DE1933375A1 - 25-Hydroxyverbindungen der Vitamin-D-Reihe und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

DH.ING. F. WUESTHOFF DIPL. ING. G. PULS DH.E.v.PECHMANN DK. ING. D. HEHHENS PATENTANXvAr.TE

8 MÜNCHEN 9O SCHWEIGEIiSTHASSE

TKLKFON 2200 51 TKLKQRAMMAPnESSKf

München

1 A - 36 235

Beschreibung zur Patentanmeldung der

WISCONSIN ALUMINI RESEARCH FOUNDATION -Madison, Wisconsin,'USA

betreffend

"25-Hydroxyverbindungen der Vitamin-D-Reihe und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Die Erfindung betrifft neue 25-Hydroxyverbindungen der Vitamin-D-Reihe. Insbesondere betrifft die Erfindung die 25-Hydroxyverbindungen von Vitamin D₂ (Ergocalciferol) und von Vitamin D, (Cholecalciferol) der Formeln I und II

(D

HO" 25-Hydroxyergocaloiferol

(II)

25-Hydroxycholecalciferol

Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.

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Die antirachitische Wirkung von Vitaminen der D-Reihe, insbesondere von Ergocalciferol und Cholecalciferol, ist ebenso wie deren Verwendung als Zusätze zu Nahrungsmitteln bekannt.

Es wurde gefunden_; daß die 25-Hydroxyderivate dieser Verbindungen, die den Formeln I und II entsprechen, eine größere biologische Wirkung aufweisen als die Stammverbindungen. Sie sind daher als Arzneimittel besonders wirksam, insbesondere zur Bekämpfung von rachitischen Erkrankungen.

Die neuen Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man Säugetiere, insbesondere Schweine, mit an Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol angereichertem Futter über einen längeren Zeitraum füttert, deren Blut sammelt, das Blutplasma isoliert, die Serumproteine des Blutplasmas abtrennt, die Serumprc -sine mit einem Methanol-'-Chloroformgemisch extrahiert, den gegebenenfalls in Chloroform angereicherten Extrakt wäscht und einengt, den Rückstand mit einem niedrig siedenden Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch aufnimmt und chromatographisch über Kieselsäure die entsprechende 25-HydroxyTrerbindung von Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol abtrennt.

Es wurde weiter gefunden, daß 25-Hydroxycholecaloiferol durch Bestrahlen einer Lösung von Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol mit Ultraviolettlicht und chromatographische:- Aufarbeitung des Bestrahlungsprodukts hergestellt werden kann.

Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol der Formel III

Jl' Cm)

ist eine neue Verbindung. Sie kann dadurch, hergestellt werden,

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daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel

(IV) oder I J (V)V

oar

O'

.O t

,in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis*"!6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe und E¹ eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe bedeutet, in einem geeigneten Lösungsmittel mit N,N'-Dibromdimethy!hydantoin bis zur Lösung des JUjN'-Dibromdimethylhydantoins umsetzt, die erhaltene Lösung abkühlt, das ausgefallene Dimethylhydantoin abfiltriert, das I'll trat zur Trockne einengt, den Rückstand in einem geeigneten Lösungsmittel aufnimmt und mit einer Lösung von Trimethylphosph.it umsetzt, das Lösungsmittel abzieht, den erhaltenen Rückstand chromatographisch über ein Aluminiumoxyd enthaltendes Adsorptionsmaterial auftrennt und entweder

a) den aus der Verbindung der Formel IT erhaltenen Diester

von Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol in einem geeigneten Lösungsmittel mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert und öholest-5,7-dien-3ß»25-diol aus ,dem Reaktion'sprodukt isoliert,

oder

b) den aus der Verbindung der Formel V erhaltenen 26-Horcholest-5»7-dien~25-on-3ß-ylester in einem geeigneten Lösungsmittel mit einer Methyl-G-rignard-Verbindung umsetzt, das Reaktionsgemisch in eine kalte wässrige Ammoniumchloridlösung gibt, die Lösungsmittelschicht abtrennt und daraus Cholest-5,7-°dien-3ß,25-diol isoliert.

Als Gruppen R und R* sind die niederen Alkylgruppen, insbesondere die Methylgruppe, sowie die Phenylgruppe bevorzugt.

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^r- 1333375

Das Verfahren wird durch folgendes Formelscheaa erläutert:

(III) .

HO "

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(II)

ORIGINAL INSPEGtED

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, Die Erfindung wird durch die folgenden Bespiele näher erläutert; Beispiel 1

Herstellung von 25-Hydroxyergooaloiferol, "biologisch

-Es wurden vier kastrierte Eber gemischter Zucht mit einem Gewicht von 75 "bis 91 leg mit Futter gefüttert, dem soviel in Wasser dispergierbares Vitamin D₂ zugesetzt worden war, daß je 45o g Futter 7o ooo Internationale Einheiten Vitamin Dp vorhanden waren. Hierdurch wurde jedes Schwein täglich mit 5oo ooo I.E. Vitamin Dg gefüttert. Nach 26 Tagen dieser Fütterung wurde das Blut der Schweine gesammelt und sofort mit 1/1ο des Volumens einer o,1 m-Natriumoxalatlösung zur Verhütung des Koagulierens versetzt. Die Zellen wurden aus dem Blut afrzentrifugiert. Das erhaltene Plasma (4,1 liter) wurde mit soviel Ammoniumsulfat versetzt, bis eine 7o %ige Sättigung erreicht war. Das Plasma wurde bei 4° O 7 Tage stehen gelassen, bis die Serumproteine ausgefällt waren. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren über 25 Minuten bei 25 ooo U/min, in einer Sharples-AS-16-P-Zentrifuge gesammelt und mit 6,6 Litern eines Gemisches von Methanol und Chloroform im Verhältnis 2 : 1 extrahiert und 24 Stunden stehengelassen. Anschließend wurden unter Rühren nochmals 2,2 Liter Chloroform zugegeben. Das denaturierte Protein wurde durch Filtrieren über Glaswolle abgetrennt und jnit weiteren 4,4 Litern des Methanol-Chloroform-Gemisches extrahiert. Die vereinigten Filtrate wurden zu einer wässrigen, methanolhaltigen Phase und einer Chloroformphase absitzen gelassen. Die wässrige Phase wurde abgezogen und erneut mit 2 Litern Chloroform extrahiert und erneut absitzen gelassen. Die Chloroformschichten wurden vereinigt, mit 1o Litern Wasser gewaschen, 24 Stunden stehen gelassen und in einem Rotationssehneilverdampfer eingeengt ρ bis 5o ml eines öligen, schwarzen Rückstandes erhalten wurden. Der Rückstand wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Er wurde im Rotationssohnellverdampfer zum Trocknen eingedampft und in 1oo ml eines

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im wesentlichen aus η-Hexan bestehenden Kohlenwasserstoffgemisches aus unmittelbar destillierten aliphatischen Naphthafraktionen mit einem Siedebereich von 65 - 67° G (Skelly B) gelöst.

Zur Auftrennung der gewünschten Plasmafraktionen durch Chromatographie wurde zuerst ein radioaktives Auftrennungsprofil für das Plasma wie folgt aufgenommen:

Es wurde radiochemisch reines Η-Vitamin Dp hergestellt, indem

1 g Vitamin Dp mit 3»o Ci tritiierter Essigsäure 2 Wochen stehengelassen wurde und das Produkt dreimal über eine Vielfach-Säule mit Kieselsäure und einmal über eine Säule mit umgekehrter Phase bis zur Erzielung einer konstanten spezifischen Aktivität chromatographiert wurde. Das erhaltenene H-Vitamiu Dp hatte eine spezifische Aktivität von 12οοΐ/ππτίΊ.Ε. oder 8,6 mc/mMol (vgl. P.Neville und H.F.Deluca in "Biochemistry" Bd.5 (1966), Seite 22o1, bezüglich der Säulen und der Bestimmung der radiochemischen Reinheit),

Es wurden 1o Ratten von je etwa 4oo g Gewicht, die mit einer an Vitamin D armen Diät gemäß H.Steenboek in "Science", Bd.58 (1923), Seite 449, gefüttert worden waren, intraperitoneal mit

3 ··

1o ooo I.E. Η-Vitamin Dp in o,1 ml Äthanol behandelt. Nach 24 Stunden wurde durch Herzpunktierung Blut entnommen und zentrifugiert. Es wurden 4o ml Plasma erhalten. Das Plasma wurde mit einem Gemisch von Methanol und Chloroform im Verhältnis

2 { 1 gemäß Blunt u.a. in "Biochemistry", Bd. 7 (1968),

Seite 3317, extrahiert. Der Chloroformextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in einem Schnellverdampfer zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit dem Kohlenwasserstoffgemisch wie vorher gelöst und mit dem aus dem Schweineblut erhaltenen Extrakt vermischt.

Der kombinierte Extrakt wurde in fünf gleiche feile auf ^ i'u und jeder Teil über eine Säule mit Xieselsäure.füllung genäß

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"^""VOo₁, BADORIGINAL.

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Blunt aaO. ehromatographiert. Das Radioaktivitätsprofil des Extrakts in einer derartigen Säule ist in der beigefügten Fig.1 wiedergegeben, wobei das Maximum III unverändertes Vitamin Dp darstellt. Die Fraktionen von je 1o ml unter jedem Maximum wurden vereinigt und auf antirachitische Wirkung biologisch nach dem fieihentest gemäß der U.S.Pharmakopoe 1955 gegen. Ratten geprüft. Die Fraktionen unter dem Maximum IV (Fig. 1) waren etwa 1,5-mal aktiver als die Fraktionen unter dem Maximum III, während die Fraktionen unter den Maxima I, II, IVa und V wenig oder keine biologische Aktivität besaßen.

Die Fraktionen des Maximums IV von den fünf Teilmengen wurden gesammelt, injeinen Schnellverdampfer zur Trockne eingedampft und erneut auf einer Mehrfachsäule mit Kieselsäure gemäß Neville und DeLuca aaO. chromatographiert, wobei jedoch die Mischkammer 25o ml des Kohlenwasserstofflösungsmittels (Skellysolve B) und die Vorratskammer 4oo ml eines Gemische von 85 io Diäthyläther im Kohlenwasserstoff gemisch enthielt. Sobald die Vorra-cslcaaaaer leer war, wurde sie mit 3oo ml reinem Diäthyläther gefüllte Das Slutionsprofil der kombinierten Fraktionen, in 5 ml Fraktionen aufgeteilt, ist in Fig.2 wiedergegeben, wobei das Maximum IVa immer noch auftritt.

Die Fraktionen 63 bis 98 wurden vereinigt, im Schnellverdampfer eingedampft und über einer Verteilungskolonne mit Gelite (Diatomeenerde) wie folgt chromatographiert: Es wurden 2oo ml des Kohlenwasserstofflösungsmittels (Skelly B) mit dem gleichen Volsmen eines Gemisches aus 8o $ Methanol und 2o $ Wasser aq.uilibriert.Es wurden 2o g Gelite mit 15 ml der Methanolphase gemischt und trocken in Teilmengen von 2 cm in eine "Säule von 6o oa Höhe und 1 cm Durchmesser gepackt. Die Ob er phase wurde als ioMle Phase benutzt. Die kombinierten Fraktionen wurden in 1 bis 3 ml der mobilen Phase auf die Säule gebracht und die Säule wurde mit der mobilen Phase entwickelt.

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Is wurden 5 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen Nr.11 bis 17 wurden erneut vereinigt, zur Trockne eingedampft und auf einer gleichen Verteilungssäule erneut chromatographiert. Das Radioaktivitätsprofil auf dieser Seite ist in Fig. 3 wiedergegeben.

Die Radioaktivitätsbestimmungen wurden mit einem Flüssigkeits-Scintillationszähler (Packard Tri-Garb Modell 3oo3) mit einem automatischen, äußeren Standardisierungssystem durchgeführt. Die zu zählenden Proben wurden mit einem Luftstrom zur Trockne eingedampft, in Toluol-Zähllösung aus 2,g 2,5-Diphenyloxazol und 1oo mg 1,4-bis~/2"-(4-methyl-5-phenyloxazoly!)benzol7;je Liter · Toluol gelöst und ausgezählt.

Identifizierung

Zur Identifizierung war es erforderlich, die als Maximum IV erhaltene Verbindung in den Te.tramethylsilyläther zu überführen. Ss wurden 3o g des isolierten Materials unter einem Strom von trockenem Stickstoff zur Trockne eingedampft. Es wurden einige. Tropfen einer Reagenzlösung aus 1o ml trockenem Pyfcidin, 4 al Hexamethyldisilazan und 2 ml Trimethylsilylehlorid zugefügt, die Lösung mit Stickstoff gespült und das Gemisch 3> Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen gelassen. Es wurden 3. ml des Kohlenwasserstofflösungsmittels (Skelly B) zugefügt und 2ml 1o $iger Schwefelsäure zugegeben« Das Gemisch wurde heftig gemischt und dann absitzen gelassen« Die KQhlgnwass&rstoffphase wurde über wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und über eine Kieselsäure enthaltende Säule gemäß Lund u.a. in "Arch, Biochem. Biophysics" Bd. 12ο. (196?), Seite 5.1f_? ch-comatographiert. In den Röhrchen 19 bis 27 wurde die S.ilylätherverbin·!- dung (15.Ug) gefunden, die durch Gasehromatographie als rein be-r funden wurde. Sie wurde zur Bestimmung des MassenSpektrums verwendet.

Das Ultraviolettspektrum und die gaschromatographisehen Werte ließen die Trien-Struktur des Vitamins P₂ ip der Verbindung vermuten. Das MassenSpektrum der Verbindung aus dem Maximum IV

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0AP ORlG^^AU

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ergab intensive Maxima beim m/e-Wert 136 (C^iLpO) und 118 -(C₉HjJ₀) aus dem Ring A einschließlich C₆ und C₇, die auch im.Spektrum des Vitamins Dp .auftreten.

Das Massenspektrum der Verbindung aus- dem Maximum IV zeigte ein ionisiertes Molekül bei m/e 412j 16 Masseneinheiten mehr als beim Vitamin Dp» was auf ein zusätzliches Sauerstoffatom hinweist. Durch ein hochauflöaendes Massenspektrum wurde dieser Befund bestätigt, der die genaue Masse des Ions mit 4-12,334-1 ergab, entsprechend der Zusammensetzung von Cp-H. .Op (berechnet 412,3341). Die Lage des zusätzlichen Sauerstoff-Substituenten in der Seitenkette ergibt sich aus dem Vergleich der Spektren von Vitamin D₂ und der neuen Verbindung. Beide zeigen Maxima bei m/e 271 (C₁^H₂₇O - 2?1,2o65 gemäß der hochauflösenden Massenspektrometrie). Diese ergeben sich aus dem Verlust der gesamten Seitenkette d^v»rch die Spaltung der Bindung bei C,γ - Cp . Außerdem enthielt das hochauflösende Spektrum der neuen Verbindung kleinere Maximo.,. die wahrscheinlich der Seitenkette selbst entsprechen, bei m/e 141,1255(CqH₁₇O) und 123,1181 (C₉H₁₅).

Ein Bruchstück der Masse 59 (C₅H₇O gemäi3 der hochauflösenden Massenspektrometrie) und die Abspaltung von 58 Masseneinheiten aus dem Molekülion zu einem Maximum bei m/e 354 (354,29oo Cp₁-H^oO) im Massenspektrum des Materials aus den Fraktionen IV, aber nicht im Spektrum des Vitamins D₂ ergaben einen Hinweis auf die Hydroxylfunktion bei C₂₅. Das erstere Maximum würde sich durch Spaltung der C₂./₂c-Bindung zum Ion (CIU)₂= Oll(-t-) und das letztere durch eine Wasserstoffumlagerung unter Abspaltung der -Acetonstruktur ergeben, was bei Homoallylalkoholer^ ein bekannter Prozess ist.-. ..

Der Beweis für die Stellung der Hydroxylgruppe wurde aus dem Masaenspektrum des Silyläthers der Verbindung aus dem Maximum IV erhalten, das ein Molekülion bei m/e 556 für einen-. . > Di-trimebhylsilyläther und das erwartete starke Maximum bei m/e 131 (Grrundmaximum) entsprechend der Struktur CgH₁

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ORlGtNAU

; - Ιο - ■- 1,1-^6-23^

ι- ... _. .. .. -.". ..■"-'.""-"- ■ ■ -(¹JH-,)PU=O-Si(CH-,), durch hochauflösende Massenspektrometrie zeigte. Dieses Maximum, das auch im Spektrum der Trimethylsilylätherderivate. von . 25-Hydroxycholesterin und 25-Hydroxy-...cholecalciferol auftritt, aber, nicht in den Spektren der Silyläther von.Vitamin Dp oder'D,, macht die Lage der zusätzlichen Hydroxyl!*unktion an GpE-Ätom erforderlich.

Das Kernresonanzspektrum des Materials aus den Fraktionen des Maximums IV, das in- GDCl^-.Lösung mit -einem Varian Associates Modell HA-1op-.Sp.ektrometernim.it angeschlossenem Rechner für die Zeitmittlung wegen der kleinen Substanzmengen unter Verwendung von Tetramethylsllan als VergleichastondSrd aufgenommen wurde, unterstützte diese Schlußfolgerungen-und ergab unabhängiges Beweismaterial für die angenommene-Struktur der Verbindung gemäß Formel I. Es wurden die folgenden»Werte als £-Werte in Teilen je Millionen Teile (PP^m) gegetiüber Teträmethylsilan (^=O) erhalten. Ein .sta-rke„s Singiett bei; S^J, 24 ppm kann den beiden Methylgruppen am Coc zugeschrieben werden, wahrend zwei Dupletts bei 6o,79 (J=6,5 Hz) und o,81 pp m (J= 7,ο Hz) auf die restlichen Methylsubstituenten der Seitenketten an Gp₁ und Cp₀ zurückgeführt werden, müssen,. Die'-Spektren von 25-Hydroxycholesterin und 25-HydroxycholecalGiferol zeigen ein Singulett für die Methylgruppen,..an;Gpg und ΘΧ« "iin der gleichen Stellung ( o'l,2o ppm),. Es. muß .bemerktjwerd^n, "däß'-zwei Dupletts bei O o,87 (J=%,o,llz). ,iUnd, r^0'i'9S .{3=^,0 ίίζ)- -im 'ursprünglichen Ergocalciferolspekbrum im d&Tymeüen"Y&i)aimlvng nicht mehr vorliegen. Dieser. Befund .kann nur durc-h eine Ilydroxylsubstitution am Cp_r erklär.· b wer,d.en, da diese Duplebts zv^ei Methylgruppen entsprechen.■■ Dag verbLeibende identifizierbare Kennzeichen isb das Singulett an der angular en Ü jg-Methylgruppe. Diese V/erbe lassen die Struktur der neuen Verbindung¹als 25-Hydroxyergocalciferol der .Formel I erkennen.

Die hochauflöaenden Massehspektren vnarden mit einem MS-9-Spektrometer der Associated Electrical Industries erhalten, der mit einem Rechner Scientific Data Sysbems Sigma-7 gekoppelt war.

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BAD ORIGINAL

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Beispiel 2 Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol, biologisch

Es wurden vier kastrierte Eber von 94 bis 118 kg mit einem Normalfutter, das mit täglich 25o ooo Internationalen Einheiten (I.E.) Vitamin D, angereichert war, 26 Tage gefüttert. Das Blut der Schweine wurde gesammelt und mit 1,6 Litern o,1 m-Natriumoxalat#lösung behandelt. Es wurden 6,8 Liter Plasma erhalten. Die Serumproteine wurden durch Zugabe von soviel Ammoniumsulfat zum Serum, daß eine Sättigung von 65 bis 7o fo erreicht wurde, ausgefällt. Die Niederschlagbildung erfolgte durch Stehenlassen über drei Tage bei 4°C. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren 25 Minuten bei 15 ooo U/Min, gesammelt und mit 9 Litern Methanol-Chloroform im Verhältnis 2 : 1 extrahiert? Der Gesamtextrakt aus diesem Verfahren wurde eingeengt und auf 5o ml mit einem Kohlenwasserstofflösungsmittel, das hauptsächlich n-Hexän enthielt und aus direkt destillierten aliphatischen Naphthas erhalten wan en war co( Skelly B) mit einem Siedebereich 6o bis 68⁰G vermischt und auf loo ooo I.E. Vitamin-D-Wirkung biologisch im Ratten-Reihenversuch gemäß der U.S.Pharmakopoe 1955 geprüft,

Es wurden 2o ml des Extrakts auf eine ohromatographisehe Abeprptionssäule mit 25 g Kieselsäure von 58 cm Höhe und 1,5 cm Durchmesser gegeben. Die Säule wurde mit einem Ather-Skelly B-Gemisch mit abfallender Konzentration eluiert, das dadurch erhalten wurde, daß 4oo ml eines Gemisches aus 85 fo Äther in Skelly B aus einer Vorratskammer in einer Mischkammer, die anfangs 25o ml Skelly B enthielt, laufen gelassen wurden. Nachdem 36 Fraktionen von 11 ml gesammelt worden waren, wurde in die Vorratskammer 25o ml reiner Äther gegeben. Es wurden weitere 3o Fraktionen von 11 ml gesammelt. Die Fraktionen 51 wurden vereinigt und auf eine Verteilungssäule gegeben. Diese Säule wurde wie folgt aufgebaut: 2o g Gelite (Diatomeenerde)

*) Canadian J.Biochem.Physiol.Bd.37 (1959) Seite 911

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wurden mit 15 ml einer stationären Phase aus 8o fi Methanol und 2o % Wasser, äquiliMert mit einem gleichen Volumen Skelly B-, vermischt. Etwa 2/3 des Materials wurden in eine G-lassäule von 1. cm Durchmesser gepackt. Die Fraktionen 51 bis 6o wurden in einer kleinen Menge mobiler Phase (Skelly B, aq.uilibri.ert mit Methanol-Wasser) auf die Säule gegeben und mit mobiler Phase eluiert, wobei Fraktionen von 5 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen 17 bis 21 wurden vereinigt. Der Rest von den 5o ml Ausgangsextrakt wurde In gleicher Weise Chromatograph!ert und verteilt und die gleichen Fraktionen gesammelt.

In allen Fällen wurden die Fraktionen, die ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei 264 m-u in Diäthyläther hatten (E»18 2oo) gesammelt und vereinigt.

Identifizierung

Durch das Ultraviolettspektrum und gaschromatographische Werte· wurde das isolierte Material mit einer dem Vitamin D, ähnlichen Struktur in Zusammenhang gebracht. Durch eine hochauflösende Massenspektrometrie gemäß Beispiel 1 wurden die Unterschiede der Struktur zwischen der neuen Verbindung und Vitamin D* aufgeklärt. ..

Das Molekulargewicht des isolierten Produkts betrug 4oo (G₂₇H.-Op, ein Cholecalciferol). Im MassenSpektrum des isolierten Produkts und im Vitamin D, zeigt die Gegenwart eines Maximums bei m/e 271 (C₁QHp₇O) die Stelle der zweiten Hydroxylgruppe an der Seitenkette an, da das Fragment m/e 271 durch einen Verlust der Seitenkette durch Spaltung der Bindung bei ^G17*~ ^G2o ^auf^^ri"^t;"^fc· Außerdem könnte ein Maximum bei m/e 59 ■ (CJa₇O) im Spektrum der isolierten Verbindung, aber nicht im Spektrum des Vitamins D,,durch eine Spaltung der Bindung bei

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^C24 ~^G25 ^auf'^tre'ⁱ'^en> wobei die Hydroxylgruppe am C₂₅ gebunden ist, Die Lage der Hydroxylgruppe am C₂₅ wurde mit dem Kernresonanzspektrum bei 1dd MHz (gemessen in CDCl, mit letramethylsilan als Standard) gemäß Beispiel 1 verifiziert. Hierbei wurde ein starkes Singulett-Maximum bei £i,2o ppm (wie in 25-Hydroxyoholesterin) und die Abwesenheit des Dupletts bei ίο,87 ppm wegen der sekundären Cpg ?7~^^e^yIg¹UPPen wie im Cholecalciferol aufgefunden. Die anderen Besonderheiten des Kernresonanzspektrums, die beim Vitamin D, und der neuen Verbindung identisch sind, sind die folgenden:

&o,58 ppm - Tetramethylsilan .
ίο,54 ppm - Resonanz der C^g-H^-Gruppe ίο,93 ppm - Duplett der C₂₁-H,-Gruppe (J=6 Hz) <$4,81 , 5,o3 ppm - Maxima der Cj^-H₂-Gr^uppe ^6,o2 ppm (J=11,5 Hz), 6,24 ppm (j=1o,5 Hz) - Dupletts der !Protonen in den Stellungen 6 und 7·

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Beispiel 3 Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol, synthetisch

A) Herstellung von· Cholest-5,7-dien-3ü,25-diol aus 3,25-Cholesteryldiacetat.

Es wurden 1oo mg 3,25-Cholesteryldiacetat in einem Gemisch aus 1,5 ml trockenem Benzol und 1,5 ml eines trockenen Kohlenwasserstoff gemische, das hauptsächlich aus η-Hexan besteht und durch direkte Destillation von Naphthas hergestellt worden ist und einen Siedebereich von 6o bis 68⁰C hat (Skelly B), gelöst. Die erhaltene Lösung wurde zu 32 mg fein pulverisiertem NjN'-Dibromdimethylhydantoin in einem Reagenzglas zugegeben, das dann in ein Wasserbad von 72 bis 74°O eingetaucht wurde. Nach vollständiger Lösung des N,N^!-Dibromdimethy!hydantoins wurde die Lösung in Eis gekühlt. Der gebildete kristalline Niederschlag von Dirnethylhydantoin wurde abfiltriert und zweimal mit je 1 ml kaltem Skelly B gepult. Die Spülflüssigkeit und das Piltrat wurden zur Trockne unterhalb 4o G unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in o,4 ml trockenem Xylol aufgenommen. Die Lösung wurde tropfenweise zusammen mit zweimal o,1 ml Spülflüssigkeit zu einer Lösung von o,1 ml Trimethylphosphit in o,3 ml Xylol gegeben, die auf etwa 13o bis 135° C gehalten worden war. Das erhaltene Gemisch, wurde etwa 9o Minuten umgesetzt, während es auf der angegebenen Temperatur gehalten wurde und anschließend bei etwa 65°C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.

Der erhaltene Rückstand wurde in Skelly B gelöst und auf eine chromatographische Säule.mit 25 g neutralem Aluminiumoxid der Aktivitätsstufe I gegeben. Die Säule wurde mit einem Gemisch aus Diäthyläther undSkelly-B im Verhältnis 3:1 und danach mit einem Gemisch der gleichen Lösungsmittel im Verhältnis 111

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eluiert. Es wurden Fraktionen von 12 ml gesammelt. Die das Diacetat von Gliolest-5_s7-dien-3ß,25-diol gemäß dem "Ultraviolett spektrum (Maxima bei 272, 282 und 294 mu) enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft.

Es wurde die Diac eta tv er "bindung erhalten _f die in. 3 ml trockenem Athyläther gelöst und mit einer kleinen Menge (io mg) Lithiumaluminiumhydrid etwa 5 Minuten umgesetzt wurde. Die erhaltene Lösung wurde mit mehreren gleichen Teilen Wasser zur Entfernung anorganischer Bestandteile gewaschen, getrocknet und der Äther unter vermindertem Druck abgezogen. Der erhaltene Rückstand in einer Menge von 18 mg wurde als Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol mit folgenden Eigenschaften identifiziert:

F. 169 "bis 171°G (aus wässrigem Methanol), UV-Spektrum: ²⁷²'²⁸²

L pap 11000. Kernresonanzspelctrum: G^g-H^ 00,65 ppm

C₁₉-H₃ ^o_f98 ppm

C₉₁-H_x «ίο,89 ppm(Duplett, ^άΛ > J=6,5 Ez)

^C26₅27"^H3

Cr rj-E &5Λ ppm(Multiplett) ο, ι -

Als Ausgangsmaterial können auch andere Ester als die 3,25-Diacetatverbindung eingesetzt werden. Die Estergruppen brauchen nicht in den Stellungen 3 und 25 gleich zu sein. Zum Beispiel kann 25-Benzojloxy-cliolesterylacetat in gleicher Weise als Ausgangsmaterial verwendet werden, wobei vergleichbare Ergebnisse erhalten werden. Im allgemeinen kann der Substituent in 3-Stellung am Steroidkern des Ausgangsmaterials eine Gruppe der Formel R«-GG-G- seia_s in der E eine Alkylgruppe mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen oöer eine Phenylgruppejist, und der Substituent in der 25-Sti.lung kann eine Gruppe der Formel R'-CO-O-sein, in der S* elB© Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgriappe ist* ' ' - ■

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hydrid,

Anstelle von Li thiumalumin iumr kann zum Beispiel auch alkoholisches Kalium oder Natriumhydroxid zur Reduktion verwendet werden.

B) Herstellung von Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol aus 26-JSTorcholest -5-en-25-on-3ß-ylaeetat

Es wurden 142 mg 26-Norcholest-5-en-25-on-3ß-ylacetat in einem Gemisch aus 2,2 ml trockenem Skelly B gelöst und zu 5o mg Ν,Ν'-Dibromdimethyl-hydantoin gegeben. Die Umsetzung wurde gemäß Verfahren A durchgeführt. Der erhaltene Rückstand wurde in o,5 ml Xylol aufgenommen. Die Lösung wurde zusammen mit o,3 ml Xylol-Spülflüssigkeit tropfenweise zu o,15 ml ITrimethylphosphit in o,5 ml Xylol von etwa 13o bis 135°C gegeben. Das Gemisch wurde 9o Minuten bei dieser Temperatur umgesetzt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei etwa 65⁰O abgezogen.

Der erhaltene Rückstand wurde in Chloroform gelöst und auf eine chromatographische Säule mit 2o g neutralem Aluminiumoxid der _: Aktivitätsstufe I gegeben. Die Säule wurde mit Chloroform eluiert. Es wurden Fraktionen von 5»5 ml gesammelt. Das 26-Norcholest-5,7-dien-25-on-3ß-ylacetat wurde das den Fraktionen 1o bis 14 durch Eindampfen des Lösungsmittels gewonnen. Die Dienverbindung im Produkt wurde durch folgende spektroskopische Werte identifiziert:

UltraviolettSpektrum: 1_ÖV272, 282, 294 mu, £_OQO 11 ooo

max ' C.OC.

Infrarot Spektrum: /max¹^⁰'^^^{2 cm} entsprechend der

Carbonylabsorption der Acetat- bzw. Methylketongruppen.

Kernresonanzspektrum: O-g-ü, Jo,63 ppm

O₁₉-H₃ ίο,95 ppm
ÖC7-H, ί2,12 ppm

OCOCH₃ £2,ο2 ppm

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Durch Gaschromatographie wurde gefunden, daß die einzige Verunreinigung aus dem Ausgangsmaterial 26-Norcholest-5-en-25-on-3ß-ylacetat bestand.

Es wurden 245 mg des Rückstands, der etwa 18o mg der 5,7-Dien-Verbindung enthielt, in 3,5 ml trockenem Benzol gelöst und zu einer G-rignardreagenzlösung zugefügt, die durch. Zugabe von o,24 mg Methyljodid in 2,5 ml trockenem Äther zu 72 mg Magnesiumdrehspänen erhalten worden war. Das Gemisch wurde 2,5 Stunden am Rückfluß erhitzt, 17 Stunden stehen gelassen und anschließend zu einer kalten Ammoniumchloridlösung zugegeben. Es bildete sich eine wässrige Schicht und eine Ätherschicht. Die Ätherschicht wurde abgezogen, getrocknet und der Äther verdampft. Der Rückstand wurde mit Skelly B verrieben und ergab nach dem Filtrieren 212 mg eines amorphen Pulvers, das gemäß dem Ultsaviolettspektrum und der Gaschromatographie aus 14o mg Oholest-5,7-dien-3ß,25-diol bestand, während der Rest 25-Hydroxycholesterin war.

Mengen der Reaktionsteilnehmer, Temperaturen und Lösungsmittel können auch geändert werden, ohne daß die Ergebnisse erheblich von einander abweichen. Es können auch andere Aufarbeitungsverfahren angewendet werden.

C) Hierstellung von 25-Hydroxyoholeoalciferol aus Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol

Es wurden 1o6 mg des gemäß Verfahren B hergestellten Gemisches mit einem Gehalt von 7o mg Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol in 4oo ml Äther gelöst und unter einer Hochdruck-Quecksilberdampflampe (Hanau, Modell 654A) 3,5 Minuten bestrahlt. Die Bestrahlung wurde in einem Mant,1 um einen doppelwandigen, wassergekühlten Quarzfinger durchgeführt. Während der Bestrahlung wurde die Ätherlösung heftig gerührt und kontinuierlich mit Stickstoff ausgespült.

- 18 - ' 909882/17U

- 18 - 1A- 36 235

Die Bestrahlungsprodukte wurden in einer Vielfachsäule gemäß G.A. Fischer und J.J. Kabara in Anal.Bioehem.Bd.9 (1966), Seite 3o3, mit 14 g wärmeaktivierter Kieselsäure (Bio-Rad,HA, Siebmaschengröße unter o,o44 mm der California Corp. for Biochemical Research, Los Angeles, California, USA) unter Verwendung von Äther-Skelly B im Verhältnis 1 : 1 chromatographyert. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelgradienten eluiert, der dadurch hergestellt wurde, daß Äther in eine 25o ml-Mischkammer einlaufen gelassen wurde, die ursprünglich mit der Lösung aus Äther und Skelly B im Verhältnis 1 : 1 gefüllt war. Es wurden Fraktionen von 2,8 ml gesammelt.

Durch Ultraviolettspektrometrie und Gaschromatographie wurde gefunden, daß nur die Fraktionen 33 "bis 38 25-Hydroxyp'rc-oh.olecalciferol (X_mQV 261 mu,£_9i-.,=9ooo)enthielten. Diese Fraktionen wurden vereinigt und etwa 7 Tage bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre stehen gelassen. Danach hatte sich die Verbindung in 25-Hydroxycholecalcxferol mit folgenden Eigenschaften umgewandelt:

Ultraviolettspektrum: Λ „„265 mu, & 18 ooo

Kernresonanzspektrum: Cp₁-H, «o,9o ppm ( Duplett, J=8 Hz)

C₁₈-H₅ ίο,54 ppm

^G26,27"^H3 i¹'²² PP^m

C₁Q-H₂ 0 4,8o ppm und 5»oo ppm

C_{6 7}-H I 5,97 ppm ( Duplett, J-T2 Hz), 6,25 ppm (Duplett,. J= 12 Hz)

Molekulargewicht: 4oo,334o (berechnet C₂₇H₄₄O₂ 4oo,3341)

Die höheren Fraktionen als Fraktion Nr. 38 enthielten 25-Hydro xytachysterol,, 25-Hydroxycholesterin und eine kleine Menge nicht umgesetztes 5,7-Dien. Die Fraktionen, die 25-Hydrosy-

- 19 909882/17U

- 19 - 1 A - 36 235

tachysterols und unverändertes 5,7-Dien enthielten, wurden mit gleichartigen Fraktionen vereinigt, die aus einem zweiten Bestrahlungsansatz stammten und erneut 3,5 Minuten bestrahlt. Es · wurde chromatographisch über aktivierte Kieselsäure eine zusätzliche Ausbeute von 8 mg 25-Hydroxycholecaloiferol erhalten.

Die Bestrahlung von 15 mg des 5,7-Diens, das gemäß Atergestellt worden war, über 2,5 Minuten gemäß der vorherigen Verfahrensweise ergab 2,4 mg 25-Hydroxyprecholecaleiferol, das in der genannten Weise in 25~Hydroxycholecalciferol überführt wurde.

Beispiel 4

A) Heilversuch gegen Rachitis

Entwöhnte JungrairfesB wurden mit einer raehitogenen Diät gemäß Steebooh. and Black, JnBiol.0hsm.Bd.64 (1925), Seite'265, 21 Tage gefüttert. Die Diät vnirde durch Zugabe von wasserlöslicher Vitaminen gemäß Deluca u.a. in J.Nutr., Bd_e?5 (1961), Seite 175, modifiziert. Nach, der Mangeldiät über 21 Tage morde eirae Einzeldosis von 4 I.E. Standard-Vitamin D, oder D₂ oder 25-Hydroxyergocaloiferol oder 25-Hydroxycholecalciferol verabreicht. 7 Tage später wurden die Rattengetötet und an den herauspräparierten Ellen und Speichen der Reihenversuch durchgeführt. Die biologische Wirkung wurde gemäß der U.S.Pharmakopoes H.Auflage 1955, durchgeführt.

Während Vitamin D^ und Vitamin D₂ nur W_erte von 4o I₀S* je ergaben, zeigte Hjdroxyergocalciferol einen Wert von etwa 6o I.E. je /ig und 25-Hydroxycholecalciferol einen Wert von 56 bis 6o I.E. je ^ag (Syntheseprodukt 55-6o I.E. je ug).

- 2o 909882/17U

- 2ο - 1 A - 36 235

B) Calciumtransportversuch

Entwöhnte männliche Jungratten wurden in hängenden Drahtkäfigen gehalten und nach Belieben mit einer gereinigten Vitamin D-armen Mangelköst gemäß DeLuca aaO. gefüttert. Die Diät erzeugte Iceine Rachitis bei Ratten, rief aber in 3 bis 4 Wochen schwere Vitamin D-Mangelerscheinungen hervor, die durch einen niedrigen Ga⁺⁺- G-ehalt im Serum und durch vermindertes Wachstum gekennzeichnet sind (H.Steenbock und D.C.Herting, J.Nutr.Bd.57 (1955), Seite 449).

Nach 6 Wochen Mangeldiät wurde den Ratten eine Dosis von o, 25 /ig Vitamin D,, Dp, 25-Hydroxyergocalciferol und 25-Hydroxycholecalciferol in Baumwollsamen/oral oder in o,o2 ml Äthanol intravenös verabreicht. Die Vergleichstiere erhielten lediglich Äthanol bzw. Baumwollsamenöl. Nach der in der folgenden Tabelle I aufgeführten Zeit wurden die Ratten getötet und gemäß J.E.ZuIl u.a., Science Bd.149 (1965), Seite 182, der Calciumtransport an umgestülpten Eingeweidesäcken geprüft. Der Calciumtransport wird als Verhältnis ⁴^Ca (serumseitig) /^Ca (schleimhautseitig) ausgedrückt. ,

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben.

- 21 909882/1 7 1 Λ

1 A - 36

	Tabelle	Vergleich	- ·	•	3	I	Tierzähl	Transportver	+	o,o2
•Probe Std	L.nach Ver-	(Baumwollöl)	-	4		hältnis	—	o,17
abreichung	(Äthanol)		6
Vitamin D,	12	8	6	ο ,66	+	o,o3
(Baumwollöl)	24	12	4	1,59	+	o,o6
	4				+	o,12
(Äthanol)	6	12	5	o,74	+	o, 1o
		24	4	1,16
Vitamin D0	3	4	1,o1	+	o,39
(Äthanol)	4	4	1,32	+	o,36
	6			+	o,3o
	8	5	1,4o	+	o,12
	12	5	1,54	—	o,7o
	4	1,88
25-OH-Ergocalciferöl	5	2,o6	+	o,41
(Äthanol)	5	3,35	+	o,65
			±	o,49
	5	1,94	+	o,23
	5	2,o9		o,59
	5	2,74
25-OH-Cholecalciferol	5	3,51	+	o,o4
(Baumwollöl)	5	3,58		o,o7
	6	o,89
4	1,24

(Äthanol)

5 4

2,31 + o,5o 2,35 + o,51

909882/ 17U

1 A - 36 235

Aus den Werten ergibt sich, daß synthetisches oder natürliches 25-Hydroxycholecalciferol den Galeituatransport in den Eingeweiden schneller als Vitamin D, einsetzen läßt und daß 25-Hydroxyergocalciferol in dieser Hinsicht dem Vitamin D₂ überlegen ist. '

Mit 25-Hydroxycholecalciferol wurde ein weiterer Versuch. durchgeführt, wobei

a) das Inkubationsmedium aus 125 mMol Natriumchlorid, 3o mMol Tris-Cl, o,25 mMol GaCIg.2H₂O und 1ο mMol Pruktose bestand, das mit HCl auf den pH-Wert 7,4- eingestellt und mit einer Ca -lösung auf etwa 1 ο Impuls e/Min/ml Medium gebracht worden war;

b) 1,5 Stunden Sauerstoff durch das Medium bei 37⁰C perlen gelassen wurde und

c) die Hätten intravenös mit o_f25 Jig Vitamin D~ oder 25-Hydroxycholecalciferol in o,o2 ml Äthanol behandelt wurden.

Die Vergleichstiere erhielten nur Äthanol. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Probe

Std.nach Verabreichung

Tierzahl

Transportverhältnis

Vergleich
25-OH-Cholecalciferol

Vitamin D,

3 4 6 1o 4

6 1o

12 4 4 4 4 4

4 3

1,25 + o,o5 1,74 + o,12 (p<0,öl

1 df. 1 _n ix über Ver-1,66 + o,13 _gleicll)

2,6 + o,4 2,3 +0,6 1,o1 +0,12 1,32'+ o,1o 2,o +0,3

- 23 -

90 9882/Ί714

- 23 - 1 A - 36 235

C) Serum-Calciumspiegel (Knochenmobilisierung)

Entwöhnten männlichen Jungratten wurde 11 bis 15 Tage bzw. 3 bis 4 Wochen eine Vitamin-D-Mangeldiät gemäß DeLuca aaO. verabreicht, wobei jedoch Calcium fortgelassen wurde. Die Ratten wurden dann intravenös mit 2,5 ^g Vitamin Dp» Vitamin D,, 25-Hydroxyergocalciferol und 25-Hydroxycholecalciferol in o,o2 ml"Äthanol behandelt. Vergleichstiere wurden nur mit Äthanol behandelt. Das Serum wurde nach den in Tabelle III angegebenen Zeiträumen gesammelt und gemäß Webster, Am.J. 0lin.Pathol.BcL.131 (1969) Seite 33o, auf Calcium geprüft. Die Versuche wurden doppelt ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.

. - 24 909882/17U

1 A - 36

Tabelle III

Probe

Std.nach Verabreichung Tierzahl·
Txerzaiii

Serumgehalt

Vergleich

Il

Vitamin Dr

25-OH-Ergooalciferol

Vitamin 33

3-

25-OH-Choleoalciferol
(aus Schweinen)

(synthetisch)

o ο

24

24

12

16

8
12

6 4

4 4 4 3 6

4 5 5 4 6

2 3 3 4

3,7 + o,2

4.0 + o,4

3,7 + o,5 3,7 + o,3

3.6 + o,3 4,2 + o,1

5.7 + o,3

4,3+ o,3 4,6 + o,3

4.8 + o,3

5.1 +o,2 6,o + o,4

3.8 + o,1

5.9 + ο,Ί 5,o + o,4 6,6 + o,4

5	4,4 +	o,3
4	5,7 +	o,2
4	7»1 +	o,4
3	7,2 +	o,4
7	6,4 +	o,5
6	7,36+	o,21

- 25 -

09882/17U

- 25 - 1 A - 36 235

Aus der Tatelle III ergibt sich, daß 25-Hydroxyergo- bzw. -cholecalciferol die Knochenmobilisierung und damit den CaI-ciumgehalt im Blut schneller in Gang setzen als Vitamin Dp bzw. Vitamin D,. Hieraus ergibt sich, daß die neuen Verbindungen anstelle von Vitamin D₂ bzw. D, als Nahrungsmittelzusatz überlegen sind.

D) Zusatz von 25-Hydroxycholecalciferol zu Hühnerfutter

Es wurden Fütterungsversuche an Hühnern gemäß "Vitamin D in Pultry Feed Supplement First Action, Methods of Analysis", A.O.A.C. Seite 784 (1965, 1o. Ausgabe, durchgeführt. Das aus Schweinen isolierte 25-Hydroxycholecalciferol wurde in einer Menge von 125 iig in 25 g Maisöl dispergiert und zur Fütterung verwendet. Nach dem Füttern wurden die Knochen der einzelnen Hühner gruppenweise geordnet und der Prozentsatz Asche in den von Feuchtigkeit und Fett freien Knochen als Einzelreaktion auf jede Dosierung bestimmt. Die Wirkkraft des Präparats wurde aus der Aufzeichnung von Standardpräparaten abgeschätzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

- 26 909882/ 1 7U

- 26 - 1 A-36 235

Tabelle IV

Intern.Huhner- ug/loog Körpergewicht Knochenasche \ einheiten* ' Putter anfangs am Ende (Schienbein)

Vergleichsgruppe: nur Maisöl

ο ο 35 116 28,3

Vergleichsgruppe: Vitamin D als Vergleichsstandard zugesetzt 4oo o,113 35 142 32,4

4oo	o,158	35	145	33,4
4oo	o,225	35	151	35,3
4oo	o,319	35	166	3b,7
4oo	o,45o	35	152	41,8

Versuchsgruppe: 25-Hydroxycholecalciferol in Maisöl

o,158	35	Ho	32,2
o, 225	35	151	36,3
o,319	35	162	41,2

^Internationale Hühnereinheiten » o,o25 ug Cholecalciferol

Aus den vorstehenden Werten wurde geschätzt, daß jedes Gramm des mit Öl verdünnten 25-Hydroxycholecalciferols wenigstens 2o6 Internationalen Hühner einheiten Vitamin D-, entsprach. Es ist somit wirksamer als Vitamin D, in HühnerfutterzuSätzen und kann allgemein als Ersatz für Vitamin D verwendet werden.

909882/1 71 U

BAD ORIGINAL

Claims (5)

1. Patentansprüche
2. 2. 25-Hydroxycholecalciferol
3. 3« Verfahren zur Herstellung von 25-Hydroxyergocalciferol bzw. 25-Hydroxycholecalciferol nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man Säugetiere mit an Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol angereichertem Putter über einen längeren Zeitraum füttert, deren Blut sammelt, das Blutplasma isoliert, die Serumproteine des Blutplasmas abtrennt, die Serumproteine mit einem Methanol-Chloroformgemisch extrahiert, den gegebenenfalls in Chloroform angereicherten Extrakt wäscht und einengt, den Rückstand mit einem niedrig sie*- denden Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch aufnimmt und chromatographisch über Kieselsäure die entsprechende 25-Hydroxyverbindung von Ergocalciferol bzw. Cholecalciferol abtrennt.
4. 4. Verfahren zur Herstellung von 25-Hydroxycholecalciferol nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel

   O-

   i-

   909882/171

   1 A - 36 235

   in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe und R^f eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe bedeutet, in einem geeigneten Lösungsmittel mit !!,N'-Dibromdimethylhyda/ntoin bis zur Lösung des !!,li'-Dibromdimethylhydantoins umsetzt, die erhaltene Lösung abkühlt, das aufgefallene Dimethylhydantoin abfiltriert, das Filtrat zur Trockne einengt, den Rückstand in einem geeigneten Lösungsmittel aufnimmt und mit einer Lösung von Trimethylphosph.it umsetzt, das Lösungsmittel abzieht, den erhaltenen Rückstand chromatographisch über ein Aluminiumoxid enthaltendes Absorptionsmaterial auftrennt und entweder

   a) den aus der Verbindung der Formel IV erhaltenen Diester von Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol in einem geeigneten Lösungsmittel mit Lithiumalurainiumhydrid reduziert und Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol aus dem Reaktionsprodukt isoliert oder

   b) den aus der Verbindung der Formel V erhaltenen 26-lorcholest-5,7-dien-25-on-3ß-ylester in einem geeigneten Lösungsmittel mit einer Methyl-Grignard-Verbindung umsetzt, das Reaktionsgemisch in eine kalte, wässrige Ammoniumchloridlösung gibt, die Lösungsmittelschicht abtrennt und daraus Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol isoliert und das erhaltene.Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol der Formel III

   (III)

   mit Ultraviolettlicht bestrahlt und die Bestrahlungsprodukte chromatographisch aufarbeitet.
5. 5. Cholest-5,7-dien-3ß,25-diol

   ■9 09882/17 ¹U

   78 IV

   sw .

   Leerseite