

Flüssiger Ammoniak (10 ml), der mit metallischem Natrium getrocknet wurde, wird in einen Dreihalskolben, der mit einem Tropftrichter und einem Trockeneiskühler ausgerüstet ist, eingeschlossen, wobei der Kolben mit einem Kühlmedium gekühlt wird, welches Aceton und Trockeneis enthält. Metallisches Lithium (150 mg) wird zu dem flüssigen Ammoniak gegeben, und man

rührt während 10 Minuten. Die Mischung wird in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst und 100 mg la,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on werden tropfenweise im Verlaul von 10 Minuten zugefügt.

Nach der Zugabe wird der Kolben von dem Kühlmedium abgetrennt und 20 Minuten unter Rückfluß des Ammoniaks behandelt. Dann wird der Kolben wieder in das Kühlmedium eingetaucht und 1,5 g vollständig trockenes Ammoniumchloridpulver werden langsam im Verlauf von 2 Stunden zugegeben. Der ι ο Kolben wird aus dem Kühlmedium entnommen und die Umsetzung wird unter Rühren weitergeführt.

Man hört mit dem Rühren auf, wenn die blaue Farbe der Lösung vollständig verschwindet. Der Kühler wird aus dem Kolben entnommen und Stickstoffgas wird eingeleitet, um das Ammoniak zu entfernen.

Äthylacetat (60 ml) und 60 ml 1 n-Chlorwasserstoffsäure werden zu dem Rückstand zugegeben, um ihn der Verteilungsextraktion zu unterwerfen. Die abgekühlte Athylacetatphase wird gut mit Wasser gewaschen und getrocknet und anschließend wird das Äthylacetat bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in 3 ml Äthylacetat gewaschen und durch eine Säule Chromatographien, die Silikagel als Trägermaterial enthält, wobei man ein Eluierungsmittel verwendet, das eine Mischung aus Benzol und Aceton enthält. Man erhält 61 mg gereinigtes Produkt mit den folgenden Eigenschaften:

NMR-Spektrum (in C₅D₅N), δ (ppm):

0,70(3 H,S, 18-CHj),0,99(3 H₁S, 19-CH₁),
3,28(4 H, M, 24-H und Hydroxy H),
3,82(1 H,M,10-H),4,OO(1 H,M,3«-H),
5,50(1 H, M,6-H)

Massenspektrum (vergl. F i g. 1): J¹»

418 (M*), 400,382

Hochresolutionsmassenspektrum:
Gefunden: 418,3428
Berechnet M +(C₂₇H^Oj) = 418,3449

40

Aus den obigen Eigenschaften kann das entstehende Produkt als Ια-24-Dihydroxycholesterin identifiziert werden.

Beispiel 2

Synthese von ΐΛ-24-Dihydroxycholesterin
(erste Stufe)

Flüssiges Ammoniak (15 ml), welches mit metallischem Natrium getrocknet wird, wird in einen ^r>o Dreihalskolben eingeschlossen, der mit einem Tropf trichter und einem Trockeneiskühler ausgerüstet ist, während man den Kolben mit einem Kühlmedium kühlt, das Aceton und Trockeneis enthält. Dann werden 400 mg metallisches Natrium zugegeben und man rührt 10 Minuten. Die Mischung wird drnn in 18 ml Tetrahydrofuran gelöst und 100 mg l«,2«-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on werden tropfenweise im Verlauf von 10 Minuten zugefügt.

Nach der Zugabe werden 1,8 g Ammoniumchlorid- bo pulver im Verlauf von 1 Stunde auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 zugegeben. Die Reaktionsmischung wird auf gleich; Weise wie in Beispiel 1 behandelt und 69 mg (Ausbeute 68%) eines Produktes, welches das gleiche NMR-Spektrum, Massenspektrum und Hochresolu- h^r> tionsmassenspektrum wie in Beispiel 1 zeigt, werden erhalten. Dieses Produkt wird als l«,2rx-24-Dihydroxycholesterin identifiziert.

Beispiel 3

(A) Synthese von
ΐΛ-24-Dihydroxycholesterin-tribenzoat

1,25 g ΐΛ-24-Dihydroxycholesterin werden mit 1,55 g Benzoylchlorid und 20 ml Pyridin vermischt und dann bei 40⁰C während eines Tages umgesetzt. Wasser (5 ml] wird zu der Reaktionsmischung gegeben und dann wird diese mit 50 ml Diäthyläther extrahiert Die Ätherphase wird mit Säure und dann mit Alkali gewaschen getrocknet und eingedampft, um den Äther zi entfernen; man erhält rohes la,3/?-24-Tribenzoyloxy cholest-5-en.

(B)Trennung des 24(R)-Derivats und 24(S)-Derivats
von 1 ix3^-24-Tribenzoyloxycholest-5-en

Eine n-Hexan-Lösung aus 1,58 g rohem 1 ac,3/?-24-Tri benzoyloxycholest-5-en wird durch eine Säule chroma tographiert, die 100 g Silikagel als Carrier enthält, um e: in Fraktionen mit jeweils einem Volumen von 50 ml zi teilen. Die Reinheit jeder dieser Fraktionen wird durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie bestimmt unc die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt unc die Lösungsmittel werden abgedampft. Zwei Epimer£ mit den folgenden r VIR-Spektren werden erhalten. Da; weniger polare Epimer (500 mg), das zu einem früher Zeitpunkt eluiert wird, ist das 24(R)-Derivat, und da: stärker polare Epimer (490 mg), das zu einem späterer Zeitpunkt gegen Ende eluiert wird, ist das 24(S)-Derivat.

NMR-Spektren von 1«,3j3-24(R)-Tribenzoyloxycholest

0,65(3 H,S,C-18), 0,92(3 H,S,C-21),
l,01(6H,b,S,C-25,26),l,20(3H,S,C-19),
5,00(1 H,M,C-24).5,20(l H,M,C-3),
5,44(1 H, M, C-I), 5,70(1 H,M,C-6),
7,5 (9 H, M, Benzoyl), 8.1 (6 H, M, Benzoyl)

NMR-Spektrum von 1<x,3/?-24(S)-Tribenzoyloxycholest

0,63(3 H, S,C-18)

Die anderen Spektrumswerte sind die gleichen wit fürdas24(R)-Derivat.

Beispiel 4

(A) Synthese von ΐΛ-24-Dihydroxycholesterindibenzoat

2,5 g ΐΛ-24-Dihydroxycholesterin werden mit 2,101 Benzoylchlorid und 40 ml Pyridin vermischt und di< Mischung wird I Tag bei 20°C stehengelassen.

Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie ir Beispiel 3(A) behandelt, wobei man rohes la-Hydroxy 3/?-24-dibenzoyloxycholest-5-en erhält.

(B) Abtrennung des 24(R)-Derivats und des

24(S)-Derivats von 1<x-Hydroxy-3|3-24-dibenzoyl-

oxycholest-5-en

2,1 g rohes 1«-Hydroxy-3/?-24-dibenzoyloxycholest 5-en werden durch eine Säule Chromatographien, dii 30 g Silikagel enthält, wobei man ein Eluierungslösungs mittel verwendet, das eine 200 :1-Mischung aus Benzo und Äthylacetat enthält, und in Fraktionen von jeweil 50 ml teilt. )ede der Fraktionen wird der Hochdruck Flüssigkeitschromatographie unterworfen, um ihn Reinheit zu bestimmen. Die entsprechenden Fraktioner werden vereinigt und das Lösungsmittel wird abdestil Ik-rl, wobei zwei Epimere mit den folgende! NMR Spektrumswerten erhalten werden.

9Ö9 ÖÜ9/2ÖÖ

10

15

Das weniger polare Epimer (500 mg, Fp. 168 bis 169° C) ist das 24(R)-Derivat und das stärker polare Epimer (600 mg, Fp. 139,5 bis 140,5° C) ist das 24(S)-DerivaL

NMR-Spektrum von li!i-Hydroxy-3^-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en:

0,67(3H,S,C-18),0,96(6H,b,S,C-19,21)

1,00(6 H,D,J = 6Hz,C-25,26),

3,96(1 H, M, C-I),

5,06(1 H,M,C-24),536(1 H,M,C-3),

5,71 (1 H, M,C-6),7,52(6 H, M, Benzoyl),

8,12(4 H, M₁ Benzoyl)

NMR-Spektrum von la-Hydroxy-30-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en:

0,70(3 H, S, C-18)

Die anderen Spektrumswerte sind gleich wie bei dem 24(S)-Derivat.

B e i s ρ i e 1 5

(A) Synthese von lix,3/?-24-Triacetoxycholest-5-en

300 mg Ια-24-Dihydroxycholesterin werden mit 40 ml Essigsäureanhydrid und 125 ml Pyridin 3 Stunden bei 95⁰C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(A) behandelt, wobei man rohes l«,3/i-24-Triacetoxycholest-5-en erhält. Das rohe Produkt wird durch eine Säule Chromatographien, die Silikagel als Carrier enthält, wobei man ein Eluierungslösungsmittel verwendet, das Benzol enthält, und man jo erhält 325 mg gereinigtes la,3)3-24-Triacetoxycholest-5-en als öliges, gereinigtes Produkt mit dem folgenden NMR-Spektrum und Massenspektrum:

NMR-Spektrum:

0,67(3 H,S,C-18),2,02(9 H,S,3-Acetyl), ^r>

4,8(2 H, M, ix- und 24- H₂), 5,05(1 H, M, \ß- H),

5,65(1 H, M, 6-H)
Massenspektrum:

484 (M + - CH 3COOH), 424,364

(B) Synthese von l«,3/?-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

300 mg l«,30-24-Triacetoxycholest-5-en werden mit 90 mg l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin in 4,5 ml n-Hexan 15 Minuten unter Rückflußbedingungen umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und das entstehende 5,5-Dimethy!hydantoin und das überschüssige l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert, man erhält 349 mg einer gelben, öligen Verbindung Xylol (2,5 ml) wird zu dieser Substanz zugegeben, wobei eine Lösung gebildet wird. Die entstehende I ösung wird tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung, die bei 165° C gehalten wird, aus 0,85 ml s-Collidin in 1,9 ml Xylol zugegeben und die Umsetzung wird dann weitere 10 Minuten durchgeführt. Nach der Umsetzung wird das Hydrobromid des s-Collidins durch Filtration abgetrennt und das s-Collidin und Xylol werden bei vermindertem Druck w) abgedampft. Der Rückstand wird in Diäthyläther gelöst. Die Ätherphase wird mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure und einer 5%igen wäßrigen Lösung aus Natriumbicarbonat und wiederholt mit Wasser gewaschen. Sie wird dann mit Aktivkohle behandelt und der Äther wird bei b^r> vermindertem Druck abgedampft, wobei man 310 mg einer gelben, öligen Verbindung erhält. Diese ölige Verbindung wird sorgfältig zweimal durch Säulenchromatographie (Eluierung mit Benzol) unter Verwendung von Kieselsäure Chromatographien, man erhält 69 mg (Ausbeute 23%) eines nichtkristallinen gereinigten Produktes. Aus den folgenden Spektrumswerten wird dieses Produkt als 1«,3^-Triacetoxycholesta-5,7-dien identifiziert.

UV-SpektrunU™¹""' (nm):
262,271,282,294

NMR-Spektrum:

2,02 und 2,04(9 H₁S₁CHjCOO-),

4,75(2 H,b,3<x- und 24-H),

5,01(1 H,b,10-H),

5,35(1 H₁D₁J = 5,5 Hz,6-oder 7-H),

5,69(1 H₁DJ = 5,5 Hz₁6-oder 7-H)

Massenspektrum:

542 (M+), 514,482,422,362,249,204

Beispiel 6

Synthese von l«,3/?-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien
(zweite Stufe)

150 mg l<x,3/?-24-Triacetoyycholest-5-en werden mit 45 mg l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin in 3 ml n-Hexan 15 Minuten bei Rückflußbedingungen umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und die entstehenden Kristalle werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert, wobei man eine gelbe, ölige Verbindung erhält. Zu dieser Verbindung gibt man 1,3 ml Xylol. Die entstehende Lösung wird tropfenweise im Verlauf von ungefähr 15 Minuten zu einer Lösung aus 0,25 ml Trimethylphosphit in 4 ml Xylol unter Rückflußbedingungen zugefügt und die Umsetzung wird weitere 90 Minuten weitergeführt. Die Reaktionsmischung wird dann bei einer Temperatur unter 75"C konzentriert, und man erhält 148 mg ölige Verbindung. Diese Verbindung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(B) behandelt. Das Endprodukt zeigt die gleichen UV-, Massen- und NMR-Spektrumswerte wie das loc,3j3-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien, das in Beispiel 5(B) erhalten wurde.

Beispiel 7

Synthese von l(x3j3-24-Tribenzoyloxy-cholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

200 mg \oi,3ß-24-TrJbCnZOyIoXy-ChOIeSt-S-Cn, das auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(A) beschrieben hergestellt wurde, werden 15 Minuten unter Rückfluß zusammen mit 55 mg N-Bromsuccinimid in 15 ml Tetrachlorkohlenstoff erwärmt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und die entstehenden Kristalle werden durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird konzentriert und 5 ml Xylol werden zu dem Rückstand zugegeben, wobei eine Lösung gebildet wird.

Die entstehende Lösung wird tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung aus 0,2 ml Trimethylphosphit in 4 ml Xylol unter Rückfluß gegeben, und die Mischung wird weitere 90 Minuten am Rückfluß erwärmt

Die Reaktionsmischung wird dann bei einer Temperatur unter 75°C konzentriert und der Rückstand wird sorgfältig zweimal durch eine Säule Chromatographien, die Kieselsäure enthält, wobei man Benzol als Eluierungsmittel verwendet. Man erhält 50 mg (Ausbeute 25%) eines gereinigten, nichtkristallinen Produktes.

IO

15

Dieses Produkt zeigt die folgenden Spektren und wird als 1«3^-24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien identifiziert

UV-Spektrum, λ J,'^""¹ (nra):
231,262,271,282,294

NMR-Spektrum:

4,95(2 H,b, 3α-Η und 24-H),
532(2 H.b, Ij3-Hund6- oder7-H),
5,72(1 H₁D,] = 6 Hz, 6-oder 7-H),
7,49 und 8,02 (15 H, M, aromatischer H)

Massenspektrum:

728(M ⁺), 638,620,606,484,362

Beispiel 8

Synthese von l«,3j?-24(S)-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

l«-Hydroxy-3jS-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird mit UAIH4 in trockenem Diäthyläther reduziert, wobei la,3/?-24(S)-Trihydroxycholest-5-en gebildet wird. Dieses Produkt (180 mg) wird dann mit 24 ml Essigsäureanhydrid und 75 ml Pyridin 3,5 Stunden bei 95°C umgesetzt. Das Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(A) behandelt und durch eine Säule Chromatographien, die Kieselgel als Trägermaterial enthält, wobei man 195 mg l«,3/?-24(S)-Triacetoxycholest-5-en erhält.

150 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise so wie in Beispiel 5 gereinigt, und man erhält 43,5 mg (Ausbeule 29%) eines gereinigten Produktes mit den folgenden Spektrumswerten. Dieses gereinigte Produkt wird als l<x,3^-24(S)-Triacetoxycholesta-5,7-dien identifiziert. Si

UV-Spektrum, λ ί,','Γ"' (nm):
262,271,282,294

NMR-Spektrum:

2,02und 2,04(9 H.S₁CHjCOO-), _w

4,75(2H,b,c-3-,C-24-H),

5,01(1 H,b,c-1-H),

5,35(1 H₁D₁J = 5-6Hz₁C-O-OdCrC-7-H),

5,69(1 H₁D₁J = 5-6Hz,C-6-oderC-7-H)

Massenspektrum:

542 (M +), 514,482,422,362,249,209

4")

Beispiel 9

Synthese von 1«,30-24(S)-Tribenzoyloxy-cholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

100 mg la,3j3-24(S)-Tribenzoyloxy-cholest-5-en, das auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(B) erhalten wurde, werden 15 Minuten unter Rückfluß zusammen mit 23 mg l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin in 16 ml Tetrachlorkohlenstoff erwärmt. Die Reaktionsmischung wird gekühlt und die entstehenden Kristalle werden durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird konzentriert und 2,5 ml Xylol werden zu dem Rückstand gegeben. Die Lösung wird tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung unter Rückfluß aus 0,3 ml s-Collidin in 2 ml Xylol gegeben und dann wird weitere 10 Minuten am Rückfluß erwärmt.

Nach der Umsetzung wird das Hydrobromid von s-Collidin durch Filtration entfernt und s-Collidin und Xylol werden bei vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird in Diäthyläther gelöst. Die Ätherphase wird mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure und einer 5%igen

>0 wäßrigen Lösung aus Natriumbicarbonat und dann wiederholt mit Wasser gewaschen. Die Ätherphase wird getrocknet und der Äther wird bei vermindertem Druck verdampft; man erhält eine gelbe, öüge Verbindung.

Die ölige Verbindung wird sorgfältig zweimal durch eine Säule Chromatographien, die Kieselsäure enthält, wobei rrxan Benzol als Eluierungslösung verwendet; man erhält 28 mg (Ausbeute 28%) eines gereinigten, nichtkristallinen Produktes. Dieses Produkt besitzt die folgenden Spektren und wird als la,3/J-24(S)-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien identifiziert.

UV-Spektrum λ™-"¹ (nm):
231,262,271,282,294

NMR-Spektrum:

4,95(2 H,b,C-3undC-24-Hs),
5,32(2 H,b,C-1 und C-6oderC-7-H),
5,72(1 H₁D₁J = 6Hz,C-6oderC-7-H),
7,49 und 8,02 (15 H, M, aromat. Hs)

Massenspektrum:

728(M⁺), 638,620,606,484,362

Beispiel 10

Synthese von lix-Acetoxy-3j3-24(S)-Dibenzoyloxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

1 <x-Hydroxy-3j3-24(S)-dibenzoyloxycholesl-3-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird mit Essigsäureanhydrid und Pyridin auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(A) umgesetzt. Das Reakiionsprodukt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 5 beschrieben gereinigt; man erhält 1«-Acetoxy-3j3-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en.

462 mg la-Acetoxy-3^-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en werden mit 188,6 mg N-Bromsuccinimid in 16 ml Tetrachlorkohlenstoff 30 Minuten unter Rückfluß umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt und die erhaltenen Kristalle werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck konzentriert, wobei man eine gelbe, ölige Verbindung erhält. Zu der Verbindung gibt man 6,8 ml Xylol, um eine Lösung herzustellen. Die Lösung wire! tropfenweise zu einer Lösung aus 0,5 ml Trimethylphosphit in 8 ml Xylol unter Rückfluß gegeben und die Umsetzung wird weitere 90 Minuten weitergeführt. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung bei vermindertem Druck konzentriert, und man erhält ein öliges Produkt. Dieses Produkt zeigt die folgenden Spektren und es wird als

la-Acetoxy-3^-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien
identifiziert.

UV-Spektrum, λ i,'.:¹·'""¹ (nm):
231,262,271,282,294

NMR-Spektrum:

2,04(3H₁S₁CH₃COO-),
4,7-5,4(3 H, M, 1/9,3«— und 24-H₃),
5,33(1 H₁D₁J = 6 Hz₁6-oder 7-H),
5,70(1 H, D, J = 6 Hz, 6- oder 7-H),
7,4-8,2 (10 H, M, aromat. Hs)

Beispiel 11

Synthese von 1«,3/?-24(R)-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

1<x-Hydroxy-3/?-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 8 unterworfen. Ein gereinigtes Produkt mit den

gleichen UV-, NMR- und Massenspektrenwerten wie das entsprechende S-Epimer, welches in Beispiel 8 erhalten wurde, wird in einer Ausbeute von 28% gebildet Dieses Produkt wird als 1a,?-0-24(R)-Triacetoxycholesta-5,7-dien identifiziert.

Beispiel M

Synthese von l«,3/?-24(R)-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

la,3p-24(R)-Tribenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(B) beschrieben, wird dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 beschrieben unterworfen.

Ein gereinigtes Produkt mit den gleichen UV-, NMR- und Massenspektren wie das entsprechende S-Epimer, welches man in Beispiel 9 erhält, wird in einer Ausbeute von 27% erhalten. Dieses Produkt wird als 1<x,3j?-24(R)-Tribenzoyloxycholesta-5-dien identifiziert.

Beispiel 13

Synthese von la-Acetoxy-3j3-24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien (zweite Stufe)

1a-Hydroxy-3/?-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird mit dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 10 beschrieben unterworfen.

Ein gereinigtes Produkt mit den gleichen UV- und Massenspektren wie das entsprechende S-Epimer. welches man in Beispiel 10 erhält, wird erhalten. Dieses Produkt wird als l«-Acetoxy-3j3-24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien identifiziert.

Beispiel 14

(A) Synthese von 1a,3/3-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien aus lÄ,3^-24-Triacetoxycholest-5-en

Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 5(B) wird 1«,3/)-24-Triacetoxycholest-5-en mit l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin und s-Collidin in η-Hexan umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird mit Säure und Alkali in Äther gewaschen und mil Aktivkohle behandelt; man erhält eine rohe Reaktionsmischung, die 1«,3j3-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien enthält.

(B) Hydrolyse von 1«,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien

Das bei (A) oben erhaltene rohe ProduKt wird in einer 5%igen Methanollösung von Kaliumhydroxid hydrolisiert, wobei man eine rohe Realaionsmischung erhält, die 1«,3j?-24-TrihydiOxycholesta-5,7-dien enthält.

(C) Bestimmung der Reinheit von
1 a,3j?-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

Das UV-Spektrum von 100% reinem l«,3ß-24-Trihydroxycholesta-5.7-dien beträgt λ*'!','""¹ = 282 nm und das UV-Spektrum von 100% reinem 1a,3j9-24-Trihydroxy-4,6-dien beträgt λϊί,',!','""'¹ = 240 nm. Eigene Untersuchungen zeigen, daß das Mischverhältnis zwischen diesen beiden Verbindungen bestimmt werden kann, indem man ihre A_max-Werte vergleicht.

Das Verhältnis des 5,7-Dien-Derivats und des 4,6-Dien-Derivats in der oben bei (B) erhaltenen rohen Reaktionsmischung wird nach diesem Verfahren bestimmt, und man stellt fest, daß das Molverhältnis von l«,3^-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien zu l<x,3/3-24-Trihydroxyeholesta-4,6-dien ungefähr 3 : 1 beträgt.

(D) Abtrennung von la,3^-24-Trihydroxycholesta-

5,7-dien und l«,3/?-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien

(dritte Stufe)

(D-I) Abtrennung durch präparative
^Ί Dünnschichtchromatographie

Eine im Handel erhältliche Platte für präparative Dünnschichtchromatographie (Silikagel, ein Produkt der Merck Company, 20 cm χ 20 cm χ 0,5 mm) wird in eine Lösung aus Silberniirat in Acetonitril eingetaucht, um die Platte in einer Menge von ungefähr 1,5 Gew.-% Silbernitrat zu imprägnieren, und dann wird die Platte bei 70⁰C 2 Stunden in der Wärme behandelt. Die so erhaltene chromatographische Platte wird für die anschließenden Trennstufen verwendet.

Die rohe Reaktionsmischung (30 mg), die man bei (B) oben erhält, wird auf der Platte adsorbiert und längs ungefähr 20 cm mit einer Lösungsmittelmischung aus 6% Methanol und Chloroform entwickelt. Nach dem Trocknen an Luft der Platte wird die Reaktionsmischung erneut mit dem gleichen Lösungsmittel entwikkelt. Es treten zwei Banden mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,23 und ungefähr 0,33 auf. Diese Fraktionen werden abgekratzt und mit Äthylacetat aus dem Silikagel extrahiert. Man erhält 17,1 mg (57%) einer farblosen, festen Verbindung (Rf = 0,23) und 6.0 mg (20%) einer farblosen, festen Verbindung (Rf = 0,33).

Ein Teil der Platte wird unter Verwendung von Schwefelsäure angefärbt und eine Bande mit einem

j» Rf-Wert von ungefähr 0,38 wird festgestellt. Diese Fraktion wird abgekratzt und auf gleiche Weise wie oben beschrieben extrahiert, und man erhält ungefähr 1 mg feste Verbindung.

Diese Produkte besitzen die folgenden Spektren. Das

j-, Produkt mit einem Rf-Wert von 0,23 wird als l(X,3/?-24-Trihydroxycholesta-5.7-dien identifiziert; das Produkt mit einem Rf-Wert von 0,33 wird als la,3j3-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien identifiziert und das Produkt mit einem Rf-Wert von 0,38 wird als Ια-24-Dihyclroxycholesterin identifiziert.

(1) Produkt mit einem Rf-Wert von 0,23 (1λ,30-24-Τπ-hydroxycholesta-5.7-dien)

UV-Spektrum (vergl. F i g. 2), λ™;- (nm):

4-1 262, 271 (ε = 11 000), 282 (κ = 12 00C). 294

(ε = 7000)

NMR-Spektrum (in CiDf₁O):
0,63(3 H,S,18-CHj),
3.30(1 H, M, 24-H),

3,70(1 H, M, 1/3-H),4,08(1 H.M,3a-H),
5,30(1 H, D. I = 6 Hz, 6-oder 7-H),
5,60(1 H, D, J = 6 Hz,6-oder 7-H)

Massenspektrum (vcrgl. F i g. 3):

416 (M +). 398,380,357,251,227,197,157

Fp.: 102 bis 103"C

(2) Produkt mit einem Rf-Wert von 0,33 (1«,3j3-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien)

W) UV-Spektrum, λ™¹""¹ (nm):

233,240,248
Massenspektruni:

416(M⁴), 398,380

(,, (3) Produkt mit einem Rf-Wert von 0,Jb (ΐΛ-24-Dihydroxycholesterin)

Dieses entspricht einer Standardprobe mit einem Rf-Wert von 0.38.

(D-2) Trennung durch Säulenchromatographie

Silikagel, das im Handel für die Verwendung in der Säulenchromatographie erhältlich ist (C-200, Warenzeichen für ein Produkt der Wako Jyunyaku Kogyo Kabushiki Kaisha), wird mit ungefähr 2 Gew.-°/o SilbeinitrU untc·" Vcrwenrlung einer Lösung imprägnieu und dann 2 Stunden bei 70⁰C in der Wärme behandelt. Das Silikagel wird dann in eine Glassäule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 30 cm gepackt. 40 mg Her rohen Reaktionsmischung, die man bei (B) oben erhält, werden in die Säule gegossen und mit einer Lösungsmitteleluierung eluiert, die Benzo! und Älhylacetat enthält. Man teilt in Fraktionen mit einem jeweiligen Volumen von ungefähr 20 ml. Diese Fraktionen werden dann getrennt, wobei man mit Dünnschichtchrornatographie und UV-Spektrum die Chromatographie verfolgt.

Wenn das Volumenverhältnis von Benzol zu Äthylacetat 2:1 bis 1:1 beträgt, werden 7,6 mg (Ausbeute 19%) eines Produktes, entsprechend einem Rf-Wert von 0,33 in (D-I), erhalten. Wenn dieses Verhältnis 1 :1 beträgt, werden 19,6 mg (49%) eines Produktes, entsprechend einem Rf-Wert von 0,23, erhalten.

Diese Produkte werden nach verschiedenen Spektrumswe ten identifiziert.

Vergleichsbeispiel 1

In diesem Beispiel wird die Trennung von 1λ,3/3-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und la,3/?-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien mit einem Trägermaterial erläutert, welches Siliciumdioxid, aber kein nichtmetallisches Silber enthält (Vergleich mit der dritten Stufe).

30 mg einer Mischung aus l*,3/3-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1a,3^-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von 3 :1, die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(A) und (B) hergestellt wurde und die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(C) identifiziert wurde, wird durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 30 cm unter Verwendung von Silikagel als Trägermaterial geleitet, um sie in ihre Bestandteile zu trennen.

Eine Lösungsmittelmischung aus Benzol und Äthylacetat wird als Entwicklungslösungsmittel in unterschiedlichen Mischverhältnissen von 10:1 bis 1:1 verwendet, und die Ausgangsmischung wird in Fraktionen mit einem Volumen von je ungefähr 20 ml geteilt. Die Trennung wird versucht, wobei man mit Dünnschichtchromatographie und UV-Spektrum die Chromatographie verfolgt. Wenn das Mischverhältnis von Benzol zu Äthylacetat ungefähr 2 :1 beträgt, beginnt die Hauptkomponente abzufließen. Analyse der jeweiligen Fraktionen mit UV-Spektrum zeigt, daß in allen analysierten Fraktionen eine Absorption bei 283, 240, 248, 262, 271, 282 und 294 nm beobachtet wird. Daraus folgt, daß, wenn Silikagel als Trägermaterial verwendet wird, das 1«3j3-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien nicht von dem 1a,3/?-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien abgetrennt werden kann. Man findet weiterhin, daß sich diese Fraktionen in ihrer Zusammensetzung kaum unterscheiden und daß das Molverhältnis von 5.7-Dien zu 4,6-Dien bei ungefähr 3 :1 erhalten bleibt (vgl. das folgende Vergleichsbeispiel 3).

Vergleichsbeispiel 2

In diesem Beispiel wird die Trennung von 1«,3j?-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien und l«,3/?-24-Triacetoxycholesta-4,6-dien unter Verwendung eines Trägermaterials, das Siliciumdioxid, aber kein nichtmetallisches Silber enthält. erläuteri(Vergleich mit der dritten Stufe). Eine Mischung aus 1a,3/?-24-Triacetoxycholesta-5,7 dien und 1λ,3/)'-24 rriacetoxycho'crta-4,6-dien in einem > Molverhältnis von 3:1, die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(A) hergestellt wurde und die auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(C) identifiziert wurde, wird der präparativen Dünnichichtehromatog! üphie unici Verwendung der gleichiP Platte, wie sie in Beispiel 14 (D-!)

in verwendet wurde, unterworfen, wobei man ein Silikagel-Trägcrmaterial verwendet, welches mit Silbernitrat behandelt wurde (Entwicklungslösungsmittel, 0,4% Mci.'ianol-Chloroform). Man stellt mit UV-Spektruni nur einen Flecken bei Rf ungefähr 0,4 fest.

ι ^ri Diese Fraktion wird isoliert, und man erhält eine ölige Substanz, deren UV-Spektrum Absorptionen bei 233, ?40,248, ?«. 271.282 und 294 nm zeigt.

Man stellt lest, daß die Abtrennung von 1nc,30-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien aus 1 a,3jS-24-Triacetoxy-

:<) cholcsta-4,6-dien nicht gelingt, selbst wenn Silikagel, welches nichtmetallisches Silber enthält, al«, Trägermaterial verwendet wird (vgl. Vergleichsbeispiel 4).

Dei s ρ i e I 15

Trennung von 1«,3/J-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1«,3j3-24(R)-Trihydroxycholesta-

4,6-dien (dritte Stufe)

1 a-Hydroxy-3/j-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en, her-

i» gestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 5(A) gezeigt, behandelt, um 1 a-Acetoxy-3/J-24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en herzustellen. Dieses Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 10 beschrieben

r> behandelt, wobei man eine rohe Reaktionsmischung erhält, welche 1 a-Acetoxy-3/?-24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien enthält. Die rohe Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(B) hydrolysiert und durch präparative Dünnschichtchromatographie auf

w gleiche Weise wie in (D-1) beschrieben getrennt.

Die Reaktionsmischung, die 1a,3/9-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und iA,3/?-24(R)-Trihydroxycholesia-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3 :1 enthält, kann in die zwei Bestandteile genau getrennt

■»5 werden.

Das Produkt, das aus dem Flecken abgetrennt wird, der aus 1«,3/?-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien stammt, besitzt die folgenden Eigenschaften.

UV-Spektrum λ·™· (nm):

"' 262,271 (ε 11 000), 282 (11 800), 294 (7000)

NMR-Spektrum (C₃D₆O):

3,25(1 H,M,C-24-H),3,68(1 H, M, \ß-H), 4,10(1 Η.Μ.3Λ-Η),

5,30(1 H,D,J = 6 Hz. 6 -oder 7 -H). 5,60(1 H, D.] =6Hz,6-oder7-H)

Massenspektrum:

416(M ⁺ ), 398,380,357,251,227,197,157 Fp.: 96 bis 99° C

Beispiel 16

Trennung von la,3/?-24(S)-TrihydroxychoIesta-5,7-dien und 1 «,3j9-24(S)-Trihydroxycholesta-4,6-dien

(dritte Stufe)

la-Hydroxy-3j8-24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und getrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 4(B) beschrieben, wird auf gleiche Weise wie in Beispiel

5(A) behandelt, wobei man la-Amoxy-30-24(S)-dibenzoyloxycholes'.-5-en erhält. Dieses Produkt wird aiii gleiche Weise wie in Beispiel 10 beschrieben behandelt, wobei man eine rohe ilc-aktionsmischung erhält, die lji-Acetoxy-3fi-24(S)-diben7.oylcholesta-5,7-dien enthält. Diese Reaklionsmischurig wird auf gleiche Weise wie in Beispie! M(B) hydrolysiert und auf gleiche Weise wie in (D-I) oben durch präparative Dünnschichtchromatographie abgetrennt.

Die rohe Reaktionsmischung, die la,3/}-24(S)-Trihydroxycholesia-5,7-dien und 1ix,3/?-24(S)-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3 :1 kann scharf in die beiden Bestandteile getrennt werden.

Das Produkt, das von dem Hecken abgetrennt wird, der auf lÄ,3/3-24(S)-Trihydroxycholesia-5,7-dien basiert, besitzt die folgenden Eigenschaften.

UV-Spektrum, λ™"""¹ (nm):

262,271 (10 800), 282 (11 500), 294 (6900)

3,27(1 H,M,C-24-H),3,b7(1 H, M, Ij3—H),
4,10(1 Η,Μ,3α-Η),
5,30(1 H, D, J = 6 Hz,6-oder 7-H),
5,60(1 H, D, J = 6 Hz.6-oder 7-H).

Massenspektrum:

416(M⁺), 398, 380,357,251,227,197,157

Fp.: 120 bis 124° C

Beispiel 17

Synthese von Ια-24-Dihydroxycholecalcifprol
(vierte Stufe)

16 mg 1a,3j3-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-I) beschrieben, werden in 500 ml Diäthyläther gelöst und diese Lösung wird mit ultravioletten Strahlen 2,5 Minuten bei 5°C in einer Argonatmosphäre unter Verwendung einer 200-W-Hochdruck-Quecksilberlampe (654A-36, Warenzeichen für ein Produkt der Hanovia Company) bestrahlt. Ein Teil der Lösung wird entnommen und ihr UV-Spektrum wird bestimmt. Man beobachtet eine Erhöhung in der Absorption bei 262 bis 263 nm, die auf das Ια-24-Dihydroxyprecholecalciferol zurückzuführen ist. Nach der Umsetzung wird der Äther bei Zimmertemperatur bei vermindertem Druck abgedampft Benzol (50 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung erfolgt während 2 Stunden bei Rückfluß des Benzols.

Nach der Umsetzung wird das Benzol bei vermindertem Druck abgedampft, man erhält 16 mg eines farblosen Feststoffs. Dieses Produkt wird sorgfältig durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikage! als Trägermaterial, das ungefähr 13% Silbernitrat enthält [das auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-I) beschrieben erhalten wurde], abgetrennt (man entwickelt zweimal mit 6% Methanol-Chloroform). Man erhält drei Banden, die durch ultraviolette Strahlen bestätigt werden. Aus der am wenigsten polaren Bande erhält man 2,8 mg farblosen Feststoff. Dieses Produkt besitzt die folgenden Eigenschaften und wird als l«-24-Dihydroxycholecalciferol identifiziert.

UV-Spektrum (F ig. 4) AÄ"""(nm)=265 (nm) = 228

N M R-Spcktrum (CjL\O):
0,57(6H₁D, 18-CH j),
0,87(b H₁D,] = 7Hz,26-und27-CHi),
0,96 (3 H, D, J = 5 Hz, 21-CHi),
3,19(1 H, M,24-H),4,15(1 H, M, 10-H).
4,36(1 H, M,3a--H), 4,85(1 H,b,S, 19-11).
5,30(1 H, b, S, 19-H),
6,05(1 H, D.Jab = 11 Hz,6-oder 7-H),
6,26(1 H, D,]mi= 11 Hz₁6-oder 7-H).

¹⁽¹ Massenspektrum(Fig. 5):

416(M+), 398,380,269,251,134

Hochresuluiionsmassenspektmm:

gefunden:416,32768
,-, berechnet, M+(C₂₇H₄₄O₃) = 416,32927

Fp.: 84 bis 85° C

Beispiel 18

Synthese von 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol
(vierte Stufe)

10 mg 1 \,3fi-24(R)-TrihydroxychoIesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 15 beschrieben, werden in 140 ml Diäthyläther gelöst

2-, und die entstehende Lösung wird 2 Minuten bei 5°C mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Ein Teil der Lösung wird entnommen und sein UV-Spektrum wird bestimmt. Eine Erhöhung der Absorption bei 262 bis 263 nm wird beobachtet, und es wird angenommen, daß dies auf die

so Vorstufe zurückzuführen ist. Nach der Umsetzung wird der Äther bei Zimmertemperatur und vermindertem Druck abgedampft. Benzol (50 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung wird während 2 Stunden in Argonatmosphäre beim Rückfluß

r> des Benzols durchgeführt.

Nach der Umsetzung wird die Reaktionsniischung auf gleiche Weise wie in Beispiel 17 beschrieben behandelt und durch präparative Dünnschichtchromatographie getrennt und gereinigt. Aus der am wenigsten polaren Bande werden 1,8 mg farbloser Feststoff erhalten. Dieses Produkt besitzt die folgenden Eigenschaften und wird als 1a-24(R)-Dihydroxycholecalciferol identifiziert.

UV-Spektrum

λ J,!,¹?"¹"¹ (nm) = 265
^4> ümi'n'""'(niii) = 228

NMR-Spektrum (C)D_bO):
0,59 (3 H, S, 18-CHj),
0,87 (6 H, D, J = 7 Hz,26- und 27-CH)),
3.20(1 H.M.29-H),4,14(1 H,M, \ß-H),
4,42(1 H,M,3a-H),4,87(1 H,b,S. lfe-H),
5,32(1 H.b.S, 19-H),
6,08(1 H₁D₁Ja₈= 11 Hz,6-oder 7-H),
6,30(1 H.D.Jad = 11 Hz,6-oder 7-H).

τ? Massenspektrum:

416(M ⁺ ), 398,380,269,251

Hochresolutionsmassenspektrum:
gefunden: 416,33084 berechnet (M ⁺ ) = 41632927(C₂₇H₄₄O))

Beispiel 19

Synthese von 1«-24(S)-Dihydroxycholecalciferol (vierte Stufe)

15 mg lo3/?-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 16 beschrieben, werden in 140 ml Diäthyläther gelöst, und die entstehende Lösung wird 2 Minuten bei 5°C mit

ultravioletten Strahlen bestrahlt. Dann wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 18 beschrieben wiederholt, und man erhält 2,8 mg farblosen Feststoff. Dieses Produkt hatte die folgenden Eigenschaften und wurde als la-24(S)-Dihydroxycholccalciferol identifiziert.

UV-Spektrum

AK '(nm) = 265

Αϊ,',!?¹""¹ (nm) = 228

NMR-Spektrum (in C₁DhO):
0,58(3H₁S, 18-CHi),
0,87 (6 H, D,) = 7 Hz, 26- und 27-CH₃),
3,20(1 H, M, 24-H), 4,14(1 H,M₁IjJ-H),
4,42(1 H, M, 3«- H), 4,87(1 H, b, S, 19-H),
5,32(1 H, b. S₁19-H).
6,08(1 H, D.Jab = Ii Hz, 6- oder 7-H),
6,30(1 H, D, Jah= 11 Hz,6-oder 7-H)

Massenspektrum:

416 (M +), 398,380,269,251,134

Hochresolutionsmassenspektrum:
berechnet: 416,33095
gefunden (M +): 416,32927 (C₂₇H₄₄Oj)

Beispiel 20

(A) Synthese von l«,3^-24-Triacetoxycholest-5,7-dien a ι i s 1 «,3jS-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

200 mg 1a,3j3-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und getrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-I) beschrieben, werden mit 2 ml Essigsäureanhydrid und 5 ml Pyridin 3 Stunden bei 95°C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird in Eis-Wasser gegeben und mit 400 ml Diäthyläther extrahiert. Die Ätherphase wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure, dann mit Alkali und weiter mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der Äther wird verdampft, und man erhält la,3j3-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien als hellgelbliche, ölige Verbindung.

(B) Synthese von ΐΛ-24-Diacetoxychoiecalciferol-3/2-acetat (vierte Stufe)

50 mg la-24-Diacetoxycholecalciferol-3/?-acetat werden in 500 ml Diäthyläther gelöst. Die entstehende Lösung wird mit ultravioletten Strahlen in einer Argonatmosphäre 4 Minuten bei 50°C bestrahlt.

Ein Teil dieser Lösung wird entnommen und sein UV-Spektrum wird bestimmt. Eine Erhöhung in der Absorption bei 262 bis 263 nm wird beobachtet, und man nimmt an, daß sie auf die Vorstufe zurückzuführen ist. Nach der Umsetzung wird der Äther bei vermindertem Druck und Zimmertemperatur verdampft. Benzol (100 ml) wird zu c'em Rückstand gegeben und die isomerisierung wird während 2 Stunden in Argonatmosphäre unter Rückfluß von Benzol durchgeführt. Nach der Umsetzung wird der Haupttefl des Benzols bei vermindertem Druck abdestilliert und zu dem Rückstand gibt man 2 ml 5%iges Kaliumhydroxid/Methanol, 2 ml Methanol und 2 ml Benzol. Die Mischung wird 1 Tag bei Zimmertemperatur stehengelassen, so daß die Hydrolyse ablaufen kann. Das Reaktionsprodukt wird mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphase wird wiederholt mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wird bei vermindertem Druck abgedampft, man erhält 35 mg einer hellgelben, öligen Verbindung.

Diese Substanz wird durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel als Trägermaterial, welches Silbernitrat enthält, auf gleiche Weise wie in Beispiel 17 beschrieben abgetrennt und gereinigt. Aus der weniger polaren Bande werden 5,7 mg Feststoff erhalten. Da die verschiedenen Spektren und Eigenschaften dieses Produktes vollständig denen von ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol, welches in Beispiel 17 erhalten wurde, entsprechen, wird das Produkt nach der Isomerisierung als Ια-24-Diacetoxycholecalciferol-3-acetat identifiziert.

Beispiel 21

(A) Synthese von

5,7-dien aus 1a,3j8-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien

160 lüg la,3j3-24-Trihydroxycho!esta 5,7-Jicn. hergestellt und abgetrennt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14(D-I) beschrieben, werden mit 410 mg Benzoylchlorid und 15 ml Pyridin umgesetzt.

Die Reaktionsmischung wird mit Wasser verdünnt und mit 40 ml Diäthyläther extrahiert. Die Ätherphase wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure und dann mit Mkali und schließlich mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der Äther wird abgedampft, man erhält la,3j3-24-Tribenzoyloxycholesta-ä.7-dien als farbloses, amorphes Produkt.

(B) Synthese voi. L\-24-Dibenzoyloxycholecalcife.-"¹ \3-benzoat (vierte Stufe)

Jd 30 mg la,3j3-24-Tribenzoyloxycholesta-5.7-dien werden in 500 ml Benzol gelöst und die entstehende Lösung wird mit ultravioletten Strahlen in Argonatmosphäre 2 Minuten bei 10⁰C bestrahlt. Nach der Umsetzung wird die Isomerisierung 2 Stunden in Argonatmosphäre

Ji unter Rückfluß von Benzol durchgeführt. Nach der Umsetzung wird der Hauptteil des Benzols bei vermindertem Druck verdampft und 2 ml 5%iges Kaliumhvdroxid Methanol und 2 ml Benzol werden zu dem Rückstand gegeben. Die Mischung wird 28 Stunden

M) bei Zimmertemperatur in Argonatmosphäre gehalten, um die Hydrolyse durchzuführen. Das Reaktionsprodukt wird mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat

4i wird bei vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird dem gleichen Trenn- und Reinigungsverfahren wie in Beispiel 20 unterworfen. Man erhält '.,9 mg ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol, das die gleichen Eigenschaften besitzt wie das Produkt, das in Beispiel 20

id erhalten wurde.

Aus diesem Ergebnis wird das nach der lsomerisierungsreaktion erhaltene Produkt als ΐΛ-24-Dibenzoylcholecalciferol-3-benzoat identifiziert.

Beispiel 22

(A) Synthese von 1 «-Hydroxy-3j3-24-dibenzoyloxy-

cholesta- 5,7 -dien aus 1 (X,30-24-Trihydroxy-

cholesta-5,7-dien

250 mg l*,3^-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 14 (D-I) beschrieben, werden mit 210 mg Benzoylchlorid und 5 ml Pyridin vermischt und die Mischung wird 1 Tag bei 23⁰C stehengelassen. Die entstehende Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 21 beschrieben behandelt, und man erhält l«-Hydroxy-3/?- 24-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien.

(B) Synthese von 1(\-HydiOxy-24-benzoyloxycholecalciferol-3/f-benzoat (vierte Stufe)

20 mg l«-Hydroxy-3j3-24-diben?r!yloxycholesta-5,7-dien werden in 500 ml üiäthyläther gelösi. Die Lösung wird mit ultravioletten Strahlen bestrahl¹., isomerisiert und auf gleiche Wcire wie in Beispiel 21(B) beschrieben hydrolysiert, wobei man 1,9 mg 1&-2-1 Dihydroxyeholecalciferol crliält, das die gleichen Eigenschaften besitzt wie das in Beispiel 20 erhaltene Produkt.

Aus diesen Ergebnissen wird bestatin', daß das Produkt, das mar. nach der IsomcrisierüngM-eaktion erhält, la-Hydroxy-24-benzoylcholecalciferol-3ß-benroat ist.

Beispiel 26

Beispiel 23

Synthese von 1 *-24(R)-Diacetoxycholecalciferoi-3/j-acetat (vierte Stufe)

O.is ^;n Be-sjjicl i J erhaltene l<x,3jS-24(R)-Trihydroxy- :<> cholesla-57-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 20(A) beschrieben acetyliert, wobei man 1a,30-24(R)-Trihydroxychoiesta-5,7-dien erhält. ^:; mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 20(B) beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß die 2> Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen 2 Minuten durchgeführt wurde. Man erhält JA mg eines Produktes, dessen Eigenschaften mit denen von 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol übereinstimmen.

Aus diesem Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt, in das man nach der Isomerisierungsreaktion erhält, 1 «-24(R)-Diacetoxycholecalciferol-3j3-acetat ist.

Beispiel 24

Synthese von 1«-24(R)-Dibenzoyloxycholecalciferol-3j3-benzoat (vierte Stufe)

Das la,3j3-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 21(A) beschrieben benzoyliert, wobei man lÄ,3j9-24(R)-Tribenzoyloxycho- -m lesta-5,7-dien erhält. Dieses Produkt wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 21(B) beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß 30 mg dieses Produktes verwendet werden und daß die Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen 2 Minuten bei 12°C durchgeführt wird. Man ·τ> erhält 3,4 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften mit denen von la-24(R)-Dihydroxycholecalciferol übereinstimmen.

Danach wird das Produkt nach der Isomerisierungsreaktion als la-24(R)-Dibenzoyloxychoiecalciferol-3|?- -50 benzoat identifiziert.

Beispiel 25

Synthese von 1 «-Hydroxy-24(R)-benzoyloxychoIe-

calciferol-30-benzoat (vierte Stufe) "

Das la,3/?-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 22(A) beschrieben benzoyliert, um la-Hydroxy-3/?-24(R)-dibenzoyIoxycholesta-5,7-dien herzustellen. t>o

10 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 22(B) beschrieben beharHelt, und man erhält 1,2 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften denjenigen von 1«-24(R)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen, to

Aus diesem Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt nach der Isomerisierung 1a-Hydroxy-24(R)-benzoyloxvcholecalciferol-SÖ-benzoat ist.

Synthese von li\-24(S)-Diacetoxycholecalciferol-3p-acetat (vierte Stufe)

Das in Beispiel 16 erhaltene l;v,3/?-24(S)-Trihydroxycholestn-5 7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 20(A) beschrieben acetylen, wobei l'x3_/9-24(S)-TrihydiOxycholesta-5,7-dien gebildet wird. 20 mg dieses Produktes werden suf gleiche Weise wie in Beispiel 23

κι beschrieben behandelt, wobei man 3,1 mg eines Produktes erhält, dessen Eigenschaften denen von I iv-24(S)-Dihydrcxycliolecalcifeu>! entsprechen.

Aus diesem Ergebnis wird bestätigt, daß das Produkt nach der Isomerisierungsreaktion !<x-24(S)-Diaceloxycholecalciferol-Sß-aielat ist.

Beispiel 27

Synthese von 1«-Hydroxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3p'-benzoat (vierte Stufe)

Das in Beispiel 16 erhaltene 1«,3/2-24(S)Trihydroxycholes!;; 5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 22(A) beschrieben benzoyliert, wobei 1ivHydroxy-3j?- 24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien gebildet wird. 15 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 25 beschrieben behandelt, wobei man 1,5 g eines Produktes erhält, dessen Eigenschaften denen von la-24(S)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen. Daraus wird bestätigt, daß das nach der Isomerisierung erhaltene Produkt 1«-Hydroxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferolOjü-bcnzoat ist.

Beispiel 28

Synthese von 1a-Acetoxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3/?-benzoat (vierte Stufe)

Das auf gleiche Weise wie in Beispiel 27 beschrieben erhaltene 1 a- Hydroxy-3jS-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 26 beschrieben acetyliert. wobei l«-Acetoxy-3|?-24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien gebildet wird.

15 mg dieses Produktes werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 26 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß die Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen 1 Minute bei 8°C durchgeführt wird. Man erhält 1,5 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften denen von lÄ-24(S)-Dihydroxycholecalciferol entsprechen. Daraus wird bestätigt, daß das nach der Isomerisierung erhc'tene Produkt 1a-Acetoxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3/i-benzoat ist.

Vergleichsbeispiel 3

Synthese von l«-24-Dihydroxycholecalciferol

aus 1 a,3/?-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien,

das la,3j?-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien enthält

(Vergleich mit der vierten Stufe)

10 mg einer Mischung aus la,3jS-24-TrihydroxychoIesta-5,7-dien und 1<x,3j3-24-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3:1, die auf gleiche Weise wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben erhalten wird, werden in 500 ml Diäthyläther gelöst, und die Lösung wird 2 Minuten bei 5°C mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Nach der Umsetzung wird der Diäthyiäther sorgfältig bei vermindertem Druck abgedampft. Zu dem Rückstand fügt man 50 ml Benzol und

die Isomerisierung wird 2 Stunden in Argonatmosphäre unter Rückfluß von Benzol durchgeführt. Nach der Umsetzung wird das Benzol ibdestilliert. und man erhält 10 mg einer braunen, c'igen Verbindung.

Das UV-Spektrum dieses Produktes ist kompliziert, insbesondere besitzt es keine spezifische Absorption des ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferols, welches ein Absorptionsmaximum bei 265 nm zeigt, und die Bildung von ΐΛ-24-Dihydroxycholecalciferol konnte nicht bestätigt werden. Hl

Dies wurde weiter bestätigt, wenn man die obige Verbindung der präparat!ven Dünnschich!Chromatographie unter Verwendung von Silikagei-Trägermaterial. das daran adsorbiert Silbernitrat enthält, unterwirft und das Chromatogramm mit dem Chromatogramm einer Standardprobe von la-24-Dihydroxycholecalciferol vergleicht. Das Produkt zeigt keinen Fleck, der der Standardprobe entspricht.

Daraus ist ersichtlich, daß die Reinheit von la,30-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien niedrig ist, li\,3/?-24-Trihy- i_ü droxycholecalciferol durch Isomerisierung unter Verwendung von ultravioletter Bestrahlung nicht gebildet wird.

Vergleichsbeispiel 4 : -,

Synthese von lft-24-Diacetoxycholecalciferol-

3j9-acetat aus 1 «,S/J-Triacetoxycholesta-

5.7-dien, das 1 A,3/?-24-Tnacetoxycholesta-

4,6-dien enthält (Vergleich der vierten Stufe)

10 mg einer Mischung aus l«,3/?-24-Triacetoxycholesta-5.7-dien und la,3/?-24-Triacetoxy-4,6-dien in einem Molverhältnis von ungefähr 3 : 1, erhalten auf gleiche Weise wie in Vergleichsbeispiel 2 beschrieben, werden in 500 ml Diäthyläther gelöst und die Lösung wird 2 r> Minuten bei 5⁼C mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Die Reaktionsmischung färbt sich gelblich-braun. Nach der Umsetzung wird der Diäthyläther sorgfältig bei vermindertem Druck abdestilliert. Benzol (50 ml) wird zu dem Rückstand gegeben und die Isomerisierung wird 2 Stunden in Argonatmosphäre unter Rückfluß des Benzols durchgeführt. Nach der Umsetzung wird die Haupimenge des Benzols bei vermindertem Druck abdestilliert. Zu dem Rückstand gibt man 1 ml 5°/oiges Kaliumhydroxid-Methanol und die Mischung wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur in Argonatmosphäre zur Durchführung der Hydrolyse stehengelassen. Nach der Umsetzung wird das Benzol abgedampft und das UV-Spektrum wird bestimmt. Das Produkt wird der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Die Ergebnisse sind die gleichen wie; bei VergleichSibeispiel 3 und es wurde keine Bildung von !α-24-Dihydroxycholecalciferol beobachtet.

Beispiel 29 -,-,

Einfluß auf die Aktivierung des intestinalen

Calciumlransports des
1«-24-Dihydroxychoiecalciferols(la-24-DHCC)

(a) Vergleich mit ΐΛ-Hydroxycholecalciferol
(Ia-HCC)

Männliche Wistarratten mit einem Körpergewicht von ungefähr 200 g müssen über Nacht fasten, und dann wird ihnen oral 625 ρ Mol einer Lösung von jeweils I \-24-DHCC und Ιλ-HCC in Maisöl verabreicht Nach (,■> einer vorbestimmten Zeitdauer wird eine Lösung aus radioaktivem Calciumchlorid (⁴⁵CaCb, 30 nCi/ml) oral verabreicht. Der Radioaktivitätsgehalt im Blut wird im Verlauf von 10 bis 60 Minuten bestimmt. Die maximaler Werte werden als Index für die intestinal· Calciumabsorption festgesetzt.

Einer Kontrollgruppe von Ratten wird Maisöl allein in der gleichen Menge verabreicht. Die Dosis der Maisöllösung von Ιλ-24-DHCC oder Ia-DHCC und des Maisöls betrugen 0.0125 ml/100 g Körpergewicht jeder Ratte, und die Dosis an radioaktiver wäßriger Calciumchloridlösung (pH 7,0) betrug 0,1 ml/100 ° Körpergewicht jeder Ratte.

Der Radioaktivitätsgehalt wurde bestimmt, inder: man 0.2 ml des Serums in eine Vial-Flasche gab, 12 m einer Lösung zugab, die einen Scintillator enthäl [enthaltend 1200 ml Toluol, 800 ml Äthylcellosolv, 8j 2.5-DiphenyIoxazol und 300 mg 2,2'-p-Phenylen-bis-(5 phenyloxazol)]. und indem man die Radioaktivität mi' einem flüssigen Scintillationszähler bestimmte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle I

Zeit nach der
Verabreichung

(Std.)

Radioaktivität im Serum (cpm)
1 σ-24-DHCC 1 <r-HCC

Vergli

ich

275 ± 95 (4)*)
360 ± 150(4)
996 ± 80(4)
924 ± 130(4)
426+ 61 (4)

275 ± 95 (4)
697 ±221 (4)
1035 ± 150 (4)
643 + 210(4)
332 ± 28(4)

*) Die Werte in Klammern zeigen die Anzahl der Ratten in einer besonderen Gruppe an.

Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, daß Ιλ-24-DHCC eine fast gleiche Wirkung besitzt wie Ia-HCC im Hinblick auf die Aktivierung der intestinalen Calciumabsorption.

(b) Vergleich zwischen 1<x-24(R)-DHCC und
lft-24(S)-DHCC

Männliche Wistarratten mußten über Nacht faster und dann wird ihnen oral 625 ρ Mol einer Lösung von je U-24(R)-DHCC und 1«-24(S)-DHCC in Maisöl verabreicht. 8 Stunden nach der Verabreichung werden die Ratten getötet und die intestinale Calciumabsorptior wird mit dem umgekehrten gut sac-Verfahren bestimm) [Martin und De Luca. Amer. J. Physiol. 216, 1351 (1969)]. Die 'Ergebnisse sind in Tabelle !1 angegeben.

Tabelle!!

Vergleich

1*-24(R)-DHCC

la-24(S)-DHCC

<">Ca(S/M)
1,29 + 0,16(4)^ ]

5,86 ±1,98 (4)
2,68 ±0,80 (4)

⁺ ) Die Zahl in Klammern zeigt die Anzahl der Rauen in einer besonderen Gruppe an.

Die Versuchsbedingungen sind die folgenden:

Verwendeter intestinaler Tnikt:
Duodenum, 7 cm

Menge an Medium, das in das
umgekehrte Duodenum
gegeben wird, 0.7 ml

1 cno /ice

Zusammensetzung des Mediums:
NaCl
Fructose
Tris-Cl-Puffer
CaCl·

Inkubationsbedingungen:
37° C, 90 Minuten eine gasförmige
Mischung aus 95% O₂ und 5% CO₂
wird durchgeleitet

Menge an Flüssigkeit, die für

die Radioaktivitätsmessungen

verwendet wird

25 26 98!

125 mM

1OmM

30 mM (pH 7,4)

0,25 mM

10 μα/1

0,1 ml

Die anderen Bedingungen sind gleich wie bei (a) ι >ben.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß 1*-24(R)-DHCC eine größere Aktivität zeigt, die intestinale Calciumabsorption zu aktivieren, als la-24{S)-DHCC.

Beispiel 30

Vergleich von U-HCC, Ιλ-24-DHCC.

1s-24(R)-DHCC und hn-24(S)-DHCC

im Hinblick auf die Aktivierung der

intestinalen Calciumabsorption

Das Versuchsverfahren ist gleich wie in Beispier 29(b). Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 111 angegeben.

Tabelle 111

Dosis
125 p Mol

625 ρ Mol

3 125 ρ Mol

Vergleich

1 a-HCC

1 ff-24-DHCC

1 ä-24(S)-D H CC

lff-24(R)-DHCC

3,59 ± 0,23 (4)
4.12 ±0,25 (4)
3,97 ±0,28 (4)
4,42 ±0,41 (4)

3,31 ±0.12(15)*)
4,10 ±0,27 (4)
4,84 ±0,32 (4)
4,17 ±0,31 (4)
5,93 ±0,33 (4)

5,10 ±0,27 (4)
5,47 ±0,33 (4)
5,18 ±0,20 (4)
5,84 ±0,39 (4)

*) Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Rauen in einer besonderen Gruppe an.

Die in Tabelle III aufgeführten Ergebnisse bestätigen die Versuchsergebnisse von Beispiel 29. In anderen Worten, ist die intestinale Calciumabsorption von Ιλ-24-DHCC mindestens gleich der Aktivität von Ia-DHCC und unter Ιλ-24-DHCC. 1a-24(R)-DHCC und la-24(S)-DHCC bestehen die folgenden Beziehungen im Hinblick auf die Fähigkeit, die intestinale Calciumabsorption zu aktivieren:

1a-24(R)-DHCC > Ιλ-24-DHCC > 1a-24(S)-DHCC

Beispiel 31

Vergleich der Knochenabsorptionswirkung zwischen
Ιλ-24-DHCC und Iä-HCC

Männlichen Wistarratten (je mit einem Körpergewicht von ungefähr 150 g) wird subkutan eine wäßrige Lösung aus ⁴⁵CaCI₂ in einer Dosis von 50 nCi/Ratte verabreicht und die Ratten werden 6 Wochen gehalten. Das so verabreichte ⁴⁵Ca wird schnell absorbiert und ein größerer Teil sammelt sich nach einigen Stunden in den Knochen. 3 Wochen später wird der ^Ca-Gehalt im Blut konstant und nur die Knochen befinden sich in dem spezifisch markierten Zustand. Dies wird durch makroautoradiographische Analyse des gesamten Körpers bestätigt. Die Ratten werden 6 Wochen gehalten und dann wird ihnen oral kontinuierlich einmal am Tag eine Lösung aus 2125p Mol von je la-HCC und 1-v-24-DHCC verabreicht. BIuI wird im Verlauf der Zeit entnommen und der Radioaktivitätsgehalt des Serums wird gemäß dem in Beispiel 29(a) beschriebenen Verfahren bestimmt. Eine Erhöhung in dem Serum-Radioaktivitätsgehalt wird als Index des Einflusses der Knochcn2bsorⁿtion angesehen Her Knntrollpninnc wird nur Maisöl allein verabreicht. Die Anzahl der Ratten, die untersucht werden, beträgt jeweils 4 in einer Gruppe. Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 6 dargestellt. In dieser Figur bedeutet das Symbol einen wesentlichen Unterschied in dem Serum-Radioaktivitätsgehalt, verglichen mit der Verglcichsprobe.

Aus den in Fig. 6 dargestellten Ergebnissen ist erkennbar, daß bei Ιλ-HCC die Knochenabsorption beachtlich 2 Tage nach dem Beginn der Verabreichung zunimmt und daß diese Erscheinung mit der Zeit größer wird. Andererseits nimmt bei Ιλ-24-DHCC die Knochenabsorption nur nach einem Verlauf von 4 Tagen beachtlich zu, aber danach ist das Ausmaß der Erhöhung wesentlich niedriger als bei Iä-HCC (ungefähr Vi am 8.Tag). Dies legt nahe, daß Ιλ-24-DHCC einen schwächeren Knochenabsorptions-Effekt zeigt als Ιλ-HCC und eine niedrigereToxizität.

Beispiel 32

Vergleich der Knochenabsorptionswirkung und der

Körpergewichtsänderung zwischen 1 a-HCC,
Ιλ-24-DHCC, 1«-24(R)-DHCC und I«-24(S)-DHCC

Ein ähnlicher Versuch wie in Beispiel 31 beschrieben wird mit den obigen vier Verbindungen durchgeführt. Im Gegensatz zu Beispiel 31 wird der Versuch 3 Wochen nach der Verabreichung von '¹⁵CaCI) begonnen. Sowohl der Radioaktivitätsgehalt des Serjms als auch die gesamte Calciumkonzentration im Serum werden bestimmt. Für die Messung der Calciumkonzentration wird ein Calciumbestimmungssack (hergestellt von latron Company) verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV und V angegeben.

Tabelle IV
^4äCa-Gehalt im Serum

52

Zeit (Tage) Serum-Aktivität (cpm) O 5

Vergleich

ltf-HCC

1 α-24-DHCC

la-24(R)-DHCC

lff-24(S)-DHCC

699 ± 53.7 690 ± 39,4 675 ± 54,9 648 ± 44,3 780 ± 43,5

621 ±48,6 1056 ±66,8 948 ± 64,6 874 ± 30,4 539 ± 45,2

597 ± 33,9

1184±51,1
700 ± 32,8
778 ± 26,9
520 ± 53,8

608 ± 49,3 904 ± 57,1 661 ±78,8 681 ±63,7

609 ±91.5

Tabelle V
Ca-Gehalt im Serum

Vergleich

1 ff-HCC

1 a-24-DHCC

\a-24i R)-DHCC

lff-24(S)-DHCC

11,4 ±0,32 10,4 ±0,21 11,7 ±0,26 11,3 ±0,35 i 1,2 ±0,16

10.0 ±0,29

14.1 ±0,29
12,9 ±0,18
12,6 ±0,23
11,5 ±0.33

11.1 ±0,22
14,7 ± 0,33
11,5 ±0,23
13.3 ±0,25

11.2 ±0.29

10.6 ±0,15 13,8 ±0,41 12,1 ±0,19 12,8 ±0,35 11,5 ±0,24

Aus den in den Tabellen IV und V aufgeführten Ergebnissen ist erkennbar, dall die Versuchsergebnisse von Beispiel 31 wieder bestätigt werden. In anderen Worten zeigen diese Ergebnisse, daß Ιλ-24-DHCC eine schwächere Knochenabsorptionswirkung als Ia-HCC besitzt, und von Ιλ-24-DHCC. la-24(R)-DHCC und 1 \-24(S)-DHCC gilt für die Knochenabsorptionswirkung die folgende Beziehung:

U\-24(R)-DHCC> 1<v24-DHCC> li\-24(S)-DHCC.

Es ist besonders bemerkenswert, daß bei lot-24(S)-DHCC kaum eine Knochenabsorptionswirkung bcobachtet wird, und diese Wirkung ist fast gleich wie bei der Vergleichsprobe. Dies legt den Schluß nahe, daß U-24(S)-DHCC keinen Einfluß auf die spezifische aktivierende intestinale Calciumabsorption zeigt und dies ist für klinische Anwendungen sehr wichtig.

Die Änderungen im Körpergewicht, die in dem

in vorliegenden Versuch bestimmt wurden, sind in Fig. 7

dargestellt. Es ist bemerkenswert, daß Ιλ.-24-DHCC

eine größere Änderung im Körpergewicht aufweist als

1Λ-HCC, und insbesondere zeigt 1«-24(S)-DHCC kaum

einen Unterschied im Hinblick auf die Vergleichsgrup-

Γ) pe. Dies legt den Schluß nahe, daß, ähnlich wie bei der

Knochenabsorption, die Toxizität von Ιλ-24-DHCC

geringer ist als von 1 λ-HCC

Beispiel 33

Vergleich der Toxizität zwischen Ιλ-24-DHCC und K-HCC

Die Toxizität von jeder der obigen zwei Verbindungen wird nach bekannten Verfahren bestimmt. Die 4> Ergebnisse sind in Tabelle Vl angegeben.

Tabelle VI	Geschlecht	LD.sn (;ig/kg)	u-ncr	1 σ-24-DHCC
Species		Verabreichungsverfahren	474	>25OO
	δ	per os	508 167	33 000-3 300
	9 S	intravenös	100	3300-1000
Vlaus	9		330 744	-
	Q	per os
Ratte

Aus der obigen Tabelle ist erkennbar, daß die Toxizität von Ιλ-24-DHCC ein Zehntel oder weniger von der von Ιλ-HCC beträgt. Dieses Ergebnis ist ebenfalls aus den Ergebnissen der Beispiele 31 und 32 ersichtlich.

Aufgrund der in den Beispielen 29 bis 33 erhaltene] Ergebnisse können die Eigenschaften von Ιλ-24-DHCC mit denen von Ιλ-HCC, wie sie in Tabelle VIl aufgeführt sind, verglichen werden. Bei diesen Werten wird die Aktivität von Ιλ-HCC als 1 angenommen.

53 54

Tabelle VII Da gezeigt wurde, daß das erfindungsgemäße

Ιλ-24-DHCC die intestinale Calciumabsorption selektiv

Ισ-24-DHCC Ia-HCC aktiviert und eine schwächere Knochenabsorptionswir-

kung zeigt, verglichen mit bekannten Analogen der

r-· η η r-i- αϊ · ι , ~> aktiven Form von Vitamin D₁. v.ird angenommen, daß

Einnuß auf die Akt!- 1 1 _{e$ pjn sehp wertvo}„_{es Arzne}j_mi_tte| ist, welches mit nur

vierung der intesti- wenigen Nebenwirkungen bei der Behandlung von

naien Calcium- Krankheiten verwendet werden kann, die durch

absorption abnormalen Metabolismus von Calcium induziert

Knochenabsorp- weniger a's ' 3 1 ₁₍, werden, insbesondere ist la-24(S) DHCC eine beson-

tionswirkrng ders wertvolle Substanz in dieser Hinsicht, und es wird

Akute To.xizität wenieer als ' io 1 angenommen, daß die große Verwendung linden wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Gemisch von la^SJ-Dihydroxycholecalciferol und !«^(RJ-Dihydroxycholecalciferol in beliebigen Verhältnissen der folgenden Formel

OH

sen, ausgedrückt durch die folgende Formel

OR,

HO

OH

2. U-24(S)-Dihycin)xycholecalcircrol der folgenden Formel

OH

llo

*O

λ K-24(R)-I)ihydro\ycholccalciferol der l'oljjenilcn Formel

OH

HO

4. 1a-24(S) Dihydroxycholecalciferol-Derivat, I it-24(R)-DihydtOxycholecalciferol-Derivat oder ein Gemisch dieser Derivate in beliebigen Vcrhältnisworin

Ri, R2 und Rj gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß die Struktur der obigen Formel geändert wird, mit dem Proviso, daß mindestens eine der Gruppen Ri, R2und R j eine Schutzgruppe bedeutet.

5. Gemisch von la,3/?-24(S)-Trihydroxycriolesta-5,7-dien oder seinen Derivaten und l«,3/i-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder seinen Derivaten in beliebigen Verhältnissen, ausgedrückt durch die folgende Formel

OR,

OR,

R₁(T

worin

Ri, R2 und Ri gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, bedeuten.

6. 1(\,3/J-24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien oder ein Derivat hiervon, gebildet durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch dip folgende Formel

OR,

OR,

R₁O

Ri, R2 und Ri gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß sich die Struktur der obigen Formel ändert.

7. l(X,3/i-24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dicn oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von

mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

OR,

\/ '■■■/

OR₅

(2-d)

Ri, Ri und R igleich oder unterschiedlich sind und je ein V'asserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die iii ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß sich die Struktur der obiger? Formel ändert.

8. ΐΛ-24-Dihydroxycholesterin oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

OR,,

OR₅

R, O

R₄' und Rs die in Anspruch 9 gegebenen Bedeutungen besitzen.

11. l«,2*-Epoxy-24-ketochoiesta-4,6-dien-3-on der folgenden Formel

rf

worin

R4, R5 und Rh gleich oder unterschiedlich sind und je ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom überführbar ist, ohne daß sich die Struktur der obigen Formel ändert.

9.1«-24(S)-Dihydroxycholesterin oder ein Derivat davon, gebildet durch den Schutz von mindestens einer Hydroxylgruppe davon, ausgedrückt durch die folgende Formel

12. Verfahren zur Herstellung von zumindest einer der folgenden Verbindungen, nämlich la,24(S)- und 1«,24(R)-Dihydroxycholecalciferol und deren Derivate, der folgenden Formel

OR.,

ORi'

(2-c)

(5)

R₁O

OR₁

worin

R₄" ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder nichtsubstituierte Benzoylgruppe bedeutet und R₅ ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeutet, die in ein Wasserstoffatom iiberführbar ist. 10. liX-24(R)-Dihydroxycholesterin oder ein Derivat davon, gebildet durch Schutz von mindestens worin

R;. R: und Ri, die gleich oder verschieden s"in können, ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten, die in ein Wasserstoffatom übcrfiihrbar ist, ohne die Struktur der Formel (5) zu ändern, dadurch gekennzeichnet, daß man

(1) ein 1ct,2ix-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on der Formel

1o£,3^,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien-Derivat, der Formel

Π) OR₄

R₄O

mit einem Alkalimetall und einem Protonendonator in Gegenwart von flüssigem Ammoniak oder einem flüssigen Amin unter Bildung von la,24-Dihydroxycholesterin der Formel

OH

OH

12-u)

HO

umsetzt,

(2) das gebildete 1a,24-Dihydroxycholesterin als r, Benzoylderival der Formel

ORi'

OR,

r; o

(2-b)

zu bilden,

(4) das gebildete 5,7-Dienderivat zur Bildung von zumindest einer der folgenden Verbindungen, nämlich 1 «,30,24(S)- und l«.3j3,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, der Formel

OH

'τ

< r

HO'

hydrolysiert,

(5) zumindest eine der folgenden Verbindungen, nämlich 1«,3£,24(S)- und 1a,3/7,24(R)-Trihydroxycholesta 5,7-dien, abtrennt und gewinnt, indem man die hydrolysierten Produkte in Form einer Lösung in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einem Träger in Kontakt bringt, der zumindest Siliciumdioxid und nichtmetallisches Silber in absorbierter Form enthält, und gegebenenfalls zumindest eine der Hydroxygruppen schützt, und

(6) zumindest eines der auf diese Weise gebildeten 1ä,30,24(S)- und 1*,30,24(R)-Trihydroxycho!esta-5,7-dien-Derivate der Formel

worin

R₄" eine substituierte oder unsubstituierte Benzoylgruppe bedeutet und Rj ein Wasserstoffatom oder eine in ein Wasserstoffatom überführbare Schutzgruppe bedeutet, in ein 1a,24(S)-Epimer und ein la,24(R)-Epimer durch Chromatographie unter Verwendung eines Trägers, der zumindest Siliciumdioxid enthält, trennt,

(3) zumindest eine der folgenden Verbindungen, nämlich das l«,24(S)-Epimer und das la,24(R)-Epimer, mit einem allylischen Bromierungsmittel in einem inerten organischen Medium umsetzt und dann die erhaltene Reaktionsmischung mit einem Dehydrobromierungsmittel in Kontakt bringt, um zumindest eine der folgenden Verbindungen, nämlich ein 1 fx,3/i,24(S)-Trihydroxycholests-5,7-dien-Derivat und ein OR.,

(3-b)

R₁O

worin Ri, R2 und R₃ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, einer Ultraviolettbestrahlung in einem inerten organischen I ösungsmittel aussetzt und dann das erhaltene Produkt isomerisiert und gegebenenlalls hiernach die Schutzgruppe uder die Schutzgruppen abspaltet.

13. Pharmazeutisch wirksames Mittel für Warm- valcdavcn werden durch die fe!gv:u!o F'>^rnel blüter, dadurch gekennzeichnet, daß es eine

pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens ^

einem 1«-24(S)- und lrtc-24(R)-Dihydroxycholecalciferol der formel

Oll